JPH05507519A

JPH05507519A - 細胞間付着仲介因子

Info

Publication number: JPH05507519A
Application number: JP51193491A
Authority: JP
Inventors: ポールソン，ジェイムス，シー．; ペレズ，メアリー，エス．; ガエタ　フェデリコ，シー．エー．; ラトクリフェ，ロバート，マーレイ
Original assignee: サイテル　コーポレイション
Priority date: 1990-06-15
Filing date: 1991-06-14
Publication date: 1993-10-28

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】細胞間付着仲介因子発明の分野本発明は、炎症を減少または抑制し、そして炎症性疾患の過程および細胞間の付着により仲介される他の病理学的状態を処置する組成物および方法に関する。

発明の背景脈管内皮細胞および血小板は、多数の生物学的応答において、血流中のある種の細胞、例えば、食作用のもつ白血球に選択的に結合することによって重要な役割を演する。例えば、内皮細胞は単球および顆粒球が炎症の応答において血管壁を通してかつ取り囲む組織の中に移動するまえに、それらと優先的に結合する。ある種の炎症をトリガーする化合物は、脈管の内皮に直接作用して、血管壁への白血球の付着を促進することが知られており、次いで細胞は壁を通してかつ損傷または感染の区域の中に移動する。脈管の内皮への細胞の付着はまた、腫瘍の転移に関係すると考えられる。循環する癌細胞は、明らかに体の正常の炎症のメカニズムを利用し、そして内皮が活性化される血管の壁の区域に結合する。

血小板もまた、同様な応答に関係する。血小板は止血が開始される間に活性化されるようになることが知られており、そして大部分形想学的、生化学的および機能的変化（例えば、急速な顆粒のエキソサイトーンスまたは脱顆粒）を行い、ここで血小板のアルファ顆粒膜は外部の血漿膜と融合するようになる。その結果、新しい細胞表面のタンパク質が発現されるようになり、これらは活性化された血小板の新しい機能、例えば、他の活性化された血小板および他の細胞の両者に結合する能力を与える。活性化された血小板は成長する血栓の中に補充されるか、あるいは血液の循環から急速に除去される。活性化された血小板は、単球および好中球を包含する、食作用の白血球に結合することが知られている。このプロセスにより仲介される病理学的および他の生物学的プロセスの例は、アテローム性動脈硬化症、血液凝固および炎症を包含する。

最近の研究において、内皮細胞および血小板上の特殊化された細胞表面レセプター、それぞれ、内皮白血球付着分子（ＥＬＡＭ−１）および顆粒膜タンパク質− １４０（ＧＭＰ−１４０）と表示する、は、内皮および血小板による種々の循環する細胞の認識に関係することが明らかにされた。これらのレセプターは、レクチン様ドメイン、表皮成長因子に対する相同性をもつ領域、および補体ｔＩＩ御タンパク質に相同性を有する領域である（参照、Ｂｅｖｉ　１ａｃｑｕａら、５ｃｉｅｎｃｅ２４３：１１６０　（１９８９）　、これをここに引用によって加える）。例えば、ＥＬＡＭ−１は、多数の炎症性応答における第１段階である、内皮白血球付着を仲介することが知られている。詳しくは、ＥＬＡＭ−１はヒト好中球、単球、好酸球、ある種のＴリンパ球（Ｎ、　Ｇｒａｂｅｒら、Ｊ、［ｍｍｕｎｏｌ、、　１４５：８１９　（＋９９０乃、ＮＫ細胞、および前骨髄球細胞系ＨＬ−６０と結合する。

用語［セレクチン」は、ＥＬＡＭ−１およびＧＭＰ−１４０を包含する、レセプターの一般のクラスについて示唆されてきている。

なぜなら、それらのレセプターはレクチン様ドメインを有しそしてそれらの付着機能は選択的性質をもつからである。これらの細胞表面のレセプターは種々の細胞上で発現される。ＧＭＰ−１４０（また、ＰＡＤＧＥＭとして知られている）は血小板および内皮細胞の表面上に存在し、ここでそれは血小板−白血球および内皮−白血球の相互作用を仲介する。セレクチンのクラスの他のメンバーはＭＥＬ−１４抗原およびそのヒト項似体ＬＡＭ−１であり、これらはリンパ球の細胞表面のレセプターであり、そしてリンパ節のホーミングレセプターとして作用する。しかしながら、セレクチンレセブターにより認識されるリガンドの正確な性質は大部分未知のままである。

セレクチン類の作用をブロッキングし、こうして細胞の付着を阻害するために、種々の他の方法か従来開発されてきている。例えば、ＥＬＡＭ−１に対して向けられたモノクローナル抗体の使用は、病理学的応答、例えば、炎症のための処置として内皮−白血球の付着を阻害する方法として提案されてきている。内皮のインターリューキン−８もまた、白血球−内皮細胞の相互作用の阻害因子であることが知られている。

