JPH06197665A - 体外受精用培地および体外受精方法 - Google Patents
体外受精用培地および体外受精方法Info
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- JPH06197665A JPH06197665A JP125793A JP125793A JPH06197665A JP H06197665 A JPH06197665 A JP H06197665A JP 125793 A JP125793 A JP 125793A JP 125793 A JP125793 A JP 125793A JP H06197665 A JPH06197665 A JP H06197665A
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- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】
【目的】体外受精においてその精子にも有効な哺乳動物
の体外受精用培地及び体外受精方法を提供する。 【構成】カゼインホスホペプチドを含有することを特徴
とする哺乳動物の体外受精用培地及びこれを用いた哺乳
動物の体外受精方法。
の体外受精用培地及び体外受精方法を提供する。 【構成】カゼインホスホペプチドを含有することを特徴
とする哺乳動物の体外受精用培地及びこれを用いた哺乳
動物の体外受精方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は体外受精率を改善する体
外受精用培地および体外受精方法に関するものである。
外受精用培地および体外受精方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】近年、哺乳動物において優良種の育種お
よび増殖等のために体外受精法が広く用いられるように
なってきている。この体外受精法は、生体または屠体の
卵巣から未成熟卵子を吸引回収し、体外成熟用培地で培
養し、成熟した時点で射出または凍結融解精子を用いて
媒精を行う。受精後、卵子を発生培地へ移して培養を行
い、この間分割が進んだものを受卵動物の発情にあわせ
て移植する技術である。この技術は原理的には極めて優
れたものであるといえるが、従来の技術では、精子によ
っては受精率が極端に低いものがあり、どの精子も卵子
に侵入可能となる体外受精方法は確立されていない。
よび増殖等のために体外受精法が広く用いられるように
なってきている。この体外受精法は、生体または屠体の
卵巣から未成熟卵子を吸引回収し、体外成熟用培地で培
養し、成熟した時点で射出または凍結融解精子を用いて
媒精を行う。受精後、卵子を発生培地へ移して培養を行
い、この間分割が進んだものを受卵動物の発情にあわせ
て移植する技術である。この技術は原理的には極めて優
れたものであるといえるが、従来の技術では、精子によ
っては受精率が極端に低いものがあり、どの精子も卵子
に侵入可能となる体外受精方法は確立されていない。
【０００３】そこで、体外受精においてどの精子にも有
効な受精系を確立するために、培地または精子処理方法
の改良が行われているが、未だ満足できる受精系が得ら
れているとはいえず、更なる改良が望まれている。
効な受精系を確立するために、培地または精子処理方法
の改良が行われているが、未だ満足できる受精系が得ら
れているとはいえず、更なる改良が望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、体外
受精においてその精子にも有効な哺乳動物の体外受精用
培地及び体外受精方法を提供することである。
受精においてその精子にも有効な哺乳動物の体外受精用
培地及び体外受精方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは精子によら
ず安定して体外受精を行ないうる受精系を確立するべく
カルシウムに着目した。すなわち、哺乳類の受精機構か
ら考えて従来の受精用培地では精子へのカルシウムの取
り込みが不十分なため、精子の卵子への侵入に必須な先
体反応が誘起されないことによると想像した。しかし、
カルシウムは精子の先体反応に必須の成分であり、体外
受精用培地には通常その必要量が充分配合されている。
体外受精用培養液として用いられる条件においては単に
カルシウム成分の配合量を増加させても限界があり、し
かもカルシウム成分の増量による効果はそれ程大きいも
のではなかった。そこで、本発明者らはさらに検討を進
めた結果、体外受精用培地中にカゼインホスホペプチド
を加えると受精率を向上させることができた。
ず安定して体外受精を行ないうる受精系を確立するべく
カルシウムに着目した。すなわち、哺乳類の受精機構か
ら考えて従来の受精用培地では精子へのカルシウムの取
り込みが不十分なため、精子の卵子への侵入に必須な先
体反応が誘起されないことによると想像した。しかし、
