JPH0595787A - ホスホグリセリン酸キナ−ゼ遺伝子プロモ−タ−、 同タ−ミネ−タ−または／及びこれらからなる 遺伝子発現用ユニツト、並びに、ホスホグリセリ ン酸キナ−ゼのゲノム遺伝子及びｃＤＮＡ遺伝子 - Google Patents
ホスホグリセリン酸キナ−ゼ遺伝子プロモ−タ−、 同タ−ミネ−タ−または／及びこれらからなる 遺伝子発現用ユニツト、並びに、ホスホグリセリ ン酸キナ−ゼのゲノム遺伝子及びｃＤＮＡ遺伝子Info
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- JPH0595787A JPH0595787A JP3284117A JP28411791A JPH0595787A JP H0595787 A JPH0595787 A JP H0595787A JP 3284117 A JP3284117 A JP 3284117A JP 28411791 A JP28411791 A JP 28411791A JP H0595787 A JPH0595787 A JP H0595787A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は、アスペルギルス・オリゼー由来の
ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子プロモーター、同タ
ーミネーターまたは／及びこれらからなる遺伝子発現用
ユニット、並びに、ホスホグリセリン酸キナーゼのゲノ
ム遺伝子及びｃＤＮＡ遺伝子に関するものである。 【効果】 該キナーゼの大量生産が可能となるだけでな
く、特に該発現用ユニットを利用することによって各種
有用物質を遺伝子工学により効率的に生産することがで
きる。
ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子プロモーター、同タ
ーミネーターまたは／及びこれらからなる遺伝子発現用
ユニット、並びに、ホスホグリセリン酸キナーゼのゲノ
ム遺伝子及びｃＤＮＡ遺伝子に関するものである。 【効果】 該キナーゼの大量生産が可能となるだけでな
く、特に該発現用ユニットを利用することによって各種
有用物質を遺伝子工学により効率的に生産することがで
きる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規なアスペルギルス
・オリゼー由来のホスホグリセリン酸キナーゼのプロモ
ーター、同ターミネーター、または／及びこれらからな
る遺伝子発現用ユニット、並びに、ホスホグリセリン酸
キナーゼのゲノム遺伝子、ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの遺
伝子に関する。
・オリゼー由来のホスホグリセリン酸キナーゼのプロモ
ーター、同ターミネーター、または／及びこれらからな
る遺伝子発現用ユニット、並びに、ホスホグリセリン酸
キナーゼのゲノム遺伝子、ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの遺
伝子に関する。
【０００２】本発明は、ホスホグリセリン酸キナーゼの
大量生産に利用できるだけでなく、上記プロモーター、
ターミネーター、または／及びこれらからなる発現ユニ
ットを適当なベクターに接続することによりかびその他
微生物における有用な発現ベクターを構築することが可
能であるので、かび等の宿主−ベクター系を用いる各種
有用物質の生産にも利用することができ、したがって本
発明は、該酵素生産のほか、その他遺伝子工学による生
理活性物質等各種有用物質の生産に大いに寄与貢献する
ものである。
大量生産に利用できるだけでなく、上記プロモーター、
ターミネーター、または／及びこれらからなる発現ユニ
ットを適当なベクターに接続することによりかびその他
微生物における有用な発現ベクターを構築することが可
能であるので、かび等の宿主−ベクター系を用いる各種
有用物質の生産にも利用することができ、したがって本
発明は、該酵素生産のほか、その他遺伝子工学による生
理活性物質等各種有用物質の生産に大いに寄与貢献する
ものである。
【０００３】
【従来の技術】遺伝子工学を用いた物質生産には、外来
遺伝子を効率よく発現し、活性のある蛋白質を多量に入
手することが、産業上極めて重要である。このための宿
主としては、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞等が検討
されてきたが、各々長所と短所があり、特に転写後の修
飾を受けるタンパク質や糖鎖を有するタンパク質、ある
種の立体構造を有するタンパク質等は、大腸菌、枯草
菌、酵母では不適当であることが多い。また動物細胞で
はその培養コストが高くなり、現実の製造では問題が多
い。そこで、かびを宿主とした発現系が注目されてきて
いる。例えば、Ｕｐｓｈａｌｌ等の報告Ｂｉｏ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５，１３０１−１３０４（１
９８７）によれば、大腸菌や酵母では活性のある形で発
現されなかったＴＰＡ（Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｌａｓｍｉｎ
ｏｇｅｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ）が、かび（Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）では活性を持った形
で発現するとされている。
遺伝子を効率よく発現し、活性のある蛋白質を多量に入
手することが、産業上極めて重要である。このための宿
主としては、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞等が検討
されてきたが、各々長所と短所があり、特に転写後の修
飾を受けるタンパク質や糖鎖を有するタンパク質、ある
種の立体構造を有するタンパク質等は、大腸菌、枯草
菌、酵母では不適当であることが多い。また動物細胞で
はその培養コストが高くなり、現実の製造では問題が多
い。そこで、かびを宿主とした発現系が注目されてきて
いる。例えば、Ｕｐｓｈａｌｌ等の報告Ｂｉｏ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５，１３０１−１３０４（１
９８７）によれば、大腸菌や酵母では活性のある形で発
現されなかったＴＰＡ（Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｌａｓｍｉｎ
ｏｇｅｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ）が、かび（Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）では活性を持った形
で発現するとされている。
【０００４】そしてこのような状況下、かびの宿主−ベ
クター系において、有効に機能するプロモーター、ター
ミネーター等の開発は重要な意味を持ってきており、既
にアスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼやアスペ
ルギルス・オリゼーのα−アミラーゼ遺伝子のプロモー
ターの利用が報告されている。しかし、これらはすべて
デンプンやマルトースなどのオリゴ糖によって誘導的に
発現するものである。
クター系において、有効に機能するプロモーター、ター
ミネーター等の開発は重要な意味を持ってきており、既
にアスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼやアスペ
ルギルス・オリゼーのα−アミラーゼ遺伝子のプロモー
ターの利用が報告されている。しかし、これらはすべて
デンプンやマルトースなどのオリゴ糖によって誘導的に
発現するものである。
【０００５】一方、通常のグルコースなどを炭素源とす
る培地で非誘導的に高発現する遺伝子として、解糖系の
酵素の一つであるホスホグリセリン酸キナーゼ（ＥＣ：
２．７．２．３． ＡＴＰ：３−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｄ−
ｇｌｙｃｅｒａｔｅ １−ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆ
ｅｒａｓｅ）の遺伝子がある。本酵素は、１，３−ビス
ホスホグリセリンとＡＤＰから３−ホスホグリセリン酸
とＡＴＰを生ずる反応及びその逆反応を触媒する酵素で
ある。また、本酵素は、非常に発現量の高い酵素の一つ
であることが知られており、酵母サッカロミセス・セレ
ビシェでは、ｍＲＮＡ並びに細胞質内の可溶性タンパク
質の５％を（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，３２９−３４１（１９９０））
占めていることが報告されている。
る培地で非誘導的に高発現する遺伝子として、解糖系の
酵素の一つであるホスホグリセリン酸キナーゼ（ＥＣ：
２．７．２．３． ＡＴＰ：３−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｄ−
ｇｌｙｃｅｒａｔｅ １−ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆ
ｅｒａｓｅ）の遺伝子がある。本酵素は、１，３−ビス
ホスホグリセリンとＡＤＰから３−ホスホグリセリン酸
とＡＴＰを生ずる反応及びその逆反応を触媒する酵素で
ある。また、本酵素は、非常に発現量の高い酵素の一つ
であることが知られており、酵母サッカロミセス・セレ
ビシェでは、ｍＲＮＡ並びに細胞質内の可溶性タンパク
質の５％を（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，３２９−３４１（１９９０））
占めていることが報告されている。
【０００６】従来、黄麹菌の一種であるアスペルギルス
・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）
由来のホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子の構造につい
ては、まったく未知であり、また、該遺伝子の単離すら
されていないのが実状であった。ましてや、そのプロモ
ーター、ターミネーター等該遺伝子の発現システムにつ
いては、その解明の糸口すらないというのが技術の実状
であった。
・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）
由来のホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子の構造につい
ては、まったく未知であり、また、該遺伝子の単離すら
されていないのが実状であった。ましてや、そのプロモ
ーター、ターミネーター等該遺伝子の発現システムにつ
いては、その解明の糸口すらないというのが技術の実状
であった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、麹菌
アスペルギルス・オリゼーのホスホグリセリン酸キナー
ゼのゲノム遺伝子並びにそのｃＤＮＡを得てその構造を
解析して当該ゲノム遺伝子のプロモーター及びターミネ
ーター領域を決定し、当該ゲノム遺伝子から、かびの宿
主−ベクター系において有効に機能するプロモーター、
ターミネーター及びこれらのプロモーターまたは／及び
ターミネーターからなる遺伝子発現用ユニットを新たに
取得、提供することにある。
アスペルギルス・オリゼーのホスホグリセリン酸キナー
ゼのゲノム遺伝子並びにそのｃＤＮＡを得てその構造を
解析して当該ゲノム遺伝子のプロモーター及びターミネ
ーター領域を決定し、当該ゲノム遺伝子から、かびの宿
主−ベクター系において有効に機能するプロモーター、
ターミネーター及びこれらのプロモーターまたは／及び
ターミネーターからなる遺伝子発現用ユニットを新たに
取得、提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、アスペルギルス・オリゼーの染色体ＤＮＡから
ホスホグリセリン酸キナーゼのゲノム遺伝子を新たに得
て、さらにアスペルギルス・オリゼーのｍＲＮＡからｃ
ＤＮＡを得、これよりホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝
子のｃＤＮＡを得て、その構造を解析し、当該ゲノム遺
伝子５′側上流にあるプロモーター領域及び３′側下流
にあるターミネーター領域の解析に成功し、本発明を完
成したものである。以下、本発明について詳細に説明す
るが、本発明に用いたゲノムＤＮＡ及びｍＲＮＡの供与
体は、アスペルギルス・オリゼーであり、、具体的には
例えばＲＩＢ４０株である。
の結果、アスペルギルス・オリゼーの染色体ＤＮＡから
ホスホグリセリン酸キナーゼのゲノム遺伝子を新たに得
て、さらにアスペルギルス・オリゼーのｍＲＮＡからｃ
ＤＮＡを得、これよりホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝
子のｃＤＮＡを得て、その構造を解析し、当該ゲノム遺
伝子５′側上流にあるプロモーター領域及び３′側下流
にあるターミネーター領域の解析に成功し、本発明を完
成したものである。以下、本発明について詳細に説明す
るが、本発明に用いたゲノムＤＮＡ及びｍＲＮＡの供与
体は、アスペルギルス・オリゼーであり、、具体的には
例えばＲＩＢ４０株である。
【０００９】先ずはじめにゲノムＤＮＡについて説明す
ると、本菌株からゲノムＤＮＡを抽出するのには、例え
ばＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５１，
３２３−３２８（１９８７）に記載されたアスペルギル
ス・オリゼーの染色体ＤＮＡの抽出に関する方法に準じ
て行われる。
ると、本菌株からゲノムＤＮＡを抽出するのには、例え
ばＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５１，
３２３−３２８（１９８７）に記載されたアスペルギル
ス・オリゼーの染色体ＤＮＡの抽出に関する方法に準じ
て行われる。
【００１０】次に、得られたゲノムＤＮＡを適当な制限
酵素で処理し、部分分解を行った後、蔗糖密度勾配超遠
心法で分画して５．０−１５．０Ｋｂｐの分画を得る。
同じ接着末端を生じさせる制限酵素で処理したプラスミ
ドに制限酵素で処理したプラスミドベクター（例えば、
ｐＲＢＧ−１）にＤＮＡ断片を挿入して染色体遺伝子ラ
イブラリーを作製する。また、サブクローンにはＭｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５
３，３−１１（１９８７）に記載のｐＵＣ１１８、ｐＵ
Ｃ１１９を用いた。
酵素で処理し、部分分解を行った後、蔗糖密度勾配超遠
心法で分画して５．０−１５．０Ｋｂｐの分画を得る。
同じ接着末端を生じさせる制限酵素で処理したプラスミ
ドに制限酵素で処理したプラスミドベクター（例えば、
ｐＲＢＧ−１）にＤＮＡ断片を挿入して染色体遺伝子ラ
イブラリーを作製する。また、サブクローンにはＭｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５
３，３−１１（１９８７）に記載のｐＵＣ１１８、ｐＵ
Ｃ１１９を用いた。
【００１１】上記で得られた染色体遺伝子ライブラリー
から当該遺伝子の単離にあたっては、アスペルギルス・
オリゼーと同属のアスペルギルス・ニドランスのホスホ
グリセリン酸キナーゼ遺伝子のＤＮＡ配列（Ｇｅｎｅ，
Ｖｏｌ．４４，９７−１０５（１９８６））に基づいて
合成オリゴＤＮＡプローブを作製し、それをプローブに
用いてコロニーハイブリダイゼーションを行いアスペル
ギルス・オリゼーのホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子
のＤＮＡをクローニングする。得られたＤＮＡ断片は、
図１の制限酵素断片地図を有していた。
から当該遺伝子の単離にあたっては、アスペルギルス・
オリゼーと同属のアスペルギルス・ニドランスのホスホ
グリセリン酸キナーゼ遺伝子のＤＮＡ配列（Ｇｅｎｅ，
Ｖｏｌ．４４，９７−１０５（１９８６））に基づいて
合成オリゴＤＮＡプローブを作製し、それをプローブに
用いてコロニーハイブリダイゼーションを行いアスペル
ギルス・オリゼーのホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子
のＤＮＡをクローニングする。得られたＤＮＡ断片は、
図１の制限酵素断片地図を有していた。
【００１２】上記で得られたＤＮＡ断片をｐＵＣ１１９
にサブクローニングして新たにｐＰＧＦを作製する。つ
いで、アスペルギルス・オリゼーのベクターとして、例
えばａｒｇＢ遺伝子をマーカーに持つｐＭＴＡＧ１（Ａ
ｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５５，１９
３９−１９４１（１９９１））からａｒｇＢ遺伝子断片
を単離し、上記のｐＰＧＦに挿入する。このプラスミド
ＤＮＡをａｒｇＢ欠損株のアスペルギルス・オリゼーに
移入し形質転換体を得る。ａｒｇＢ欠損株として具体的
にはＭ−２−３株（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，Ｖｏｌ．５１，２５４９（１９８９））が挙げら
れる。形質転換方法としては公知の方法例えばＡｇｒｉ
ｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５１，３２３−３
２８（１９８７）に記載された方法あるいはこれに準じ
た方法がとられる。この方法によって形質転換体を得
る。
にサブクローニングして新たにｐＰＧＦを作製する。つ
いで、アスペルギルス・オリゼーのベクターとして、例
えばａｒｇＢ遺伝子をマーカーに持つｐＭＴＡＧ１（Ａ
ｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５５，１９
３９−１９４１（１９９１））からａｒｇＢ遺伝子断片
を単離し、上記のｐＰＧＦに挿入する。このプラスミド
ＤＮＡをａｒｇＢ欠損株のアスペルギルス・オリゼーに
移入し形質転換体を得る。ａｒｇＢ欠損株として具体的
にはＭ−２−３株（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，Ｖｏｌ．５１，２５４９（１９８９））が挙げら
れる。形質転換方法としては公知の方法例えばＡｇｒｉ
ｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５１，３２３−３
２８（１９８７）に記載された方法あるいはこれに準じ
た方法がとられる。この方法によって形質転換体を得
る。
【００１３】この形質転換体並びに宿主のアスペルギル
ス・オリゼーのホスホグリセリン酸キナーゼの酵素につ
いては、公知の方法例えば、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．３４，７６５
−７７１（１９９１）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｅｎｚ
ｙｍａｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｖｏｌ．２，２ｎｄ
ｅｄｎ．，ｐ５０２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７４）に記載の方法に準拠
して菌体からの酵素の粗抽出及び酵素活性の測定を行っ
た。
ス・オリゼーのホスホグリセリン酸キナーゼの酵素につ
いては、公知の方法例えば、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．３４，７６５
−７７１（１９９１）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｅｎｚ
ｙｍａｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｖｏｌ．２，２ｎｄ
ｅｄｎ．，ｐ５０２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７４）に記載の方法に準拠
して菌体からの酵素の粗抽出及び酵素活性の測定を行っ
た。
【００１４】また、本発明において、アスペルギルス・
オリゼーからのＲＮＡの抽出及び、それに基づくｃＤＮ
Ａライブラリーの作製は次に記載する方法による。
オリゼーからのＲＮＡの抽出及び、それに基づくｃＤＮ
Ａライブラリーの作製は次に記載する方法による。
【００１５】即ち、アスペルギルス・オリゼーからＤＮ
Ａ，Ｖｏｌ．２，３２９−３３５（１９８３）に記載の
方法に準拠した方法により全ＲＮＡを抽出する。得られ
た全ＲＮＡから蛋白質核酸酵素，Ｖｏｌ．３５，２２５
７−２２６５（１９９０）に記載の方法によりポリＡ含
有ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）−ラテックス（日本合成ゴム
（株）製）を用いて精製しｍＲＮＡを得る。このｍＲＮ
ＡからｃＤＮＡをＧｅｎｅ，Ｖｏｌ．２５，２６３−２
６９（１９８３）に記載の方法で合成した。
Ａ，Ｖｏｌ．２，３２９−３３５（１９８３）に記載の
方法に準拠した方法により全ＲＮＡを抽出する。得られ
た全ＲＮＡから蛋白質核酸酵素，Ｖｏｌ．３５，２２５
７−２２６５（１９９０）に記載の方法によりポリＡ含
有ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）−ラテックス（日本合成ゴム
（株）製）を用いて精製しｍＲＮＡを得る。このｍＲＮ
ＡからｃＤＮＡをＧｅｎｅ，Ｖｏｌ．２５，２６３−２
６９（１９８３）に記載の方法で合成した。
【００１６】上記で得られた遺伝子ライブラリーから、
当該ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子ｃＤＮＡのクロ
ーニングは、前述のアスペルギルス・オリゼーのゲノム
遺伝子の塩基配列の情報並びにアスペルギルス・オリゼ
ーと同属のアスペルギルス・ニドランスのホスホグリセ
リン酸キナーゼ遺伝子のＤＮＡ配列（Ｇｅｎｅ，Ｖｏ
ｌ．４４，９７−１０５（１９８６））の情報から転写
開始点を含む順方向のプライマーと転写終止点を含む逆
方向のプライマーを合成し、上記ｃＤＮＡ遺伝子ライブ
ラリーを鋳型としたＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ法）により行った。なお
この際に実際にはＤＮＡ組み換え操作に便利なように、
この配列の両端に既知の制限酵素認識配列を付加して作
製したものを用いることが可能である。
当該ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子ｃＤＮＡのクロ
ーニングは、前述のアスペルギルス・オリゼーのゲノム
遺伝子の塩基配列の情報並びにアスペルギルス・オリゼ
ーと同属のアスペルギルス・ニドランスのホスホグリセ
リン酸キナーゼ遺伝子のＤＮＡ配列（Ｇｅｎｅ，Ｖｏ
ｌ．４４，９７−１０５（１９８６））の情報から転写
開始点を含む順方向のプライマーと転写終止点を含む逆
方向のプライマーを合成し、上記ｃＤＮＡ遺伝子ライブ
ラリーを鋳型としたＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ法）により行った。なお
この際に実際にはＤＮＡ組み換え操作に便利なように、
この配列の両端に既知の制限酵素認識配列を付加して作
製したものを用いることが可能である。
【００１７】ＤＮＡの塩基配列は、公知の方法（例え
ば、キロシークエンス法、ダイデオキシ法）によって解
析した。
ば、キロシークエンス法、ダイデオキシ法）によって解
析した。
【００１８】上記の様にして取得、構造決定された本発
明のアスペルギルス・オリゼーのホスホグリセリン酸キ
ナーゼの遺伝子ｃＤＮＡに含まれるコーティング領域
は、配列表の配列番号４の塩基配列を有する。また、ゲ
ノム遺伝子は、図１の制限酵素断片地図及び配列表の配
列番号３の塩基配列を有し、以下本発明のプロモータ
ー、ターミネーター領域のほか、２つのイントロン配列
を有している。（図中、ＩＮＴ１、ＩＮＴ２と表示）
明のアスペルギルス・オリゼーのホスホグリセリン酸キ
ナーゼの遺伝子ｃＤＮＡに含まれるコーティング領域
は、配列表の配列番号４の塩基配列を有する。また、ゲ
ノム遺伝子は、図１の制限酵素断片地図及び配列表の配
列番号３の塩基配列を有し、以下本発明のプロモータ
ー、ターミネーター領域のほか、２つのイントロン配列
を有している。（図中、ＩＮＴ１、ＩＮＴ２と表示）
【００１９】また、本発明のプロモーターは、上記ゲノ
ム遺伝子の５′側上流域に存在し、１６３２ｂｐのＤＮ
Ａを有している。その塩基配列を配列表の配列番号１に
示すが、これは配列番号３のゲノム遺伝子の塩基配列番
号１−１６３２に相当するものである。
ム遺伝子の５′側上流域に存在し、１６３２ｂｐのＤＮ
Ａを有している。その塩基配列を配列表の配列番号１に
示すが、これは配列番号３のゲノム遺伝子の塩基配列番
号１−１６３２に相当するものである。
【００２０】更に本発明のターミネーターは、上記ゲノ
ム遺伝子が３′側下流域に存在し、６１７ｂｐのＤＮＡ
を有している。その塩基配列を配列表の配列番号２に示
すが、これは配列番号３のゲノム遺伝子の塩基配列中塩
基番号３０６９−３６３５に相当するものである。
ム遺伝子が３′側下流域に存在し、６１７ｂｐのＤＮＡ
を有している。その塩基配列を配列表の配列番号２に示
すが、これは配列番号３のゲノム遺伝子の塩基配列中塩
基番号３０６９−３６３５に相当するものである。
【００２１】このプロモーターあるいはターミネーター
を適当なプラスミドベクターに接続することによりアス
ペルギルス・オリゼーでの発現用ベクターとして利用可
能である。
を適当なプラスミドベクターに接続することによりアス
ペルギルス・オリゼーでの発現用ベクターとして利用可
能である。
【００２２】そして、これらの本発明のプロモーターの
全長を有するか、あるいはその一部を欠損させたＤＮＡ
配列を有する領域、または／及び、ターミネーターの全
長を有するか、あるいはその一部を欠損させたＤＮＡ配
列を有する領域は、これら、あるいは別起源のプロモー
ターまたは／及びターミネーター（例えば、α−アミラ
ーゼのプロモーター、ターミネーター）とセットにして
遺伝子発現用ユニットとして用いることができる。
全長を有するか、あるいはその一部を欠損させたＤＮＡ
配列を有する領域、または／及び、ターミネーターの全
長を有するか、あるいはその一部を欠損させたＤＮＡ配
列を有する領域は、これら、あるいは別起源のプロモー
ターまたは／及びターミネーター（例えば、α−アミラ
ーゼのプロモーター、ターミネーター）とセットにして
遺伝子発現用ユニットとして用いることができる。
【００２３】得られた発現用ベクターに例えば、ヒトリ
ゾチーム、キモシン、インターフェロンα、ヒトインタ
ーフェロンγ及びその誘導体等の遺伝子等を挿入し、さ
らに例えば、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギル
ス・ニガー、アスペルギルス・ニドランス、アスペルギ
ルス・アワモリ、アスペルギルス・ソヤー等の宿主を形
質転換し、該形質転換体で培養することにより目的化合
物を効率的に得ることができる。
ゾチーム、キモシン、インターフェロンα、ヒトインタ
ーフェロンγ及びその誘導体等の遺伝子等を挿入し、さ
らに例えば、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギル
ス・ニガー、アスペルギルス・ニドランス、アスペルギ
ルス・アワモリ、アスペルギルス・ソヤー等の宿主を形
質転換し、該形質転換体で培養することにより目的化合
物を効率的に得ることができる。
