JPH0616033B2 - アンモニアおよび尿素の分析具 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は液体試料、特に体液、例えば血液、血清、血
漿、唾液中のアンモニアおよび尿素の濃度を測定するた
めの分析具に関するものである。

体内におけるアンモニアは、主として蛋白質代謝の過程
におけるアミノ酸の脱アミノ化および食事によって摂取
される蛋白質の細菌などによる分解によって生成され
る。そして近年、この血中アンモニア濃度が、肝性脳症
を伴う重症肝疾患、とくに劇症肝炎、肝硬変などの病態
把握やその治療を行なう際に重要視されるとともに、先
天性尿素サイクル酵素欠損症や先天性アミノ酸代謝異常
症の診断治療に欠くことのできない検査項目として注目
されてきている。

一方尿素は、人体における蛋白質代謝の反応主生成物で
あり、尿素の濃度は腎機能の指標となるし、毒性物質は
尿素の度合に概ね比例して血液中に含まれるので、高濃
度の血中尿素は、医師にとって診断上重要な指標とな
る。

このようにアンモニアおよび尿素の濃度測定は臨床的見
地から極めて重要である。

ところで、臨床化学でよく知られているアンモニアの測
定法には、従来からコンウエイ（Conway）やセリグソン
（Seligson）らの微量拡散法、イオン交換樹脂法、更に
は、除蛋白比色法ならびに最近では酵素法がある。又、
尿素の測定法には、従来では、尿素とジアセチルモノオ
キシムを反応させ新しく生成した化合物の吸収を光度計
で測定するジアセチルモノオキシム法がある。また、近
代的には尿素をウレアーゼにて分解し、炭酸アンモニウ
ムにした後、これを分解してアンモニアガスとし公知の
ネスラー（nessler）試薬又はバースロット（Berthelo
t）試薬に生成した着色反応物の呈色度を調べる方法が
ある。しかしこれらの方法は正確である反面、多量の
検体を要する、検量線をその度毎に作成しなければな
らない、分析に長時間を要する、特殊な分析装置を
必要とする、毒劇物を使用するなど、多くの欠点を有
している。

そこで、これらの欠点を是正し、手軽に測定するための
測定具がいくつか開発されている。

例えば、米国マイルス社より発売されているアゾスティ
ックス（商品名）で知られる尿素濃度測定用試験紙があ
る。これは濾紙の細片にウレアーゼと緩衝剤を含浸させ
てあり、全血の１滴を塗布して、１分間反応を待って全
血中の赤い血球成分を水洗除去し、表面に呈した色調を
あらかじめ作成された標準比色表を用いて肉眼判定して
血中の尿素濃度を大まかに知るものである。この試験具
は簡易性迅速性を満たしているが、検体が全血に限られ
ており、かつ、その全血のヘマトクリット値に測定結果
が大きく影響を受け、さらに血球成分を水洗除去した後
は直ちに呈色度が低下するなどの分析の精密・正確さに
重大な欠点を有している。

次に、特公昭50−1619号明細書には、強酸性イオン交換
樹脂とパラジメチルシンナムアルデヒドが反応して生じ
る青色化合物による呈色を目視判定する尿素濃度測定用
組成物が開示されている。これは試料が血清又は血漿に
限られていること、試料自体のpH・緩衝能・色調に測定
値が影響され、さらにウレアーゼを使用していないため
尿素に対する特異性に乏しく、試料中の代謝物や薬剤に
測定値が影響されるなどの欠点を有している。

更に特開昭54−151094号明細書には、全血あるいは血清
を測定試料とするアンモニア及び尿素の分析具が開示さ
れている。これは反応系で発生したアンモニアをネット
又はフォィルを通して指示薬に到達させ、指示薬系での
発色の度合より試料中のアンモニア又は尿素の濃度を調
べるものであるが、指示薬系の一部が開口しているため
に、試料が指示薬系に浸み込んで呈色が不均一となり、
あるいは反応系で発生したアンモニアが指示薬系を均一
に呈色せしめることができない欠点がある。

又、特公昭56−11108号明細書には、水溶液中のアンモ
ニアを反応系でアンモニアガスとなし、該アンモニアガ
スがガス通気性膜を通って指示薬系に達することにより
指示薬系の顕色剤を変色せしめることを利用して水溶液
のアンモニア濃度を知る技術が示されている。しかしこ
の分析具は、指示薬系に、顕色剤を親水性ゲルビーズに
含浸させ、該ゲルビーズを粘着テープ上に単層に付着さ
せたものを用いており、またガス通気性フイルムを用い
ているために再現性のある製造が困難である。