カルシウムは精子の先体反応に必須の成分であり、体外
受精用培地には通常その必要量が充分配合されている。
体外受精用培養液として用いられる条件においては単に
カルシウム成分の配合量を増加させても限界があり、し
かもカルシウム成分の増量による効果はそれ程大きいも
のではなかった。そこで、本発明者らはさらに検討を進
めた結果、体外受精用培地中にカゼインホスホペプチド
を加えると受精率を向上させることができた。
【０００６】すなわち、本発明はカゼインホスホペプチ
ドを含有することを特徴とする哺乳動物の体外受精用培
地および体外受精改良法に関するものである。
ドを含有することを特徴とする哺乳動物の体外受精用培
地および体外受精改良法に関するものである。
【０００７】カゼインホスホペプチドはカゼインの加水
分解物であってカルシウムを可溶化する活性を含有する
ホスホペプチドである。食品として摂取されたカゼイン
は腸管内で分解されてカゼインホスホペプチドとなり、
このカゼインホスホペプチドがカルシウムを可溶化し
て、腸管吸収を高めていることは既に報告されている
（日本栄養・食糧学会誌，36巻，433〜439頁，1986
年）。
分解物であってカルシウムを可溶化する活性を含有する
ホスホペプチドである。食品として摂取されたカゼイン
は腸管内で分解されてカゼインホスホペプチドとなり、
このカゼインホスホペプチドがカルシウムを可溶化し
て、腸管吸収を高めていることは既に報告されている
（日本栄養・食糧学会誌，36巻，433〜439頁，1986
年）。
【０００８】カゼインには、α−ガゼイン、β−カゼイ
ン及びγ−カゼイン等が知られているが、用いられるカ
ゼインはそのいずれであってもよい。カゼインホスホペ
プチドについてはいくつかの報告があり、例えばトリプ
シン分解酵素で分解したものについては、αS1−カゼイ
ンの42〜79残基ペプチド鎖、β−カゼインの１〜25及び
１〜28残基ペプチド鎖及びαS2−カゼインの１〜32残基
ペプチド鎖部分のものが生成することが知られている。
しかし、本発明の体外受精用培地に用いるカゼインホス
ホペプチドはこれらに限定されるものではなく、カルシ
ウムを可溶化し得る活性を有するものであればよい。
ン及びγ−カゼイン等が知られているが、用いられるカ
ゼインはそのいずれであってもよい。カゼインホスホペ
プチドについてはいくつかの報告があり、例えばトリプ
シン分解酵素で分解したものについては、αS1−カゼイ
ンの42〜79残基ペプチド鎖、β−カゼインの１〜25及び
１〜28残基ペプチド鎖及びαS2−カゼインの１〜32残基
ペプチド鎖部分のものが生成することが知られている。
しかし、本発明の体外受精用培地に用いるカゼインホス
ホペプチドはこれらに限定されるものではなく、カルシ
ウムを可溶化し得る活性を有するものであればよい。
【０００９】カルシウムを可溶化する活性中心はホスホ
セリン部位であることが示唆されており、分子量も例え
ば１万以下程度でよいものと考えられる。従って、カゼ
インホスホペプチドを得るためのカゼインの分解手段は
問わないが、一般には活性中心部位を分解しない蛋白分
解酵素、例えばペプシン、トリプシン等の分解産物が望
ましい。
セリン部位であることが示唆されており、分子量も例え
ば１万以下程度でよいものと考えられる。従って、カゼ
インホスホペプチドを得るためのカゼインの分解手段は
問わないが、一般には活性中心部位を分解しない蛋白分
解酵素、例えばペプシン、トリプシン等の分解産物が望
ましい。
【００１０】カゼインホスホペプチドの培地中の含有量
は、とくには制限されないが、0.1〜30％（重量）程
度、好ましくは0.8〜12％程度が適当であり、この培地
を用いて調製される培養液中0.005〜１％（重量／体
積）程度、好ましくは0.02〜0.3％程度である。
は、とくには制限されないが、0.1〜30％（重量）程
度、好ましくは0.8〜12％程度が適当であり、この培地
を用いて調製される培養液中0.005〜１％（重量／体
積）程度、好ましくは0.02〜0.3％程度である。
【００１１】他の培地成分としては、水溶性カルシウム
を含有させることが必要である。この水溶性カルシウム
としては塩化カルシウム等を用いればよく、培地中の含
有量としては0.1〜12％（重量）、好ましくは0.4〜４％
程度が適当である。体外受精用の培地には通常水溶性カ
ルシウムが含まれている。その量が上記の範囲にあれば
水溶性カルシウムを更に添加する必要はない。
を含有させることが必要である。この水溶性カルシウム
としては塩化カルシウム等を用いればよく、培地中の含
有量としては0.1〜12％（重量）、好ましくは0.4〜４％
程度が適当である。体外受精用の培地には通常水溶性カ
ルシウムが含まれている。その量が上記の範囲にあれば
水溶性カルシウムを更に添加する必要はない。
【００１２】培地にカフェインを含有させることは好ま
しい。カフェイン添加により受精率をさらに向上させる
ことができる。培地中のカフェインの含有量としては0.