【００２４】
【発明の効果】本発明により、ホスホグリセリン酸キナ
ーゼプロモーター、ターミネーター、または／及び、こ
れらからなる発現用ユニット並びにホスホグリセリン酸
キナーゼのｃＤＮＡ及びゲノム遺伝子を新たに提供する
ことができた。特に上記プロモーター、ターミネーター
または／及びこれらからなる発現用ユニットは適当なプ
ラスミドベクターに接続することにより、アスペルギル
ス・オリゼー、アスペルギルス・ニガー、アスペルギル
ス・ニドランス、アスペルギルス・アワモリ、アスペル
ギルス・ソヤー等のかびにおける有用な発現ベクターを
構築することが可能であり、本発明は、かびの宿主−ベ
クター系を用いる有用物質の生産において大いに寄与す
るものである。
ーゼプロモーター、ターミネーター、または／及び、こ
れらからなる発現用ユニット並びにホスホグリセリン酸
キナーゼのｃＤＮＡ及びゲノム遺伝子を新たに提供する
ことができた。特に上記プロモーター、ターミネーター
または／及びこれらからなる発現用ユニットは適当なプ
ラスミドベクターに接続することにより、アスペルギル
ス・オリゼー、アスペルギルス・ニガー、アスペルギル
ス・ニドランス、アスペルギルス・アワモリ、アスペル
ギルス・ソヤー等のかびにおける有用な発現ベクターを
構築することが可能であり、本発明は、かびの宿主−ベ
クター系を用いる有用物質の生産において大いに寄与す
るものである。
【００２５】このように本発明によれば、ホスホグリセ
リン酸キナーゼを効率的に生産できることはもちろんの
こと、本発明に係る発現用ユニットを利用することによ
って、生理活性物質等各種の有用物質を効率的に生産す
ることも可能となり、遺伝子工学の技術分野において本
発明は重要な役割を果すものである。
リン酸キナーゼを効率的に生産できることはもちろんの
こと、本発明に係る発現用ユニットを利用することによ
って、生理活性物質等各種の有用物質を効率的に生産す
ることも可能となり、遺伝子工学の技術分野において本
発明は重要な役割を果すものである。
【００２６】以下に本発明を実施例により更に詳しく説
明するが、本発明は特にこれらの実施例のみに限定され
るものではない。
明するが、本発明は特にこれらの実施例のみに限定され
るものではない。
【００２７】
【実施例１．アスペルギルス・オリゼー染色体ＤＮＡの
遺伝子ライブラリーの作製】アスペルギルス・オリゼー
の染色体ＤＮＡ抽出は、以下に記した方法で行った。ま
ず、アスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０株の分生子を
スラントから一白金耳とり、１００ｍｌのＤＰ培地（１
％ ポリペプトン、２％ デキストリン、０．５％ Ｋ
Ｈ2ＰＯ4、０．１％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）に植菌し、
３０℃で３日間培養した。集菌は、ガラスフィルター３
Ｇ１で濾過することにより行い、集めた菌体は、蒸留水
にて洗浄し、更にＴＥバッファー（１０ｍＭトリス−塩
酸（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄する。濾
紙で水分を除去した菌体をあらかじめ冷却した乳鉢を用
いて液体窒素中で擦り潰した。この菌体に１％ＳＤＳを
含むＴＥバッファー１０ｍｌを加え懸濁後、５分室温で
放置した。フェノール・クロロホルム処理を３回行いエ
タノール沈澱を行った。沈澱物を５μｇ／ｍｌＲＮａｓ
ｅを含むＴＥバッファー１ｍｌに懸濁して３７℃で３０
分間反応した。フェノール・クロロホルム処理後の溶液
に２．５倍量のエタノールを添加し、界面に生じた染色
体ＤＮＡをパスツールピペットで巻き取った。巻き取っ
たＤＮＡは、７０％エタノールにリンスし、乾燥後、Ｔ
Ｅバッファーに溶解し、アスペルギルス・オリゼーの染
色体ＤＮＡを調製した。本ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで
部分分解を行った後、蔗糖密度勾配超遠心法で分画し
て、５．０−１５．０Ｋｂｐの分画を得る。この得られ
たアスペルギルス・オリゼー染色体ＤＮＡのＰｓｔＩ断
片をプラスミドベクターｐＲＢＧ１のＰｓｔＩサイトに
導入して、アスペルギルス・オリゼーの染色体ＤＮＡの
遺伝子ライブラリーを構築した。
遺伝子ライブラリーの作製】アスペルギルス・オリゼー
の染色体ＤＮＡ抽出は、以下に記した方法で行った。ま
ず、アスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０株の分生子を
スラントから一白金耳とり、１００ｍｌのＤＰ培地（１
％ ポリペプトン、２％ デキストリン、０．５％ Ｋ
Ｈ2ＰＯ4、０．１％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）に植菌し、
３０℃で３日間培養した。集菌は、ガラスフィルター３
Ｇ１で濾過することにより行い、集めた菌体は、蒸留水
にて洗浄し、更にＴＥバッファー（１０ｍＭトリス−塩
酸（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄する。濾
紙で水分を除去した菌体をあらかじめ冷却した乳鉢を用
いて液体窒素中で擦り潰した。この菌体に１％ＳＤＳを
含むＴＥバッファー１０ｍｌを加え懸濁後、５分室温で
放置した。フェノール・クロロホルム処理を３回行いエ
タノール沈澱を行った。沈澱物を５μｇ／ｍｌＲＮａｓ
ｅを含むＴＥバッファー１ｍｌに懸濁して３７℃で３０
分間反応した。フェノール・クロロホルム処理後の溶液
に２．５倍量のエタノールを添加し、界面に生じた染色
体ＤＮＡをパスツールピペットで巻き取った。巻き取っ
たＤＮＡは、７０％エタノールにリンスし、乾燥後、Ｔ
Ｅバッファーに溶解し、アスペルギルス・オリゼーの染
色体ＤＮＡを調製した。本ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで
部分分解を行った後、蔗糖密度勾配超遠心法で分画し
て、５．０−１５．０Ｋｂｐの分画を得る。この得られ
たアスペルギルス・オリゼー染色体ＤＮＡのＰｓｔＩ断
片をプラスミドベクターｐＲＢＧ１のＰｓｔＩサイトに
導入して、アスペルギルス・オリゼーの染色体ＤＮＡの
遺伝子ライブラリーを構築した。
【００２８】
【実施例２．アスペルギルス・オリゼーの染色体ＤＮＡ
の遺伝子ライブラリーからのホスホグリセリン酸キナー
ゼ遺伝子のクローニング】一般に、すでに他生物で遺伝
子の塩基配列が判明している場合その遺伝子を別種生物
でクローニングしようとする場合、その塩基情報の良く
保存されていると思われる配列をプローブとして用いハ
イブリダイゼーションによりクローニングを行う。本発
明の実施において、既に明らかになっているホスホグリ
セリン酸キナーゼ遺伝子の情報を元にして、例えば、以
下の化１に示したアスペルギルス・オリゼーと同属のア
スペルギルス・ニドランスのホスホグリセリン酸キナー
ゼ遺伝子（Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．４４，９７−１０５（１
９８６））のＮ末端から４３−５２番目のアミノ酸に相
当する２９塩基の塩基をプローブとしてアプライドバイ
オシステムズ（株）のＤＮＡ合成機を用いて作製し、公
知の方法（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ，２ｎｄ，ｅｄｎ．，ｐ１２．２１−１２．２３，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ（１９８９））に従って、コロニーハイブリダイ
ゼーションを行い、約１５，０００のコロニーから５個
の陽性クローンを得た。
の遺伝子ライブラリーからのホスホグリセリン酸キナー
ゼ遺伝子のクローニング】一般に、すでに他生物で遺伝
子の塩基配列が判明している場合その遺伝子を別種生物
でクローニングしようとする場合、その塩基情報の良く
保存されていると思われる配列をプローブとして用いハ
イブリダイゼーションによりクローニングを行う。本発
明の実施において、既に明らかになっているホスホグリ
セリン酸キナーゼ遺伝子の情報を元にして、例えば、以
下の化１に示したアスペルギルス・オリゼーと同属のア
スペルギルス・ニドランスのホスホグリセリン酸キナー
ゼ遺伝子（Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．４４，９７−１０５（１
９８６））のＮ末端から４３−５２番目のアミノ酸に相
当する２９塩基の塩基をプローブとしてアプライドバイ
オシステムズ（株）のＤＮＡ合成機を用いて作製し、公
知の方法（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ，２ｎｄ，ｅｄｎ．，ｐ１２．２１−１２．２３，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ（１９８９））に従って、コロニーハイブリダイ
ゼーションを行い、約１５，０００のコロニーから５個
の陽性クローンを得た。
【００２９】
【化１】
【００３０】得られた５個の陽性クローンのプラスミド
には、すべて共通の３．６ＫｂｐのＰｓｔＩ断片を含ん
でいた。いくつかの制限酵素で消化後、アガロースゲル
電気泳動により断片パターンを観察することによりそれ
