JPH0585943A - 組換えワクシニアウイルスを用いる非ａ非ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現および非ａ非ｂ型肝炎ワクチン - Google Patents
組換えワクシニアウイルスを用いる非ａ非ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現および非ａ非ｂ型肝炎ワクチンInfo
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Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】本発明は、組換えワクシニアウイルスを用いる
非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質の発現およびワクチ
ンへの応用。 【構成】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質をコードす
る塩基配列を含む遺伝子と、該遺伝子を発現させ得るウ
イルスプロモーターと、ワクシニアウイルスの増殖のた
めに必須でないワクシニアウイルス遺伝子とを含有する
プラスミド、該プラスミドとワクシニアウイルスの相同
性組換えにより得られた組換えワクシニアウイルス及び
その製造方法、該組換えワクシニアウイルスからの発現
非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質の製造方法及び糖を
有するその発現産物、並びに、糖を有する発現非Ａ非Ｂ
型肝炎ウイルス抗原蛋白質又は弱毒化若しくは不活化組
換えワクシニアウイルスを含むワクチン。
非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質の発現およびワクチ
ンへの応用。 【構成】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質をコードす
る塩基配列を含む遺伝子と、該遺伝子を発現させ得るウ
イルスプロモーターと、ワクシニアウイルスの増殖のた
めに必須でないワクシニアウイルス遺伝子とを含有する
プラスミド、該プラスミドとワクシニアウイルスの相同
性組換えにより得られた組換えワクシニアウイルス及び
その製造方法、該組換えワクシニアウイルスからの発現
非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質の製造方法及び糖を
有するその発現産物、並びに、糖を有する発現非Ａ非Ｂ
型肝炎ウイルス抗原蛋白質又は弱毒化若しくは不活化組
換えワクシニアウイルスを含むワクチン。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、組換えワクシニアウイ
ルスを用いる非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質の発現
およびワクチンへの応用に関する。
ルスを用いる非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質の発現
およびワクチンへの応用に関する。
【０００２】
【従来の技術】非Ａ非Ｂ型肝炎はウイルス性の伝染性肝
炎であり、発症後多くは慢性化し、肝硬変、肝癌へと高
率に移行することから社会的にも大きな問題であり、そ
の予防法が必要とされている。ウイルス性疾患の予防に
はワクチンを用いる方法と感染状況を把握してその道す
じを断つことの２種類がある。このうちで感染状況を把
握するのに必要な診断用のキットはカイロン社の M. Ho
ughtonら（特表平２−500880号公報）あるいは槙ら（特
願平２−180889号）によりすでに開発されており、輸血
による感染はかなり高率で予防できるようになりつつあ
る。しかし非Ａ非Ｂ型肝炎患者の約半数（約５０万人／
年）は輸血を介さない感染者であり、現在のところこれ
らの感染を予防する有効な手段はなく、予防ワクチンの
開発が希求されている。
炎であり、発症後多くは慢性化し、肝硬変、肝癌へと高
率に移行することから社会的にも大きな問題であり、そ
の予防法が必要とされている。ウイルス性疾患の予防に
はワクチンを用いる方法と感染状況を把握してその道す
じを断つことの２種類がある。このうちで感染状況を把
握するのに必要な診断用のキットはカイロン社の M. Ho
ughtonら（特表平２−500880号公報）あるいは槙ら（特
願平２−180889号）によりすでに開発されており、輸血
による感染はかなり高率で予防できるようになりつつあ
る。しかし非Ａ非Ｂ型肝炎患者の約半数（約５０万人／
年）は輸血を介さない感染者であり、現在のところこれ
らの感染を予防する有効な手段はなく、予防ワクチンの
開発が希求されている。
【０００３】この種のワクチンに関してはすでに、 M.
Houghtonらが、上記公報中でヒトＣ型肝炎ウイルス（Ｈ
ＣＶ）エピトープを含む免疫原性ポリペプチドを含有す
るワクチン、不活性化ＨＣＶを含有するワクチン、及び
弱毒化ＨＣＶを含有するワクチンについて開示してい
る。
Houghtonらが、上記公報中でヒトＣ型肝炎ウイルス（Ｈ
ＣＶ）エピトープを含む免疫原性ポリペプチドを含有す
るワクチン、不活性化ＨＣＶを含有するワクチン、及び
弱毒化ＨＣＶを含有するワクチンについて開示してい
る。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】通常、ワクチンにはホ
ルマリン等の薬剤で不活化されたウイルスそのものが使
われることが多いが、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスはいまだ
に分離されておらず、またin vitro でのウイルス増殖
系もないため、大量に該ウイルスを得ることができな
い。そのため、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を大腸
菌、酵母、動物細胞等で発現させ、ワクチン抗原を得る
ことが示唆されている（特表平２−500880号公報）。
ルマリン等の薬剤で不活化されたウイルスそのものが使
われることが多いが、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスはいまだ
に分離されておらず、またin vitro でのウイルス増殖
系もないため、大量に該ウイルスを得ることができな
い。そのため、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を大腸
菌、酵母、動物細胞等で発現させ、ワクチン抗原を得る
ことが示唆されている（特表平２−500880号公報）。
【０００５】一般に、ウイルスエンベロープ蛋白質のよ
うに糖をもつ蛋白質は、それをもたない蛋白質と比べて
免疫原性が高く免疫化に優れているが、このような糖蛋
白質の有効な発現法及びその取得については、M. Hough
tonらは何ら教示していない。ウイルスエンベロープ蛋
白質のような糖蛋白質を糖鎖が付加した形で発現させる
のには動物細胞を用いた発現系が考えられる。しかし動
物細胞を用いた発現系では一般的に数mg／ｌの効率でし
か発現蛋白質が得られず、ワクチンとして使用可能な精
製度にまで純度をあげるのはかなり困難である。
うに糖をもつ蛋白質は、それをもたない蛋白質と比べて
免疫原性が高く免疫化に優れているが、このような糖蛋
白質の有効な発現法及びその取得については、M. Hough
tonらは何ら教示していない。ウイルスエンベロープ蛋
白質のような糖蛋白質を糖鎖が付加した形で発現させる
のには動物細胞を用いた発現系が考えられる。しかし動
物細胞を用いた発現系では一般的に数mg／ｌの効率でし
か発現蛋白質が得られず、ワクチンとして使用可能な精
製度にまで純度をあげるのはかなり困難である。
【０００６】本発明者らは、鋭意研究の結果、ワクシニ
アウイルス遺伝子中に非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白
質をコードする塩基配列を含む遺伝子及びウイルスプロ
モーターを含有する組換えプラスミドとワクシニアウイ
ルスとの間での相同性組換えにより得られる組換えワク
シニアウイルスを用いることによって、糖をもつ非Ａ非
Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質が発現され得ることを見出
し、この発明を完成した。
アウイルス遺伝子中に非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白
質をコードする塩基配列を含む遺伝子及びウイルスプロ