1〜20％（重量）、好ましくは0.2〜12％程度が適当であ
る。
しい。カフェイン添加により受精率をさらに向上させる
ことができる。培地中のカフェインの含有量としては0.
1〜20％（重量）、好ましくは0.2〜12％程度が適当であ
る。
【００１３】上記以外の培地成分は公知の体外受精用培
地と同様でよく、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｐ、Ｃｌ等の基本的
無機成分、代謝能力に応じた血清あるいはＢＳＡ等を適
宜配合したものを用いればよい。このような体外受精用
培地の例としては、体外受精用ＢＯ液、ＰＡＬＰ液等を
挙げることができる。
地と同様でよく、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｐ、Ｃｌ等の基本的
無機成分、代謝能力に応じた血清あるいはＢＳＡ等を適
宜配合したものを用いればよい。このような体外受精用
培地の例としては、体外受精用ＢＯ液、ＰＡＬＰ液等を
挙げることができる。
【００１４】培地の調製方法は従来と同様でよく、カゼ
インホスホペプチドはその混合工程において他の培地成
分とともに混合あるいは別個に加えてもよい。
インホスホペプチドはその混合工程において他の培地成
分とともに混合あるいは別個に加えてもよい。
【００１５】上記培地を用いて体外受精を行なう方法は
例えば次のように実施できる。市販のＷaymouth液など
に入れて成熟させたブタ卵子を、体外受精用ＢＯ液など
の公知体外受精用培地成分にカゼインホスホペプチドを
0.1〜30％（重量）を添加した体外受精用培地から調製
したカゼインホスホペプチドを0.005〜１％（重量／体
積）含む培養液に移した後、ブタの凍結融解精巣上体精
子を加え、公知の条件下で培養を行う。従来の公知の培
地を用いた方法によってもある程度の受精率は得られる
が、本発明のカゼインホスホペプチドを添加した体外受
精用培地を用いた方法の場合、従来の培地ではみられな
いカゼインホスホペプチドのカルシウム可溶化機構によ
って受精率を更に向上させることができる。
例えば次のように実施できる。市販のＷaymouth液など
に入れて成熟させたブタ卵子を、体外受精用ＢＯ液など
の公知体外受精用培地成分にカゼインホスホペプチドを
0.1〜30％（重量）を添加した体外受精用培地から調製
したカゼインホスホペプチドを0.005〜１％（重量／体
積）含む培養液に移した後、ブタの凍結融解精巣上体精
子を加え、公知の条件下で培養を行う。従来の公知の培
地を用いた方法によってもある程度の受精率は得られる
が、本発明のカゼインホスホペプチドを添加した体外受
精用培地を用いた方法の場合、従来の培地ではみられな
いカゼインホスホペプチドのカルシウム可溶化機構によ
って受精率を更に向上させることができる。
【００１６】上記は本発明におけるブタへの応用例を示
したが、同様の原理を用いてウシ、ウマ、ヒツジ、ヒト
等の哺乳動物にも本発明は応用できる。即ち、各種動物
に適した公知の培地にカゼインホスホペプチドを加えた
体外受精用培地からカゼインホスホペプチドを含む培養
液中で体外受精を実施できる。
したが、同様の原理を用いてウシ、ウマ、ヒツジ、ヒト
等の哺乳動物にも本発明は応用できる。即ち、各種動物
に適した公知の培地にカゼインホスホペプチドを加えた
体外受精用培地からカゼインホスホペプチドを含む培養
液中で体外受精を実施できる。
【００１７】
〔実施例１〕表１の組成をもつ体外受精用ＢＯ液を用い
た。
た。
【００１８】
【表１】
【００１９】この体外受精用ＢＯ液にカフェインを、
０，５または15mM添加した３種の培養液（１，３，５
区）及びカゼインホスホペプチド（ＣＰＰ；明治製菓
(株)製品）をそれぞれ１mg／ml添加混合した３種の受精
用培養液（２，４，６区）を調製した。市販のＷaymout
h液（10％卵胞液、10％ウシ胎児血清、黄体形成ホルモ
ンおよび卵胞刺激ホルモンを含む）中で成熟させたブタ
卵子を上記４種の受精用培養液に移した後、凍結融解精
巣上体精子（ブタＡ）を最終濃度１×105cells／mlにな
るように加え、39℃，６時間培養した。受精率の結果を
表２に示す。
０，５または15mM添加した３種の培養液（１，３，５
区）及びカゼインホスホペプチド（ＣＰＰ；明治製菓
(株)製品）をそれぞれ１mg／ml添加混合した３種の受精
用培養液（２，４，６区）を調製した。市販のＷaymout
h液（10％卵胞液、10％ウシ胎児血清、黄体形成ホルモ
ンおよび卵胞刺激ホルモンを含む）中で成熟させたブタ
卵子を上記４種の受精用培養液に移した後、凍結融解精
巣上体精子（ブタＡ）を最終濃度１×105cells／mlにな
るように加え、39℃，６時間培養した。受精率の結果を