一方、本願出願人による特願昭56−177660号明細書に
は、気密に保たれる試料穴中で、試料中の尿素を酵素に
より加水分解し、生成した炭酸アンモニウムをアルカリ
性条件下でアンモニアガスとなし、これをガス通過性膜
を通して指示薬層に導き、アンモニアガスによるpH変動
に対応する指示薬の変色により尿素を分析する方法及び
装置が開示されている。この尿素分析用具はガスの逃げ
が少なく、また試料の性状に影響を受けずに分析できる
特徴を有するが、やはりガス透過性膜を用いているため
再現性のある製造に問題があるとともに構造が複雑で、
ストリップ状の用具と比較するとき製造上の不利は免れ
得ない。

本発明は上記に鑑みなされたもので、その第１の目的と
するところは、従来技術の欠点を有さない、微量の検体
を用いて迅速・簡易・精密・正確なアンモニア及び尿素
の分析ができる分析具を提供することにある。また第２
の目的は、試料の量を厳密に定量しなくても試料中のア
ンモニア又は尿素の濃度を精密・正確に測定できる分析
具を提供することにある。さらに第３の目的は製造及び
使用が極めて容易なアンモニア又は尿素の分析具を提供
することにある。

本発明者らはこの目的を達成するために、アルカリ性側
にpHを保持する緩衝剤系を含有する担体（尿素の場合に
はウレアーゼ活性を有する酵素系及び緩衝剤系）、及び
担体より発生したアンモニアガスにより変色する指示薬
層とともに、該担体より指示薬層へアンモニアガスが拡
散できる面積及び拡散したアンモニアガスと接触できる
指示薬層の面積を一定にできるスペーサー、並びに担体
上部を覆うカバーシートを備えた分析具を開発した。

次に本発明に係る分析具の測定機構を、尿素の測定を例
に挙げて説明する。

まず、試料中の尿素をわずかな時間で分解できるウレア
ーゼ及びアルカリ性緩衝剤を含んだ担体(4)に試料を滴
下すると、試料中の尿素はウレアーゼによって直ちに分
解されて炭酸アンモニウムとなり、担体(4)にはアルカ
リ性緩衝剤により試料の尿素濃度に対応するアンモニア
ガス分圧が発生する。発生したアンモニアガスは担体
(4)の側面および拡散室(5)に対向している面より均一に
拡散する。尚、担体に試料を滴下した後担体(4)の上部
をカバーシートで覆うと該担体(4)の上部からのアンモ
ニアの拡散を防ぐことができる。側面が開放系であるの
に対し、拡散室は閉じられた空間なので、両系への拡散
量及び開口部のアンモニア分圧には次第に差が生じる。
しかし、両系（拡散室(5)と側面）間の最短距離と担体
(4)の厚みの比が大きければ、側面からのアンモニアガ
スの拡散が拡散室(5)へのアンモニアガスの拡散量に与
える影響は無視できる。拡散室側へ拡散したアンモニア
ガスは、指示薬層(2)に達して指示薬を変色させるの
で、指示薬の変色度を調べることによって試料中の尿素
濃度を調べることができる。

以下、添付図面を参照しながら本発明の分析具について
詳述する。

第１図〜第３図は本発明分析具の１例を示すもので、支
持体(1)の一端側に、指示薬層(2)、スペーサー(3)及び
担体(4)が順次積層され、全体がストリップ状に構成さ
れている。担体(4)は、試料中のアンモニアをアンモニ
アガスにする試薬（アンモニア分析の場合）、又はウレ
アーゼ活性を有する酵素系を含む試薬とウレアーゼによ
って試料中の尿素が分解されて生じた炭酸アンモニウム
をアンモニアガスにする試薬（尿素分析の場合）とを含
有する。指示薬層(2)は、アンモニアガスにより変動す
るpHの変化に応じて変色する指示薬を含むもので、支持
体(1)上に塗布乾燥することによって施されている。

