JPH05508856A - 抗体接合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗体接合体 本発明は、細胞障害性Ｔ細胞（ｅｙｔｏｔｏｘｊｃ　Ｔ−ｃｅｌｌｓ）（ＣＴＬ ）を活性化することができる抗体接合体に関する。

この接合体は、とくに発癌、自己免疫過程、寄生体感染ならびに細菌、ウィルス およびかびの感染に関連する望ましくない細胞の破壊に有用である。

発明の背景 標的細胞に対する選択的作用を付与し、他の細胞に対する非特異的作用を最小限 にするため、標的細胞に直接毒性作用を発揮する薬剤（細胞障害剤、細胞毒素） と組合わせて抗体を使用することは、何年も前から試みられてきた。これまでに 示唆されてきた組合わせは、連鎖付与分子を用いた共有結合複合体および非共有 結合複合体から単純な混合物にまで及んでいる〔たとえば、ＧｈＯ３ｅら：Ｊ、 Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　■ｎｓｔ、６１　（１９７９）　６５７−６７６およ びＣａｒｌｓｓｏｎら：　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７（１９８９）５６７ −５７３）　、示唆されている細胞毒素には、たとえば、ジフテリア毒素、リシ ン、リシンのサブユニットＡ１ゲロニン、および緑膿菌外毒素Ａがある（Ｔａｋ ｅｄａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄ、、ＥＰ−Ａ−３３６、４０５およびＰａ５ ｔａｎら、ＷＯ−＾−８８１００７０３、いずれも優先権出願、５Ｅ−９００２ ４７９に関連して引用された）。

ハイブリドーマ技術の出現と、それに伴いモノクローナル抗体が利用可能になっ たことから、細胞障害剤を、意図された標的細胞集団へさらに特異的に指向させ るため、抗体と細胞障害剤の複合体を用いるという考え方の利用が容易になって きた。

細胞障害剤に認められる標的細胞以外の細胞に対する障害作用から、細胞障害剤 を、Ｔリンパ球を感作してＣＴＬを活性化する免疫刺激物質に置換することが示 唆されている。特定の提案には、 （ｉ）Ｔ細胞受容体、またはＴｍＦ１受容体に結合できる化合物に対する抗体（ ｌ［ａｓｓ、Ｉｎ５ｔ、Ｔｅｃｈｎ、、ＥＰ−＾１−１８０．１７１）　； （ｉｆ）　抗原、ミトゲン、他の異種蛋白質、および細胞障害性Ｔ細胞を活性化 するペプチドのような化合物（Ｎｅｏｒｅｘ　Ｃａｒｐ、、　ＥＰ−ＡＩ−３３ ４，３００）　；（ｆｆｌ）　ＭＨＣ抗原（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ　ＡＧ、 ＥＰ−ＡＩ−３５２，７６１）　；（汁）処置される個体が免疫を有する抗原［ １１ｅｄ、Ｒｅｓ。

Ｃｏｕｎｃ、　ＷＯ−＾−９０／　１１７７９（１９９０−１０−１８公告）〕 ：および（ｖ＞　無考の細菌エンテロトキシン（Ｏｃｈｉ　＆　Ｗａｋｅ。

ＵＣＬＡ−３ｙｍｐｏｓｉｕｍ　：　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｎｕｎｉｔｙ　ａｎ ｄ　ｔｈｅ　Ｉｍｍｕｎｏ−ｔｈｅｒａｐｙ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒｓ、　１９９ ０年１月２７日〜２月３日、＾ｂｓ−ｔｒａｃｔ　ＣＥ５１５．１０９頁）があ る。

しかしながら、これまでに示唆されている免疫刺激剤の作用は、特異的すぎるか または一般的すぎる。たとえば、古典的抗原は１０’個のＴ細胞巾約１個を活性 化するにすぎないし、一方、ミトゲンは大部分のＴ細胞を活性化する可能性があ る。

これまでに、ある種の薬剤が適度の比率のＴ細胞の活性化を仲介することは認め られている。すなわち、それらは比較的高頻度でＴ細胞を活性化するが、１００ ％よりははるかに低頻度である［Ｆ１６ｉｓｃｈｅｒら：　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｗｅｄ 。

１６７（１９８ｇ）１６９７−１７０７　、およびＷｈｉｔｅら：　Ｃｅ１ｌ　 ５６（１９８９）２７−３５、両文献とも参照によって本明細書に導入〕。この 種類の抗原は古典的抗原よりも有効なアクティベーターであり、したがって超抗 原と命名されている（Ｋａｐｐｌｅｒ＆　Ｍａｒｒａｃｋ　：　５ｃｉｅｎｃｅ 　２４８　：　７０５（１９９０）参照〕。さらに、現在知られている限りの超 抗原は、標的細胞上のＭｌ’ＩＣクラス■分子に結合し、適切なＴ細胞受容体Ｖ β鎖をもつ細胞障害性Ｔ細胞を活性化する能力をもつことが明らかにされている 。発表されているデータは、Ｔ細胞の結合および活性化が起こるには、ＭＨＣの 結合が必須であることを示している。Ｔ細胞受容体Ｖα鎖またはＴ細胞の亜集団 上にのみみられる他の表面構造を介して作用する超抗原が、将来見出される可能 性は否定できない。

Ｐｌａｔｓｏｕｃａｓら（Ｃｅｌｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、９７（１９８６）３７１ −３８５）により、超抗原、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）の免疫修 飾作用も報告されている。

現在知られている超抗原の大部分は、以前にはトキシンとして認識されていたも ので、それらはすべて微生物起源のものである。たとえば、ブドウ球菌エンテロ トキシンは、腸管前であり、またＴ細胞を活性化するものであり、そしてこの２ つの作用は互いに識別可能である（Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒら：Ｃｅ１１．　Ｉｍｍ ｕｎｏｌ、１１８　（１９８９）　９２−１０１　；＾１ｂｅｒら：　Ｊ、Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、、１４４　（１９９０）　４５０１−４５０６　；およびＩｎｆｅ ｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、５９（１９９１）２１２６−２１３４）　。

１１Ｈｃクラス■抗原をもつ細胞のＣＴＬによる溶解を意図した超抗原の使用が 以前に示唆されている（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＡＢ。

１０−＾−９１１０４０５３，１９９１−０４−０４公告）。ＷＯ−＾−９１１ ０４０５３は、共有結合免疫接合体へ導入された超抗原を包含しているが、それ について明瞭には言及していない。

ＭＩＩＣクラス■を欠（かまたはＭＨＣクラス■蛋白質をわずかしか発現しない 細胞は、しかしながら、ＣＴＬによるそれらの溶解を効率的に指示するために十 分な量の超抗原を結合しない。したがって、ＩＩＨｃクラス■抗原をもつ細胞は 一般的に豊富であり、大部分の腫瘍細胞上にはＭＩＩＣクラス■抗原は豊富では ないことから１、このような望ましくない細胞の特異的な殺滅における超抗原の 価値は低い。

しかしながら、本発明者らは、超抗原を、殺滅すべき細胞に特異的なエピトープ に対する抗体に共有結合させると、ＣＴＬによって仲介される特異的細胞殺減作 用が超抗原によって達成できることを見出したのである。免疫系の活性化がＩＨ Ｃクラス■抗原を欠く標的細胞にその発現を誘導し、それが所望の溶解作用を増 強する。

発明の要約 本発明は、 （ｉ）（１）標的細胞に対する抗体および（２）超抗原、すなわちＴ細胞とくに ＣＴＬを認識（相互作用もしくはそれと結合）して活性化する構造とからなる新 規な抗体接合体、 （ｉｉ）　とくに哺乳動物を対象とした治療的処置方法に関連した標的細胞の破 壊方法、およびＴ細胞と（にＣＴＬの特異的活性化方法、 （ｆｉｔ）　その接合体の合成方法、ならびに（ｉＶ）　その接合体を含有する 医薬組成物およびその組成物の製造方法、 を提供する。

標的細胞の破壊方法には、ある種の細胞を高い正確度をもって殺滅することを目 的とした、癌、自己免疫、ウィルス感染、細菌感染、かび感染、寄生体感染およ び他の疾患の治療的処置方法が包含される。本発明の接合体は、上述の疾患に関 連して標的細胞の破壊への使用を意図した医薬組成物の製造に用いることができ る。処置される個体は通常、哺乳動物、主としてヒトである。

新規な抗体接合体は、Ｔ細胞によって認識される構造である超抗原によって特徴 づけられる。接合体は通常、生理的ｐ旧こおいて可溶性であり、ｉｎ　ｖｉｔｒ ｏで血清に溶解する。

好ましい超抗原は、ブドウ球菌エンテロトキシン群（ＳＥ）、たとえばＳＥＡ、 ＳＥＢ、　５ＥＣＳＳＥＤおよびＳＥＥ、　）キソイド、それらの活性フラグメ ントまたはペプチド、ならびにＣＴＬの活性化に本質的に同じ作用様式を有する 他の物質から選択される。超抗原には、他の微生物（細菌およびウィルス）産物 、たとえば毒素性ショック症候群トキシン（ＴＳＳＴ−１＞のようなブドウ球菌 株からの産物、発熱エキソトキシンＡのような連鎖球菌からの産物、ならびに細 菌エキソ蛋白質およびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ　ａｒｔｈｒｉｄｉｓによって産生 される蛋白質が包含され、これらは超抗原と同じ様式でＴ細胞と相互作用する類 似の能力を有する。

超抗原は、それらの天然の産生菌類もしくは遺伝子操作（組換え技術）細胞の培 養により得られ、また合成的ペプチド合成によっても得ることができる。本発明 に使用される超抗原は、本明細書に示した実験モデルに適用された場合、本明細 書の実験の部に示した作用と類似の作用を発揮しなければならない。

好ましい超抗原は、ＣＴＬの活性化に関連する多形Ｔ細胞表面蛋白質のイソフオ ーム、好ましくはＴ細胞受容体Ｖβ鎖、約１〜４０％に結合する潜在的能力を有 する。

接合体の抗体部分 抗体はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であることが好ましいが、ポリクローナル 抗体も十分に狭い特異性をもつものであれば使用可能である。抗体の表現は一般 的に抗体を指し、したがって、抗体活性フラグメント、および抗体の結合能を模 倣する他の分子も、問題の標的細胞に対して適当な特異性、結合活性および親和 性を有する限リ、包含される。これは遺伝子操作（組換えによって製造された） 抗体および抗体誘導体または他の類似の結合構造を包含する。一実施態様におい ては、抗体は腫瘍細胞上の抗原決定基、たとえば結腸癌関連決定基（エピトープ 、構造）に特異的である。抗体が、自己免疫に関係する細胞、ウィルス感染細胞 、細菌、寄生体もしくはかび、または他の望ましくない細胞上の抗原決定基に特 異的である場合も考えられる。接合体の効率によっては、抗体は、結合後に抗体 をインターナライズする抗原に対するものであってもよいが、このような抗体の 特異性は好ましくないと考えられる。

本発明に関連して検討されたモノクローナル抗体は、Ｇ＾−７３３フアミリーの 抗原に向けられたＣ２１５抗体〔たとえばＥＰ−＾−３７６、７４６およびそれ に引用された文献ならびにＬａｒｓｓｏｎら、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃ、４２　（ １９８ｇ）　８７７−８８２参照〕、Ｃ２４２抗体［Ｌａｒｓｓｏｎら：　Ｉｎ ｔ、Ｊ、Ｃａｎｃ、４２　（１９８８）　８７７−８８２〕およびＴｈｙ−１， ２抗体（ｍＡｂ　Ｃ，０ｐｉｔｚら：　Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ。

１６０（１９８２）４３８−）である。他の標的細胞表面構造に対して特異性を 有するａ＋Ａｂも有用であることが考えられる。

選ばれた標的細胞に独特なエピトープに対するモノクローナル抗体の製造は本技 術分野においてよく知られている。たとえば、上述の文献が参考になる。Ｃ２４ ２エピトープまたはＣ２１５エピトープに対して向けられたモノクローナル抗体 のような表現は、交差反応エピトープと反応する抗体を包含する。