表２に示す。
【００２０】
【表２】
【００２１】表２から、ＣＰＰを添加した培地中での受
精率は、対応するＣＰＰ無添加区に対して有意に高値で
あった。
精率は、対応するＣＰＰ無添加区に対して有意に高値で
あった。
【００２２】〔実施例２〕ＣＰＰを１mg／mlおよびカフ
ェインを５mg／ml添加した実施例１の２区と同じ受精用
培養液（１区）、比較例としてＣＰＰをホスファターゼ
で処理してリン酸基を除去した脱リンＣＰＰを１mg／ml
添加した培養液（２区）及びＣＰＰ無添加の培養液（３
区）の３種を調製した。実施例１と同様にブタ卵子を39
℃，46〜48時間培養し、３頭のブタ（Ａ，Ｂ，Ｃ）の凍
結融解精巣上体精子を加えた。精子侵入卵子率及び多精
子侵入卵子率の結果を表３に示す。
ェインを５mg／ml添加した実施例１の２区と同じ受精用
培養液（１区）、比較例としてＣＰＰをホスファターゼ
で処理してリン酸基を除去した脱リンＣＰＰを１mg／ml
添加した培養液（２区）及びＣＰＰ無添加の培養液（３
区）の３種を調製した。実施例１と同様にブタ卵子を39
℃，46〜48時間培養し、３頭のブタ（Ａ，Ｂ，Ｃ）の凍
結融解精巣上体精子を加えた。精子侵入卵子率及び多精
子侵入卵子率の結果を表３に示す。
【００２３】
【表３】
【００２４】表３から、どの精子でも、ＣＰＰを添加し
た培地中での精子侵入卵子率及び多精子侵入卵子率共に
ＣＰＰ添加区は無添加区及び脱リンＣＰＰ添加区に対し
て有意に高値を示した。
た培地中での精子侵入卵子率及び多精子侵入卵子率共に
ＣＰＰ添加区は無添加区及び脱リンＣＰＰ添加区に対し
て有意に高値を示した。
【００２５】
【発明の効果】本発明により、精子にかかわりなく体外
受精効率を安定して向上させることができる。
受精効率を安定して向上させることができる。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年２月２２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、体外
受精においてどの精子にも有効な哺乳動物の体外受精用
培地及び体外受精方法を提供することである。
受精においてどの精子にも有効な哺乳動物の体外受精用
培地及び体外受精方法を提供することである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１３】上記以外の培地成分は公知の体外受精用培
地と同様でよく、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｐ、Ｃｌ等の基本的
無機成分、代謝能力に応じた血清あるいはＢＳＡ等を適
宜配合したものを用いればよい。このような体外受精用
培地の例としては、体外受精用ＢＯ液、ＴＡＬＰ液等を
挙げることができる。
地と同様でよく、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｐ、Ｃｌ等の基本的
無機成分、代謝能力に応じた血清あるいはＢＳＡ等を適
宜配合したものを用いればよい。このような体外受精用
培地の例としては、体外受精用ＢＯ液、ＴＡＬＰ液等を
挙げることができる。
フロントページの続き (72)発明者 平山 匡男 埼玉県坂戸市千代田５−３−１ 明治製菓 株式会社生物科学研究所内 (72)発明者 加茂 善弘 埼玉県坂戸市千代田５−３−１ 明治製菓 株式会社生物科学研究所内 (72)発明者 西沢 耕治 埼玉県坂戸市千代田５−３−１ 明治製菓 株式会社生物科学研究所内
Claims (2)
- 【請求項１】 カゼインホスホペプチドを含有すること
を特徴とする哺乳動物の体外受精用培地 - 【請求項２】 体外受精をカゼインホスホペプチドを含
有する体外受精用培地中で行うことを特徴とする哺乳動
物の体外受精方法
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP125793A JPH06197665A (ja) | 1993-01-07 | 1993-01-07 | 体外受精用培地および体外受精方法 |
| AU53005/94A AU5300594A (en) | 1993-01-07 | 1994-01-04 | Medium for in vitro fertilization and method of in vitro fertilization |