モーターを含有する組換えプラスミドとワクシニアウイ
ルスとの間での相同性組換えにより得られる組換えワク
シニアウイルスを用いることによって、糖をもつ非Ａ非
Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質が発現され得ることを見出
し、この発明を完成した。
【０００７】本発明は、組換えワクシニアウイルスを用
いる非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質の発現系を提供
することを目的とする。
いる非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質の発現系を提供
することを目的とする。
【０００８】本発明はまた、この発現系を介して得られ
る天然型又は天然型に近い該抗原蛋白質を提供すること
を目的とする。
る天然型又は天然型に近い該抗原蛋白質を提供すること
を目的とする。
【０００９】本発明はさらに、弱毒化若しくは不活化組
換えワクシニアウイルスおよび該抗原蛋白質のワクチン
への応用を目的とする。
換えワクシニアウイルスおよび該抗原蛋白質のワクチン
への応用を目的とする。
【００１０】組換えワクシニアウイルスをワクチンとし
て使用する場合は、ウイルスが接種部位で増殖すること
により免疫を与えるので非常に少量の使用でよく、精製
も簡単である。
て使用する場合は、ウイルスが接種部位で増殖すること
により免疫を与えるので非常に少量の使用でよく、精製
も簡単である。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は、非Ａ非Ｂ型肝
炎ウイルス抗原蛋白質をコードする塩基配列を含む遺伝
子、該遺伝子を発現させ得るウイルスプロモーター、及
びワクシニアウイルスの増殖のために必須でないワクシ
ニアウイルス遺伝子を含有するプラスミドを提供する。
炎ウイルス抗原蛋白質をコードする塩基配列を含む遺伝
子、該遺伝子を発現させ得るウイルスプロモーター、及
びワクシニアウイルスの増殖のために必須でないワクシ
ニアウイルス遺伝子を含有するプラスミドを提供する。
【００１２】該プラスミドは、ワクシニアウイルスとの
間での相同性組換えにより組換えワクシニアウイルスを
作製するうえで必須な構成物である。
間での相同性組換えにより組換えワクシニアウイルスを
作製するうえで必須な構成物である。
【００１３】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質をコー
ドする塩基配列を含む遺伝子において、コードされる該
抗原蛋白質は非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの非構造蛋白質又
は構造蛋白質のいずれでもよいが、効率的な免疫化を実
現するためには構造蛋白質、特にエンベロープ及びコア
を構成する蛋白質が好ましい。エンベロープは、動物ウ
イルス外被を構成する構造体であり、細胞質膜に類似し
た脂質二重層膜とウイルス遺伝子によって作られた糖蛋
白質構造体とを含む。この糖蛋白質構造体は、該膜中に
その一端が埋め込まれ、他端が突起状（スパイクと呼ば
れる）に外部に突出している。また、コアは、内部カプ
シドとも呼ばれ、ウイルスゲノムを包む蛋白質から成る
殻を構成している。該抗原蛋白質は糖を必ずしも必要と
しないが、免疫原性を高めるためには糖蛋白質であるこ
とが好ましく、この場合、糖蛋白質の効率的発現を可能
にする本発明の特徴が十分に発揮され得る。後述の実施
例では、実際、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスのエンベロープ
抗原糖蛋白質ｇｐ３５をコードする遺伝子をプラスミド
に組み込み、その発現を実現している。
ドする塩基配列を含む遺伝子において、コードされる該
抗原蛋白質は非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの非構造蛋白質又
は構造蛋白質のいずれでもよいが、効率的な免疫化を実
現するためには構造蛋白質、特にエンベロープ及びコア
を構成する蛋白質が好ましい。エンベロープは、動物ウ
イルス外被を構成する構造体であり、細胞質膜に類似し
た脂質二重層膜とウイルス遺伝子によって作られた糖蛋
白質構造体とを含む。この糖蛋白質構造体は、該膜中に
その一端が埋め込まれ、他端が突起状（スパイクと呼ば
れる）に外部に突出している。また、コアは、内部カプ
シドとも呼ばれ、ウイルスゲノムを包む蛋白質から成る
殻を構成している。該抗原蛋白質は糖を必ずしも必要と
しないが、免疫原性を高めるためには糖蛋白質であるこ
とが好ましく、この場合、糖蛋白質の効率的発現を可能
にする本発明の特徴が十分に発揮され得る。後述の実施
例では、実際、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスのエンベロープ
抗原糖蛋白質ｇｐ３５をコードする遺伝子をプラスミド
に組み込み、その発現を実現している。
【００１４】ウイルスプロモーターは、前記抗原蛋白質
をコードする塩基配列を含む遺伝子を発現させ得るもの
であればその種類を問わない。このようなプロモーター
としては、ワクシニアウイルス由来プロモーター（７．
５ｋＤ蛋白質、ＡＴＩプロモーター）、サイトメガロウ
イルスプロモーターなどが挙げられるが、組換えワクシ
ニアウイルス内での該遺伝子の発現を有効に行わしめる
ためには、ワクシニアウイルス由来プロモーターが好ま
しい。
をコードする塩基配列を含む遺伝子を発現させ得るもの
であればその種類を問わない。このようなプロモーター
としては、ワクシニアウイルス由来プロモーター（７．
５ｋＤ蛋白質、ＡＴＩプロモーター）、サイトメガロウ
イルスプロモーターなどが挙げられるが、組換えワクシ
ニアウイルス内での該遺伝子の発現を有効に行わしめる
ためには、ワクシニアウイルス由来プロモーターが好ま
しい。
【００１５】ワクシニアウイルス遺伝子は、このウイル
スの増殖系に係る遺伝子以外のものが好ましく、組換え
ウイルスのスクリーニングの点で特にヘマグルチニン
（ＨＡ）遺伝子が好適に使用され得る。
スの増殖系に係る遺伝子以外のものが好ましく、組換え
ウイルスのスクリーニングの点で特にヘマグルチニン
（ＨＡ）遺伝子が好適に使用され得る。
【００１６】また、これらの遺伝子及びプロモーターの
配置は、一般に、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質を
コードする塩基配列を含む遺伝子がウイルスプロモータ
ーの下流に配置されるように、両者がワクシニアウイル
ス遺伝子内部に挿入された形態をとるのが適している。
配置は、一般に、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質を
コードする塩基配列を含む遺伝子がウイルスプロモータ
ーの下流に配置されるように、両者がワクシニアウイル
ス遺伝子内部に挿入された形態をとるのが適している。
【００１７】本発明の実施態様によるプラスミドＰ７．
５−Ｅ１２が本発明プラスミドとして好適に使用し得、
この特定プラスミドも本発明の範囲内に含まれる。この
例示のプラスミドは、後述の実施例に示すように、先ず
ワクシニアウイルスＷＲ株よりＨＡ遺伝子を単離して p
UC18にクローニングし、このＨＡ遺伝子のＮruＩ部位に
ワクシニアウイルス由来の７．５ｋＤ蛋白質プロモータ
ーを挿入し、その下流に非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋
白質をコードする塩基配列を含む遺伝子を挿入すること
により作製することができる（図１参照）。
５−Ｅ１２が本発明プラスミドとして好適に使用し得、
この特定プラスミドも本発明の範囲内に含まれる。この
例示のプラスミドは、後述の実施例に示すように、先ず
ワクシニアウイルスＷＲ株よりＨＡ遺伝子を単離して p
UC18にクローニングし、このＨＡ遺伝子のＮruＩ部位に
ワクシニアウイルス由来の７．５ｋＤ蛋白質プロモータ
ーを挿入し、その下流に非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋
白質をコードする塩基配列を含む遺伝子を挿入すること
により作製することができる（図１参照）。
【００１８】本発明はまた、上述の組換えプラスミドと
ワクシニアウイルスの相同性組換えにより得られた組換
えワクシニアウイルスを提供する。
ワクシニアウイルスの相同性組換えにより得られた組換
えワクシニアウイルスを提供する。
【００１９】本発明組換えワクシニアウイルスは、本発
明の上記組換えプラスミドを制限的に線状化し、ワクシ