一方スペーサー(3)は、指示薬層(2)と担体(4)の間に拡
散室(5)を形成するための透孔(6)を一方の端部寄りに備
えており、該部分が支持体(1)上に剥離可能な状態で接
着されている。また耐端部寄りの上面には粘着剤(7)が
施してあり、試料滴下後直ちに担体(4)を覆うためのカ
バーシートの役割を果たす。そのためにスペーサー(3)
の素材は軟質のプラスチックフィルム乃至シートが好適
に用いられる。またこのスペーサー(3)は、担体(4)と一
緒に撤去することにより、所定の反応時間経過後指示薬
層(2)での反応を停止させる働きをする。尚、スペーサ
ー(3)の透孔(6)の上部及び下部は夫々担体(4)と指示薬
層(2)に接着されているので、担体(4)と拡散室(5)との
接触面積及び指示薬層(2)と拡散室(5)との接触面積さら
にこれら２面(2)・(4)間の距離を正確に再現することが
容易である。

ところで、上記担体(4)に含まれる試薬（試料中のアン
モニアをガス化する試薬）は、試料のpHをアルカリ性に
保持できるアルカリ性緩衝剤が好ましい。このアルカリ
性緩衝剤は常温で固体であればなんでもよく、ホウ酸と
ホウ砂、炭酸ナトリウムと重炭酸ナトリウムの組合せ、
トリス緩衝剤などが挙げられる。アルカリ性緩衝剤のpH
は、高い程アンモニアのガス化が活発に行なわれるが、
あまりに高すぎると蛋白質やアミノ酸が分解して余分な
アンモニアを副生する。また尿素分析の場合は、同一系
内に存在させるウレアーゼが高いpH下では不安定にな
る。そこで、アンモニア分析の場合pH７．５〜11、特に
10.5付近、尿素分析の場合pH７．５〜10特に８．５付近
が好ましい。

担体(4)の素材としては、濾紙、不織布等溶液中に含浸
し、溶媒を乾燥したとき乾燥残分を保持できるものであ
れば何でもよい。また担体には、所望により滴下した試
料がよく浸透するよう湿潤剤や界面活性剤を加えておく
と有利である。尚、支持体の材料としては加工性・経済
性等からポリスチレン、ポリエチレン、ポリエステル等
のプラスチックが好適である。

次に指示薬系としては、pHの変動に対応して変色する種
々な薬品または薬品群が用いられる。また微量のpH調定
剤を使用することにより、より良好な結果が得られる。
そして好ましくは、所望によりpH調定剤としてマロン
酸、フタル酸、酒石酸のような常温で固形の酸又はこれ
らの酸と該酸の塩との混合物を使用し、酸性側に変色域
を有する種々なpH指示薬を単独または複合で使用する。
単独で用いる例としてブロムクレゾールパープル、クロ
ルフェノールレッド、ブロムクレゾールグリーン等が挙
げられる。複合で用いる例としてブロムクレゾールグリ
ーン，ブロムキシレノールブルー，パラキシレノールブ
ルーの組合せ、クロルフェノールレッド，ブロムフェノ
ールレッド，フェノールレッド，クレゾールフタルレイ
ンの組合せ、フェノールフタレイン、メチルレッド，ジ
メチルアミノアゾベンゼン，ブロムチモールブルー，チ
モールブルーの組合せ〔ボーゲン（Bogen）の万能指示
薬〕等を挙げることができる。単一の指示薬又は類似の
色相にて変色するpH指示薬群の場合は、光反射率計を用
いて被測定物質濃度を測定するのに有効であり、予め定
めた波長にセットすることによってpH指示薬の変色の度
合いを個人差なしで測定することができる。一方複合で
用いるpH指示薬の中でも、例えば前述したボーゲンの万
能指示薬、或いはコルソフ（Kolthoff）の万能指示薬等
に代表される広い範囲のpHに渡って変色するものは、肉
眼で被測定物質濃度を測定する場合、特に有利である。
すなわち万能指示薬では赤〜橙〜黄〜緑〜青の様にpHに
応じて変色するので肉眼で判定するのに好都合である。

これらのpH指示薬は、天然及び合成のフイルム形成可能
な重合体をバインダーとして配合して支持体上に塗布さ
れる、好適なバインダーは酢酸セルロース、ポリビニル
ブチラール、エチルセルロースのようは非水溶性のフイ
ルム形成重合体であり、pH指示薬の均一な変色、均一な
塗布に対して有効である。さらに均一な変色に有効に働
く物質としてポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポ
リエチレングリコール、グリセリン等の湿潤剤や界面活
性剤を加えることも好ましい。