試験した限りの３種の抗体中、Ｃ２１５接合体は、極めて頻繁に正常細胞上にも 発現する腫瘍抗原上エピトープと反応するので、重要性は多分、低いものと考え られる。

Ｃ２４２接合体は、本発明者らの結果ではより高い投与量を必要とすることを示 しているが、特異性のデータによればより優れていると思われる。Ｔｈｙ−１， ２はＴｈｙ−１，２抗原が非ヒト哺乳動物腫瘍細胞に特異的であることから、ヒ ト癌細胞のターゲティングには多分、価値が低いと思われる。

Ｃ２４２モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系はＥｕｒｏｐｅａｎ　Ｃ ｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、　Ｐｏ ｒｔｏｎＤｏｗｎ、Ｓａｌｔｓｂｕｒｇ、ｔｉｌｔｓ、Ｕ、に、に、１９９０年 １月２６日、ＥＣＡＣＣ９００１２６０１号として寄託された。

超抗原を抗体に連結する構造 本発明の好ましい接合体においては、超抗原は、共有結合連鎖（−Ｂ−）を介し て抗原に共有結合で連結される。

接合体が、殺滅すべき細胞たとえば動物に投与された場合、分解しないことが重 要であれば、連鎖は、達成される効果に十分な期間、代謝的に実質的に安定でな ければならない。さらに、連鎖自体が免疫反応を生じないことが有利である。一 般的に、連鎖は、接合体が有効な標的細胞結合特異性（抗腫瘍、抗ウィルス等） および有効な細胞障害Ｔ細胞活性化能を保持するという意味で不活性でなければ ならない。

科学文献および特許文献には、免疫接合体の連鎖構造として数種の官能基が示唆 されている。本発明の新規な接合体における連鎖−Ｂ−には、 （ｉ）　アミドおよびヒドラジド（アミド＝−ＣＯＮＲ，−または−ＮＲ，Ｃ０ −１この場合、遊離結合価はそれぞれ飽和炭素原子に結合し、Ｒ１は水素もしく はアルカリ置換基たとえば低級アルキル（Ｃ＋〜６）または天然に存在するアミ ノ酸好ましくは親水性アミノ酸のα−Ｎ−置換基であり、ヒドラジド＝−ＣＯＮ ｔｌＮＩＩ−または−ＮＦＩＮｌ’ｌ０Ｃ−１この場合、遊離結合価はそれぞれ 飽和炭素原子に結合する）：（ｉｉ）　千オニーチルおよびジスルフィド（−ｓ ｒ−１この場合、各遊離結合価は飽和炭素原子にそれぞれ直接結合し、Ｓは硫黄 原子であり、ｒは整数１または２であ（ｆｆｌ）　飽和の、１個または２個以上 のヒドロキシまたはアミノ基で置換されていてもよい直鎖、分岐鎖または環状の 炭化水素鎖： （汁）エーテル（−〇−１この場合、遊離結合価はそれぞれ飽和炭素原子に直接 結合する）：および（Ｖ）　−級アミンまたはジ置換ヒドラジン（それぞれ−Ｎ Ｈ−または−ＮＨ−ＮＨ−１この場合、遊離結合価はそれぞれ飽和炭素原子に直 接結合する） からなる群より選ばれる構造が包含される。

架橋の長さは、通常この技術分野で想定されている範囲内、すなわち１８０原子 未満たとえば〈１００原子、ただし３〜６原子より長く、好ましくは＞１６原子 である。連鎖−Ｂ−の部分を形成する好ましい親水性構造は、（ｉ）　天然に存 在する親水性αアミノ酸（たとえば、アスパラギン酸およびそのアミド、グルタ ミン酸およびそのアミド、リジン、アルギニン、グリシン、スレオニン、セリン 、および多分ヒスチジンも）のポリペプチド鎖； （ｉｉ　）　（０−（Ｃ１１２）ｎ）ｎ’　（式中、ｎは整数２〜５、好ましく は２〜３であり、ｎ′は整数１〜２０である）のようなオキサアルキレン鎖： （迅）すべて、短い（０１〜４）好ましくは自−２の炭素原子を含有する不飽和 炭化水素鎖に連結したーＳ−（チオエーテル＞　、−０−Ｃエーテル）および不 飽和アミド（−ＣＯＮＨ−）である。

親水性アミノ酸は、（Ｆ−（Ｐｒｏ）ｎ）ｍＦ　（式中、Ｆは、好ましくは４〜 ８残基のアミノ酸配列を表し、各アミノ酸体それぞれセリン、グリシンおよびス レオニンから選ばれ、ｍは整数１〜４、ｎは整数４〜８である。Ｃｅｔｕｓ　Ｃ ａｒｐ、。

ＷＯ−Ａ−８５／　０３５０ｇ）のタイプの親水性構造で提供できる。

連鎖−Ｂ−は、接合体の抗体もしくは超抗原部分の特定の位置に、またはランダ ムに結合させることができる。

可能性のある位置はアミノ末端、カルボキシ末端およびリジン残基（ωアミノ基 ）である。抗体または超抗原がチオール基またはジスルフィド基（それぞれシス チンまたはシスティン）をもつ場合には、それが接合体の活性部分の活性に必須 ではない限り、それも共有結合用に使用できる。炭水化物構造が存在する場合に は、これをアルデヒド基に酸化し、ついで接合体の他の残部への連結に使用でき る（Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐ、、　ＥＰ−Ａ−２４０，２００参照）。

本発明の接合体には、有意な量のエステル結合および不安定なアミド結合、とく にそれぞれ千ロジンおよびヒスチジン残基と形成される結合を含んではならない 。このような結合が形成された場合には、ヒドロキシルアミンを用いて除去する ことができる（Ｅｎｄｏら：　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ。

４８（１９８８）３３３０−３３３５３゜抗体の活性残基あたり存在する超抗原 残基の数は、通常１〜５、好ましくは１または２である。

好ましい様式の一つにおいては、接合体物質は、抗体ごとに超抗原に関して実質 的に均一であり、ならびに／または超抗原および抗体それぞれにおける結合位置 および／もしくは連鎖−Ｂ−等を使用しなければならない。換言すれば、接合体 中の各接合体分子はすべて、これらの変動因子に関して同一でなければならない 。

この物質は、非接合抗体または非接合超抗原を実質的に含まないものでなければ ならない。

至適接合体における正確な超抗原対抗体比、連鎖構造は、選ばれたモノクローナ ル抗体（クラス、サブクラス、産生クローン、特異性）および選ばれた超抗原に よって変動する。本明細書に示した実験モデルは、他の超抗原および池の抗体に ついての至適パラメーターのスクリーニングも可能にする。

本発明の実施態様において、出願の日までに最も広範に検討された連鎖−Ｂ−の 構造は、 −３ｒＲＣＯＮＢＣＨ２ＣＨｔ（ＯＣ［ＩｔＣＪ）＋１０（ＣＨＩ）ｍＣＯＹ− （Ｉ　）である。

式Ｉにおける遊離の結合価は、それぞれ活性部分に連結する。これは直接または さらに架橋−Ｂ−内に存在する２価の不活性構造を介して起こる。

ｎは〉０の整数、たとえば１〜２０、好ましくは２または〉２であり、多くの場 合＜１０である。ｍは１または２である。

Ｓは硫黄原子であり、その各結合価で飽和炭素原子に直接結合する（−Ｓ、−＝ チオエーテルまたはジスルフィド）。

ｒは整数１または２である。

Ｙは−ＮＨ−１−ＮＨＮＨ−または−Ｎ［ｌＮ−Ｃ１１−であり、その左端は式 Ｉの右末端に示したＣａ基に結合し、その右端は飽和炭素原子またはカルボニル 基（Ｙが−ＮＨＮトの場合のみ）に結合する。

Ｒは好ましくはアルキレン（１〜４個の炭素原子、多くの場合１または２個の炭 素原子を有する）であり、１または２以上（１〜３、好ましくはく２）のヒドロ キシ（０■）基で置換されていてもよい。

抗体−超抗原接合体の製造 本発明の抗体接合体は、それらを産生ずる細胞の培養培地からまたはその中でそ れらが合成された媒体から、濃縮および精製することによって得ることができる 。

本発明の新規な接合体の合成は、本技術分野でよく知られた接合体の合成技術、 すなわち遺伝子操作（組換え技術）または適当な抗体および超抗原から適当な官 能基の古典的カップリングによって達成できる。蛋白質中に存在し、通常使用さ れる官能基は次の通りである。

（ｉ）　炭水化物構造。この構造はアルデヒド基に酸化が可能で、ついで基Ｈ， ＮＮＨ−を含有する化合物と反応させて−ＣＢ−Ｎｌｌ−ＮＯ−基を形成させる 。

（ｉｆ）　チオール基（ｆｌｓ−）。チオール基はチオール反応性の基を含有す る化合物と反応して、チオールエーテル基またはジスルフィド基を形成する。蛋 白質の遊離子オ　。

−ル基はシスチン残基中に存在し、またチオール化または天然のシスティン残基 中のジスルフィドの開裂によって蛋白質上に導入できる。

（ｆｆｌ）　アミノ酸残基中の遊離アミノ基（［１，Ｎ−）。アミノ基は請求電 子基たとえば活性化カルボキシ基を含む化合物と反応して、アミド基を形成する 。遊離アミノ基は好ましくはアミノ末端またはりジン残基のωアミノ基である。

（ｔｖ）　アミノ酸残基中の遊離カルボキシ基。カルボキシ基は反応性（活性化 ）カルボキシ基に変換し、ついでアミノ基を含有する化合物と反応させてアミド 基を形成させる。しかしながら、同じ蛋白質中にカルボキシ基とともに大抵は存 在するアミノ基とのアミド形成を最小限にするため、注意が必要である。遊離カ ルボキシ基は好ましくはカルボキシ末端または二酸性αアミノ酸のカルボキシ基 である。

１２ＮＮＨ−基、チオール反応性基、活性化カルボキシ基、またはアミノ基をも つ化合物は、二官能性カップリング試薬または抗体もしくは超抗原である。これ らの基は、カルボニル炭素とも結合できる■、ＮＮｔｌ−基を除いて、飽和炭素 原子に直接結合する。これらの基は、抗体または超抗原上に、通常の誘導化によ って導入されている。

組換え技術は、その部分が一方の残部の末端カルボキシ基と他方の残部の末端ア ミノ基とを特異的に連結させた接合体の製造に有効な手段を提供する。適用した 技術に合致する連鎖構造を挿入することもできる。

使用される試薬は、それらが上に定義した連鎖−Ｂ−を与えるように選択される 。通常の二官能性試薬は、式Ｚ−８’−Ｚ’を有し、Ｚおよび２′は相互に矛盾 しない官能基であり、蛋白質上に存在する官能基（上記参照）との共有結合によ るカップリングを可能にする。Ｂ′は上に連鎖−Ｂ−について示したのと同じ構 造を含有する不活性架橋である。とくに、Ｚおよび２′は同一でも異種でもよく 、チオール基、チオール反応性基、活性化カルボキシ、−ＣＯＮＨＮＨ，等から 選択される。これらの基の定義は、新規な試薬の標題で以下に示す。

実験の部で用いられた接合体について使用した方法は、以下の工程からなる。

（ｉ）　抗体または超抗原を、チオール反応性基およびアミノ反応性基を含有す る有機試薬と反応させて、チオール基をもつ抗体または超抗原を形成させ、（ｉ ｉ）　超抗原および抗体の残部を、チオール基または保護チオール基およびアミ ノ反応性基を含有する有機試薬と反応させて、チオール基または保護チオール基 をもつ超抗原または抗体を形成させ、ついで（ｆｆｌ）　工程（ｆ）および（ｉ ｆ）からそれぞれ得られた生成物を互いに反応させ、超抗原がジスルフィドまた は千オニーチルを介して抗体に連結した接合体を形成させる。