リガンド−レセプターの相互作用が解明されると、療法的養生法において有用であるセレクチン仲介細胞付着の、高度に特異的な、効率よい阻害剤を開発することかできる。また、１種または２Ｆ！以上のリガンドを使用して、製剤学的化合物、例えば、抗炎症剤または酸化防止剤を損傷部位にターゲツティングすることができる。しかしながら、今日まで、Ｉｆｉまたは２ＦｉｐＩ上のリガンドおよびレセプター分子のレセプター分子への相互作用の不十分な理解はこれらの努力を妨害している。本発明はこれらおよび他の関係する必要性を満足する。

発明の要約本発明によれば、セレクチンレセブターに選択的に結合しかつ少なくとも１つのオリゴ糖成分を有する新規な組成物が提供される。

セレクチン結合性成分は、式：％式％（）Ｒ３はオリゴ糖またはＲ，−Ｒ，−Ｃ（ＣＯ２Ｈ）−であり、Ｒ３およびＲ４は同一であるか、あるいは異なり、そして−Ｈ１−ＣＩ　−Ｃ８アルキル、−ヒドロキシルＣｌ−Ｃ８アルキル、−アリールＣ１−Ｃ８アルキル、または−アルコキシＣｌ−Ｃ８アルキルであり、Ｒ２はβＩ、３Ｇａｌ、αｌ、２Ｍａｎ、またはαｌ、６ＧａｌＮａｃであり、そしてａは０または１である〕を有する。

ある種の好ましい態様において、Ｒ１はシアル酸、通常ＮｅｕＡＣまたはＮｅｕＧｃである。Ｒ６がオリゴ糖である場合、それは好ましくはＮｅｕＡｃａ２．３Ｇａｌβ１．４ＧＩｃＮＡｃβｌ、３、またはＮｅｕＧｃａ２．３ＧａｌβＩ、４Ｇ１ｃＮＡｃβ１，３である。セレクチン結合性成分は、典型的にはセレクチンレセブターにより認識される最小テトラサツカリド（ＳＬＸと呼ぶ）を゛含んでなるオリゴ糖である。

この化合物は、典型的には、フコシル化されていないＳＬＸコア構造を含んでなる反復単位を有する多糖から調製される。フコシル化されると、多価のＳＬＸを有する多糖が得られる。この目的に好ましいＩａ型、■望およびＩＮ群Ｂのストレプトコッカス（Ｓ　ｔ　ｒｅｐｔｏｃｏｃｏｏｓ）からの多糖である。多価のセレクチン結合化合物は、また、セレクチン結合性部分を種々のリンカ一部分に連鎖することによって得られる。

請求の範囲の組成物は、セレクチン細胞表面のレセプターにより仲介される細胞間の付着を阻害し、これにより、例えば、炎症および細胞の付着に関連する他の病理学的応答を阻害することができる。

関係する態様において、セレクチンと結合する組成物は糖タンパク質、グリコリピドまたはオリゴ糖であることができる。

本発明は、詳しくは、医薬組成物中の上記化合物を提供する。医薬組成物は、例えば、セレクチンレセブターに選択的に結合することができる成分および医薬として許容されうる担体を含んでなるリポソームを含んでなることができる。この成分を有するリポソームは、また、常用の化学療法剤のためのターゲツティングビヒクルとして働き、この化学療法剤はリポソーム内に封入されそしてセレクチンレセブターを発現する襟的にされた細胞に供給される。典型的には、化学療法剤は抗炎症因子または酸化防止剤である。リポソーム内に封入された化学的因子をターゲツティングするためにここに記載する成分を使用することは、薬物の療法的レベルを低下しそして副作用を最小とする便利で有効な方法である。

本発明の医薬組成物はまた、セレクチンレセブターにより認識されるオリゴ糖のリガンドに選択的に結合することができる免疫グロブリンを含んでなることができる。この目的に適当な免疫グロブリンは、Ｃ３ＬＥＸ〜１．ＦＨ６，ＳＮＨ，、ＳＮＨ，およびＶＩＭ−２を包含する。

他の面において、本発明は、患者に療法的有効投与量の、セレクチンレセブターに選択的に結合することができる成分を含んでなる化合物を投与することによって、病気のプロセス、例えば、炎症を引き起こす細胞間の付着を患者において阻害する方法を含む。細胞表面のレセプター、例えば、ＥＬＡＭ−１またはＧＭＰ −１４０は、脈管内皮細胞または血小板上の発現されることができる。炎症のプロセスは、例えば、敗血症性ショック、敗血症にＩ！Ｉ連する創傷、急性の呼吸である。

図面の簡単な説明第１図は、ｌｒ−シフル化Ｌｅ”　（ＣＨＯ−ｋｌおよびＬＥＣ１２）を発現する細胞と比較した、ＩＬ−１β活性化された内皮細胞に結合するセレクチン（ＬＥＣ１１）を発現する細胞の能力を示す。