らの制限酵素断片地図を図１に示す。前述のプローブを
用い陽性クローンに対してサザンハイブリダイゼーショ
ンを行ったところ、図中ＳａｌＩとＸｈｏＩで切り出さ
れる０．８Ｋｂｐの断片とハイブリダイズしたため、こ
の共通に含まれる３．６ＫｂｐのＰｓｔＩ断片はホスホ
グリセリン酸キナーゼのゲノム遺伝子を十分にコードし
ていると判断した。
には、すべて共通の３．６ＫｂｐのＰｓｔＩ断片を含ん
でいた。いくつかの制限酵素で消化後、アガロースゲル
電気泳動により断片パターンを観察することによりそれ
らの制限酵素断片地図を図１に示す。前述のプローブを
用い陽性クローンに対してサザンハイブリダイゼーショ
ンを行ったところ、図中ＳａｌＩとＸｈｏＩで切り出さ
れる０．８Ｋｂｐの断片とハイブリダイズしたため、こ
の共通に含まれる３．６ＫｂｐのＰｓｔＩ断片はホスホ
グリセリン酸キナーゼのゲノム遺伝子を十分にコードし
ていると判断した。
【００３１】
【実施例３．アスペルギルス・オリゼーにおけるホスホ
グリセリン酸キナーゼ遺伝子のコピー数の調査】本発明
のホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のアスペルギルス
・オリゼーにおけるコピー数を調べるために以下に記す
る実験を行った。
グリセリン酸キナーゼ遺伝子のコピー数の調査】本発明
のホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のアスペルギルス
・オリゼーにおけるコピー数を調べるために以下に記す
る実験を行った。
【００３２】前項で得られた３．６ＫｂｐのＰｓｔＩ断
片をｐＵＣ１１９のＰｓｔＩサイトに挿入することによ
り新たにｐＰＧＦを作製した。アスペルギルス・オリゼ
ーＲＩＢ４０株の染色体ＤＮＡをいくつかの制限酵素
（例えば、ＥｃｏＲＩ，ＰｓｔＩなど）で消化後、アガ
ロースゲル電気泳動にて分離した。泳動後、サザントラ
ンスファー法により、ＤＮＡをナイロンメンブレンフィ
ルター（アマシャム（株）製）にブロッティングした。
このメンブレンフィルターに対して、染色体ＤＮＡを消
化した制限酵素と同じ酵素でｐＰＧＦを消化した断片を
プローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行い、
パーオキシダーゼが触媒するルミノールの酸化反応によ
るケミルミネセンスを検出するという原理を応用したア
マシャム（株）のＥＣＬ検出システムによりバンドの検
出を行なった。主な６塩基認識の制限酵素での消化物と
ハイブリダイズしたバンドは一本だけであることが判明
し、アスペルギルス・オリゼーには本クローンのホスホ
グリセリン酸キナーゼ遺伝子が一つだけ存在することを
明らかにした。
片をｐＵＣ１１９のＰｓｔＩサイトに挿入することによ
り新たにｐＰＧＦを作製した。アスペルギルス・オリゼ
ーＲＩＢ４０株の染色体ＤＮＡをいくつかの制限酵素
（例えば、ＥｃｏＲＩ，ＰｓｔＩなど）で消化後、アガ
ロースゲル電気泳動にて分離した。泳動後、サザントラ
ンスファー法により、ＤＮＡをナイロンメンブレンフィ
ルター（アマシャム（株）製）にブロッティングした。
このメンブレンフィルターに対して、染色体ＤＮＡを消
化した制限酵素と同じ酵素でｐＰＧＦを消化した断片を
プローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行い、
パーオキシダーゼが触媒するルミノールの酸化反応によ
るケミルミネセンスを検出するという原理を応用したア
マシャム（株）のＥＣＬ検出システムによりバンドの検
出を行なった。主な６塩基認識の制限酵素での消化物と
ハイブリダイズしたバンドは一本だけであることが判明
し、アスペルギルス・オリゼーには本クローンのホスホ
グリセリン酸キナーゼ遺伝子が一つだけ存在することを
明らかにした。
【００３３】
【実施例４．染色体ＤＮＡから単離したアスペルギルス
・オリゼーのホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のＤＮ
Ａ配列】前項で得たｐＰＧＦについて、いくつかの制限
酵素で消化後、アガロースゲル電気泳動により断片パタ
ーンを観察することによりそれらの制限酵素断片地図を
作成した。その結果を図１に示す。そこで図に示すよう
に適当な制限酵素部位、並びに以下に記するｐＰＧＦの
デレーションクローンを用いてＤＮＡ配列の決定を行っ
た。デレーションクローンは、Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．２
８，３５１−３５９（１９８４）及びＧｅｎｅ，Ｖｏ
ｌ．３３，１０３−１１９（１９８５）の方法に従って
ｐＰＧＦ上の３．６Ｋｂｐ挿入部分をエキソヌクレアー
ゼIII及び、マングビーンヌクレアーゼで処理して短鎖
化し、当該挿入断片の一部が脱落し、異なる鎖長を有す
る種々のクローンを作成した。この過程では、キロシー
クエンス用デレーションキット（宝酒造（株））を使用
した。得られた種々のクローンの挿入断片についてジデ
オキシ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２１４，１２０５
−１２１０（１９８１））に従いアプライド バイオシ
ステムズ（株）の自動ＤＮＡシークエンサーを用いてＤ
ＮＡ配列を決定した。その結果、アスペルギルス・オリ
ゼーのホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のコーディン
グ領域及びそのイントロン領域の全部並びに５′側上流
にあるプロモーター領域及び３′側下流域にあるターミ
ネーター領域のＤＮＡ配列について、下記の表１〜表５
で示される配列表の配列番号３に示す配列が見いだされ
た。
・オリゼーのホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のＤＮ
Ａ配列】前項で得たｐＰＧＦについて、いくつかの制限
酵素で消化後、アガロースゲル電気泳動により断片パタ
ーンを観察することによりそれらの制限酵素断片地図を
作成した。その結果を図１に示す。そこで図に示すよう
に適当な制限酵素部位、並びに以下に記するｐＰＧＦの
デレーションクローンを用いてＤＮＡ配列の決定を行っ
た。デレーションクローンは、Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．２
８，３５１−３５９（１９８４）及びＧｅｎｅ，Ｖｏ
ｌ．３３，１０３−１１９（１９８５）の方法に従って
ｐＰＧＦ上の３．６Ｋｂｐ挿入部分をエキソヌクレアー
ゼIII及び、マングビーンヌクレアーゼで処理して短鎖
化し、当該挿入断片の一部が脱落し、異なる鎖長を有す
る種々のクローンを作成した。この過程では、キロシー
クエンス用デレーションキット（宝酒造（株））を使用
した。得られた種々のクローンの挿入断片についてジデ
オキシ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２１４，１２０５
−１２１０（１９８１））に従いアプライド バイオシ
ステムズ（株）の自動ＤＮＡシークエンサーを用いてＤ
ＮＡ配列を決定した。その結果、アスペルギルス・オリ
ゼーのホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のコーディン
グ領域及びそのイントロン領域の全部並びに５′側上流
にあるプロモーター領域及び３′側下流域にあるターミ
ネーター領域のＤＮＡ配列について、下記の表１〜表５
で示される配列表の配列番号３に示す配列が見いだされ
た。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【表２】
【００３６】
【表３】
【００３７】
【表４】
【００３８】
【表５】
【００３９】
【実施例５．アスペルギルス・オリゼーのｃＤＮＡライ
ブラリーの作製】公知の方法（例えばＤＮＡ，Ｖｏｌ．
２，３２９−３３５（１９８３））に準じて、アスペル
ギルス・オリゼーＲＩＢ４０株よりｍＲＮＡを取得し
た。具体的には、アスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０
株を、５００ｍｌ用バッフル付き三角フラスコ中で１０
０ｍｌの培地（２％ マルトース、１％ ポリペプト
ン、０．１％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０５％ ＭｇＳＯ4・
７Ｈ2Ｏ、０．０５％ ＫＣｌ、０．００１％ ＦｅＳ
Ｏ4・７Ｈ2Ｏ）にて３０℃で２日間振とう培養後、ガラ
スフィルター３Ｇ１で集菌し、これを蒸留水で洗浄後濾
紙で水分を除去した。この菌体を液体窒素中で乳鉢にて
凍結破砕し、５Ｍ Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｉｓｏｔｈｉ
ｏｃｙａｎａｔｅに懸濁し３Ｍ ＬｉＣｌで沈澱する画
分を全ＲＮＡとして取得した。さらに３回フェノール・
クロロホルム１回のクロロホルム処理、エタノール沈
澱、エタノールリンス、風乾、ＴＥバッファーに懸濁と
いう一連の操作の後、最終的に２．６ｇ湿菌体から約
７．０ｍｇの全ＲＮＡを得た。この得られたＲＮＡの４
４０μｇを日本合成ゴム（株）製の２ｍｇ（１００μ
ｌ）のオリゴ（ｄＴ）−ラテックスと混合して公知の方