各基のカップリング条件は、蛋白質化学に適用される条件とそれ自体同じで公知 である。カップリングは段階的に、または出発原料に不活性スペーサーアームに よって連結できる中間官能基を創製することにより１工程で進行させることがで きる。一般的に、接合体の合成および精製／回収を行う条件は、常に関連蛋白質 の非変性条件である。これは通常、水性媒体ならびにそれぞれｐＨ３〜１Ｏ１Ｏ ℃〜５０℃の範囲内のｐＨ値、温度を意味する。正確な値は、反応させる基およ び回収される接合体によって変動する。その他の点については、新規な試薬の項 にｇ己載する。

新規な試薬（本発明に関連して開発） 連鎖−Ｂ−を有する接合体の化学合成のために、本発明者らは、一般式■ −Ｚ＋　ＲＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＩ’ｌｚＣＨｔ）ｎＯ（ＣＨｚ）ｍＺ＋ 　’　（ｎ　）で表される新規なヘテロニ官能性試薬を開発した。ｍおよびｎは 上記式Ｉの場合と同じ意味である。ｚｌはＩｓ−反応性求電子基、チオール（− Ｓｔｌ）または保護チオール（たとえば＾ａＳ−）であり、ただしチオール基お よびヒドロキシ基はＲ中の一つの同一炭素原子に結合していてはならない。ｆｌ ｓ−反応性求電子基の例には、（ｉ）　ハロゲン、飽和炭化水素に、好ましくは α−ハローアルキルカルボニルの形で結合したハロゲン（たとえばＺＩＣＩ’１ ２ＣＯ−）　； （ｎ）　活性化チオール、好ましくは、飽和炭素原子に結合した、いわゆる反応 性ジスルフィド（−３ＳＲＩ）　；（ｆｆｌ）　３．５−ジオキソ−１−アザ− シクロペンタ−３反応性ジスルフィドの定義については、たとえばＥＰ−＾−１ ２８，８８５に記載されている。これは参考として本明細書に導入する。

Ｚｌ′は活性化カルボキシ、すなわち電子基である。

例としては、カルボン酸ハライド（−ＣＯＣＩ、−ｃｏＢｒｓおよび−ＣＯＩ） 　、混合カルボン酸無水物（−ＣＯＯＯＣＲＩ）　、反応性エステルたとえばＮ −スクシンイミジルオキシカルボニル、−Ｃ（＝ＮＨ）−ＯＲ，，４−ニトロフ ェニルカルボキシレート（−ＣＯ−ＯＣｇｌ’ｌ＊Ｎ０ｚ）等を挙げることがで きる。ＲｏおよびＲ７は低級アルキル（Ｃ＋−ｇ）であり、Ｒ２はまたベンジル であってもよい。

本発明の新規な試薬の利点の一つは、構造（ＯＣＨ２ＣＬ）。

におけるｎに関して均一な接合体物質を生じることである。すなわち、ｎは与え られた接合体物質の個々の分子それぞれについて同一である。

Ｚｌ’およびＺ、と反応する官能基は、ネイティブの抗体活性分子またはネイテ ィブの超抗原分子上に存在するか、あるいはそれらに導入することができる。つ いで、２１′およびｚｌ末端は、これらの種類の基についてそれ自体知られた方 法で適当な抗体または超抗原と選択的に反応させることができる。

既知の技術には、本発明の新規な試薬または接合すべき化合物のいずれかに出発 する連鎖延長が包含される。

本発明の試薬を利用する連鎖延長は、たとえば−Ｂ−が（２）　−ＣＯＲ’−３ ｒ−ＲＣＯＮＨＣＨ２ＣＨｚ（ＯＣＲ２Ｃ［Ｉｔ）ｎＯ（ＣＨｚ）ｍＣＯＮＨＮ Ｆｌ−炭水化物構造（糖蛋白の場合）に由来するｓ　ｐ　２混成炭素に結合する 、 （３）　−ＣＯ（ＣＬ）ｆｆｌＯ（Ｃ１１２ＣＨ２０）、ＣＬＣＨ２ＮＨＣＯＲ ’−３，−１？Ｃ０ＮＩＴ−ＣＨｚＣｌｌｚ（ＯＣＨ２Ｃ［Ｉｔ）。０（ＣＨ２ ）、Ｃ０Ｙ−；ＣＨｔＣＨｚ（ＯＣＨｚＣＨｘ）。０（ＣＬ）、Ｃ０ＮｔｌＮ！ Ｉ−Ｒ’ＮＨ計；Ｒ，Ｒ’およびＲ′は式ＩにおけるＲと同様に選択されるアル キレンである。ｒは上述の場合と同じ意味である。

試薬（式■）は、式■ ＮＨｚＣＦ１２ＣＩ’１ｚ（ＯＣＢ２側ｚ）ｎＯ（ＣＨ２）ｍｃＯＯＨ（ＩＩＩ 　）（式中、ｍは整数１または２であり、ｎは整数１〜２０、たとえば２〜２０ または３〜９である）で表される化合物に出発して製造することができる。

式■で表され、ｍ＝１および２、ｎ＝１〜１０のある種の化合物の合成について は、以前に報告がある（Ｊｕｌｌｉｅｎら：　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔ ｔ、　２９（１９８８）３８０３−３８０６　：　Ｈｏｕｇｈｔｏｎ＆　５ｏｕ ｔｈｂｙ：５ｙｎｔｈ、　Ｃｏ＊ｍｕｎ、　１９（１８）（１９８９）３１９９ −３２０９；およびＥＰ−Ａ−４１０，２８０（公告１９９１−１−２０）　； ならびにＳｌａｍａ＆　Ｒａｎｄｏ　：　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ　８８（１９８１）２１３−２２１およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　 １９（１９８０）４５９５−４６００３゜式■で表される新規な試薬は、式■の 化合物を、式Ｚ−Ｂ−Ｚ’　（Ｚ＝Ｚ、、　Ｂ’＝Ｒ’先にＲおよびＲ’１．ニ ー）イテ定義シタ通りであり、２′は先に定義した活性化カルボキシである）の それ自体公知の二官能性試薬と反応させることにより合成できる。反応後に、− ｃｏｏｎ官能基を、活性化カルボキシ基、ｚ、’＝活性化エステル、たとえばＮ −スクシンイミジルオキシカルボニル、４−ニトロフェニルオキシカルボニル、 ２．４−ジニトロフェニルオキシカルボニル等に変換する。

式■の新規な化合物およびそれらの新規な誘導体は、一般式 ＸＣＨ，Ｃ■ｚ（ＯＣＨｔＣＨｚ−）ｎＯｃＨｔＹ　（ＩＶ　）を有するポリエ ーテルで表される。ｎは整数２〜２０、好ましくは３〜２０または３〜９である 。Ｘは＋１！Ｎ−であり、そのプロトン化型（”Ｈ３Ｎ−）または好ましくは加 水分解もしくは還元によって１１．Ｎ−に変換可能な置換Ｕ、Ｎ−である。

例としては、非置換アミノ（■ｚＮ−）　：ニトロ；アミド（カルボアミド）た とえば低級アシルアミド（ホルミルアミド、アセチルアミド０１１．ヘキサノイ ルアミド）、アシル残基のα炭素原子に電子求引置換基を有するアシルアミド基 、とくにＣＦ、Ｃ０ＮＨ−１ＣＨ３ＣＯＣＩＩ２ＣＯＮｔｌ−等：環に置換基を もっていてもよいフタルイミドイル：カルバメート、とくにＲ、’　０ＣＯＮＨ −および（Ｒ，’０ＣＯ）（Ｒ，’０ＣＯ）Ｎ−１たとえばＮ−（ｔ−ブチルオ キシカルボニル）アミノ（Ｂｏｃ）、環に置換基をもっていてもよいＮ−（ベン ジルオキシカルボニル）アミノおよびジ（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）アミ ノ（それぞれＺおよびジＺ）：窒素原子に結合した炭素原子が芳香系に対してα であるアルキルアミノ、たとえばＮ−モノベンジルアミノおよびジベンジルアミ ノ、Ｎ−トリチルアミノ（トリフェニルメチルアミノ）等、ならびにメチル炭素 原子（ベンジル炭素原子を含む）がシリコン（Ｓｉ）原子で置換された類縁基、 たとえばＮ、Ｎ−ジ（ｔｅｒｔ−ブチルシリル）アミノ：３−および／または５ −位が低級アルキルで置換されていてもよい４−オキソ−１，３，５−トリアジ ン−１−イルを挙げることができる。

上述のおよび以下に述べるＲ、ｌおよびＲ８′は、低級アルキル、と（に二級お よび三級アルキル基、ならびに環に置換基をもっていてもよい１〜３個のフェニ ル基で置換されたメチル基を意味する。低級アルキルおよび低級アシル基は１〜 ６個の炭素原子を有する。

Ｙは、カルボキシ（−ＣＯＯｔｌ、−ＣＯＯ−を含む）、またはカルボキシに好 ましくは加水分解もしくは酸化によって変換可能な基である。最も重要な基はエ ステル基であり、この場合、カルボニル炭素原子またはオルトエステル中の相当 する原子が式Ｉの右端におけるメチレン基に結合している。例には、アルキルエ ステル基（−ＣＯＯＲＩ’）、オルトエステル基［−Ｃ（ＯＲｓ’　）ｓ）およ び上に定義した反応性エステル基がある。１ｔ　、　ｌは先に定義したＲ　、　 ｌと同義である。

Ｙの他の基には−ｃ■ｏ、−ＣＮ、−ＣＯＮＨ，、−ＣＯＮＲ，’Ｒ，’がある 。この場合、Ｒ１′およびＲ２′は先の定義と同じ意味である。

式■の化合物は既知の出発原料から、それ自体公知の方法の組合せによって合成 できる。適当な合成経路は、Ａ、連鎖の形成 り６末端官能基の変換 Ｃ６対称ポリエーテルの非対称エーテルへの変換り、バイシンメトリックな連鎖 の２つの同一のフラグメントへの開裂 である。

反復単位−０ＣＨ２ＣＨ２−を有する便利な出発原料は市販品を入手できる。た とえば、２〜６個の反復単位を有するオリゴエチレングリコールがある。同一の 末端基をもつ他の適当な化合物には相当するジカルボン酸およびジアミンがある 。

異なる末端基を有する便利な出発原料は、末端基が純粋なポリエチレンオキシド 橋によって間隔を置いて配置されたω−ヒドロキシモノカルボン酸である。５つ までの反復単位を有するこのような化合物は、先行技術に記載されている［Ｎａ ｋａｔｓｕｊｉ、Ｋａｗａｍｕｒａ　＆　０ｋａｈａｒａ　：５ｙｎ−ｔｈｅｓ ｉｓ　（１９８１）　ｐ、　４２）。

医薬組成物およびその製造 本発明の医薬組成物は、本技術分野において知られているような処方であるが、 本発明の新規な接合体を含有する。すなわち、この組成物は、凍結乾燥した粒子 状物賃、滅菌もしくは無菌的に製造された溶液、錠剤、アンプル等である。ビヒ クル、たとえば水（好ましくは、たとえばＰＢＳで、生理的ｐＨ値に緩衝する） または他の不活性固体もしくは液体材料を添加することができる。一般的に、組 成物は、必要に応じて適当な添加物および補助剤とともに、１種または２種以上 の水不溶性もしくは水溶性の水性もしくは非水性ビヒクルに、混合、溶解、結合 または他の方法でそれと合体させることにより製造される。ビヒクルおよび条件 が接合体の活性に悪影響を与えないことが重要である。水そのままもビヒクルの 表現内に包含される。

投与および使用方法 通常、接合体は、本明細書に示す結果に基づいて１０１１９〜５０厘９の範囲と 考えられる接合体の有効量をそれぞれ含有する。予め調剤された剤型として販売 され、投与される。正確な投与量は、症例ごとに変動し、患者の体重および年齢 、投与経路、疾患の種類、抗体、超抗原、連鎖（−８−）等によって決定される 。