ニアウイルスが感染している動物細胞にトランスフェク
ションして相同性組換えを行う段階、及び非Ａ非Ｂ型肝
炎ウイルス抗原蛋白質をコードする遺伝子が挿入されて
いる組換えウイルスをスクリーニングし、それを回収す
る段階を含む方法により製造することができる。この製
造方法も本発明の範囲内に含まれる。
明の上記組換えプラスミドを制限的に線状化し、ワクシ
ニアウイルスが感染している動物細胞にトランスフェク
ションして相同性組換えを行う段階、及び非Ａ非Ｂ型肝
炎ウイルス抗原蛋白質をコードする遺伝子が挿入されて
いる組換えウイルスをスクリーニングし、それを回収す
る段階を含む方法により製造することができる。この製
造方法も本発明の範囲内に含まれる。
【００２０】本発明の実施態様により、ワクシニアウイ
ルスとしてワクシニアウイルスリスター株が好適に使用
され得る。また、該ウイルスを感染させるための動物細
胞としては、哺乳動物細胞が適しており、例えばウサギ
腎継代細胞（ＲＫ−１３細胞）を挙げることができる。
ルスとしてワクシニアウイルスリスター株が好適に使用
され得る。また、該ウイルスを感染させるための動物細
胞としては、哺乳動物細胞が適しており、例えばウサギ
腎継代細胞（ＲＫ−１３細胞）を挙げることができる。
【００２１】本発明の実施態様による組換えワクシニア
ウイルスＰ７．５−Ｅ１２／ＲＬＶが好適に使用し得、
これも本発明の範囲内に含まれる。この組換え体ウイル
スにおいては、線状化されたプラスミドｐ７．５−Ｅ１
２／ＲＬＶがワクシニアウイルス遺伝子中のＨＡ（ヘマ
グルチニン）蛋白質をコードする遺伝子のほぼ中央に挿
入されている。このため正常なヘマグルチニン蛋白質は
産生されない。また挿入された非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス
遺伝子は頭の部分に開始コドンＡＴＧをもつので、ここ
から新たにｍＲＮＡが合成され蛋白合成が行なわれる。
ウイルスＰ７．５−Ｅ１２／ＲＬＶが好適に使用し得、
これも本発明の範囲内に含まれる。この組換え体ウイル
スにおいては、線状化されたプラスミドｐ７．５−Ｅ１
２／ＲＬＶがワクシニアウイルス遺伝子中のＨＡ（ヘマ
グルチニン）蛋白質をコードする遺伝子のほぼ中央に挿
入されている。このため正常なヘマグルチニン蛋白質は
産生されない。また挿入された非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス
遺伝子は頭の部分に開始コドンＡＴＧをもつので、ここ
から新たにｍＲＮＡが合成され蛋白合成が行なわれる。
【００２２】組換えワクシニアウイルスのスクリーニン
グは、先ず赤血球吸着試験（ＨＡ試験）（Shida, H., v
irology 150:451-462, 1986 ）によりＨＡ（−）の組換
えウイルス候補株を取得し、次いで非Ａ非Ｂ型肝炎ウイ
ルス抗原蛋白質を構成するペプチドをコードするヌクレ
オチド配列をプローブとするプラークハイブリダイゼー
ションによって陽性クローンを検出する手法により実施
し得る。
グは、先ず赤血球吸着試験（ＨＡ試験）（Shida, H., v
irology 150:451-462, 1986 ）によりＨＡ（−）の組換
えウイルス候補株を取得し、次いで非Ａ非Ｂ型肝炎ウイ
ルス抗原蛋白質を構成するペプチドをコードするヌクレ
オチド配列をプローブとするプラークハイブリダイゼー
ションによって陽性クローンを検出する手法により実施
し得る。
【００２３】本発明はさらに、上述のようにして作製さ
れた組換えワクシニアウイルスを動物細胞に感染し、該
細胞を培養して非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質をコ
ードする塩基配列を含む遺伝子を発現させ、発現蛋白質
を回収することから成る発現非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗
原蛋白質の製造方法を提供する。
れた組換えワクシニアウイルスを動物細胞に感染し、該
細胞を培養して非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質をコ
ードする塩基配列を含む遺伝子を発現させ、発現蛋白質
を回収することから成る発現非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗
原蛋白質の製造方法を提供する。
【００２４】動物細胞は哺乳動物細胞が適しており、特
にウサギ腎継代細胞（ＲＫ−１３細胞）が好適に使用さ
れ得る。また、培養条件は使用する動物細胞に依存して
決定され、増殖可能な培地、培養温度、培養時間等が適
宜選択される。例えば前記Ｐ７．５−Ｅ１２／ＲＬＶの
場合、グルコースの代りにフルクトースを含む牛血清含
有ＥＭＥＭ培地が使用され得る。
にウサギ腎継代細胞（ＲＫ−１３細胞）が好適に使用さ
れ得る。また、培養条件は使用する動物細胞に依存して
決定され、増殖可能な培地、培養温度、培養時間等が適
宜選択される。例えば前記Ｐ７．５−Ｅ１２／ＲＬＶの
場合、グルコースの代りにフルクトースを含む牛血清含
有ＥＭＥＭ培地が使用され得る。
【００２５】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質の発現
は、該抗原蛋白質に対する抗体か又はそれを含有する非
Ａ非Ｂ型肝炎患者血清を用いる免疫沈降法及び間接蛍光
抗体法のような慣用の免疫学的技術によって確認され得
る（図２および図３）。
は、該抗原蛋白質に対する抗体か又はそれを含有する非
Ａ非Ｂ型肝炎患者血清を用いる免疫沈降法及び間接蛍光
抗体法のような慣用の免疫学的技術によって確認され得
る（図２および図３）。
【００２６】本発明はまた、このようにして発現された
非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質のうち、特に糖を有
する発現非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質を提供す
る。
非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質のうち、特に糖を有
する発現非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質を提供す
る。
【００２７】糖蛋白質の発現は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
ス関連分野においてはいまだに実現されたことがなく、
該抗原糖蛋白質をコードする塩基配列を含む遺伝子を含
有する組換えワクシニアウイルスを使用する発現系の発
明によってはじめて該遺伝子の発現を可能にした。
ス関連分野においてはいまだに実現されたことがなく、
該抗原糖蛋白質をコードする塩基配列を含む遺伝子を含
有する組換えワクシニアウイルスを使用する発現系の発
明によってはじめて該遺伝子の発現を可能にした。
【００２８】本明細書中、『糖を有する発現非Ａ非Ｂ型
肝炎ウイルス抗原蛋白質」とは、天然型非Ａ非Ｂ型肝炎
ウイルス抗原糖蛋白質およびその類似体の両方を包含す
ることを意味する。また、該天然型抗原糖蛋白質の類似
体は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの動物体内への侵入を阻
止することが又は、動物に感染した該ウイルスを撲滅す
ることが可能な非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスに対する抗体を
産生し得る範囲の改変体を意味する。
肝炎ウイルス抗原蛋白質」とは、天然型非Ａ非Ｂ型肝炎
ウイルス抗原糖蛋白質およびその類似体の両方を包含す
ることを意味する。また、該天然型抗原糖蛋白質の類似
体は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの動物体内への侵入を阻
止することが又は、動物に感染した該ウイルスを撲滅す
ることが可能な非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスに対する抗体を
産生し得る範囲の改変体を意味する。
【００２９】本発明はさらに、上記の糖を有する発現非
Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質を含む、非Ａ非Ｂ型肝
炎を治療又は予防するためのワクチンを提供する。
Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質を含む、非Ａ非Ｂ型肝
炎を治療又は予防するためのワクチンを提供する。
【００３０】本発明はまた、弱毒化した又は不活化した