第２図は、ＳＬＸ決定基に結合しないモノクローナル抗体と比較した、３７°Ｃ（第２Ａ図）および４°Ｃ（第２Ｂ図）におｕＮｒＨＬ−６０細胞へのセレクチン仲介の結合をブロックするＳＬＸに対して特異的なモノクローナル抗体の能力を示す。

第３図は、活性化された内皮細胞への結合に対する、ＳＬＸおよび非ＳＬＸ特異的モノクローナル抗体とのＬＥＣＩＩ（第３Ａ図）およびＬＥＣ１２（第３Ｂ図）細胞のインキュベーションの効果を示す。

第４図は、活性化された内皮細胞への結合前にＨＬ−６０，ＬＥＣｌｌおよびＬＥＣＩ　２細胞をシアリダーゼで処理することによって得られた結果を示す。

第５図は、活性化された内皮細胞へのＨＬ−６０細胞の結合を阻害するＳＬＸ、Ｌｅ”または同様な炭水化物構造をもつグリコリピドを含有するリポソームの能力を比較する。

第６図は、ＳＬＸおよびＬｅ”決定基に対して特異的なモノクローナル抗体によりＧＭＰ−１４０仲介血小板の付着の阻害を比較する。

第７図は、活性化された血小板へのＨＬ−６０細胞の結合を阻害するＳＬＸ、Ｌｅ”または同様な炭水化物構造をもつグリコリピドを含有するリポソームの能力を比較する。

第８図は、活性化された血小板へのＰＭＮの結合を阻害するＳＬＸ、Ｌｅ”または同様な炭水化物構造をもつグリコリピドを含有するリポソームの能力を比較する。

第９図は、末端のシアル酸ＮｅｕＡｃまたはＮｅｕＧｃをもつグリコリピドによるＧＭＰ−１４０仲介付着の阻害を示す。

第１０図は、予防的に投与された、ＥＬＡＭ−１に対するモノクローナル抗体かラットにおけるリボ多糖誘発化を防止することを示す。

第１１図は、治療的に投与された、ＥＬＡ、Ｍ−１に対するモノクローナル抗体がラットにおけるリボ多糖誘発化を防止することを示す。

好ましい態様の説明炎症および細胞の付着により仲介される他の病気の応答を阻害する組成物および方法が提供される。本発明は、また、セレクチン細胞表面レセプターにより仲介される細胞の付着をブロックまたは阻害する能力を育する化合物（例えば、糖接合体およびモノクローナル抗体）を提供する。このような化合物を調製する方法もまた提供される。さらに、化合物の診断および治療学的使用が提供される。

本発明の基礎は、セレクチン細胞表面レセプターにより認識される炭水化物成分の発見である。前述したように、セレクチン類は、また細胞付着分子のｒＬＥＣ −ＣＡＭＪ族として知られており、種々の細胞の表面上で発現される独特の糖タンパク質である。例えば、ＥＬＡＭ−１は脈管内皮細胞上で誘導的に発現される（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａｅｔ　ａｌ、、前掲およびＨｅ５ｓｉｏｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　８７：１６７３−１６７７　（１９９０）　、それらの両者をここに引用によって加える）。このレセプターは炎症性サイトカイン、例えば、インターリューキン■β（ＩＬ−ｒβ）および腫瘍壊死因子 α（ＴＮＦα）、ならびにバクテリアの内毒素（リボ多糖）により誘発されることが証明されている（参照、Ｂｅｖｉ　Ｌａｃｑｕａら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　８４：９２３８−９２４２（１９８７）　、これをここに引用によって加える）。これらの化合物は、試験管内で内皮細胞に直接作用して多形核白血球（好中球）および単球の付着を増強する（　Ｂｅｖ　ｉ　Ｉａｃｑｕａら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、前掲）。

前述したように、ＧＭＰ−１４０は血小板および内皮分泌顆粒の膜部タンパク質である（　Ｇｅｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、　３４３．７５７−７６０　（１９９０）、これをここに引用によって加える）。ＧＭＰ−１４０をそれらの表面上で発現する活性化された血小板は単球および好中球に結合しくＪｕｎｇｉら、Ｂｌｏｏｄ　６７：６２９−６３６　（１９８６））　、そしてまた、単球様細胞系、例えば、ＨＬ６０およびＵ９３７に結合することが知られている（Ｊｕｎｇｉら、前掲；　５ｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、（ｎｖｅｓｔ、　７９：８６７−８７４（＋９８７））、それらのすべてをここに引用によって加える。

ＧＭＰ−１４０は分子量１４０．０００のアルファ顆粒膜タンパク質であり、血小板の刺激および顆粒の分泌の際に活性化された血小板の表面上で発現される（Ｈｓｕ　Ｌｉｎら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２５９：９１２１−９１２６　（１９８４）　：された。Ｆｕｒｉｅら、米国特許第４．７８３．３３０号は、ＧＭＰ−１４０と反応性のモノクローナル抗体を記載している。以上の参考文献のすべてをここに引用によって加える。