投与経路は、本技術分野において一般的に知られている通りである。すなわち、 本発明の接合体の、標的細胞溶解有効量もしくは治療有効量を、標的細胞と接触 させる。上述の適応症の場合、これは通常、哺乳動物たとえばヒトに対する非経 口投与たとえば注射、注入（皮下、静脈内、動脈内、筋肉内）を意味する。接合 体は、処置すべき個体に、局所的にまたは全身的に投与できる。

「標的細胞溶解有効量」は、その量がＣＴＬを標的細胞の破壊に活性化および指 向化するのに有効であることを意味する。

本発明は、この説明の一部である添付の請求の範囲によって定義される。以下に 本発明を、多（の実施態様によって例示するが、これらは本発明の全体的概念を 限定するものではない。実験の部には、第１部で、接合体の化学的合成について 、第２部で、例４において製造された接合体の、Ｔ細胞の標的細胞溶解に対する 活性化作用について記述する。

実験の部、第１部 ω−アミノ−ＰＥＧ−カルボン酸 ８−ヒドロキシ−３，６−シオキサーオクタン酸イソプロピルエステル（１） チップの形状のナトリウム（２３ｇ、１．０■０１ｅ）を、窒素気相下ジエチレ ングリコール（５００ｗ／）に少量ずつ添加した。ナトリウムが完全に反応した のち、混合物を室温に冷却し、ブロモ酢酸（７６ｇ、０．５■ｏｌｅ）を撹拌下 に加えた。１００℃で１８時間反応させたのち、過剰のジエチレングリコールを 約４　ｍｍＨｇで留去した。ついで、イソプロピルアルコール（４０（１＋４） 　、およびアセチルクロリド（５１９，０、６５ｓｏｌｅ）を加えた。６５℃で １８時間撹拌したのち、混合物を室温に冷却し、酢酸ナトリウム（３，５ｇ、０ ．１５ｓｏｌｅ）で中和した。混合物を濾過し、濾液をほぼ蒸発乾固し、ついで 水（２００ｍ１）に溶解した。水相を１．１．１−トリクロロエタン（３Ｘ　５ ０＋＋１）で抽出した。プールした有機相を水（２０，１）で洗浄した。生成物 はプールした水相からジクロロメタン（５０＊ｊりで抽出し、蒸発させると油状 物（５５ｇ）が得られた。

１１−ヒドロキシ−３，６，９−トリオキサ−ウンデカン酸イソプロピルエステ ル（２） チップ形状のナトリウム（２３ｇ、１．　Ｏｍｏｌｅ）を、窒素気相下トリエチ レングリコール（７００ｓ＋１りに少量ずつ添加した。ナトリウムが完全に反応 したのち、混合物を室温に冷却し、ブロモ酢酸（７６ｇ、０．５＋ｏｌｅ）を撹 拌下に加えた。１００℃で１８時間反応させたのち、過剰のジエチレングリコー ルを約４　ｍｍＶｉｇで留去した。ついで、イソプロピルアルコール（４００鷹 ｌ）、およびアセチルクロリド（５１ｇ、０．６５■ｏｌｅ）を加えた。６５℃ で１８時間撹拌したのち、混合物を室温に冷却し、酢酸ナトリウム（３，５９， ０，１５ｓｏｌｅ）で中和した。混合物を濾過し、濾液をほぼ蒸発乾固し、つい で水（２０Ｔｏ／）に溶解した。水相を１．１．１−トリクロロエタン（３Ｘ　 ５０ｍ／）で抽出した。プールした有機相を水（２０ｍＡ’）で洗浄した。生成 物はプールした水相からジクロロメタン（５０＋＋Ｊ）で抽出し、蒸発させると 油状物が得られた。

’トｎ、ｍ、ｒ、（ＣＤ（δ３）：　１．２６（ｄ、６Ｈ）；　３．０７（ｓ、 ２Ｈ）：　３．６〜３、８（ｍ、　１２Ｈ）　；　４．１１（ｓ、　２１１）　 ；　５．０９（ｍ、　ＬＨ）８−クロロ−３，６−シオキサーオクタノール（３ ６５９，２，２ｓｏｌｅ、トリエチレングリコールおよび５ｏｃｚ、から製造） を、ジメチルホルムアミド（４０（＋＋ｊ）に溶解し、フタルイミドカリウム（ ３７０ｇ、２．　（１＋ｏｌｅ）を撹拌下に加えた。１００℃で１８時間撹拌し たのち、ジメチルホルムアミドを減圧下に留去した。残留物をトルエン（１，５ １）に４０〜５０℃で懸濁し、塩化カリウムを濾去した。生成物を冷却して（− １０℃）結晶化した。母液を濃縮して結晶化操作を繰り返すと、母液から第二の 分画が得られる。

衷Ｈ−ｒ＋、　Ｉｌ、　ｒ、　（ＣＤＣｊ’ｓ）　；　２．９０（ｓ、　ＩＨ） 　；　３．５１〜３．５８（ｍ、　２＋’ｌ）　；３、６０〜３．６８（＋、　 ６Ｈ）　；　３．７３〜３．７８（ｔ、　２Ｈ）　：　３．８９〜３．９４（ｔ 。

２Ｈ）　；　７．７０〜７．８９（ｏ＋、　４Ｈ）１７−（Ｎ−フタルイミドイ ル”）　−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサ−ヘプタデカン酸イソプロピ ルエステル（４）ジクロロメタン（３０，Ａり中ピリジン（２，８ｇｋ　３５ｍ ｍｏｌｅ）の溶液を、ジクロロメタン中８−（Ｎ−フタルイミドイル）−３，６ −シオキサーオクタノール（３）（８，５ｑ、３６ｍｍｏｌｅ）およびトリフル オロメタンスルホン酸無水物（１０，２９，３６ｍｍｏｌｅ）の溶液に、約−５ ℃で撹拌しながら滴下した。約３０分後に、有機相を０．５Ｍ塩酸および水で洗 浄した。乾燥しくＮａ２５Ｏ４）、濾過したのち、８−ヒドロキシ−３，６−シ オキサーオクタン酸イソプロピルエステル（１）（１２ｇ、４ｇ＋ｓｍｏ１ｅ） およびＮａ２Ｐ０４（６゜５ｇ、４６ｍｍｏｌｅ）を加え、混合物を室温で２０ 時間激しく撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物を１．１ ．１−トリクロロエタンおよび水に分配した。有機相を蒸発させると、油状物（ １３ｇ）が得られた。

真Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ、　（ＣＤＣｊ’３）　：δ１．２６（ｄ、　６Ｈ）　：　３ ．５８〜３．７６（ｍ、　１８Ｈ）　：　３．９０（ｔ、　２Ｂ）　：　４．１ １（ｓ、　２Ｂ）　：　５．０９（■、　ＩＩＩ）　；　７．７０〜７．８９（ ｍ、　４Ｈ） １７−　（Ｎ−フタルイミドイル）　−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサ −ヘプタデカン酸（５） １７−（Ｎ−フタルイミドイル）−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサ−ヘ プタデカン酸イソプロピルエステル（４）（１３ｇ）をテトラヒドロフラン（５ ０８７）および塩酸（濃、５０ｍ１）に溶解した。室温に１６時時間−たのち、 溶液を水（２００＋ｓｌ）で希釈し、テトラヒドロフランを減圧下に除去した。

水相をトルエン（１×）で洗浄し、ジクロロメタン（２×）で抽出した。乾燥し くＮａ２５Ｏ４）、有機相を蒸発させると、生成物が油状物（８，５９）の形で 得られた。

’Ｈ−ｎ、　Ｉｌ、ｒ、　（ＣＤＣ１ｓ）：　δ３．５７〜３．７６（ｍ、１８ Ｂ）；　３．９１（ｔ。

２Ｈ）　：　４．１１（ｓ、２Ｈ）　：　４．８（ｂｒ、　ＩＦｉ）　：　７． ６５〜７．９０（ｍ、４ＦＩ）１７−　（Ｎ−フタルイミドイル）　−３，６， ９，１２，１５−ペンタオキサ−ヘプタデカン酸（５）（８，５９）を、１５０ ＋ｃｊ！のエタノールおよび３ｍｌのヒドラジンヒトラードに溶解した。

この溶液を室温で１６時間撹拌し、ついで塩酸（１００ｍ／。

３Ｍ）を加えて３時間還流した。室温に冷却して濾過したのち、ｐＨを調整しく ｐＨ９、Ｎａ０Ｈ）　、濾液をほぼ蒸発乾固した。水を加えて、再びほぼ蒸発乾 固し、ついでｐＨを調整しくｐｉ　４．８Ｃ１り　、蒸発乾固した。生成物をイ ソプロパツール（１００鳳Ｉりおよびアセチルクロリド（２露ｌ）によって室温 で一夜処理したのち、蒸発させた。残留物を水中に集め、アルカリ性のｐｆｌで （７〜１１）ジクロロメタン中に抽出した。蒸発させると、“生成物（３，３９ ）が得られた。

１■−ｎ、　ｍ、　ｒ、　（ＣＨ，ＯＤ）　；δｌ、２６（ｄ、　６Ｂ）　；　 ３．１７（ｔ、　２Ｈ）　；３、６５〜３．８０（ｍ、　１８１）　：　４．１ ６（ｓ、　２Ｈ）　：　５．０７（ｍ、　１１）ト（，０Ｃｉ１２ＣＨ２）。Ｃ ｌ２ＣＯ−ＯＣＨ（ＣＲｓ）　２化合物１：ｎ＝ｉ 化合物２＋ｎ＝１ ＰｈｔＮ−Ｃ１１２ＣＢ２−（ＯＣ［ｌＩＣ１ｌ、）、Ｏ１ｌ重合化３、Ｐｈｔ Ｎ−＝　Ｎ−フタルイミドイルＰｈｔＮ−ＣＨｚＣＨ１−（ＯＣＨｔＣＩＩ２） 　ｎｃＨｚｃＯ−ＯＣＨ（ＣＨｓ）　を化合物４　、ＰｈｔＮ−＝　Ｎ−フタル イミドイルＰｈｔＮ−ＣＨ２ＣＩ、−（ＯＣＲ２ＣＢ、）　４ｃｏ、ｃｏ−ｏｎ 化合物５ ＨＪ−ＣＨ２ＣＨｚ−（ＯＣＩｈＣＨｚ）４ｃＨｚｃｏ−ＯＲ化合物６ 二官能性試薬およびカップリング生成物の製造構造式は別紙に示す。

Ａ１．　１７−ヨートアセチルアミノー３．６．９．１２．１５−ペンタオキサ ヘプタデカン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの製造 １７−アミノ−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン酸イソプロ ピルエステル（実験の部、第１部参照）（１，１９，３，２Ｉ■ｏｌｅ）を、３ 腫ｌの１Ｍ水酸化ナトリウム溶液に溶解し、室温に３０分間放置した。１．５■ ｌの６Ｍ塩酸を加え、混合物を蒸発乾固した。残留物をジクロロメタンに取り、 濾過し、溶媒を蒸発させると１７−アミノ−３、６，９，１２，１５−ペンタオ キサヘプタデカン酸５４５８９が得られた。この化合物４６０ｍｇ（１，３９ｍ ｍｏｌｅ）を１０１１１！のホウ酸塩緩衝液ｐａＬ４に溶解した。この溶液に窒 素ガスを通じて空気を除去した。５ｍｇのジオキサン中４３２１（１，５２ｍｍ ｏｌｅ）のＮ−スクシンイミジル２−ヨードアセテートの溶液を１分間を要して 滴下し、この間５ＭＮａＯＨを加えてｐ■を８．４に保持した。反応溶液を１５ 分間、窒素ガスを通じながら撹拌した。溝相クロマトグラフィー（溶出液：Ｃ■ 、（Ｊ４−１１ｅＯＨ６０：　３５）によれば、反応はほぼ数分で完結した。１ ５分後に、反応溶液のｐ■を３に調整し、溶液を凍結し、乾燥した。反応混合物 を逆相カラムＰＥＰ−ＲＰＣ３０／２６　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｓｙｓ ｔｅｍｓ　ＡＢ）上、０〜１３％のアセトニトリル勾配を０，１％トリフルオロ 酢酸とともに用いて分離し、ついで１３％アセトニトリル、０．１％ＴＦ＾でイ ソクラティック分離を行い分画した。所望のピークからのフラクションをプール し、凍結乾燥すると、１７−ヨートアセチルアミノー３．６．９．１２．１５− ペンタオキサヘプタデカン酸（Ａ）３５１ｍｇが得られた。収率ニア６％。