組換えワクシニアウイルスを含む、非Ａ非Ｂ型肝炎を治
療又は予防するためのワクチンを提供する。
組換えワクシニアウイルスを含む、非Ａ非Ｂ型肝炎を治
療又は予防するためのワクチンを提供する。
【００３１】ワクシニアウイルスはヒトの痘瘡免疫をつ
くるのに使われるポックスウイルス属の一種である。組
換えワクシニアウイルスを動物の細胞、組織、器官等の
中で増殖させた後、病原性を弱めて弱毒化生ワクチンと
したり、又はホルムアルデヒドで不活化して不活化ワク
チンとすることができる。後述の実施例７では、組換え
ワクシニアウイルスＰ７．５−Ｅ１２／ＲＬＶをウサギ
背部皮内に接種することにより、実際、ウサギ血清中に
非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質に対する抗体が産生
されることが実証される（図４）。
くるのに使われるポックスウイルス属の一種である。組
換えワクシニアウイルスを動物の細胞、組織、器官等の
中で増殖させた後、病原性を弱めて弱毒化生ワクチンと
したり、又はホルムアルデヒドで不活化して不活化ワク
チンとすることができる。後述の実施例７では、組換え
ワクシニアウイルスＰ７．５−Ｅ１２／ＲＬＶをウサギ
背部皮内に接種することにより、実際、ウサギ血清中に
非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質に対する抗体が産生
されることが実証される（図４）。
【００３２】本発明のワクチンは、一般に、免疫原が油
中水乳剤中に含まれるか又は水酸化アルミニウム、リン
酸アルミニウム等の無機ゲル上に吸着されるか又は慣用
の有機アジュバントを含む等のアジュバントワクチンの
形態かあるいは生理食塩水、グリセロール等の液体溶媒
中の溶液形態で使用されるが、これに限定されない。ま
た、ワクチンの適用法としては接種が好ましく、目的と
する予防効果又は治療効果が得られる量で投与され、そ
の量は個体の年齢、体重、症状等に依存する。
中水乳剤中に含まれるか又は水酸化アルミニウム、リン
酸アルミニウム等の無機ゲル上に吸着されるか又は慣用
の有機アジュバントを含む等のアジュバントワクチンの
形態かあるいは生理食塩水、グリセロール等の液体溶媒
中の溶液形態で使用されるが、これに限定されない。ま
た、ワクチンの適用法としては接種が好ましく、目的と
する予防効果又は治療効果が得られる量で投与され、そ
の量は個体の年齢、体重、症状等に依存する。
【００３３】
【実施例】以下の実施例により、本発明を更に詳細に説
明するが、本発明は本発明の要旨を変えない限りこれら
の実施例に限定されるものではない。
明するが、本発明は本発明の要旨を変えない限りこれら
の実施例に限定されるものではない。
【００３４】実施例 １ ワクシニアウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子の
クローニング ワクシニアウイルスＷＲ株をショ糖密度勾配遠心法［Jo
klik.W.K,Virology, 18, 9-18（1962）］で精製し、50m
M Tris-HCl(pH 7.4) バッファー（1mM EDTA、0.5%ドデ
シル硫酸ナトリウム含有）中に懸濁し、プロティナーゼ
Ｋを 250〜1000μｇ／mlの濃度になるように加えて３７
℃で一晩インキュベートした後、ＴＥバッファーで飽和
下フェノール：クロロホルム（１：１）液で３回抽出
し、エタノール沈殿を行ないウイルスＤＮＡを得た。こ
のＤＮＡを中塩濃度緩衝液中でHindIII により消化し、
アガロースゲル電気泳動により、約５０ｋｂのＨinｄ I
IIＡ断片を得た。このＨinｄ IIIＡ断片を、高塩濃度緩
衝液中でＳalＩにより消化し、Ｈinｄ IIIＡ断片の３′
末端に位置する約１．８ kbpのＨinｄ III−ＳalＩ断片
を、アガロースゲル電気泳動により単離した。
クローニング ワクシニアウイルスＷＲ株をショ糖密度勾配遠心法［Jo
klik.W.K,Virology, 18, 9-18（1962）］で精製し、50m
M Tris-HCl(pH 7.4) バッファー（1mM EDTA、0.5%ドデ
シル硫酸ナトリウム含有）中に懸濁し、プロティナーゼ
Ｋを 250〜1000μｇ／mlの濃度になるように加えて３７
℃で一晩インキュベートした後、ＴＥバッファーで飽和
下フェノール：クロロホルム（１：１）液で３回抽出
し、エタノール沈殿を行ないウイルスＤＮＡを得た。こ
のＤＮＡを中塩濃度緩衝液中でHindIII により消化し、
アガロースゲル電気泳動により、約５０ｋｂのＨinｄ I
IIＡ断片を得た。このＨinｄ IIIＡ断片を、高塩濃度緩
衝液中でＳalＩにより消化し、Ｈinｄ IIIＡ断片の３′
末端に位置する約１．８ kbpのＨinｄ III−ＳalＩ断片
を、アガロースゲル電気泳動により単離した。
【００３５】一方、プラスミドｐＵＣ１３を中塩濃度緩
衝液中でＨinｄIII により、続いて高塩濃度緩衝液中で
ＳalＩにより消化して線状化した。この線状化プラスミ
ドをアガロースゲル電気泳動により、単離した。
衝液中でＨinｄIII により、続いて高塩濃度緩衝液中で
ＳalＩにより消化して線状化した。この線状化プラスミ
ドをアガロースゲル電気泳動により、単離した。
【００３６】前記のＨinｄ III−ＳalＩ断片と、線状化
プラスミドとをライゲーション緩衝液中でＴ４リガーゼ
により連結し、この反応混合物を用いて大腸菌ＪＭ103
を形質転換した。個々の形質転換体からアルカリ抽出法
により、プラスミドを回収した。さらに制限酵素による
分析を行ない、目的とする遺伝子構成を有するプラスミ
ドを選択し、これをｐＨＡ１３と命名した。
プラスミドとをライゲーション緩衝液中でＴ４リガーゼ
により連結し、この反応混合物を用いて大腸菌ＪＭ103
を形質転換した。個々の形質転換体からアルカリ抽出法
により、プラスミドを回収した。さらに制限酵素による
分析を行ない、目的とする遺伝子構成を有するプラスミ
ドを選択し、これをｐＨＡ１３と命名した。
【００３７】実施例 ２ ワクシニアウイルスの７．５ｋＤタンパク質プロモータ
ーを用いた組み換え用マルチベクターの作製 ワクシニアウイルスの７．５ｋＤタンパク質プロモータ
ーとその下流に連結した外来遺伝子をワクシニアウイル
スのゲノムＨＡ遺伝子内に組み込むための組み換え用ベ
クターを以下の方法で作製した。
ーを用いた組み換え用マルチベクターの作製 ワクシニアウイルスの７．５ｋＤタンパク質プロモータ
ーとその下流に連結した外来遺伝子をワクシニアウイル
スのゲノムＨＡ遺伝子内に組み込むための組み換え用ベ
クターを以下の方法で作製した。
【００３８】まず、ワクシニアウイルスＷＲ株よりＤＮ
Ａを実施例１で示した方法と同様に抽出し、Venkatesan
らの方法［Venkatesan & B. Moss, J. Virol. 33, 738-
745(1981)］により７．５ｋＤタンパク質プロモーター
を単離した。すなわち、抽出したＷＲ株のＤＮＡをＳal
Ｉにて消化し、得られた０．９ｋｂｐのＤＮＡ断片をｐ
ＵＣ１８のＳalＩサイトにクローニングした。さらに、
このプラスミドをＲsaＩおよびＨinｃIIで消化し、７．
５ｋＤタンパク質プロモーターを含む0.26 kbpのＲsaＩ
−ＨinｃII断片を得た。このＤＮＡ断片をｐＵＣ１８に
クローニングした（ｐ 7.5−18）。
Ａを実施例１で示した方法と同様に抽出し、Venkatesan
らの方法［Venkatesan & B. Moss, J. Virol. 33, 738-
745(1981)］により７．５ｋＤタンパク質プロモーター
を単離した。すなわち、抽出したＷＲ株のＤＮＡをＳal
Ｉにて消化し、得られた０．９ｋｂｐのＤＮＡ断片をｐ
ＵＣ１８のＳalＩサイトにクローニングした。さらに、
このプラスミドをＲsaＩおよびＨinｃIIで消化し、７．
５ｋＤタンパク質プロモーターを含む0.26 kbpのＲsaＩ
−ＨinｃII断片を得た。このＤＮＡ断片をｐＵＣ１８に
クローニングした（ｐ 7.5−18）。
【００３９】次に、以上の方法により単離した７．５ｋ
Ｄタンパク質プロモーターを実施例１でクローニングし
たＨＡ遺伝子のＮruＩサイトに以下の方法で挿入した。
Ｄタンパク質プロモーターを実施例１でクローニングし
たＨＡ遺伝子のＮruＩサイトに以下の方法で挿入した。
【００４０】プラスミドｐ 7.5−18を中塩濃度緩衝液中
でＥcoＲＩおよびＨinｄIII により消化することによ
り、約0.29 kbpの 7.5ｋプロモーター遺伝子を切り出
し、アガロースゲル電気泳動により単離した。単離した
遺伝子断片をニックトランスレーション緩衝液中でｄＴ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰ存在下におい