| EP94100104A EP0606847A3 (en) | 1993-01-07 | 1994-01-05 | Medium and method for in vitro fertilization. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP125793A JPH06197665A (ja) | 1993-01-07 | 1993-01-07 | 体外受精用培地および体外受精方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06197665A true JPH06197665A (ja) | 1994-07-19 |
Family
ID=11496411
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP125793A Pending JPH06197665A (ja) | 1993-01-07 | 1993-01-07 | 体外受精用培地および体外受精方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0606847A3 (ja) |
| JP (1) | JPH06197665A (ja) |
| AU (1) | AU5300594A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997008946A1 (fr) * | 1995-09-04 | 1997-03-13 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Composition d'un milieu pour fertilisation externe |
| JP2021136891A (ja) * | 2020-03-03 | 2021-09-16 | 正雄 神野 | 顕微授精用液体組成物、未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物、それらを用いた顕微授精方法並びに未受精卵、受精卵及び胚の賦活方法 |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2264428B1 (en) | 1997-01-31 | 2017-05-03 | Xy, Llc | Optical apparatus with focussing reflector for converging radiation onto a flow of particles |
| US6071689A (en) | 1997-12-31 | 2000-06-06 | Xy, Inc. | System for improving yield of sexed embryos in mammals |
| US6149867A (en) | 1997-12-31 | 2000-11-21 | Xy, Inc. | Sheath fluids and collection systems for sex-specific cytometer sorting of sperm |
| US7208265B1 (en) | 1999-11-24 | 2007-04-24 | Xy, Inc. | Method of cryopreserving selected sperm cells |
| CA2408939C (en) | 2000-05-09 | 2011-11-08 | Xy, Inc. | High purity x-chromosome bearing and y-chromosome bearing populations of spermatozoa |
| AU3768902A (en) | 2000-11-29 | 2002-06-11 | Xy Inc | System to separate frozen-thawed spermatozoa into x-chromosome bearing and y-chromosome bearing populations |
| US7169548B2 (en) | 2002-09-13 | 2007-01-30 | Xy, Inc. | Sperm cell processing and preservation systems |
| HUE026838T2 (en) | 2003-03-28 | 2016-07-28 | Inguran Llc | Method for providing sex-sorted animal sperm |
| GB0329608D0 (en) * | 2003-12-22 | 2004-01-28 | Univ Nottingham | A novel method for embryo and animal production |
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