生成物の構造はそのＮＭＲスペクトルによって確立された。’ＨＮＭＲスペクト ル（Ｄ、０）をδ値で示す。

ＩＣＨｚＣＯ４，２３ｓ、　０ＣＨｉＣＯＯＦＩ　３．７６ｓ、　−０ＣＨｚＣ ＨｔＯ−３，７１〜３．７６、−ＮＨＣ■、（４！０−３．６５ｔ、　−ＮＨＣ 旦、Ｃｌｌ、Ｏ−３，４１Ｂ、１７−ヨートアセチルアミノー３．６．９．１２ ．１５−ペンタオキサヘプタデカン酸　Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル （Ｂ）の製造 ヒドロキシスクシンイミド（４，５腐り、３９Ｂｏｌｅ）を反応バイアル中に秤 量した。１７−ヨードアセチルアミノ−３、６，９，１２，１５−ペンタオキサ ヘプタデカン酸（Ａ　）（１８，３ｔｇ、３９ｓｍｏｌｅ）を０．５５ｇ１’の 乾燥ジオキサンに溶解し、反応バイアルに加えた。バイアルに窒素ガスを通じて 空気を除去したのち、０．１５ｇ／の乾燥ジオキサン中８．０ｍｇ（３９ｕｏｌ ｅ）のジシクロへキシルカルボジイミドの溶液を反応バイアルに滴下した。バイ アルに窒素ガスを充填し、密閉して、暗所に置いた。反応溶液を３．５時間撹拌 した。生成した沈殿を濾過して除去した。濾液中の生成物Ｂの生成率は、ＮＩＩ Ｒ分析によって８９％と測定された。

例２．　（１７−ヨートアセチルアミノー３．６．９．１２．１５−ペンタオキ サヘプタデカノイルアミノ）免疫グロブリン（Ｃ）の製造 Ａ、モノクローナル抗体１１ａｂ　Ｃ２１５免疫グロブリンクラスＩｇＧ２ａの モノクローナル抗体（Ｉｌａｂ　Ｃ２Ｃ２１５）（３４，０，２１８１ａ＋ｏｌ ｅ）を、０．９％塩化ナトリウムを含有する０、１Ｍホウ酸塩緩衝液ｐＨ８，１ ，１７，’７＋Ｊに溶解し、この溶液を反応バイアルに加えた。１７−ヨートア セチルアミノー３．６．９．１２．１５−ペンタオキサヘプタデカン酸　Ｎ−ヒ ドロキシスクシンイミドエステル（Ｂ）３．６冨９（６，４ａｍｏｌｅ）を含む ジオキサン溶液１４６＋／を緩衝溶液に注入し、２５分間室温で撹拌して反応を 完結させた。反応バイアルはホイルで覆って遮光した。過剰の試薬（Ｂ）を、５ ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５に２６／４０カラム上、溶出液として０．９％塩化ナト リウム含有０．１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７，５を用いた分画化によって除去した 。所望の生成物Ｃを含む分画をプールした。溶液（２２ｍｌ”）を、Ｙｊ１３０ フィルターを通してへｍ１ｃｏｎセルで８１１に濃縮した。濃度および置換度は 、アミノ酸分析によれば、それぞれ４．７ｍｇ／ｍＡ’および１ｌａｂ　Ｃ２１ ５あたり１８スペーサーであった。

Ｂ、　モノクローナル抗体Ｍａｂ　Ｃ２４２免疫グロブリンクラスＩｇＧ　１の モノクローナル抗体（Ｍａｂ　Ｃ２４２）を、例２Ａに記載の操作に従い、それ ぞれ１５．２０および２２倍モル過剰の１７−ヨードアセチルアミノ−３、６， ９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ ステル（Ｂ）と反応させ、ノナ、ドデカおよびテトラデカ（１７−ヨードアセチ ルアミノ）−３、６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカノイルアミノ） −１１ａｂ　Ｃ２４２（Ｃ）を得た。

Ｃ，モノクローナル抗体１１ａｂ　Ｃ 免疫グロブリンクラスＩｇＧ２ａのモノクローナル抗体（Ｍａｂ　Ｃ）を、例２ Ａに記載の操作に従い、それぞれ１４および１８倍モル過剰の１７−ヨードアセ チルアミノ−３、，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン酸Ｎ−ヒド ロキシスクシンイミドエステル（Ｂ）と反応させ、テトラおよびヘプタ（１７− ヨードアセチルアミノ）　−３，６，９，１２，１５−ベンタオキサヘブタデカ ノイルアミノ）　−Ｍａｂ　Ｃ（Ｃ）を得た。

例３．２−メルカプトプロピオニルアミノ−Ｅｕ”−標識−ブドウ球菌エンテロ トキシンＡ　（ＳＥＡ）の製造Ａ、Ｅｕ”標識５ＥＡ（Ｄ）の製造 ＳＥＡ　（Ｔｏｘｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ、からの凍結乾燥製品） （２ｍｇ、　７２ｎｍｏｌｅ）を１２２ｔｒｌのｍ１ｌｌｉ−Ｑ水に溶解し、１ ５ｍ１のポリプロピレンチューブに加えた。１０ｈＡ’の０．１Ｍホウ酸塩緩衝 液ｐ１１８．６、ついで１７８ＩＩＪのｍ１１１ｉ−Ｑ中２１６０ｎｗｏｌｅの Ｅｕ”−キレート試薬（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｗａｌｌａｃ　Ｏｙ）を加えた。

室温に一装置くと反応は完結した。反応溶液を５ｅｐｈａｄｅｘ６２５ＦＤ１０ カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＡＢ）上、溶出液として ０．１Ｍリン酸塩緩衝液ｐ［１，０を用いた分画化によって除去した。所望の生 成物りを含む分画をプールした。

溶液（３謂りを、ＹＭ５フィルターを通してＡ曹１ｃｏｎセルで容量Ｑ、　８ｍ ｇに濃縮した。濃度はアミノ酸分析によれば、１、７１１９／　ｍｌであった。

置換度はＥｕＣ／３標準溶液と比較して、ＳＥＡあたりＱ、３Ｅｕ”と測定され た。

８１．３−（２−ピリジルジチオ）プロピルアミノＥｕ”″標識５ＥＡ（Ｅ）お よび３−メルカプトプロピオニルアミノＥｕ”標識５ＥＡ（Ｆ）の製造 ０、１５ｍ１の０．１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ８，０中Ｅｕ”　−５ＥＡ（１，２ ４富ｖ、４４．８旧５ｏｌｅ）を、１５ｍ／のポリプロピレンチューブに加えた 。１ｍｇのエタノール中１．６ｍｇの３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオン 酸Ｎ−スクシンイミジルエステルの溶液３５ｒｔｌをチューブに加え、反応溶液 を室温で３０分間撹拌した。得られた生成物Ｅは単離しないでそのまま、生成物 Ｆに還元した。

上記反応溶液に、２０ｇ／の０．２Ｍ　Ｅｕ”−クエン酸溶液および５０μｌの ２Ｍ酢酸を加えて、ｐＨを５に調整した。ついで、Ｑ、１ｍｇの０．９％基塩化 ナトリウム中、　１１１９のジチオスレイトール（Ｍｅｒｃｋ）を加え、反応溶 液を室温で２０分間撹拌した。ついで５０μｌの０．９％塩化ナトリウム溶液を 加えて全容をｌ＋＋１に調整した。反応溶液（１ｍｌ）を５ｅｐｈａｄｅｘＧ２ ５　ＮＡＰ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＡＢ） 上に置き、所望の生成物Ｆを、０．９％塩化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸塩緩 衝液ｐＨ７，５、ｌ、　５ｍｇを添加して溶出した。溶出した生成物Ｆを１５ｍ ｊ’のポリプロピレンチューブに集め、ジスルフィド化合物への再酸化を避ける ため、生成物Ｇの合成に直ちに使用した。

８２．２−メルカプトプロピオニルアミノ−ブドウ球菌エンテロトキシンＡ　（ ＳＥＡ）（Ｆ２）の製造ネイティブなＳＥＡ　（Ｔｏｘｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｙ　Ｉｎｃからの凍結乾燥製品）または組換え操作で製造されたＳＥＡ　（ｒ ＳＥＡ）に例３Ｂ１に記載の操作により、２倍モル過剰の３−（２−ビリジルジ チオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジルエステルを反応させた。

置換度は、Ｃａｒｌｓｓｏｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、１７３（１９７８）７２ ３−７３７）のＵｖ−分析で測定し、ＳＥＡあたり１．９メルカプトプロピオニ ル基であった。

例４，５ＥＡ−モノクローナル抗体接合体（ＧｌまたはＧ２）の製造 Ａ、　Ｅｕ”−３Ｅ＾とｌ［ａｂ　Ｃ２１５の接合体（Ｇ１）例３Ｂに記載の４ −メルカプトプロピオニルアミノＥｕ”標識５ＥＡ（Ｆ　）の溶液に、０，９％ 塩化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７，５中オクタデカ（１７−ヨ ートアセチルアミノー３．６．９．１２．１５−ペンタオキサヘプタデカノイル アミノ）　ｌ１ａｂ　Ｃ２１５（Ｃ）（４ｍｇ）の溶液１．２ｍＪを加えた。室 温に一夜放置すると反応は完結した。ついで、水１ｓ＋Ｊ中２０ｔｒｌのメルカ プトエタノールの溶液５　ｔｒｌ　（１，２ａｍｏｌｅ）を添加して、未反応ヨ ードアルキル基を遮断した。反応溶液を室温に４時間放置したのち、濾過した。

次に、濾液を５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２ＨＲ１６１５０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ＾Ｂ）上、溶出液として０．９％塩化ナトリウム含有 ０．００２Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７、５を用いて分画化した。所望の生成物Ｇを 含む分画をプールし、分析した。アミノ酸分析による蛋白質含量は０．２２す／ ■ｌであった。置換度は、Ｅｕ”ゝの定量により、ＩｇＧあたりＳＥＡ１個と測 定された。この生成物については、免疫刺激作用および抗体結合能も検討した。

化合物Ｃに対する化合物Ｆの量を増加させると、置換度の上昇が認められた。

Ｂ、　ｒＳＥＡとＭａｂ　Ｃ２１５の接合体（Ｇ２）オクタデカ（１７−ヨート アセチルアミノー３．６．９．１２．１５−ペンタオキサヘプタデカノイルアミ ノ）蓋ａｂ　Ｃ２１５（Ｃ）を、例４＾に記載の操作に従い、１．８倍モル過剰 の２−メルカプトプロピオニルアミノ−ｒＳＥＡ（Ｆ２）と反応させた。

接合体の組成を、Ｐｈａｓｔ−ＧｅｌＴＭ勾配４〜１５上ドデシル硫酸ナトリウ ムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付し、結合をＰｈａ ｓｔ　ＩＭＡＧＥ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｓｙｓ−ｔｅｍｓ　ＡＢ）で 走査した。得られた接合体の組成は、３個のＳＥＡをもツ１ｌａｂ　Ｃ２１５が ６％、２個のＳＥＡをもつものが１５％、１個のＳＥＡをもつものが２８％、非 置換１ａｂ　Ｃ２１５が５１％であった。