てKlenow断片と反応させ末端を平滑にした。
でＥcoＲＩおよびＨinｄIII により消化することによ
り、約0.29 kbpの 7.5ｋプロモーター遺伝子を切り出
し、アガロースゲル電気泳動により単離した。単離した
遺伝子断片をニックトランスレーション緩衝液中でｄＴ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰ存在下におい
てKlenow断片と反応させ末端を平滑にした。
【００４１】一方、プラスミドｐＨＡ−13をＮruＩ緩衝
液中で消化して、線状化した。この線状化したプラスミ
ドと前記の平滑化した遺伝子断片をライゲーション緩衝
液中でＴ４リガーゼで連結し、大腸菌ＪＭ109 を形質転
換した。形質転換体から得られたプラスミドは、制限酵
素による分析の結果、７．５ｋＤプロモーター（Ｐ7.5
）がＨＡ遺伝子の方向と同じ向きに挿入されたもので
あった。これをｐＶＲ−１と命名した（図１）。
液中で消化して、線状化した。この線状化したプラスミ
ドと前記の平滑化した遺伝子断片をライゲーション緩衝
液中でＴ４リガーゼで連結し、大腸菌ＪＭ109 を形質転
換した。形質転換体から得られたプラスミドは、制限酵
素による分析の結果、７．５ｋＤプロモーター（Ｐ7.5
）がＨＡ遺伝子の方向と同じ向きに挿入されたもので
あった。これをｐＶＲ−１と命名した（図１）。
【００４２】実施例 ３ 組換えプラスミドの作製 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスのエンベロープ領域の遺伝子を
ワクシニアウイルスのゲノムのＨＡ遺伝子中に組み込む
ために用いる組換えベクターを以下の方法で作製した。
ワクシニアウイルスのゲノムのＨＡ遺伝子中に組み込む
ために用いる組換えベクターを以下の方法で作製した。
【００４３】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの構造蛋白質をコ
ードする領域をもつクローンＣ10−Ｅ12（微工研条寄第
3444号）（特願平２−413844号）を低塩濃度緩衝液中で
ＫpnＩにて消化し、約1.0kbpの遺伝子断片をアガロース
ゲル電気泳動により単離し遺伝子断片を得た（図１）。
ードする領域をもつクローンＣ10−Ｅ12（微工研条寄第
3444号）（特願平２−413844号）を低塩濃度緩衝液中で
ＫpnＩにて消化し、約1.0kbpの遺伝子断片をアガロース
ゲル電気泳動により単離し遺伝子断片を得た（図１）。
【００４４】また、組換え用プラスミドｐＶＲ−１を低
塩濃度緩衝液中で同じくＫpnＩにて消化し、線状化し
た。両者をライゲーション緩衝液中でＴ４リガーゼによ
り連結した。この連結物を用いて大腸菌ＨＢ101 を形質
転換し、形質転換体よりアルカリ法にてプラスミドを回
収した。制限酵素による分析を行ない、エンベロープ領
域がプロモーターの下流に同方向に連結されているプラ
スミドを得、これをＰ７．５−Ｅ１２と命名した。
塩濃度緩衝液中で同じくＫpnＩにて消化し、線状化し
た。両者をライゲーション緩衝液中でＴ４リガーゼによ
り連結した。この連結物を用いて大腸菌ＨＢ101 を形質
転換し、形質転換体よりアルカリ法にてプラスミドを回
収した。制限酵素による分析を行ない、エンベロープ領
域がプロモーターの下流に同方向に連結されているプラ
スミドを得、これをＰ７．５−Ｅ１２と命名した。
【００４５】実施例 ４ 組換えワクシニアウイルスの作製 ａ）トランスフェクションに用いるＤＮＡの調製 DIAGENプラスミドキット（DIAGEN社製）を用いて、２０
０mlの培養液で培養した大腸菌から１５０μｇのプラス
ミドＰ7.5 −Ｅ12を抽出した。このプラスミドをＣｓＣ
ｌ密度勾配遠心法により精製した。すなわち、プラスミ
ドをρ＝1.47ｇ／mlのＣｓＣｌ液（ＥｔＢｒ含有）に溶
解し、クイックシールチューブ（ベックマン社製、ウル
トラクリアー、１３×５１mm）に充填したものを、10
℃、55,000rpm で１５時間遠心した。（VTi 65.2ロータ
ー、ベックマン超遠心機）。遠心後、closed circular
プラスミドＤＮＡのバンドを回収し、イソプロパノール
抽出を３回行ないＥｔＢｒを除去した。続いて、エタノ
ール沈殿により、精製プラスミドを得た。
０mlの培養液で培養した大腸菌から１５０μｇのプラス
ミドＰ7.5 −Ｅ12を抽出した。このプラスミドをＣｓＣ
ｌ密度勾配遠心法により精製した。すなわち、プラスミ
ドをρ＝1.47ｇ／mlのＣｓＣｌ液（ＥｔＢｒ含有）に溶
解し、クイックシールチューブ（ベックマン社製、ウル
トラクリアー、１３×５１mm）に充填したものを、10
℃、55,000rpm で１５時間遠心した。（VTi 65.2ロータ
ー、ベックマン超遠心機）。遠心後、closed circular
プラスミドＤＮＡのバンドを回収し、イソプロパノール
抽出を３回行ないＥｔＢｒを除去した。続いて、エタノ
ール沈殿により、精製プラスミドを得た。
【００４６】中塩濃度緩衝液中で上記の精製したＰ7.5
−Ｅ12をＨinｄIII により開裂した。この線状化した組
換えベクターをトランスフェクション用に２５μｇ用意
した。
−Ｅ12をＨinｄIII により開裂した。この線状化した組
換えベクターをトランスフェクション用に２５μｇ用意
した。
【００４７】ｂ）トランスフェクション 遺伝子の導入はPerkesらのエレクトロポレーション法
［Marion E. Perkus、Keith Limbach and Enzo Paolett
i 、J. Virol. 63、3829−3836（1989）］に準じて行っ
た。すなわち、１７５cm2 のカルチャーボトルに単層培
養したウサギ腎臓由来細胞株ＲＫ１３細胞にワクシニア
ウイルス・リスター株をm.o.i. 5で感染させ、３７℃、
５％ＣＯ2 下で１時間吸着させた後、トリプシンを用い
て感染細胞を回収した。回収した細胞をＨｅＢＳバッフ
ァー（ｐＨ7.05）で２回洗浄し、ａ）でトランスフェク
ション用に調製したＤＮＡ２５μｇと共に０．８mlのＨ
ｅＢＳバッファーに懸濁した。パルサーキュベット（バ
イオラッド社製）に細胞懸濁液を移し、この状態で１０
分間、氷上にて冷却した。この後、バイオラッドジーン
パルサーで２００Ｖ（Capacitance 、 960μＦ）のパル
スを１回かけた。再度、氷上にて１０分間冷却し、細胞
を２０mlの１０％ FCS−MEM に懸濁し、１７５cm2 のカ
ルチャーボトルで３７℃、５％ＣＯ2 存在下にて培養し
た。２４時間後、この培養物の凍結融解を３回繰り返
し、ウイルスを回収した。
［Marion E. Perkus、Keith Limbach and Enzo Paolett
i 、J. Virol. 63、3829−3836（1989）］に準じて行っ
た。すなわち、１７５cm2 のカルチャーボトルに単層培
養したウサギ腎臓由来細胞株ＲＫ１３細胞にワクシニア
ウイルス・リスター株をm.o.i. 5で感染させ、３７℃、
５％ＣＯ2 下で１時間吸着させた後、トリプシンを用い
て感染細胞を回収した。回収した細胞をＨｅＢＳバッフ
ァー（ｐＨ7.05）で２回洗浄し、ａ）でトランスフェク
ション用に調製したＤＮＡ２５μｇと共に０．８mlのＨ
ｅＢＳバッファーに懸濁した。パルサーキュベット（バ
イオラッド社製）に細胞懸濁液を移し、この状態で１０
分間、氷上にて冷却した。この後、バイオラッドジーン
パルサーで２００Ｖ（Capacitance 、 960μＦ）のパル
スを１回かけた。再度、氷上にて１０分間冷却し、細胞
を２０mlの１０％ FCS−MEM に懸濁し、１７５cm2 のカ
ルチャーボトルで３７℃、５％ＣＯ2 存在下にて培養し
た。２４時間後、この培養物の凍結融解を３回繰り返
し、ウイルスを回収した。
【００４８】回収したウイルスから組換えウイルスを赤
血球吸着試験（ＨＡ試験）によって選択した。試験の方
法は以下のとおりである。９cmシャーレに単層培養した
ＲＫ１３細胞に６００プラーク／シャーレになるように
ウイルスを接種し、２日間培養してプラーを形成させ
た。培養上清を除き、０．５％のニワトリ赤血球液を添
加した。３７℃で１０分間インキュベートした後、プラ
ークを観察し、赤血球を吸着しないプラーク（組換えウ
イルス候補株）を得た。
血球吸着試験（ＨＡ試験）によって選択した。試験の方
法は以下のとおりである。９cmシャーレに単層培養した
ＲＫ１３細胞に６００プラーク／シャーレになるように
ウイルスを接種し、２日間培養してプラーを形成させ
た。培養上清を除き、０．５％のニワトリ赤血球液を添
加した。３７℃で１０分間インキュベートした後、プラ
ークを観察し、赤血球を吸着しないプラーク（組換えウ