法（例えば、蛋白質核酸酵素，Ｖｏｌ．３５，２２５７
−２２６５（１９９０））従い、約２μｇのｐｏｌｙ
（Ａ）＋ ＲＮＡを取得した。
ブラリーの作製】公知の方法（例えばＤＮＡ，Ｖｏｌ．
２，３２９−３３５（１９８３））に準じて、アスペル
ギルス・オリゼーＲＩＢ４０株よりｍＲＮＡを取得し
た。具体的には、アスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０
株を、５００ｍｌ用バッフル付き三角フラスコ中で１０
０ｍｌの培地（２％ マルトース、１％ ポリペプト
ン、０．１％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０５％ ＭｇＳＯ4・
７Ｈ2Ｏ、０．０５％ ＫＣｌ、０．００１％ ＦｅＳ
Ｏ4・７Ｈ2Ｏ）にて３０℃で２日間振とう培養後、ガラ
スフィルター３Ｇ１で集菌し、これを蒸留水で洗浄後濾
紙で水分を除去した。この菌体を液体窒素中で乳鉢にて
凍結破砕し、５Ｍ Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｉｓｏｔｈｉ
ｏｃｙａｎａｔｅに懸濁し３Ｍ ＬｉＣｌで沈澱する画
分を全ＲＮＡとして取得した。さらに３回フェノール・
クロロホルム１回のクロロホルム処理、エタノール沈
澱、エタノールリンス、風乾、ＴＥバッファーに懸濁と
いう一連の操作の後、最終的に２．６ｇ湿菌体から約
７．０ｍｇの全ＲＮＡを得た。この得られたＲＮＡの４
４０μｇを日本合成ゴム（株）製の２ｍｇ（１００μ
ｌ）のオリゴ（ｄＴ）−ラテックスと混合して公知の方
法（例えば、蛋白質核酸酵素，Ｖｏｌ．３５，２２５７
−２２６５（１９９０））従い、約２μｇのｐｏｌｙ
（Ａ）＋ ＲＮＡを取得した。
【００４０】次にこのｍＲＮＡからｃＤＮＡを以下の方
法により作製した。原理は、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，Ｖｏｌ．２，１６１−１７０（１９８２）及びＧ
ｅｎｅ，Ｖｏｌ．２５，２６３−２６９（１９８３）に
記載のＲＮａｓｅＨ法を用い、実際の操作にはアマシャ
ム（株）製のｃＤＮＡ合成システムプラスを用いて、Ｒ
ａｎｄｏｍ Ｈｅｘａｐｒｉｍｅｒをプライマーとし、
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，ＲＮａ
ｓｅ Ｈ，ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＩの各酵素を用
いｃＤＮＡを合成した。
法により作製した。原理は、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，Ｖｏｌ．２，１６１−１７０（１９８２）及びＧ
ｅｎｅ，Ｖｏｌ．２５，２６３−２６９（１９８３）に
記載のＲＮａｓｅＨ法を用い、実際の操作にはアマシャ
ム（株）製のｃＤＮＡ合成システムプラスを用いて、Ｒ
ａｎｄｏｍ Ｈｅｘａｐｒｉｍｅｒをプライマーとし、
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，ＲＮａ
ｓｅ Ｈ，ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＩの各酵素を用
いｃＤＮＡを合成した。
【００４１】
【実施例６．ｃＤＮＡライブラリーからのアスペルギル
ス・オリゼーのホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子ｃＤ
ＮＡのクローニング】上記で得られた遺伝子ライブラリ
ーから、当該ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子ｃＤＮ
Ａのクローニングは、前述のアスペルギルス・オリゼー
のゲノム遺伝子の塩基配列の情報並びにアスペルギルス
・オリゼーと同属のアスペルギルス・ニドランスのホス
ホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のＤＮＡ配列（Ｇｅｎ
ｅ，Ｖｏｌ．４４，９７−１０５（１９８６））の情報
から制限酵素ＣｌａＩサイトと転写開始点を含む順方向
のプライマー（５′−ＣＧＡＴＣＧＡＴＧＴＣＴＣＴＣ
ＴＣＣＡＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣ−３′、但し下線はＣ
ｌａＩサイト）と制限酵素ＢｇｌIIサイトと転写終止点
を含む逆方向のプライマー（５′ＧＣＡＧＡＴＣＴＴＡ
ＣＴＴＡＣＴＴＧＡＣＡＧＡＧＣＡＴＣＡ−３′、但し
下線はＢｇｌIIサイト）をアプライド バイオシステム
ズ（株）社のＤＮＡ合成機を用いて合成し、上記ｃＤＮ
Ａ遺伝子ライブラリーを鋳型として公知の方法（例え
ば、細胞工学、Ｖｏｌ．８，５４５−５５３（１９８
９））に準じて、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃ
ｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ法）により行った。本断片
は、用いたプローブの塩基配列から、５′末端側に制限
酵素ＣｌａＩサイトと３′末端側にＢｇｌIIサイトを持
つため、これをｐＵＣ１１８並びにｐＵＣ１１９のＡｃ
ｃＩサイトとＢａｍＨＩサイトに挿入したプラスミドｐ
ＣＰ８とｐＣＰ９を作製した。
ス・オリゼーのホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子ｃＤ
ＮＡのクローニング】上記で得られた遺伝子ライブラリ
ーから、当該ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子ｃＤＮ
Ａのクローニングは、前述のアスペルギルス・オリゼー
のゲノム遺伝子の塩基配列の情報並びにアスペルギルス
・オリゼーと同属のアスペルギルス・ニドランスのホス
ホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のＤＮＡ配列（Ｇｅｎ
ｅ，Ｖｏｌ．４４，９７−１０５（１９８６））の情報
から制限酵素ＣｌａＩサイトと転写開始点を含む順方向
のプライマー（５′−ＣＧＡＴＣＧＡＴＧＴＣＴＣＴＣ
ＴＣＣＡＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣ−３′、但し下線はＣ
ｌａＩサイト）と制限酵素ＢｇｌIIサイトと転写終止点
を含む逆方向のプライマー（５′ＧＣＡＧＡＴＣＴＴＡ
ＣＴＴＡＣＴＴＧＡＣＡＧＡＧＣＡＴＣＡ−３′、但し
下線はＢｇｌIIサイト）をアプライド バイオシステム
ズ（株）社のＤＮＡ合成機を用いて合成し、上記ｃＤＮ
Ａ遺伝子ライブラリーを鋳型として公知の方法（例え
ば、細胞工学、Ｖｏｌ．８，５４５−５５３（１９８
９））に準じて、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃ
ｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ法）により行った。本断片
は、用いたプローブの塩基配列から、５′末端側に制限
酵素ＣｌａＩサイトと３′末端側にＢｇｌIIサイトを持
つため、これをｐＵＣ１１８並びにｐＵＣ１１９のＡｃ
ｃＩサイトとＢａｍＨＩサイトに挿入したプラスミドｐ
ＣＰ８とｐＣＰ９を作製した。
【００４２】
【実施例７．アスペルギルス・オリゼーのホスホグリセ
リン酸キナーゼｃＤＮＡに含まれるコーディング領域の
ＤＮＡ配列の決定】実施例４で得られたアスペルギルス
・オリゼーのホスホグリセリン酸キナーゼのゲノム遺伝
子のＤＮＡ配列の情報から図２に示す適当な制限酵素部
位を利用して、ｐＣＰ８、ｐＣＰ９のセルフクローニン
グを行い、これを実施例４と同様にしてホスホグリセリ
ン酸キナーゼ遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。
（下記の表６〜表８で示される配列表の配列番号４）
リン酸キナーゼｃＤＮＡに含まれるコーディング領域の
ＤＮＡ配列の決定】実施例４で得られたアスペルギルス
・オリゼーのホスホグリセリン酸キナーゼのゲノム遺伝
子のＤＮＡ配列の情報から図２に示す適当な制限酵素部
位を利用して、ｐＣＰ８、ｐＣＰ９のセルフクローニン
グを行い、これを実施例４と同様にしてホスホグリセリ
ン酸キナーゼ遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。
（下記の表６〜表８で示される配列表の配列番号４）
【００４３】
【表６】
【００４４】
【表７】
【００４５】
【表８】
【００４６】
【実施例８．活性アスペルギルス・オリゼーのホスホグ
リセリン酸キナーゼを生産するアスペルギルス・オリゼ
ーの作製】まず、実施例４のデレーションクローンの作
製に従って、ｐＰＧＦのアスペルギルス・オリゼーのホ
スホグリセリン酸キナーゼゲノム遺伝子の５′側挿入サ
イトのＰｓｔＩサイトをデレーションによって欠損させ
たプラスミドｐＰＧＦｄ１を作製した。このｐＰＧＦｄ
１には、ＰｓｔＩサイトは、挿入した本遺伝子の３′側
に一つだけ存在する。
リセリン酸キナーゼを生産するアスペルギルス・オリゼ
ーの作製】まず、実施例４のデレーションクローンの作
製に従って、ｐＰＧＦのアスペルギルス・オリゼーのホ
スホグリセリン酸キナーゼゲノム遺伝子の５′側挿入サ