別の実験で、２．７倍過剰のＦ２を使用した場合は、得られた接合体の組成は、 ３（ＩのＳＥＡをもツｌａｂ　Ｃ２１５が１５％、２個のＳＥＡをもつものが２ ５％、１個のＳＥＡをもつものが３４％、非置換Ｍａｂ　Ｃ２１５が２６％であ った。

Ｃ，ｒＳＥＡと璽ａｂ　Ｃ２４２の接合体Ｃ１，テトラデカ（１７−ヨードアセ チルアミノー３、６．９．１２．１５−ペンタオキサヘプタデカノイルアミノ） Ｉａｂ　Ｃ２４２（Ｃ）を、例４Ａに記載の操作に従い、３．２倍モル過剰の２ −メルカプトプロピオニルアミノ−ｒＳＥＡ（Ｆ２）と反応させた。接合体の組 成を例４Ｂの記載と同様に分析したところ、４個のＳＥＡをもつＩａｂ　Ｃ２４ ２が４％、３個のＳＥＡをもつものが１２％、２個のＳＥＡをもつものが２８％ 、１個のＳＥＡをもつものが３６％、非置換１１ａｂ　Ｃ２４２が２０％であっ た。

同じ反応を行ったが、カラムで分画化する前に生成物を０．２Ｍヒドロキシルア ミンで４時間処理して、１ｌａｂＣ２４２とスペーサー、およびＳＥＡとメルカ プトプロピオニル基の間の不安定な結合を除去した。生成した接合体の組成は、 ４個のＳＥＡをもつＩａｂ　Ｃ２４２が１％、３個のＳＥＡをもつものが１２％ 、２個のＳＥＡをもつものが２７％、１個のＳＥＡをもつものが３６％、非置換 １ａｂ　Ｃ２１５が２４％であった。

Ｃ２，ドデカ（１７−ヨートアセチルアミノー３．６．９．１２．１５−ペンタ オキサヘプタデカノイルアミノ）　Ｉａｂ　Ｃ２４２（Ｃ）を例４＾に記載の操 作に従い、３倍モル過剰の２−メルカプトプロピオニルアミノ−ｒＳＥＡ（Ｆ２ ）と反応させた。得られた接合体組成は、３個のＳＥＡをもつＩａｂ　Ｃ２４２ が６％、２個のＳＥＡをもつものが２６％、１個のＳＥＡをもつものが３６％、 非置換１１ａｂ　Ｃ２４２が３１％であった。

Ｃ３，ノナ（１７−ヨートアセチルアミノー３．６．９．１２．１５−ペンタオ キサヘプタデカノイルアミノ）　１ｌａｂ　Ｃ２４２（Ｃ）を、例４＾に記載の 操作に従い、３倍モル過剰の２−メルカプトプロピオニルアミノ−ｒＳＥＡ（Ｆ ２）と反応させた。得られた接合体の組成は、２個のＳＥＡをもつｌ１ａｂ　Ｃ ２４２が１３％、１個のＳＥＡをもつものが３９％、非置換のｊａｂ　Ｃ２４２ が４６％であった。

Ｄ、ｒＳＥＡとＭａｂ　Ｃの接合体 Ｄ１．ヘプタ（１７−ヨートアセチルアミノー３．６．９．１２．１５−ペンタ オキサヘブタデカノイルアミノ）　ｌ１ａｂ　Ｃを、例４＾に記載の操作に従い 、５．４倍モル過剰の２−メルカプトプロピオニルアミノ−ｒＳＥＡ（Ｆ２）と 反応させた。接合体の組成を例４Ｂの記載と同様に分析したところ、４個のＳＥ Ａをもつものが１５％、３個のＳＥＡをもつものが２４％、２個のＳＥＡをもつ ものが２９％、１個のＳＥＡをもつものが１９％、非置換のＭａｂ　Ｃが３％、 ダイマー型が１０％であった。

同じ反応を０．２Ｍヒドロキシルアミンの存在下に行い、１１ａｂ　Ｃとスペー サー、およびＳＥＡとメルカプトプロピオニル基の間の不安定な結合を除去した 。生成した接合体の組成は、３個のＳＥＡをもツＭａｂＣがｉｔ％、２８１のＳ ＥＡをもつものが２４％、１個のＳＥＡをもつものが３０％、非置換１［ａｂ　 Ｃが１８％、ダイマー型が１７％であった。

Ｄ２．テトラ（１７−ヨートアセチルアミノー３．６．９．１２．１５−ペンタ オキサヘプタデカノイルアミノ）　Ｉａｂ　Ｃを、例４Ａに記載の操作に従い、 ５．７倍モル過剰の２−メルカプトプロピオニルアミノ−ｒＳＥＡ（Ｆ２）と反 応させた。得られた接合体の組成は、４個のＳＥＡをもつＭａｂ　Ｃ２が８％、 ３個のＳＥＡをもつものが１８％、２１！１のＳＥＡをもつものが３０％、１個 のＳＥＡをもつものが２６％、非置換１１ａｂ　Ｃが５％、ダイマー型が１２％ であった。

例５．　［１７−（３−メルカプトプロピオニルアミノ）−３、６，９，１２， １５−ペンタオキサヘプタデカノイルアミノ］−ｒＳＥＡ（Ｉ）の製造 Ａ、１７−　（３−（２−ピリジルチオ）プロピオニルアミノ］　−３，６，９ ，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカノイルアミノ）−ｒＳＥＡ（Ｈ）の製造 １７−　［３−（２−ピリジルチオ）プロピオニルアミノ〕−３，６，９，１２ ，１５−ペンタオキサヘプタデカン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ Ｋ）（０，５３ｓｎ、８９６ｎｍｏｌｅ）のジオキサン４３ａｌの溶液を、１５ １／の０．９％塩化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７，５中３．６ ７ｍｇ（１２８ｎｍｏｌｅ）のｒＳＥＡ溶液に注入した。反応は、室温３０分で 完結した。置換度の分析のために、１００μｌを採取した。残部は、生成物Ｉに 還元するまで、凍結保存した。

置換度は、反応溶液１０ｈ／を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ５０　ＮＩＣＫカラム（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＡＢ）で脱塩し、溶出液をＣａｒｌ ｓｓｏｎら［Ｂｉｏｃｈｅｉ、　Ｊ、　１７３（１９７ｇ）７２３−７３７）の ＵＶ−スペクトロスコピーで分析して測定した。ｒＳＥＡに２．７のスペーサー がカップリングした。

Ｂ、［１７−（３−メルカプトプロピオニルアミノ）−３、６，９，１２，１５ −ペンタオキサヘプタデカノイルアミノ〕−ｒＳＥＡ（Ｉ）の製造 生成物Ｈを含む反応溶液（０，９婁ｌ）のｐＨを２ＨＣ１で４．４に調整し、０ ．９％塩化ナトリウム７．５μｌに溶解したジチオスレイトール２．９８９を加 えた。還元は３０分で完結した。

反応溶液を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５　ＮＰＡＩＯカラム（Ｐｈａｒｍａｃｔａ 　Ｂｌｏ−５ｙｓｔｅ＋＊ｓ　ＡＨ）に加え、■、５ｍｌの０．９％塩化ナトリ ウム含有０．１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ１，５で溶出し、直ちに例６の生成物Ｊの 合成に使用した。

例６、ダブルスペーサ−を有するＳＥＡ−モノクローナル抗体接合体Ｊの製造 ドデカ（１７−ヨートアセチルアミノー３．６．９．１２．１５−ペンタオキサ ヘプタデカノイルアミノ）Ｉａｂ　Ｃ２４２（Ｃ）（４，２す、２７ｎｓｏＬｅ 、　１．０ｇｊ！の０．９％塩化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７ ，５中）を、［１７−（３−メルカプトプロピオニルアミノ）−３，６，９，１ ２，１５−ペンタオキサへブタデカノイルアミノ）−ｒＳＥＡ（Ｉ）　（１，１ ７１＋９．４２％ｍｏｌｅ、ｌ　ｍｅの上記緩衝液中）と、４３時間、窒素下、 暗所で反応させた。

ついで、１．１４Ｉ１ｍｏｌｅのメルカプトエタノールを加えた。

さらに１時間後に、反応溶液を５ｕｐｅｒｄｅｘ　２００　ＨＲ１６／２５カラ ムで分画した。生成物を、０．９％塩化ナトリウム含有２１Ｍリン酸塩緩衝液ｐ ［＋７．５で溶出した。所望の生成物Ｊを含む分画をプールし、例４Ｂの記載と 同様にして分析した。接合体の組成は２個のＳＥＡをもつＤａｂ　Ｃ２４２が９ ％、１個のＳＥＡをもつものが２５％、非置換１ａｂ　Ｃ２４２が６６％であっ た。

ｎ＝４．７．９．１２、Ｉ４、ｌ８ ＝−一 実験の部、第２那 細胞に対する超抗原−抗体接合体の作用以下の実験に使用した細菌トキシンは、 Ｔｏｘｉｎ　Ｔｅｃｈ−ｎｏｌｏｇｉｅｓ　（ＩＩＩ　：　ＵＳ＾）から入手し たか、または大ｒｌＩｊｒ１１から組換え蛋白質として製造したブドウ球菌エン テロトキシンＡ　（ＳＥＸ）である。

抗体は、Ｃ２１５、Ｃ２４２およびＴｂｙ−１，２■＾ｂとした。Ｃ２１５はヒ ト結腸癌細胞系に対するＩｇＧＺａ　ｍＡｂであり、数種のヒト結腸細胞系の３ ４ｋＤ蛋白抗原と反応する。これらのｍＡｂについての文献は先に示した。接合 体は、第１部に記載したようにして製造した。

優先日前には、Ｅｕ”標識ＳＥ＾−Ｃ２１５ｍ＾ｂ接合体についてのみ検討が行 われた。優先臼の年に、結果は非標識ＳＥ＾−Ｃ２１５、ＳＥＡ　−Ｃ２４２お よびＳＥＡ−Ｔｈｙ−１，２ｍＡｂ接合体について確認された。今回導入された 結果は非接合体に関するものである。

ＭＨＣクラス■を欠くかＭＨＣクラス■は少量、検出不能量しか発現しない結腸 癌細胞に対する５ＥＡ−Ｃ２１５厘＾ｂ接合体ならびに非接合ＳＥＡおよびＣ２ １５ｍＡｂにより仲介される細胞障害作用の測定には、エフェクター細胞として 各種ヒトＳＥＡで増強されたＴ細胞系を、標的細胞として結腸癌細胞およびＭｌ ’ＩＣクラスｎ”Ｒａｊｉ細胞パネルを採用した。