イルス候補株）を得た。
【００４９】次に、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス構造蛋白質
領域の遺伝子をプローブとして、先に得られた組換えウ
イルス候補株３４クローンのうち１２クローンのプラー
クハイブリダイゼーションを行い、候補株から、さらに
遺伝子が組込まれた組換えウイルスを選択した。まず、
３cmシャーレに単層培養したＲＫ−１３細胞に組換えウ
イルス候補株を２０〜５０プラーク／シャーレになるよ
うに接種し、２日間培養してプラークを形成させた。形
成したプラークの上にナイロンメンブラン（ハイボンド
Ｎ、アマーシャム社製）をのせてプラークをメンブラン
上に移し、０．５Ｎ ＮａＯＨにより５分間処理してＤ
ＮＡを変性させた後、 1M Tris-HCl(pH7.4)で中和し、
さらに1.5M NaCl 、0.5M Tris-HCl(pH 7.4) で処理して
ＤＮＡをメンブランに吸着させた。メンブランを風乾し
たのち、３０５ nm の紫外線を５分間照射してＤＮＡを
メンブランに固定した。ハイブリダイゼーションバッフ
ァーにこのメンブランを浸し、６５℃で１時間インキュ
ベートした。さらに、ランダムプライムラベリング法を
用いて32Ｐで標識した非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス構造蛋白
質領域の遺伝子を加えたハイブリダイゼーションバッフ
ァーにメンブランを移し、６５℃で一晩反応させ、プロ
ーブＤＮＡと組換えウイルスＤＮＡをハイブリダイズさ
せた。１×ＳＳＣ、 0.1％ＳＤＳ、６５℃で１０分間ず
つ２回洗浄し、−７０℃でオートラジオグラフィーを行
ない、陽性クローンを検出した。
領域の遺伝子をプローブとして、先に得られた組換えウ
イルス候補株３４クローンのうち１２クローンのプラー
クハイブリダイゼーションを行い、候補株から、さらに
遺伝子が組込まれた組換えウイルスを選択した。まず、
３cmシャーレに単層培養したＲＫ−１３細胞に組換えウ
イルス候補株を２０〜５０プラーク／シャーレになるよ
うに接種し、２日間培養してプラークを形成させた。形
成したプラークの上にナイロンメンブラン（ハイボンド
Ｎ、アマーシャム社製）をのせてプラークをメンブラン
上に移し、０．５Ｎ ＮａＯＨにより５分間処理してＤ
ＮＡを変性させた後、 1M Tris-HCl(pH7.4)で中和し、
さらに1.5M NaCl 、0.5M Tris-HCl(pH 7.4) で処理して
ＤＮＡをメンブランに吸着させた。メンブランを風乾し
たのち、３０５ nm の紫外線を５分間照射してＤＮＡを
メンブランに固定した。ハイブリダイゼーションバッフ
ァーにこのメンブランを浸し、６５℃で１時間インキュ
ベートした。さらに、ランダムプライムラベリング法を
用いて32Ｐで標識した非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス構造蛋白
質領域の遺伝子を加えたハイブリダイゼーションバッフ
ァーにメンブランを移し、６５℃で一晩反応させ、プロ
ーブＤＮＡと組換えウイルスＤＮＡをハイブリダイズさ
せた。１×ＳＳＣ、 0.1％ＳＤＳ、６５℃で１０分間ず
つ２回洗浄し、−７０℃でオートラジオグラフィーを行
ない、陽性クローンを検出した。
【００５０】この結果、５クローンが陽性であり、それ
ぞれクローンをＰ７．５−Ｅ１２／ＲＬＶ ＃７、８、
９、１０、１１と命名した。
ぞれクローンをＰ７．５−Ｅ１２／ＲＬＶ ＃７、８、
９、１０、１１と命名した。
【００５１】実施例５ 間接蛍光抗体法による発現の確認 単層培養したＲＫ−１３細胞を0.05％トリプシン・０．
１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液で処理し単細胞にしたのちにＭＥ
Ｍ培養液（５％仔牛血清、0.22％炭酸水素ナトリウム）
に５万個／mlになるように分散する。この細胞溶液にワ
クシニア親株のリスター株及びＰ７．５−Ｅ１２／ＲＬ
Ｖをm.o.i.＝0.1 になるように別々に接種する。ウイル
スが接種された細胞を２０μｌ／穴で１２穴スライドグ
ラスにのせ３７℃、５％ＣＯ2 下で１晩培養する。培養
したスライドグラスを蒸留水で１回洗浄し風乾後、−２
０℃の５％アセトン・５０％メタノール混液に１５分間
漬けて固定化する。固定後風乾し、ＰＢＳ（−）で５０
倍に希釈した非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清を２０μｌ／穴ず
つのせて３７℃で４０分間反応させる。４０分間の反応
後ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、２５０倍にＰＢＳ（−）
で希釈した抗ヒトＩｇＧ・ＦＩＴＣ標識（ヤギ）を２０
μｌ／穴ずつのせてさらに３７℃で３０分間反応させ
る。反応終了後ＰＢＳ（−）で３回洗浄し蛍光顕微鏡で
観察したところリスター株を感染させた細胞には蛍光が
認められなかったがＰ７．５−Ｅ１２／ＲＬＶを感染さ
せた細胞には強い特異蛍光が認められた（図２）。
１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液で処理し単細胞にしたのちにＭＥ
Ｍ培養液（５％仔牛血清、0.22％炭酸水素ナトリウム）
に５万個／mlになるように分散する。この細胞溶液にワ
クシニア親株のリスター株及びＰ７．５−Ｅ１２／ＲＬ
Ｖをm.o.i.＝0.1 になるように別々に接種する。ウイル
スが接種された細胞を２０μｌ／穴で１２穴スライドグ
ラスにのせ３７℃、５％ＣＯ2 下で１晩培養する。培養
したスライドグラスを蒸留水で１回洗浄し風乾後、−２
０℃の５％アセトン・５０％メタノール混液に１５分間
漬けて固定化する。固定後風乾し、ＰＢＳ（−）で５０
倍に希釈した非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清を２０μｌ／穴ず
つのせて３７℃で４０分間反応させる。４０分間の反応
後ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、２５０倍にＰＢＳ（−）
で希釈した抗ヒトＩｇＧ・ＦＩＴＣ標識（ヤギ）を２０
μｌ／穴ずつのせてさらに３７℃で３０分間反応させ
る。反応終了後ＰＢＳ（−）で３回洗浄し蛍光顕微鏡で
観察したところリスター株を感染させた細胞には蛍光が
認められなかったがＰ７．５−Ｅ１２／ＲＬＶを感染さ
せた細胞には強い特異蛍光が認められた（図２）。
【００５２】実施例６ 免疫沈降法による発現の確認 ＲＫ−１３細胞を５％牛血清ＥＭＥＭ培地で１晩培養し
モノレーヤーを形成させた。これにリスター株又はＰ
７．５−Ｅ１２／ＲＬＶを感染させグルコースの代りに
１０ｍＭフルクトースを含むＥＭＥＭに１００μＣｉの
3Ｈ−グルコサミンを添加して１６時間培養した。正常
人血清又は非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清とプロテインＡセフ
ァロースとを用いた免疫沈降法で特異抗原蛋白質を沈降
させＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）で分析した。その結果Ｐ７．５−Ｅ１２
／ＲＬＶ感染細胞を非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清で免疫沈降
したものだけにｇｐ３５の特異的なバンドが認められ発
現していることが確認された（図３）。
モノレーヤーを形成させた。これにリスター株又はＰ
７．５−Ｅ１２／ＲＬＶを感染させグルコースの代りに
１０ｍＭフルクトースを含むＥＭＥＭに１００μＣｉの
3Ｈ−グルコサミンを添加して１６時間培養した。正常
人血清又は非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清とプロテインＡセフ
ァロースとを用いた免疫沈降法で特異抗原蛋白質を沈降
させＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）で分析した。その結果Ｐ７．５−Ｅ１２
／ＲＬＶ感染細胞を非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清で免疫沈降
したものだけにｇｐ３５の特異的なバンドが認められ発
現していることが確認された（図３）。
【００５３】実施例７ Ｐ７．５−Ｅ１２／ＲＬＶ免疫ウサギ血清を用いた免疫
沈降試験 Ｐ７．５−Ｅ１２／ＲＬＶを日本白色種ウサギ（１．５
〜２．０kg）の背部皮内に１０8 ＰＦＵを接種し２カ月
後に血清を採取した。
沈降試験 Ｐ７．５−Ｅ１２／ＲＬＶを日本白色種ウサギ（１．５