イトのＰｓｔＩサイトをデレーションによって欠損させ
たプラスミドｐＰＧＦｄ１を作製した。このｐＰＧＦｄ
１には、ＰｓｔＩサイトは、挿入した本遺伝子の３′側
に一つだけ存在する。
【００４７】アスペルギルス・オリゼーのベクターとし
て例えばａｒｇＢ遺伝子をマーカーに持つｐＭＴＡＧ１
（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５５，
１９３９−１９４１（１９９１））からマーカーのａｒ
ｇＢ遺伝子を単離し、その両端にＰｓｔＩリンカーをつ
なぐ。このＰｓｔＩ断片をｐＰＧＦｄ１及びｐＵＣ１１
８のＰｓｔＩサイトに挿入してそれぞれｐＰＡｄ１とｐ
ＭＡＲ１を作製する。これらのプラスミドを、ａｒｇＢ
欠損株のアスペルギルス・オリゼーに導入し形質転換体
を得る。ａｒｇＢ欠損株として具体的にはＭ−２−３株
（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５１，
２５４９−２５５５（１９８７））が挙げられる。形質
転換方法としては公知の方法例えばＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５１，３２３−３２８（１９
８７）に記載された方法あるいはこれに準じた方法がと
られる。この方法によって形質転換体を得る。
て例えばａｒｇＢ遺伝子をマーカーに持つｐＭＴＡＧ１
（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５５，
１９３９−１９４１（１９９１））からマーカーのａｒ
ｇＢ遺伝子を単離し、その両端にＰｓｔＩリンカーをつ
なぐ。このＰｓｔＩ断片をｐＰＧＦｄ１及びｐＵＣ１１
８のＰｓｔＩサイトに挿入してそれぞれｐＰＡｄ１とｐ
ＭＡＲ１を作製する。これらのプラスミドを、ａｒｇＢ
欠損株のアスペルギルス・オリゼーに導入し形質転換体
を得る。ａｒｇＢ欠損株として具体的にはＭ−２−３株
（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５１，
２５４９−２５５５（１９８７））が挙げられる。形質
転換方法としては公知の方法例えばＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５１，３２３−３２８（１９
８７）に記載された方法あるいはこれに準じた方法がと
られる。この方法によって形質転換体を得る。
【００４８】
【実施例９．アスペルギルス・オリゼーのホスホグリセ
リン酸キナーゼ活性の測定】前項で得られたホスホグリ
セリン酸キナーゼ遺伝子の形質転換体並びに宿主のアス
ペルギルス・オリゼーのホスホグリセリン酸キナーゼの
酵素の粗抽出法及び活性測定法は、公知の方法（例え
ば、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ．，Ｖｏｌ．３４，７６５−７７１（１９９１），
Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｎａｌｙ
ｓｉｓ，Ｖｏｌ．２，２ｎｄ ｅｄｎ．ｐ５０２）に準
じて以下のように行った。
リン酸キナーゼ活性の測定】前項で得られたホスホグリ
セリン酸キナーゼ遺伝子の形質転換体並びに宿主のアス
ペルギルス・オリゼーのホスホグリセリン酸キナーゼの
酵素の粗抽出法及び活性測定法は、公知の方法（例え
ば、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ．，Ｖｏｌ．３４，７６５−７７１（１９９１），
Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｎａｌｙ
ｓｉｓ，Ｖｏｌ．２，２ｎｄ ｅｄｎ．ｐ５０２）に準
じて以下のように行った。
【００４９】宿主あるいは形質転換したアスペルギルス
・オリゼーを１０ｍｌの培地（３％グルコース、１％
ポリペプトン、０．１％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０５％ Ｍ
ｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０５％ ＫＣｌ、０．００１％
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）に一白金耳植菌し３日間３０℃
にて振とう培養した。集菌は、ガラスフィルター３Ｇ１
で濾過することにより行い、集めた菌体は、蒸留水にて
洗浄し、更に溶解バッファー（５０ｍＭ リン酸ナトリ
ウムバッファー（ｐＨ７．０），０．１ｍＭＥＤＴＡ、
２０μＭ Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ
Ｆｌｕｏｒｉｄｅ）で洗浄する。濾紙で水分を除去し
た菌体をあらかじめ冷却した乳鉢を用いて液体窒素中で
擦り潰した。この菌体を２ｍｌの溶解バッファーに懸濁
し、この遠心上清を粗抽出液とする。
・オリゼーを１０ｍｌの培地（３％グルコース、１％
ポリペプトン、０．１％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０５％ Ｍ
ｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０５％ ＫＣｌ、０．００１％
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）に一白金耳植菌し３日間３０℃
にて振とう培養した。集菌は、ガラスフィルター３Ｇ１
で濾過することにより行い、集めた菌体は、蒸留水にて
洗浄し、更に溶解バッファー（５０ｍＭ リン酸ナトリ
ウムバッファー（ｐＨ７．０），０．１ｍＭＥＤＴＡ、
２０μＭ Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ
Ｆｌｕｏｒｉｄｅ）で洗浄する。濾紙で水分を除去し
た菌体をあらかじめ冷却した乳鉢を用いて液体窒素中で
擦り潰した。この菌体を２ｍｌの溶解バッファーに懸濁
し、この遠心上清を粗抽出液とする。
【００５０】タンパク質濃度の定量は、ローリー法（例
えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，
Ｖｏｌ．３，４５１−１４５４）に従って行った。
えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，
Ｖｏｌ．３，４５１−１４５４）に従って行った。
【００５１】ホスホグリセリン酸キナーゼ活性の測定
は、以下のようにして行った。ホスホグリセリン酸キナ
ーゼは、下記の化２に示した反応を触媒する酵素で、こ
の反応を両方向に触媒する。従って、ホスホグリセリン
酸キナーゼの活性は、下記の化２に示すようにグリセル
アルデヒド３−リン酸脱水素酵素と共役させることによ
り基質３−ホスホグリセリン酸を１，３−ジホスホグリ
セリンを経てグリセルアルデヒド３−リン酸に至る反応
で起こるＮＡＤＨの減少を３４０ｎｍの吸光度の減少で
測定する。またホスホグリセリン酸キナーゼ１単位（１
ｕｎｉｔ）は、基質３−ホスホグリセリン酸を３０℃で
１分間に１μｍｏｌ変換させる量とする。
は、以下のようにして行った。ホスホグリセリン酸キナ
ーゼは、下記の化２に示した反応を触媒する酵素で、こ
の反応を両方向に触媒する。従って、ホスホグリセリン
酸キナーゼの活性は、下記の化２に示すようにグリセル
アルデヒド３−リン酸脱水素酵素と共役させることによ
り基質３−ホスホグリセリン酸を１，３−ジホスホグリ
セリンを経てグリセルアルデヒド３−リン酸に至る反応
で起こるＮＡＤＨの減少を３４０ｎｍの吸光度の減少で
測定する。またホスホグリセリン酸キナーゼ１単位（１
ｕｎｉｔ）は、基質３−ホスホグリセリン酸を３０℃で
１分間に１μｍｏｌ変換させる量とする。
【００５２】
【化２】
【００５３】これにより、下記の表１３で示される第１
表が得られ、本遺伝子の導入により、アスペルギルス・
オリゼーのホスホグリセリン酸キナーゼが、上昇するこ
とが見出された。
表が得られ、本遺伝子の導入により、アスペルギルス・
オリゼーのホスホグリセリン酸キナーゼが、上昇するこ
とが見出された。
【００５４】
【表１３】
【００５５】
【実施例１０．発現ベクターの構築】下記の表９〜１０
で示される配列表の配列番号１で示されるプロモーター
領域の全長を有するか、あるいはその一部を欠損させた
ＤＮＡ配列を有する領域と下記の表１１、１２で示され
る配列表の配列番号２に示すターミネーター領域の全長
を有するか、あるいは、その一部を欠損させたＤＮＡ配
列を有する配列をタンデムに繋ぎこれをアスペルギルス
・オリゼーのベクターとして例えばａｒｇＢ遺伝子をマ
ーカーに持つｐＭＡＲ１に挿入する事により、標記ベク
ターを構築した。
で示される配列表の配列番号１で示されるプロモーター
領域の全長を有するか、あるいはその一部を欠損させた
ＤＮＡ配列を有する領域と下記の表１１、１２で示され
る配列表の配列番号２に示すターミネーター領域の全長
を有するか、あるいは、その一部を欠損させたＤＮＡ配
列を有する配列をタンデムに繋ぎこれをアスペルギルス
・オリゼーのベクターとして例えばａｒｇＢ遺伝子をマ
ーカーに持つｐＭＡＲ１に挿入する事により、標記ベク
ターを構築した。
【００５６】
【表９】
【００５７】
【表１０】
【００５８】
【表１１】
【００５９】
【表１２】