結腸癌細胞系、Ｃｏ１ｏ２０５．５Ｗ６２０およびＷｉＤｒはＨＬＡ−ＤＲ。

［ＩＬＡ−ＤＰおよびＨＬＡ−ＤＱに対する１＾ｂでの染色ならびにＦＡＣ３分 析によって明らかなように、すべてＩＢＣクラス■の発（２０単位／ｍｌ）の存 在下にＳＥＡでプレコートした、マイトマイシンＣ処置ＭＨＣクラスＩＩ”Ｂ５ １ｌリンパ腫細胞による毎週の再刺激によって、末梢血から確立された。これら のＴ細胞系はＳＥＡでコートされたＲａｊｉまたは９３Ｍ細胞に対して強力な細 胞障害作用を示したが、コートされていない細胞、またはブドウ球菌エンテロト キシンＢ　（ＳＥＢ）でコートされた細胞には障害性を示さなかった。このＳＥ Ａによって誘導される殺滅は、遮断ＨＬ＾−Ｈ抗体、ＭＨＣクラス１ｌ−Ｒａｊ ｉ変異細胞およびＩＩＬＡ−ＤＲ）ランスフエクトＬ−細胞の使用により明らか なように、ＳＥＡと標的細胞上のＭＨＣクラス■の相互作用に依存する（Ｄｏｈ ｌｓｔｅｎら、Ｉ醜態ｕｎｏ−１ｏｇｙ　７１（１９９０）９６−１００）　、 これらのＴ細胞系は、Ｃ２１５−３ＥＡ接合体によって活性化されて、Ｃ２１５ ”ｌＨＣクラス■−結腸癌細胞を殺滅した。これに反し、非接合ＳＥ＾およびＣ ２１５鳳Ａｂはｃ２ｉｓ’ｍｎｃクラス■−結腸癌細胞を殺滅するＴ細胞はきわ めてわずかしか誘導できなかった。ブドウ球菌エンテロトキシン抗体接合体依存 性の細胞仲介細胞障害性は、Ｃ２１５”腫瘍細胞への５ＥＡ−Ｃ２１５ｍＡｂ接 合体の結合に依存した。この結合の特異性は、過剰の非接合Ｃ２１５■Ａｂが結 腸癌細胞の溶解を阻害し、この作用は無関係なＣ２４２およびｗ６／３２　ｍＡ ｂにはない事実によって明らかであった。ＣＤ４　’およびＣＤ８０Ｔ細胞はＳ ＥＡ　−Ｃ２１５処置Ｃ２１５＋結腸癌細胞の殺減作用を示したが、ＳＥ＾処置 細胞は溶解しなかった。ＭＨＣクラスｔｔ−［８細胞に結合したＳＥＡ−Ｃ２１ ５ｍＡｂ接合体とＴ細胞の相互作用には、ＭＨＣクラス■１細胞のＳＥＡ誘導殺 減作用について以前に示されているのと同様、特異的ＶβＴＣＲ配列が関与して いるように思われる。

これは、Ｃ２１５−ＳＥＡ接合体との、自己由来ＳＥＡ特異的Ｔ細胞系ではなく 、ＳＥＡ特異的Ｔ細胞の相互作用によって指示された。Ｃ２４２ｍＡｂおよびＴ ｈｙ−１，２■Ａｂ接合体はＣ２１５■＾ｂ接合体と同様の活性を示す。

クロミウム標識および標的細胞のＳＥＡとのインキュベーション ０．７５Ｘ１０’個の標的細胞と、１５（１＋＋ｃｉの５１クロミウム（＾ｍｅ ｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、、ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔ、Ｅｎｇｌａｎｄ ）を、１００μｌの容量で、３７℃において４５分間インキュベートした。細胞 は、２，８％（ｖ／ｖ）７．５％ＮａＨＣＯ３，１％ピルビン酸ナトリウム、２ ％２０ｈｌｌ　Ｌ−グルタミン、１％　ＩＭＨｅｐｅｓ、　１％　１０１９／厘 ｌゲンタマイシンおよび１０％ウシ胎仔血清（Ｆｅ２．　Ｇｉｂｃｏ、　Ｐａ１ ｓｌｅｙ、　ＧＥＲ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、　Ｐａ １ｓｌｅｙ、　ＧＥＲ）を含む完全培地中に保持した。インキュベージコン後、 細胞をＦｅ２を含まない完全培地で１回洗浄し、３７℃で６０分間インキュベー トし、洗浄し、１０％ＦＣＳ含有完全培地に再懸濁した。Ｕ学匠９６ウエルマイ クロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂ−ｒｉｄｇｅ、ＵＳ＾）の各ウ ェルに５Ｘ１０３の標的細胞を添加した。

細胞障害性のアッセイ エフェクター細胞を、様々なエフェクター／標的細胞比で、ウェルに加えた。各 ウェルの最終容量は２００μｌとした。各試験は３回行った。プレートを３７℃ で４時間インキュベートしたのち、放出したクロミウムを収穫した。ｉ＋Ｃｒの 量はガンマ−カウンター（Ｃｏｂｒａ　Ａｕｔｏ−ｇａｍｍａ。

Ｐａｃｋａｒｄ）で測定した。細胞障害性百分率は、式５式％） で算出した。式中、Ｘは試験サンプルについて得られたクロミウム放出（ｃｐｓ ）であり、Ｍは培地とインキュベートした標的細胞のクロミウムの自然放出であ り、Ｔは標的細胞を１％ドデスル硫酸ナトリウムとインキュベートして得られる 総りロミウム放出である。

結果 ＳＥＡ　−Ｃ２４２、ＳＥＡ　−Ｃ２１５および５ＥＡ−抗Ｔｈｙ−１．２−＾ ｂ接合体は、それぞれそのｍＡｂの関連エピトープを発現する細胞、およびＭＨ Ｃクラス■１細胞に結合する。一方、非接合ＳＥＡは麗■Ｃクラス■“細胞にの み、結合した。非接合Ｃ２１５、Ｃ２４２およびＴｈｙ−１，２ｍＡｂは、関連 細胞に結合するが、Ｒａｊｉ細胞には結合しない（表１）。

ヒトＴ細胞系は、ＳＥＡ　−Ｃ２１５■Ａｂ接合体の存在下にＭＨＣクラスｎ− ３１１６２０、Ｃｏ１ｏ２０５およびＷｉＤｒ細胞を溶解したが、非接合ＳＥ＾ およびＣ２１５ｍＡｂの存在下には溶解しなかった（図１）。結腸癌細胞の溶解 は、１０〜１００ｒ＋ｇ／　ｍｌのＳＥＡ　−Ｃ２１５ｍＡｂ接合体で認められ た。５Ｗ６２０に対して、ＳＥＡ　−Ｃ２１５＋ｓＡｂ接合体は、様々なエフェ クター細胞対標的細胞比で、高レベルの溶解がみられた（図１）。これに反し、 非接合ＳＥ＾またはＣ２１５ｔｓ＾ｂは、試験したすべてのエフェクター細胞対 標的細胞比で、５ｆ６２０に対して細胞障害性はまった（示さなかった。これは ＩＩＨｃクラスＩＩ　−Ｃｏｌｏ２０５細胞の溶解能は接合体に限定され、非接 合ＳＥ＾およびＣ２１５ｍＡｂでは誘導できないことを示す。ＳＥＡおよびＳＥ Ａ　−Ｃ２１５ｍＡｂ接合体はＭＨＣクラス■′″Ｒａｊｉ細胞およびインター フェロン処置ＭＨＣクラスｎ　’Ｃｏ１ｏ２０５細胞のＴ細胞による殺滅を誘導 するが、Ｃ２１５ａ＋Ａｂは誘導しなかった（図１）。

５ＥＡ−Ｃ２１５ｍＡｂ接合体が誘導する溶解作用には、標的細胞上のＣ２１５ ｍＡｂ分子への接合体の特異的結合が関与しているかどうかを明らかにするため 、過剰の非結合Ｃ２１５腸＾ｂおよびＣ２４２ｍＡｂにより遮断試験を実施した 。この場合、Ｃ２４２ｍＡｂは結腸癌細胞上のＣ２１５ｍＡｂ関連抗原とは無関 係な抗原に結合する。Ｃ２１５ｍＡｂの添加は細胞障害性を強力に遮断したが、 Ｃ２４２ｍＡｂはまった（影響しなかった。同様に、ＳＥＡ−Ｃ２４２ｍＡｂに よる溶解は過剰非接合Ｃ２４２■Ａｂにより特異的に遮断されたが、Ｃ２１５ｍ Ａｂによっては遮断されなかった。

ＳＥＡ−Ｃ２１５ｍＡｂ接合体の、麗ｔｌｃクラスＩＩ　Ｓ？６２０結腸癌細胞 のＴ細胞依存性溶解の誘導能は、ＣＤ４”、ＣＤ８”Ｔ細胞集団のいずれにおい ても認められた（表２）。ＳＥＡは、これらのＴ細胞サブセットのいずれをも５ １６２０細胞の殺滅を仲介するように活性化することはないが、ｍＩＨＣクラス ■′″Ｒａｊｉ細胞の溶解は誘導した（表２）。

ＳＥＡ−Ｃ２１５ｓＡｂ接合体は、ＳＥＡ増強Ｔ細胞系により５ｆ６２０および Ｒａｊｉ細胞の溶解を誘導したが、ＳＥＢ増強Ｔ細胞系によっては溶解を誘導し なかった（図３）。ＳＥＡおよびＳＥＢ系の特異性は、Ｒａｊｉ細胞に曝露した 場合の、ＳＥＡおよびＳＥＢそれぞれに対するそれらの選択的応答によって示す れる。これは、５ＥＡ−Ｃ２１５ｍＡｂ接合体が、非接合ＳＥＡと同じＶβＴＣ Ｒ特異性を維持していることを示している。

図の説明 図１　：　５ＥＡ−Ｃ２１５苗＾ｂ接合体は、ＩＩＦＩｃクラス■−結腸癌細胞 に対してＣＴＬを指向させる。左上のパネルは、ＳＥＡ　−Ｃ２１５菖＾ｂ接合 体、ＳＥＡ、　Ｃ２１５およびＣ２１５とＳＥＡの混合物（Ｃ２１５＋５ＥＡ） の不存在下、またはｌ１１ｇ／冨ｌ濃度での存在下、様々なエフェクター細胞対 標的細胞比での、５Ｗ６２０細胞に対するＳＥ＾応答ＣＴＬの作用を示す。他の パネルはＣ２１５＋　Ｉｎｃクラス■−結腸癌細胞系５Ｗ６２０％Ｃｏ１ｏ２０ ５およびＷｉＤｒ、　１ｌＨｃクラスＩＩ″ＩＣ２１５”インターフェロン処置 Ｃｏ１ｏ２０５細胞ならびにＣ２１５−１１ＨＣクラスＩＩ　”Ｒａｊｉ細胞に 対して、ＳＥＡ応答ＣＴＬを標的化する５ＥＡ−Ｃ２１５ｍＡｂ接合体、および ＳＥＡの能力を示す。エフェクター細胞対標的細胞比は３０：１とした。数種の 濃度での非接合Ｃ２１５■Ａｂの添加は、これらの細胞系に対するＣＴＬの標的 化をまった（誘導しなかった。ｔｌＬＡ−ＤＩ？、　ＨＬＡ−ＤＰおよび［ＩＬ Ａ−ＤＱに対するｍＡｂを用いた５Ｗ６２０細胞、Ｃｏ１ｏ２０５およびＷｉＤ ｒ細胞のＦＡＣＳ分析では、表面ＭＨＣクラス■発現はまったく検出できなかっ たが、ＨＬＡ−ＤＩ？、−ＤＰおよび−ＤＱの豊富な発現がＲａｊｉ細胞に、Ｈ ＬＡ−ＤＲおよびＤＰの発現がインターフェロン処置Ｃｏ１ｏ２０５細胞に検出 された。Ｃｏ１ｏ２０５細胞は、ＣＴＬアッセイに使用する前に４８時間、１０ ００単位７’ｓｌの組換えインターフェロン−γで処置した。

図２　：　５ＥＡ−Ｃ２１５園Ａｂ接合体およびＳＥＡ−Ｃ２４２ｓＡｂ接合体 によって誘導される結腸癌細胞に対するＣＴＬの標的化は、ｍＡｂの抗原選択性 に依存する。ＳＥＡ−Ｃ２１５ｍＡｂ接合体およびＳＥＡ　−Ｃ２４２■Ａｂ接 合体（３１１ｇ／　ｌ１１）の存在下でのＳＥ＾応答ＣＴＬによるＣｏＬｏ２０ ５細胞の溶解は、それぞれ非接合Ｃ２１５およびＣ２４２ｍＡｂ接合体（３０ｓ ｑ／震ｌ）の添加によって遮断される。非接合−Ａｂまたは対照培地（−）は接 合体の前１０分に標的細胞に添加した。