〜２．０kg）の背部皮内に１０8 ＰＦＵを接種し２カ月
後に血清を採取した。
【００５４】一方、ブルースクリプトＫＳベクター（St
rategene）のＴ７プロモーター下流に C10−E12 DNA を
挿入しインビトロ・トランスクリプションにより C10−
E12DNA に相補的なＲＮＡを合成した。この合成したＲ
ＮＡをもちいてウサギレティキュロサイト抽出液中でイ
ンビトロ・トランスレーションを行い C10−E12 DNAで
コードされるポリペプチドの試験管内合成を行なった。
rategene）のＴ７プロモーター下流に C10−E12 DNA を
挿入しインビトロ・トランスクリプションにより C10−
E12DNA に相補的なＲＮＡを合成した。この合成したＲ
ＮＡをもちいてウサギレティキュロサイト抽出液中でイ
ンビトロ・トランスレーションを行い C10−E12 DNAで
コードされるポリペプチドの試験管内合成を行なった。
【００５５】先に得られたウサギ免疫血清と合成された
ポリペプチドとを用いて実施例６と同様に免疫沈降試験
を行なった（図４）。
ポリペプチドとを用いて実施例６と同様に免疫沈降試験
を行なった（図４）。
【００５６】この結果レーン２に示したようにＰ７．５
−Ｅ１２／ＲＬＶ免疫ウサギの血清中には非Ａ非Ｂ型肝
炎ウイルスの構造蛋白質領域をコードする C10−E12 DN
A からつくられたポリプロテインと特異的に反応する抗
体が産生されていることが確認できた。
−Ｅ１２／ＲＬＶ免疫ウサギの血清中には非Ａ非Ｂ型肝
炎ウイルスの構造蛋白質領域をコードする C10−E12 DN
A からつくられたポリプロテインと特異的に反応する抗
体が産生されていることが確認できた。
【００５７】
【発明の効果】本発明により、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス
抗原蛋白質、特にエンベロープ蛋白質のような糖蛋白質
の発現、産生が可能となり、従って、非Ａ非Ｂ型肝炎の
治療又は予防のための、有効な免疫化を付与し得るワク
チン抗原の提供を実現した。
抗原蛋白質、特にエンベロープ蛋白質のような糖蛋白質
の発現、産生が可能となり、従って、非Ａ非Ｂ型肝炎の
治療又は予防のための、有効な免疫化を付与し得るワク
チン抗原の提供を実現した。
【図１】この図は、組換えプラスミド及び組換えワクシ
ニアウイルスの作製方法を示す。図中、ｐ２２は非Ａ非
Ｂ型肝炎ウイルスゲノム上のコアをコードする遺伝子、
ｇｐ３５はエンベロープをコードする遺伝子、およびｇ
ｐ７５は非構造蛋白質をコードする遺伝子を表わす。
ニアウイルスの作製方法を示す。図中、ｐ２２は非Ａ非
Ｂ型肝炎ウイルスゲノム上のコアをコードする遺伝子、
ｇｐ３５はエンベロープをコードする遺伝子、およびｇ
ｐ７５は非構造蛋白質をコードする遺伝子を表わす。
【図２】この図は、ワクシニアウイルス・リスター株
（対照）又はＰ７．５−Ｅ１２／ＲＬＶ感染細胞を非Ａ
非Ｂ型肝炎患者血清と反応させた後、ＦＩＴＣ標識抗ヒ
トＩｇＧ抗体（ヤギ）を用いて蛍光抗体染色した結果を
示す写真である。
（対照）又はＰ７．５−Ｅ１２／ＲＬＶ感染細胞を非Ａ
非Ｂ型肝炎患者血清と反応させた後、ＦＩＴＣ標識抗ヒ
トＩｇＧ抗体（ヤギ）を用いて蛍光抗体染色した結果を
示す写真である。
【図３】この図は、ワクシニアウイルス・リスター株
（対照）又はＰ７．５−Ｅ１２／ＲＬＶ感染細胞と正常
人血清又は非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清との免疫沈降試験の
結果を示す写真である。但し、 レーン１，３：リスター株感染細胞 レーン２，４：Ｐ７．５−Ｅ１２／ＲＬＶ感染細胞 レーン１，２：正常人血清 レーン３，４：非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清 を示す。また、図中左端の数字は分子量マーカー（アマ
シャム社レインボウマーカー使用）を示す。
（対照）又はＰ７．５−Ｅ１２／ＲＬＶ感染細胞と正常
人血清又は非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清との免疫沈降試験の
結果を示す写真である。但し、 レーン１，３：リスター株感染細胞 レーン２，４：Ｐ７．５−Ｅ１２／ＲＬＶ感染細胞 レーン１，２：正常人血清 レーン３，４：非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清 を示す。また、図中左端の数字は分子量マーカー（アマ
シャム社レインボウマーカー使用）を示す。
【図４】この図は、Ｐ７．５−Ｅ１２／ＲＬＶ免疫ウサ
ギ血清または正常人血清と、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの
構造蛋白領域をコードするＣ１０−Ｅ１２ ＤＮＡをも
とにインビトロ・トランスレーションにより作られたポ
リプロテインとの免疫沈降試験の結果および合成ポリプ
ロテインの電気泳動の結果を示す写真である。レーン１
〜５の説明は以下のとおりである。 レーン１：インビトロ・トランスレーションをキャニン
・ミクロゾーム膜存在下で行い、糖鎖の付加と合成され
た蛋白質のプロセシングを行い、得られた合成蛋白質と
正常人血清との免疫沈降試験の結果を示す。正常人血清
には抗体が存在しないため特異的な沈降は認められな
い。 レーン２：上記の合成蛋白質とｐ７．５−Ｅ１２／ＲＬ
Ｖ免疫ウサギ血清との免疫沈降試験の結果を示す。ウサ
ギ血清にはｇｐ３５に対する抗体が存在するため３５ｋ
Ｄａの分子量のところに特異的なバンドが認められる。 レーン３：上記の合成蛋白質の電気泳動の結果を示す。
３５ｋＤａの分子量に相当するところにｇｐ３５の存在
を示すバンドが認められる。 レーン４：キャニン・ミクロゾーム膜非存在下でインビ
トロ・トランスレーションを行って得られた合成蛋白質
の電気泳動の結果を示す。合成された蛋白質は、プロセ
シングが行われていないので、ｇｐ３５の両端にｐ２２
の一部およびｇｐ７５の一部が付加した蛋白質となって
いる。 レーン５：インビトロ・トランスレーション時にＲＮＡ
を添加しなかった対照の電気泳動の結果を示す。蛋白質
が合成されないためバンドが現れていない。 また、図中左端の数字は分子量マーカーを示す。
ギ血清または正常人血清と、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの
構造蛋白領域をコードするＣ１０−Ｅ１２ ＤＮＡをも
とにインビトロ・トランスレーションにより作られたポ
リプロテインとの免疫沈降試験の結果および合成ポリプ
ロテインの電気泳動の結果を示す写真である。レーン１
〜５の説明は以下のとおりである。 レーン１：インビトロ・トランスレーションをキャニン
・ミクロゾーム膜存在下で行い、糖鎖の付加と合成され
た蛋白質のプロセシングを行い、得られた合成蛋白質と
正常人血清との免疫沈降試験の結果を示す。正常人血清
には抗体が存在しないため特異的な沈降は認められな
い。 レーン２：上記の合成蛋白質とｐ７．５−Ｅ１２／ＲＬ
Ｖ免疫ウサギ血清との免疫沈降試験の結果を示す。ウサ
ギ血清にはｇｐ３５に対する抗体が存在するため３５ｋ
Ｄａの分子量のところに特異的なバンドが認められる。 レーン３：上記の合成蛋白質の電気泳動の結果を示す。
３５ｋＤａの分子量に相当するところにｇｐ３５の存在
を示すバンドが認められる。 レーン４：キャニン・ミクロゾーム膜非存在下でインビ
トロ・トランスレーションを行って得られた合成蛋白質
の電気泳動の結果を示す。合成された蛋白質は、プロセ
シングが行われていないので、ｇｐ３５の両端にｐ２２
の一部およびｇｐ７５の一部が付加した蛋白質となって
いる。 レーン５：インビトロ・トランスレーション時にＲＮＡ
を添加しなかった対照の電気泳動の結果を示す。蛋白質
が合成されないためバンドが現れていない。 また、図中左端の数字は分子量マーカーを示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 15/39 15/51 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 8214−4Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/86 (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 小原 道法 埼玉県入間郡大井町西鶴ケ岡一丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内
Claims (18)