【００６０】具体的には、図３〜５に示すストラテジー
にしたがって作製した。先ず、下記の化３に示すプライ
マーをアプライド バイオシステム（株）製のＤＮＡ合
成機で合成後、実施例６．と同様にしてｐＰＧＦを鋳型
とし、プライマー＃１とプライマー＃２を用いてプロモ
ーター領域を、また、プライマー＃３とプライマー＃４
を用いてターミネーター領域をＰＣＲ法で合成した。合
成したプロモーター領域は、そのプライマーから、５′
末端に制限酵素ＥｃｏＲＩサイトを、３′末端に制限酵
素ＫｐｎＩサイトを唯一サイトとして有するので、これ
をＥｃｏＲＩとＫｐｎＩで消化して、ｐＵＣ１１８の同
サイトに挿入して、ｐＰＧＰを作製した。また、同様に
合成したターミネーター領域は、その５′末端にＢａｍ
ＨＩサイトを、３′末端にＰｓｔＩサイトを唯一のサイ
トとして有しているので、これをＢａｍＨＩとＰｓｔＩ
で切り出した断片をｐＵＣ１１８の同サイトに挿入して
ｐＰＧＴを作製し、また本断片をｐＰＧＰの同サイトに
挿入してｐＰＧＰＴを作製した。ｐＰＧＰ、ｐＰＧＴ並
びにｐＰＧＰＴは、ＰｓｔＩサイトを唯一持つことによ
りこのサイトにｐＭＡＲ１からＰｓｔＩで切り出したａ
ｒｇＢ領域を挿入して、それぞれｐＰＡＰ、ｐＰＡＴ、
ｐＰＡＰＴを作製した。これらのプラスミドベクター
は、プロモーターの下流または／及びターミネーターの
上流に５′側からＫｐｎＩ，ＳｍａＩ，ＢａｍＨＩの唯
一の制限酵素サイトを持つ。ｐＰＡＰＴでは、このサイ
トに異種遺伝子を挿入することで、発現させ得るベクタ
ーである。また、ｐＰＡＰでは、このサイトに異種遺伝
子− ターミネーター −３′を挿入することで、ｐＰ
ＡＴでは、このサイトに５′− プロモーター −異種
遺伝子を挿入することで異種遺伝子を発現させ得るベク
ターである。
にしたがって作製した。先ず、下記の化３に示すプライ
マーをアプライド バイオシステム（株）製のＤＮＡ合
成機で合成後、実施例６．と同様にしてｐＰＧＦを鋳型
とし、プライマー＃１とプライマー＃２を用いてプロモ
ーター領域を、また、プライマー＃３とプライマー＃４
を用いてターミネーター領域をＰＣＲ法で合成した。合
成したプロモーター領域は、そのプライマーから、５′
末端に制限酵素ＥｃｏＲＩサイトを、３′末端に制限酵
素ＫｐｎＩサイトを唯一サイトとして有するので、これ
をＥｃｏＲＩとＫｐｎＩで消化して、ｐＵＣ１１８の同
サイトに挿入して、ｐＰＧＰを作製した。また、同様に
合成したターミネーター領域は、その５′末端にＢａｍ
ＨＩサイトを、３′末端にＰｓｔＩサイトを唯一のサイ
トとして有しているので、これをＢａｍＨＩとＰｓｔＩ
で切り出した断片をｐＵＣ１１８の同サイトに挿入して
ｐＰＧＴを作製し、また本断片をｐＰＧＰの同サイトに
挿入してｐＰＧＰＴを作製した。ｐＰＧＰ、ｐＰＧＴ並
びにｐＰＧＰＴは、ＰｓｔＩサイトを唯一持つことによ
りこのサイトにｐＭＡＲ１からＰｓｔＩで切り出したａ
ｒｇＢ領域を挿入して、それぞれｐＰＡＰ、ｐＰＡＴ、
ｐＰＡＰＴを作製した。これらのプラスミドベクター
は、プロモーターの下流または／及びターミネーターの
上流に５′側からＫｐｎＩ，ＳｍａＩ，ＢａｍＨＩの唯
一の制限酵素サイトを持つ。ｐＰＡＰＴでは、このサイ
トに異種遺伝子を挿入することで、発現させ得るベクタ
ーである。また、ｐＰＡＰでは、このサイトに異種遺伝
子− ターミネーター −３′を挿入することで、ｐＰ
ＡＴでは、このサイトに５′− プロモーター −異種
遺伝子を挿入することで異種遺伝子を発現させ得るベク
ターである。
【００６１】
【化３】
【図１】ホスホグリセリン酸キナーゼのゲノム遺伝子の
制限酵素断片地図である。
制限酵素断片地図である。
【図２】ホスホグリセリン酸キナーゼｃＤＮＡ遺伝子の
ＣｌａＩ−ＢｇｌII断片の制限酵素断片地図である。
ＣｌａＩ−ＢｇｌII断片の制限酵素断片地図である。
【図３〜図５】発現ベクターの構築図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:69） (72)発明者 五 味 勝 也 東京都北区滝野川２丁目６番30号 国税庁 醸造試験所内 (72)発明者 北 本 勝 ひ こ 東京都北区滝野川２丁目６番30号 国税庁 醸造試験所内 (72)発明者 熊 谷 知 栄 子 東京都北区滝野川２丁目６番30号 国税庁 醸造試験所内 (54)【発明の名称】 ホスホグリセリン酸キナ−ゼ遺伝子プロモ−タ−、 同タ−ミネ−タ− または／及びこれらからなる 遺伝子発現用ユニツト、並びに、ホスホ グリセリ ン酸キナ−ゼのゲノム遺伝子及びｃＤＮＡ遺伝子
Claims (10)
- 【請求項１】 アスペルギルス・オリゼーのホスホグリ
セリン酸キナーゼのゲノム遺伝子由来のホスホグリセリ
ン酸キナーゼ遺伝子プロモーター。 - 【請求項２】 配列表の配列番号１に示す塩基配列を有
する請求項１記載のホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子
プロモーター。 - 【請求項３】 アスペルギルス・オリゼーのゲノム遺伝
子由来のホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子ターミネー
ター。 - 【請求項４】 配列表の配列番号２に示す塩基配列を有
する請求項３記載のホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子
ターミネーター。 - 【請求項５】 請求項１もしくは２記載のホスホグリセ
リン酸キナーゼ遺伝子プロモーターの全長を有するか、
あるいはその一部を欠損させたＤＮＡ配列を有する領
域、または／及び、請求項３もしくは４記載のホスホグ
リセリン酸キナーゼ遺伝子ターミネーターの全長を有す
るか、あるいはその一部を欠損させたＤＮＡ配列を有す
る領域からなる遺伝子発現ユニット。 - 【請求項６】 請求項１記載のホスホグリセリン酸キナ
ーゼ遺伝子プロモーター領域及び請求項３記載のホスホ
グリセリン酸キナーゼ遺伝子ターミネーター領域を含み
かつイントロン配列を含むアスペルギルス・オリゼーの
ホスホグリセリン酸キナーゼのゲノム遺伝子。 - 【請求項７】 イントロン配列が２つである請求項６記
載のホスホグリセリン酸キナーゼのゲノム遺伝子。 - 【請求項８】 配列表の配列番号３に示す塩基配列を有
する請求項６または７記載のホスホグリセリン酸キナー
ゼのゲノム遺伝子。 - 【請求項９】 アスペルギルス・オリゼーのホスホグリ
セリン酸キナーゼのｃＤＮＡ遺伝子。 - 【請求項１０】 配列表の配列番号４に示す塩基配列を
有する請求項９記載のホスホグリセリン酸キナーゼのｃ
ＤＮＡ遺伝子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3284117A JPH0595787A (ja) | 1991-10-04 | 1991-10-04 | ホスホグリセリン酸キナ−ゼ遺伝子プロモ−タ−、 同タ−ミネ−タ−または／及びこれらからなる 遺伝子発現用ユニツト、並びに、ホスホグリセリ ン酸キナ−ゼのゲノム遺伝子及びｃＤＮＡ遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3284117A JPH0595787A (ja) | 1991-10-04 | 1991-10-04 | ホスホグリセリン酸キナ−ゼ遺伝子プロモ−タ−、 同タ−ミネ−タ−または／及びこれらからなる 遺伝子発現用ユニツト、並びに、ホスホグリセリ ン酸キナ−ゼのゲノム遺伝子及びｃＤＮＡ遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0595787A true JPH0595787A (ja) | 1993-04-20 |
Family
ID=17674407
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3284117A Pending JPH0595787A (ja) | 1991-10-04 | 1991-10-04 | ホスホグリセリン酸キナ−ゼ遺伝子プロモ−タ−、 同タ−ミネ−タ−または／及びこれらからなる 遺伝子発現用ユニツト、並びに、ホスホグリセリ ン酸キナ−ゼのゲノム遺伝子及びｃＤＮＡ遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0595787A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010046080A (ja) * | 1997-12-22 | 2010-03-04 | Koninkl Dsm Nv | 糸状菌での発現クローニング |
-
1991
- 1991-10-04 JP JP3284117A patent/JPH0595787A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| GENE(AMST)=1986 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010046080A (ja) * | 1997-12-22 | 2010-03-04 | Koninkl Dsm Nv | 糸状菌での発現クローニング |
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