第３のセレクチンレセプターは、リンパ球ホーミングレセプター、ＭＥＬ−１４抗原またはＬＡＭ−］である（Ｇａｌｌａｔｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ３０４：３０ −３４　（１９８３）　；　Ｓｉｅｇｅｌｌｍａｎら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４３：１１６５１１７２（１９８９）；−１は内皮への好中球の結合において初期に機能すると信じられる。

セレクチンルセブターの構造および機能は上のレセプターの各々をコードする全長のｃＤＮＡのクローニングおよび発現により解明された（参照、例えば、ＢｅｖＨａｅｑｕａら、５ｃｉｅｎｃｅ、　５ｕｐｒａ、　（Ｅ　ＬＡＭ　−１）　、　Ｇｅｎｇら、前掲（ＧＭＰ　Ｉ　４０）　、およびＬａ５ｋｙら、前掲（ＭＥＬ−１４ｔ′ｉｃ原））。セレクチンの細胞外成分は、従来記載されたタンパク質への相同性に基づいて３つのセグメントに分けることができる。Ｎ末端領域（約１２０アミノ酸）は、低い親和性のＩｇＥレセプターＣＤ２３を包含する叶ｉｃｋａｍｅｒ、　、１Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ、、　２６３：９５５７−９５６０　（１９８８）　（これをここに引用によって加える）に記載されているＣ型哨乳動物しクチンタンパク質族に関係する。ポリペプチドのセグメントがそれに続き、これは表皮成長因子（ＥＧＦ）のモチーフを含有するタンパク質に関係する配列を有する。最後に、ＥＦＧドメインの後に、各々約６０アミノ酸の１または２以上の直列の反復モチーフが存在し、これらは補体制御タンパク質の族の中に存在するものに関係する。

セレクチンレセブターはレクチン様ドメインを含んでなるので、これらの分子の特異性はタンパク質−炭水化物の相互作用に基つくように思われる。ここに提供される証拠が示すように、レウィス（Ｌｅｗｉｓ）Ｘ抗原（ここでＳＬＸと表示する）のシアル化、フコシル化Ｎ−アセチルラクトサミン単位は、セレクチンレセブターのレクチン領域により認識される部分である。とくに、証拠はＥＬＡＭ −１およびＧＭＰ−１４０の両者によるこの部分の認識を示す。

本発明の組成物は、種々の立体配置にあるこのシアル化、フコシル化Ｎ−アセチルラクトサミン単位を含んでなる。

選択的結合は、ここで使用するとき、第２分子上の決定基部位の空間的または極性の８！構にもとずく１つの分子（典型的にはレセプターと呼ぶ）による他の分子（典型的にはリガンドと呼ぶ）の特異的認識を意味する。２つの分子間の選択的結合は、親和性が十分に強い場合に起こる。結合親和性は、典型的には、会合および解離する立体配置の平衡濃度についての親和性定数（Ｋ、）により表される。すなわち、Ｋ、＝　（Ｒ−Ｌ）／　（Ｒ）（Ｌ）であり、ここで（Ｒ）、（Ｌ）および（Ｒ−Ｌ）は、それぞれ、レセプター（Ｒ）、リガンド（Ｌ）およびレセプター−リガンド複合体（Ｒ−Ｌ）の平衡における濃度である。

レセプターおよびリガンドの分子の特異的結合の相互作用は、典型的には、可逆的非共育結合的会合、例えば、静電引力、ファン・デル・ワールスカおよび水素結合である（参照、一般に、５ｔｒｙｅｒ。

ＢｉｏｃｈｅｍｉＳｔｒｙ（Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク、第３版、＋９８８）　、その全体をここに引用によって加える）。選択的結合の例は、抗体−抗原の認識、酵素−基質の認識などを包含する。

本発明のオリゴ糖成分を記載するために使用する命名は常用の命名法に従う。個々の単糖についての標準の略号を使用する。例えば、２−Ｎ−アセチルグルコサミンはＧｌｃＮＡｃにより、フコースはＦｕｃにより、ガラクトースはＧａｌにより、そしてグルコースはＧｌｃにより表す。本発明のオリゴ槍玉に存在することができる２つのシアル酸は、５−Ｎ−アセチルニューラミン酸（ＮｅｕＡｃ）および５−Ｎ−グリコリルニューラミン酸（ＮｅｕＧｃ）である。

特記しない限り、フコース（Ｌ−異性体）を除外してすべての糖は環状ピラノース立体配置においてＤ−異性体である。環状の２つのアノマーはαおよびβにより表す。

単糖は一般にグリコシド結合により連鎖されてオリゴ糖および多糖を形成する。

環の平面に関する結合の向きはαおよびβにより示す。２つの単糖の間の結合を形成する特定の炭素原子も記載する。

こうして、ガラクトースのＣ−１とグルコースのＣ−４との間のβグリコシド結合はＧａｌβＩ、４Ｇ１ｃにより表わされる。Ｄ−糖（例えば、Ｄ−Ｇ　ｌ　ｃＮＡｃ、　Ｄ−Ｇａ　１およびＤ−ＮｃｕＡｃ）について、表示αはＣ−１（ＮｅｕＡｃにおいてＣ−２）に結合するヒドロキシルが環の平面より下にあることを意味し、そしてβは環の上にあることを意味する。Ｌ−フコースの場合において、表示αはヒドロキシルが環の上に存在することを意味し、そしてβはそれか下にあることを意味する。