図３：ＳＥ＾−Ｃ２１５■Ａｂ接合体でコートされた結腸癌細胞の溶解は、ＳＥ ＾応答ＣＴＬによって仲介されるが、ＳＥＢ応答ＣＴＬによっては仲介されない 。自己ＳＥＡおよびＳＥＢ選択的Ｔ細胞系は、ＳＥＡ−Ｃ２１５曽Ａｂ接合体、 非接合のＣ２１５ｍＡｂとＳＥＡの混合物（Ｃ２１５＋５ＥＡ）および非接合の Ｃ２１５ａＡｂとＳＥＢの混合物（Ｃ２１５＋５ＥＢ）の不存在下（対照）、ま たはＬａｙ／ｗｅ濃度での存在下、エフェクター細胞対標的細胞比１０：１で、 ５Ｗ６２０およびＲａｊｉ標的細胞に対して使用した。

図４　：５ＥＡ−Ｃ２４２＊Ａｂ接合体および５ＥＡ−抗−Ｔｈｙ−ｔ、　２■ Ａｂ接合体により、それらの標的細胞（それぞれＣｏ１ｏ２０５腫瘍細胞および ＥＬ−４腫瘍細胞）に対して誘導される細胞障害性。

表　１ ＳＥＡ−Ｃ２１５ｍＡｂ接合体のＣ２１５”結腸癌細胞およびＭ）ＩＣクラス［ ’Ｒａｊｉ細胞の結合状　薬　細　胞　ＦＡＣＳ分析 ＳＥＡ　−Ｃ２１，５■＾ｂ　Ｃｏ１ｏ２０５　Ｐｏ５Ｒａ　ｊ　ｔ　Ｐｏ５ Ｃ２１５ｍＡｂ　Ｃｏ１ｏ２０５　Ｐｏ５Ｒａｊｉ　Ｎｅｇ ＳＥＡ　−Ｃ２４２膿Ａｂ　Ｃｏ１ｏ２０５　Ｐｏ５ＲａｊｉＰｏｓ Ｃ２４２■＾ｂ　Ｃｏ１ｏ２０５　Ｐｏ５Ｒａ　ｊ　ｉ　Ｎｅｇ ＳＥＡ−抗−Ｔｈｙ−ｔ、　２■Ａｂ　ＥＬ−４Ｐｏｓ抗−Ｔｂｙ−ｉ、２　鳳 Ａｂ　ＥＬ−４Ｐｏ５ＳＥＡ　Ｃｏ１ｏ２０５　Ｎｅｇ Ｒａｊｉ　Ｐｏｓ 対照Ｃｏ１ｏ２０５　Ｎｅｇ ＲａｊｉＮｅｇ ＥＬ−４Ｎｅｇ 細胞は、対照（ＰＢＳ−ＢＳＡ）の各種添加物とともに氷上で３０分間インキュ ベートし、洗浄し、以下に記載するように処理した。Ｃｏ１ｏ２０５細胞に結合 したＣ２１５およびＣ２４２ｍＡｂならびにＥＬ−４に結合した抗−Ｔｈｙ−ｔ 、　２の染色は、ＦＩＴＣ標識ウサギ抗マウス１９を用いて検出した。Ｒａｊｉ 細胞に対するＳＥＡの染色はウサギ抗−５ＥＡ血清を用い、ついでＦＩＴＣ−ブ タ抗ウサギ１ｇによって検出した。Ｃｏ１ｏ２０５ならびにＲａｊｉ細胞に対す るＳＥＡ　−Ｃ２１５■＾ｂ接合体の染色は、Ｃ２１５ｍＡｂおよびＳＥＡにつ いて上述の操作を用いて検出した。ＥＡＣ３分析はＢｅｃｔｏｎ　＆　Ｄｉｃｋ ｉｎｓｏｎからのＦＡＣＳスタープラス上で実施した。第２および第３工程の染 色はツク・ツクグランドを明瞭にするためにのみ使用した。

表　２ ＣＤ４”およびＣＤ８”ＣＴＬの、Ｃ２１５−ＳＥ＾接合体の存在下における結 腸癌細胞の溶解 ＣＤ４”　５Ｗ６２０　２　５　５０ ＣＤ４’″　Ｒａｊｉ　θ　４１４３ ＣＤ８”　５Ｗ６２０　０　１　２３ ＣＤ８’″　Ｒａｊｔ　２　７２　６８Ａ）　ＣＴＬ　（ＳＥＡ−３’）は、エ フェクタ一対標的比３０：１で、ＳＥＡおよびＣ２１５−ＳＥＡの不存在下（対 照）または１ｐｇ／■ｌの存在下に使用した。

ＦＩＧＵＲＥ　１ 比細胞障害性（％） 比細胞陣菩性（％） ＦＸＧＵＲＥ　３ 蛋白濃度ｕｇ／＋＊Ｉ Ｆ工ＧＵＲＥ　４ 要　約　書 Ｔ細胞によって認識され、Ｔ細胞を標的細胞の溶解に向けさせる能力を有し、抗 体によって認識される構造に連結された抗体からなる可溶性抗体接合体。この接 合体は、構造が超抗原であることを特徴とする。一つの重要な態様は、標的細胞 を、接合体の標的細胞溶解有効量と接触させる、標的細胞の溶解方法である。こ の溶解方法は、癌、自己免疫、寄生体感染ならびにかび、ウィルスおよび細菌感 染に対する処置方法の一つになる可能性がある。この接合体の合成、医薬組成物 およびその製造も包含される。

宝　瞭　！ｌ　番　報　告 、□１□１灯／ＳＥ　９１１０（ロ）％１．１−１−１１区ゴ／ＳＥ　９Ｉ１０ 料％第４頁の続き ［相］Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号優先権主張　［相］１９９ ０年７月加日［相］スウェーデン（ＳＥ）［株］つ００２４７９−５う発　明　 者　ヘドルンド、グンナー　スウェーデン国エト　１０セー ひ発　明　者　ドールステン、ミカエル　スウェーデン国工（番地なし） 浄発　明　者　ランドウ、ベーテル　スウェーデン国エニン材 浄発　明　者　オーケルブロム、エーヴア　スウェーデン国エニン１５ ニス−２２３５１ルンド０モルテンストーＪレイニーニス−２２３５２ルンド、 リツラセデルガタンニスー２１４　３４　マルミョ、ソフイエルンツヴエイロス −７５２５２ウプサラ、タールグウクスヴエイ

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．抗体および超抗原からなる可溶性抗体接合体。
2. ２．（ｉ）抗体は疾患に関連する標的細胞の細胞表面構造に特異的であり、 （ｉｉ）超抗原はＴ細胞によって認識され、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性 化可能で、好ましくはＴ細胞受容体複合体の部分たとえばＴ細胞受容体Ｖβ鎖と 相互作用可能である請求項１記載の可溶性抗体接合体。
3. ３．標的細胞は、癌、自己免疫、寄生体感染および微生物感染、たとえばウイル ス感染、かび感染および細菌感染からなる群より選ばれる疾患に関連し、抗体は その標的細胞上に存在する抗原決定基に対して特異的である請求項１および２記 載の接合体。
4. ４．疾患は癌であり、抗体は腫瘍細飽たとえば結腸癌関連細胞上に存在する抗原 決定基（エピトープ）に対する抗体である請求項２および３記載の接合体。
5. ５．抗体はＣ２４２エピトープに特異的である請求項４記載の接合体。
6. ６．抗体はＧＡ−７３３ファミリーに属する蛋白質上のエピトープ、とくにＣ２ １５エピトープに特異的である請求項４記載の接合体。
7. ７．抗体残基あたり、超抗原残基が少なくとも１〜５、好ましくは１〜３存在す る請求項１〜６のいずれかに記載の接合体。
8. ８．抗体はモノクローナル抗体である請求項１〜７のいずれかに記載の接合体。
9. ９．超抗原は細菌起源のものであり、とくにブドウ球菌エンテロトキシンからな る群より選ばれる請求項１〜８のいずれかに記載の接合体。
10. １０．超抗原はＳＥＡである請求項１〜９のいずれかに記載の接合体。
11. １１．超抗原および抗体は共有結合有機連鎖構造−Ｂ−を介して保持され、連鎖 構造は少なくとも１個のアミド構造からなり、好ましくは、連鎖は少なくとも６ 原子長であることを条件に親水性である請求項１〜１０のいずれかに記載の接合 体。
12. １２．連鎖−Ｂ−は、構造 −ＳｒＲＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯ（ＣＨ２）ｍＣＯＹ−　 （Ｉ）（式中、ｒは整数１または２であり、Ｒは１〜４個の炭素原子を有するア ルキレン基であり、ｎは整数１〜２０であり、ｍは１または２であり、Ｙは−Ｎ Ｈ−、−ＮＨＮＨ−または−ＮＨＮ＝ＣＨ−である）からなる請求項１１記載の 接合体。
13. １３．接合体の抗体残基がそれに対して向けられている細胞表面構造をもつ標的 細胞の溶解のために使用される請求項１〜１１のいずれかに記載の接合体。
14. １４．超抗原に連結された抗体からなり、抗体は標的細胞に特異的で、超抗原は Ｔ細胞によって認識され細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化できる可溶性抗体 接合体の標的細胞溶解有効量を標的細胞と接触させる、標的細胞の溶解方法。
15. １５．超抗原、抗体、および抗体を超抗原に連結させる連鎖構造は請求項１〜１ ３のいずれかで定義された通りである請求項１４記載の溶解方法。
16. １６．（ｉ）超抗原を抗体に、（ａ）炭水化物構造、ならびに（ｂ）官能基すな わちチオール基、ジスルフィド基、カルボキシ基およびアミノ基から選ばれる少 なくとも１つの構造を介して、それ自体知られた方法によってカップリングさせ て抗体および／または超抗原から接合体を合成し、（ｉｉ）接合体をそれがその 中で製造された媒体から回収する工程からなる接合体の製造方法。
17. １７．カップリングは超抗原および／または抗体中のアミノ基で行わせる請求項 １６記載の接合体の製造方法。
18. １８．カップリングは、（ｉ）抗体または超抗原を、チオール反応性基およびア ミノ反応性基を含有する有機試薬と反応させて、チオール基をもつ抗体または超 抗原を形成させ、 （ｉｉ）超抗原および抗体の残基部を、チオール基または保護チオール基および アミノ反応性基を含有する有機試薬と反応させて、チオール基または保護チオー ル基をもつ超抗原または抗体を形成させ、ついで（ｉｉｉ）工程（ｉ）および（ ｉｉ）からそれぞれ得られた生成物を互いに反応させ、超抗原がジスルフィドま たはチオエーテルを介して抗体に連結した接合体を形成させる各工程からなる請 求項１７記載の接合体の製造方法。
19. １９．チオール反応性基を含有するアミノ反応性基はα−ハロアセチルハライド であり、チオール基または保護チオール基を含有する化合物は式ＩＩ −Ｚ１ＲＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯ（ＣＨ２）ｍＺ１′　（ ＩＩ）〔式中、ｍは整数１または２であり、ｎは整数１〜２０であり、Ｚ１はＨ Ｓ−反応性求電子基、チオール（−ＳＨ）または保護チオール（たとえばＡｃＳ −）であり、ただしチオール基およびヒドロキシ基はＲ中の一つの同一炭素原子 に結合していてはならない。Ｚ１′は活性化カルボキシである〕で表される二官 能性カップリング試薬である請求項１８記載の接合体の製造方法。
20. ２０．超抗原および抗体は請求項２〜１０のいずれかで定義された通りである請 求項１６〜１９のいずれかに記載の接合体の製造方法。
21. ２１．癌、自己免疫、ウイルス、細菌またはかびによる感染、および寄生体によ る感染からなる群より選ばれる疾患に罹患したヒト個体を含めた哺乳動物の処置 方法において、その動物に請求項１〜１２のいずれかに記載の接合体の標的細胞 溶解有効量を投与し、この場合、標的細胞は処置する疾患に関連する方法。
22. ２２．癌、自己免疫、ウイルス、細菌もしくはかびによる感染、または寄生体に よる感染の処置を意図した医薬組成物の製造における請求項１〜１２のいずれか に記載の接合体の使用。