- 【請求項１】 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質をコ
ードする塩基配列を含む遺伝子と、該遺伝子を発現させ
得るウイルスプロモーターと、及びワクシニアウイルス
の増殖のために必須でないワクシニアウイルス遺伝子と
を含有するプラスミド。 - 【請求項２】 前記抗原蛋白質がウイルス構造蛋白質で
ある請求項１記載のプラスミド。 - 【請求項３】 前記構造蛋白質がエンベロープ糖蛋白質
である請求項２記載のプラスミド。 - 【請求項４】 前記ウイルスプロモーターがワクシニア
ウイルス由来のプロモーターである請求項１記載のプラ
スミド。 - 【請求項５】 前記ワクシニアウイルス遺伝子がヘマグ
ルチニン遺伝子である請求項１記載のプラスミド。 - 【請求項６】 前記抗原蛋白質をコードする塩基配列を
含む遺伝子及び前記ウイルスプロモーターの１組以上
が、前記ワクシニアウイルス遺伝子中に挿入されている
ことを特徴とする請求項１記載のプラスミド。 - 【請求項７】 プラスミドＰ７．５−Ｅ１２。
- 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか一項に記載のプ
ラスミドとワクシニアウイルスの相同性組換えにより得
られた組換えワクシニアウイルス。 - 【請求項９】 組換えワクシニアウイルスＰ７．５−Ｅ
１２／ＲＬＶ。 - 【請求項１０】 請求項８又は９記載の組換えワクシニ
アウイルスの製造方法であって、 請求項１〜７のいずれか一項に記載のプラスミドを制限
的に線状化し、ワクシニアウイルスが感染している動物
細胞にトランスフェクションして相同性組換えを行う段
階、及び 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質をコード
する塩基配列を含む遺伝子が挿入されている組換えウイ
ルスをスクリーニングし、回収する段階を含む方法。 - 【請求項１１】 ワクシニアウイルスがワクシニアウイ
ルス・リスター株である請求項１０記載の方法。 - 【請求項１２】 前記動物細胞がウサギ腎継代細胞ＲＫ
−１３である請求項１０記載の方法。 - 【請求項１３】 請求項８又は９記載の組換えワクシニ
アウイルスを動物細胞に感染し、該細胞を培養して非Ａ
非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質をコードする塩基配列を
含む遺伝子を発現させ、発現蛋白質を回収することから
成る発現非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質の製造方
法。 - 【請求項１４】 前記動物細胞がウサギ腎継代細胞ＲＫ
−１３である請求項１３記載の方法。 - 【請求項１５】 請求項１３又は１４記載の方法によっ
て得られる、糖を有する発現非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗
原蛋白質。 - 【請求項１６】 請求項１５記載の糖を有する発現非Ａ
非Ｂ型肝炎ウイルス抗原蛋白質を含む、非Ａ非Ｂ型肝炎
を治療又は予防するためのワクチン。 - 【請求項１７】 弱毒化した請求項８又は９記載の組換
えワクシニアウイルスを含む、非Ａ非Ｂ型肝炎を治療又
は予防するためのワクチン。 - 【請求項１８】 不活化した請求項８又は９記載の組換
えワクシニアウイルスを含む、非Ａ非Ｂ型肝炎を治療又
は予防するためのワクチン。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3204030A JPH0585943A (ja) | 1991-07-18 | 1991-07-18 | 組換えワクシニアウイルスを用いる非ａ非ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現および非ａ非ｂ型肝炎ワクチン |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3204030A JPH0585943A (ja) | 1991-07-18 | 1991-07-18 | 組換えワクシニアウイルスを用いる非ａ非ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現および非ａ非ｂ型肝炎ワクチン |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0585943A true JPH0585943A (ja) | 1993-04-06 |
Family
ID=16483598
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3204030A Pending JPH0585943A (ja) | 1991-07-18 | 1991-07-18 | 組換えワクシニアウイルスを用いる非ａ非ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現および非ａ非ｂ型肝炎ワクチン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0585943A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997016539A1 (fr) * | 1995-11-01 | 1997-05-09 | Dnavec Research Inc. | Virus sendai recombinant |
| JP2001253833A (ja) * | 2000-03-10 | 2001-09-18 | Handai Biseibutsubiyou Kenkyukai | 生ワクチンの細胞性免疫活性を不活化ワクチンにも起こさせる方法、及びこれより得られる混合ワクチン |
| US6645760B2 (en) | 1995-10-31 | 2003-11-11 | Dnavec Research Inc. | Negative strand RNA viral vector having autonomous replication capability |
| EP1489164A1 (en) * | 2003-06-18 | 2004-12-22 | Genelux GmbH | Recombinant vaccinia viruses with modified F3 genes, uses thereof |
-
1991
- 1991-07-18 JP JP3204030A patent/JPH0585943A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6645760B2 (en) | 1995-10-31 | 2003-11-11 | Dnavec Research Inc. | Negative strand RNA viral vector having autonomous replication capability |
| US6723532B2 (en) | 1995-10-31 | 2004-04-20 | Dnavec Research Inc. | Negative strand RNA viral vector having autonomous replication capability |
| WO1997016539A1 (fr) * | 1995-11-01 | 1997-05-09 | Dnavec Research Inc. | Virus sendai recombinant |
| US7101685B2 (en) | 1995-11-01 | 2006-09-05 | Dnavec Research Inc. | Recombinant Sendai virus |
| US7442544B2 (en) | 1995-11-01 | 2008-10-28 | Dnavec Research Inc. | Recombinant sendai virus |
| JP2001253833A (ja) * | 2000-03-10 | 2001-09-18 | Handai Biseibutsubiyou Kenkyukai | 生ワクチンの細胞性免疫活性を不活化ワクチンにも起こさせる方法、及びこれより得られる混合ワクチン |
| EP1489164A1 (en) * | 2003-06-18 | 2004-12-22 | Genelux GmbH | Recombinant vaccinia viruses with modified F3 genes, uses thereof |
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