ＳＬＸが白血球−内皮細胞および白血球−血小板細胞の付着を仲介する炭水化物のリガンドとして同定されると、ＳＬＸまたはその擬ＳＬＸ　（ｍ　ｉｍｅ　ｔ　ｉ　ｃ　ｓ）を含んでなる化合物はｔｆＪ製することができ、あるいは新しく合成することかできる。後述するように、本発明は、本発明のセレクチン結合性成分を含んでなる種々の化合物を提供する。例えば、生物分子を、該成分を有する化合物として使用することができる。ここにおいて定義する生物分子は、次のものを包含するが、これらに限定されない：生物学的に意味をもつ分子、例えば、アミノ酸（およびそれらの擬物質）、オリゴペプチド、タンパク質（例えば、糖タンパク質およびタンパク質性ホルモン）、脂肪酸、脂質（例えば、グリコリピド、リン脂質、スフィンゴリピドおよびガングリオシド）、ステロイドホルモン、オリゴ糖、多糖類、および核酸（例えば、デオキシリボ核酸およびリボ核酸）。これらの化合物は、当業者に知られている標準的技法に従い精製および／または合成することができる。さらに、この成分を有する広範な種類の化合物を、後述するように、新しく合成することかできる。

いったん得られると、このような化合物は、例えば、セレクチンレセブターを発現する細胞へのＳＬＸを有する細胞の結合の競争阻害を包含する、種々の目的に使用することができる。本発明の化合物を細胞表面のセレクチンに結合することによって、セレクチンと移動する細胞上の天然ＳＬＸとの相互作用は防止され、内皮または血小板への白血球および他の細胞の正常および病的結合は妨害される。こうして、ｌまたは２以上のＳＬＸ単位または擬ＳＬＸを含存する化合物は、例えば、炎症、アレローム性動脈硬化症、凝固および他の内皮または血小板仲介病理学的事象の有効な阻害因子として働くことができる。

ＳＬＸ中のシアル酸残基は、セレクチンの結合が有意に影響を受けないかぎり、異なる形態であることができる。典型的には、シアル酸は５−Ｎ−アセチルネウラミン酸（ＮｅｕＡｃ）または５−Ｎ−グリコリルネウラミン酸（ＮｅｕＧｃ）である。しかしながら、他のシアル酸をそれらの代わりに使用することができる。本発明において適当なシアル酸の異なる形態の概観は、一般に、Ｒ，５ｃｈａｕｅｒ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　５０　：　６４−８９　（１９８７）、および５ｃｈａｕｒ、　Ａｄｖａｃｅｓｉｎ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　４０　：　１３１−２３４を参照のこと。それらの両者をここに引用によって加える。下の実施例■において示すように、セレクチンレセブターの親和性は、ＮｅｕＡｃまたはＮｅｕＧｃにおいてオリゴ糖の末端が終わる場合、同一である。こうして、用語「ＳＬＸ」は、ここで使用するとき、最小のテトラサツカリド単位（シアル酸 α２．３Ｇａｌβ１．　４　ｒＦｕｃａＬ３）Ｇｌｃ（β１，３））を意味し、ここでシアル酸は、ＮｅｕＡｃ、ＮｅｕＧｃまたはシアル酸の他の同等の形態である。

シアル酸残基をＮｅｕＡｃとして示すここにおいて例示する構造は、これらの他の形態、とくにＮｅｕＧｃを包含すると理解される。

下に提供する証拠か示すように、式：％式％を含んでなるペンタサツカリドはテトラサツカリドより実質的に高い阻害作用を育する最小構造である。こうして、ある種の好ましい態様において、オリゴ糖はこのペンタサツカリド構造を含んでなる。

基本的ＳＬＸ単位についての他の変化もまた、セレクチンレセブターにより認識される。例えば、下の実施例■において提供された証拠は、構造ＮｅｕＧｃａ２．３Ｇａｌβ１，４Ｇ１ｃＮＡｃβｌ。

３Ｇａ　ＩβＩ、４　（Ｆｕｃαｌ、３）Ｇ１ｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβｌ、４ＧＩｃβを育する、ＳＹと呼ぶ（またＶＩＭ−２抗原として知られている）オリゴ糖成分はセレクチンレセブターならびにＳＬＸに結合することを示している。