測定に際しては、まず担体(4)に試料を滴下し、直ちに
スペーサー粘着剤部にて担体上部を覆う。担体(4)では
試料中のアンモニア又は尿素の濃度に対応したアンモニ
アガス分圧が発生し、アンモニアガスは拡散室(5)を通
って指示薬層(2)に達する。アンモニアガスは最終的に
は試料中のアンモニア又は尿素の濃度に対応する指示薬
の変色を生じさせる。尚、試料中の水、血球などは担体
(4)に保持されるので、指示薬層の変色の度合は拡散室
を通過したアンモニアガスのみに依存する。しかして、
その変色の程度をスペーサー(3)及び担体(4)を撤去した
後、第２図Ａ方向から眺めて色見本と比較するか、又
は、光反射率と被測定物質濃度との検量線をあらかじめ
作成しておくことにより、光反射率計により容易に試料
中の被測定物質濃度を知ることができる。

次に、本発明を一層よく理解させるために実施例を掲げ
るが、本実施例によって本発明を制限するものではな
い。

実施例 １ アンモニア分析具 Ａ〕アンモニア分析具の製造 (1)準備 （ａ） 担体 15cm平方の濾紙〔東洋濾紙(株)製＃1026〕を下記の組成
の溶液に含浸し、50℃で乾燥したのち、１cm角に切断す
る。

０．５Ｍ炭酸緩衝液（pH10.5） 25ml triton Ｘ−100 0.1 ｇ （ｂ） 指示薬層形成用塗布液 下記組成の溶液を指示薬層形成のための塗布液とする。

フエノールフタレイン 20mg メチルレッド 40mg ジメチルアミノアゾベンゼン 60mg ブロムチモールブルー 80mg グリセリン 1ｇ チモールブルー 100mg エチルセルロース 8ｇ エチルアルコール 50ml アセトン 50ml 精製水 ２ml （ｃ） 支持体と指示薬層 10cm幅の白色ポリエステルシート〔東レ(株)製、厚さ0.
2mm〕の一方の端から10mm〜20mmの部分に、上記（ｂ）
で作製した塗布液を塗布厚0.25mmで施し、50℃で乾燥し
た後、塗布方向と直角方向に１cm幅で裁断する。

（ｄ） スペーサー 10mm×80mmのポリエステルシート〔東レ(株)製、厚さ0.
1mm〕の一方の端から20mmのところを中心とする直径6mm
の透孔を設け、他方の端より３cmの部分に10mm×30mmの
両面テープ貼る。

(2) 組立て (a)、(d)、(c)をこの順に第３図のように接着する。

Ｂ〕測定 担体にアンモニア水溶液30μを滴下し、直ちにスペー
サーの粘着剤部で担体を覆う、10分経過後、スペーサー
と担体を撤去し、指示薬層の色調を肉眼で観察した結果
を表１に示す。

実施例 ２ 尿素分析具 Ａ〕尿素分析具の製造 (1) 準備 （ａ） 担体 15cm平方の濾紙〔東洋濾紙(株)製＃1026〕を下記組成の
溶液に含浸し、50℃で乾燥したのち、１cm角に切断す
る。

ウレアーゼ 3000Ｕ 1.0Ｍトリス緩衝液（pH８．５） ２５ml ポリエチレングリコール 1ｇ （ｂ） 指示薬層形成様塗布液 下記組成の溶液を指示薬層形成用の塗布液とする。

ブロムクレゾールグリーン 40mg グリセリン ０．４ｇ 酢酸セルロース ４ｇ アセトン 20ml エタノール 20ml 1.0Mクエン酸緩衝液（pH３．０） ０．３ml （ｃ） 支持体と支持薬層 実施例１と同じ （ｄ） スペーサー 実施例１と同じ (2) 組立て 実施例１と同じ Ｂ〕測定 (1) 担体に尿素水溶液３０μを滴下し、直ちにスペ
ーサーの粘着剤部で担体を覆う。10分経過後、担体とス
ペーサーを撤去し、光反射率計（測定波長620nm）に
て、指示薬層の光反射率を測定した結果を表２に示す。