ＳＹ２部分は２つのシアル化Ｎ−アセチルラクトサミン単位を含んでなり、その１つはＳＬＸである。こうして、セレクチンレセブターにより認識されるオリゴ糖は多数のシアル化Ｎ−アセチルラクトサミン単位からなり、それらの少なくとも１つはフコシル化されている（参照、Ｔｅｉｍｅｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　８８　：　１１３８−１１４２　（１９９１）、これをここに引用によって加える）。

本発明のオリゴ糖成分は、好ましくは、シアル酸残基において終わる。ある種の態様において、シアル酸残基はさらに他のサツカリド残基、例えば、第２のシアル酸にＣ２，８連鎖で連鎖することができる。

あるいは、末端のシアル酸残基は種々の基で置換されることができる。こうして、本発明のある種のセレクチン結合性成分は、式・Ｒ，−ＮｅｕＡｃα２，３Ｃ；ａｌβ１．４ＧｌｃＮＡｃβ１−（ここでＲ１はＲ３Ｒ４Ｃ（ＣＯ２Ｈ）−であり、Ｒ３およびＲ２は同一であるか、あるいは異なり、モしてＨ１低級アルキル（ＣＩ−Ｃ８）、ヒドロキシル低級アルキル（Ｃ１−Ｃ８）、アリールアルキルまたはアルコキシアルキルである）を有する。さらに、Ｒ２およびＲ８は接続して４〜８員炭素環または複素環を形成することができる。

ＳＬＸおよび関係する構造を含有する化合物は、多数の細胞がらの細胞表面筒タンパク質またはグリコリピドがら得ることができる。

例えば、ＳＬＸ抗原はＬＥＣ１１細胞、ＣＨＯ細胞のグリコジル化変異の細胞表面筒タンパク質のＮ一連鎖した炭水化物基土に存在する。ＬＥＣｌｌは、ＳＬＸ配列の中にシアル酸およびフコースの両者を育する末端構造を含有する、この独特の糖タンパク質を発現するここでＲは次の通りである：こに引用によって加える。）下に記載する手順を使用して、ＬＥＣＩＩ変異体が活性化されたヒト脈管内皮細胞に結合することが証明された。野生型ＣＨＯ細胞および特定のグリコジル化パターン（ＳＬＸ）をもたない他の関係するグリコジル化突然変異のＣＨＯ細胞系は同一レベルの結合を示した。

ＳＬＸ単位を得るために使用する他の源は、グリコリピドまたは糖タンパク質の炭水化物基土の成分を発現する任意の細胞を包含する。こうして、多形核好中球、リンパ球、腫瘍細胞またはＨＬ−６０を使用してこの単位は精製されている。

活性化された脈管内皮細胞に結合する他の細胞を、リガンドの分離に使用することもできる（参照、Ｓｙｍｉｎｇｔｏｎら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３４：２４９８−２５０６　（１９８５）。

Ｌｌｉｚｏｇｕｃｈｉ　ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５９：１１９４９− １１９５７　（１９８４）、　Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５９：１１９４３−１１９４８　（１９８４）、Ｐａ１ｅｔｔａ　ら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、　４８：２８−２８７　（１９８８す。それらのすべてをここに引用によって加える。

ＳＬＸまたはその擬ＳＬＸを含有する化合物は、表面部タンパク質、糖ペプチド、オリゴ糖およびグリコリピドを細胞から分離するためのこの分野においてよく知られている方法を使用して天然源から調製することができる（参照、例えば、Ｇｅｒａｒｄ、ｒＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ　ｇ！１ｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）およびＴｈｏｍａｓら、　ｒＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｎｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｓｌ　、両者共Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、　Ｖｏｌ、　１８２゜Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編、１９９０）　、これをここに引用によって加える）。例えば、ＬＥＣＩ＋細胞を使用して、例えば、５ｔａｎｌｅＹら、前掲の方法を使用して、ＳＬＸ単位を含有する糖タンパク質およびグリコリピドを得ることができる。簡単に述へると、１つの方法において、ＬＥＣＩ！細胞を水泡性口内炎ウィルスで感染させる。次いで、ＬＥＣＩＩにより示される構造的炭水化物変更は、ウィルスのＧ糖タンパク質のＮ一連鎖した２触角状（ｂｉａｎｔｅｎａｒｙ）の炭水化物上に発現される。このウィルスを平衡勾配遠心により精製し、そして糖ペプチドを５ｔａｎｌｅｙらにより記載されているようにプロテイナーゼ消化により精製する。

いくつかのアプローチを使用して、ＨＬ−６０，ＨＴ−２９゜ｃｏｌｏ２０５、好中球およびセレクチンレセブターにより認識されるリガンドを含有する他の細胞系からセレクチン結合性部分を単離する。リガンドは一般にこれらの細胞型の細胞表面上に発現されるので、１つのアプローチはリガンドに富んだ血漿膜分画を分離することを含んで成る。いったん血漿膜が分離されると、リガンドを分離し、引き続いてモノクローナル抗体、とくにＳＬＸオリゴ糖構造と反応性のもの、例えば、モノクローナル抗体ＦＨ６，５ＮＨ３およびＣ３ＬＥＸ−１を使用して同定することができる。