(2) 測定（試料量変化） 担体(4)に滴下する尿素水溶液（40mg／dl）の量を変え
て、上記(1)と同様にして測定した結果を表３に示す。

この表から明らかなように、本例の場合試料液の量が20
〜60μの範囲では略等しい値が得られ、試料の量を厳
密に定量しなくても試料中の尿素の濃度を精密・正確に
測定できる。これは、担体(4)の側面が開口しているこ
とによる。

実施例 ３ 唾液中尿素濃度の測定 実施例２において製造した尿素分析具、光反射率計、表
２より得た検量をを使ってヒト唾液の尿素濃度測定を行
ない、ウレアーゼインドフェノール法との相関を調べ
た。結果を以下に示す。

試料の数 48 相関係数 0.982 回帰直線の式 ｙ＝0.99ｘ＋１．７ 回帰直線の式において、ｘはウレアーゼインドフェノー
ル法による測定値、ｙは本発明の尿素分析具による測定
値である。測定結果をよりわかりやすくするため第７図
に表わした。この結果より本発明は試料の性状（ヘマト
クリット値による影響．粘度．pH）に影響なく、水溶液
での標準曲線により、検体中の尿素濃度を測定できるこ
とがわかる。

以上、本発明分析具の好適な実施例について述べたが、
本発明の技術思想の範囲内において更に種々の変更が考
えられる。まず第４図は、支持体(1)の端部近傍にもス
ペーサー(3)の透孔(6)と同様の透孔(8)を設け、両透孔
(6)・(8)により拡散室(5)を形成するとともに、指示薬
層(2)を別途塗布した指示薬担体(9)を該透孔(8)の下部
を覆うように接着したものである。かくすると、拡散室
(5)が深くなるので反応は幾分遅くなるがより安定した
測定値が得られる。

また第５図及び第６図は、スペーサー(3)以外に再拡散
防止用シート(10)を支持体(1)上に設けた他の例を示
す。この再拡散防止用シート(10)は、測定時に担体(4)
及びスペーサー(3)を撤去した後、指示薬層(2)を覆って
指示薬層(2)からのアンモニアガスの再拡散を防止し、
指示薬層(2)の変褪色を防ぐ働きをするもので、大量測
定等反応後直にち測定が出来ない場合に便利である。

本発明の分析具は上述したように、試料を受け入れてア
ンモニアガスを発生する吸収性担体とアンモニアガスに
より変色する指示薬層とを、スペーサーに設けた拡散室
を介して付設したものである。従って、両者の相対する
面積及び距離はスペーサーの厚み及び透孔の大きさによ
り一定にでき且つ透過性膜を用いないため極めて再現性
に優れたものとなる。また全体がストリップ状のため製
造及び使用が極めて簡単であり、更に吸収性担体がカバ
ーシートに覆われるためアンモニアガスの蒸散が少な
く、且つ吸収性担体の側面が開口しているためある一定
範囲であれば試料の量の影響を受けずに、微量の検体を
用いて迅速・簡易・精密・正確なアンモニア及び尿素の
濃度分析が行えるなどの特徴を有するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図乃至第３図は本発明に係る分析具の１例を示すも
ので第１図はスペーサーの一部を支持体から剥離した状
態の斜視図、第２図は第１図におけるＸ−Ｘ線断面図、
第３図は分解斜視図である。第４図から第６図は夫々異
なる他の実施例を示す断面図、第７図は実施例３にて行
なった測定の相関図で、横軸はウレアーゼインドフェノ
ール法による測定値、縦軸は本分析具による測定値で、
単位はいずれも（mg／dl）である。 １……支持体 ２……指示薬層 ３……スペーサー ４……担体 ５……拡散室 ６・８……透孔 ７……粘着剤 ９……指示薬担体 １０……再拡散防止用シート

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】試料中のアンモニア、又は試料中の尿素が
   分解して生じたアンモニアをガス化するアルカリ性緩衝
   剤を含む担体、支持体上に直接又は間接的に施こされた
   アンモニアガスを検出する指示薬層及び、担体と指示薬
   層の間に位置するスペーサーを含み、該スペーサーに
   は、担体より指示薬層側へアンモニアガスが拡散できる
   面積及び拡散したアンモニアガスと接触できる指示薬層
   の面積を一定にできる透孔を設け、且つ該スペーサー
   は、指示薬層と剥離可能に固着され、その延長された端
   部に接着剤層を設けて担体の上面を覆うカバーシートと
   して構成されたことを特徴とするアンモニアおよび尿素
   の分析具。