糖タンパク質上のセレクチンレセブターリガンドを特性決定するために、糖ペプチドからのオリゴ糖の解放はオリゴ糖鎖の構造分析の第１段階である。これはタンパク質−炭水化物連鎖の化学切断によるか、あるいはエンドグリコシダーゼでオリゴ糖を解放することによって達成される。はとんどの場合において、異なる手順を使用して個々の糖タンパク質のために正確な条件を確立することができる。アスパラギン連鎖オリゴ糖はヒドラジツリシス、エンドグリコシダーゼ、激しいアルカリ性加水分解およびトリフルオロアセトリシスにより解放される。０連鎖炭水化物事位はアルカリ性β−排除により解放される。オリゴ糖はゲル濾過により糖ペプチドから分離される。次いて、生ずるオリゴ糖をゲル濾過、ＨＰＬＣ１薄層クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーの組み合わせを使用して互いに分離する。次いで分離したオリゴ糖を完全に分析する。精製したオリゴ糖単位の完全な構造の分析は、単糖単位、それらの環形、立体配置（ＤまたはＬ）、アノマーの連鎖（αまたはβ）、糖とそれらの配列との間の連鎖の位置の決定を必要とする。

さらに、任意の置換基の位置が確立される。メチル化を使用して、単糖の間のグリコシド連鎖の位置を決定する。糖残基のアノマーの立体配置は５００−λＩＨｚ　’ＨのＮＭＲ分光分析を使用してアドレスすることができる。完全な構造の炭水化物分析の実施に使用する条件および方法は、Ｂｅｅｌｅｙ、　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　ＢｕｒｄｏｎおよびＫｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ、纏、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、アムステルダム（１９８５）に一般に記載されており、これをここに引用によって加える。

オリゴ糖の糖を完全に特性決定するための当業界の技術は、いくつかの分析技術、例えば、ＦＡＢ−ＭＳ　（急速原子衝突質量スペクトル）、ＨＰＡＥ　（高いｐＨのアニオン交換クロマトグラフィー）および’Ｉ（−ＮＭＲの使用を包含する。これらの技術は相互補完的である。これらの技術を使用してオリゴ糖の構造を完全に特性決定する方法の最近の例は、分析において、Ｓｐｅｌｌｍａｎｎら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

２６４：１４１００　（＋９８９）、および５ｔａｎｌｅｙら、前掲の中に見いだすことかできる。他の方法は正イオン急速原子衝突質量スペクトル（ＦＡＢ− ＭＳ）およびガスクロマトグラフィー−４子質量スペクトル（ＧＣ／Ｅ　Ｉ−ＭＳ）によるメチル化分析を包含する（参照、ＥＰＯ出願第８９３０５１５３．２号、これをここに引用によって加える）。

グリコリピド上のセレクチンリガンドを特性決定する１つのアプローチは、細胞を有機溶媒で破砕し、グリコリピドを分離し、そしてＳＬＸに対するモノクローナル抗体、例えば、ＦＨ６，５ＮＨ３゜５ＮＨ４，Ｃ５ＬＥＸ−１またはＶＩＭ −２と反応性のグリコリピドを同定し、次いでオリゴ糖鎖の構造を決定することから成る。

ＳＬＸを含有するグリコリピドおよびガングリオシドを得るために、グリコリピドの調製の標準的方法を使用することができる（参照、例えば、Ｌｅｄｅｅｎら、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、、　２１：８２９　（１９７３）　、これをここに引用によって加える）。例えば、グリコリピドをＨＬ−６０，ＨＴ−２９，ＰＭＮ、ヒト白血球、およびセレクチンリガントを発現する池の細胞系から一般に当業者に知られている方法によって抽出する（参照、例えば、Ｓｙｍｉｎｇｔｏｎら、Ｊ、Ｉｍｍｕｒ＋ｏ１．、　＋３４：２４９８　（＋９８５）およびｋｌａｃｈｅｒおよびＢｅｃｋｓｔｅａｄ、　［、ｅｕｅｍｉａ　Ｒｅｓ、、　１４：１１９−１３０（１９９０））。

細胞を！！濁液中て増殖させ、そして遠心により収得する。グリコリピドを、Ｋａｎｎａｇｉ　ら、Ｊ、Ｂｉｏｔ、Ｃｈｅｍ、、　２５７：１４８６５　（＋９８２）に記載されている（引用によりこの明細書に組み入れる）ように、細胞沈澱物からクロロホルム／メタノール２，１およびイソプロピルアルコール／ヘキサン／水５５　：　２５　：　２０で抽出する。生ずる抽出物をクロロホルム／メタノール／水（３：　２　＋　１）で分配する。生ずる抽出液の上相はガングリオシドを含有し、そして下相はグリコリピドを含有する。

ガングリオシド（少なくとも１つのシアル酸成分を含有するグリコスフィンゴリピド）を含有する上相を、ＬｅｄｅｅｎおよびＹｕ、　ＡＩｅｔｈＯｄＳＥｎｚｙｍｏｌ、　８３：ｌ３９（＋９８２）に詳細に記載されている（引用によりこの明細書に組み入れる）ようにして分離し、そしてＤＥＡＥ−セファデックス（Ｓ　ｅ　ｐ　ｈ　ａ　ｄ　ｅ　ｘ）クロマトグラフィーにより中性および酸性の分画に分割する。生ずるガングリオシドをプールし、凍結乾燥し、そしてクロロホルム／メタノール（２：１）中に溶解する。

フォルテ（Ｆｏｌｃｈ）分配の下相はグリコリピドを含有する。これらを分離し、そして調製用薄層クロマトグラフィーでクロロポルム／メタノール／水（６０：３５：８）を溶媒系として使用してＳｙｍｉｎｇｔｏｎにより記載されているように分離する。

セレクチンのリガンドを含有するガングリオシドおよびグリコリピドを同定するために、免疫化学的グリコリピド分析ｉＡＩａｇｎａｉら、Ａｎａｌｙｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０９：３９９　（１９８０）（引用によりこの明細書に組み入れる）の手順に従い実施する。簡単に述べると、前述のガングリオシドのプールを薄層クロマトグラフィーによりクロマトグラフィーにかける。次いて薄層のプレートを１２１１標識したＦＨ６、または関連構造物とインキュベージタンする。標識した抗体とインキュベーションした後、プレートをラジオグラフの検出フィルムに露光し、そして現像する。Ｘ線フィルム上の黒いスポットはモノクローナル抗体に結合するガングリオシドに相当し、そしてそれらのガングリオシドを、シリカプレートの対応する区域をかき取り、そしてガングリオシドをクロロホルム／メタノール／水で溶離することによって回収する。ガングリオシドをまた乾燥し、そしてクロロポルムの中に再懸濁させ、そして同様な薄層系で展開し、そして放射線標識した抗体でブロービングする。グリコリピドがら誘導されたオリゴ糖の構造分析は、本質的にガングリオシドについて記載したように実施する。

ＳＬＸ単位を含んでなるオリゴ糖はこの分野において知られている方法により糖タンパク質から調製することができる（参照、例えば、Ｇｅｒａｒｄ、前掲、ｐｐ、５３７−５３９）　、典型的には、Ｎ−グリコシダーセ（Ｎ−グリカナーゼ）を使用してＮ一連鎖オリゴ糖を切断するが、〇一連鎖基はエンド−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼて切断する。

種々の成分に結合したＳＬＸまたはその擬ＳＬＸを含有する合成化合物は、所望の特定の用途に依存して調製することができる。例えば、ＳＬＸはセラミド部分を還元性末端のＧＩｃＮＡｃ単位のＣ−１に連鎖することによってガングリオシドに転化することができる。ＳＬＸ構造および関連構造はまた、広範な種類の他の分子、例えば、種々の置換されたアミノ酸、複素環化合物、分岐鎖または直鎖状の炭素鎖をもつエーテル結合、およびアリールまたはアルキルアリール部分をもつエーテル結合に連鎖することができる。セレクチン結合成分はまた、種々の多糖層、アミノ酸、攪アミノ酸、オリゴペプチドまたはタンパク質に、当業界においてよく知られている方法により結合することができる。

用語「アルキルＪは、ここで使用するとき、分岐鎖または直鎖状の飽和または不飽和の炭化水素鎖、例えば、１〜７ｇの炭素原子を存する低級アルキル、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ブチル、ｎ−ヘキシルなど、シクロアルキル（３−７炭素）、シクロアルキルメチル（４〜８炭素）およびアリールアルキルを意味する。

用語「アリール」は、芳香族炭化水素から１つの原子を除去することによって誘導された基、例えば、ベンゼンからのフェニルを意味する。芳香族炭化水素は１より多い不飽和の炭素環、例えば、ナフチルを有することができる。用＃！’アルコキシル」は、分子の残部に酸素により結合するアルキル基、例えば、エトキシル基を意味する。「複素環化合物」は３またはそれより多くの原子を有する環の化合物を意味し、ここで原子の少なくとも１つは炭素以外（例えば、Ｎ、Ｏ，Ｓ、　Ｓｅ、ＰまたはＡｓ）である。このような化合物の例は、フラン類、ピリミジン類、プリン類、ピラジン類などを包含する。用！！「オリゴ」は、２〜はぼＩＯ残基から成るポリマーの分子、例えば、アミノ酸（オリゴペプチド）、単糖（オリゴ糖）、および核酸（オリゴヌクレオチド）を意味する。用語「ポリ」は１０より多い残基から成るポリマーの分子を意味する。

多価の形態のセレクチン結合成分の合成のために、ＳＬＸまたは他の構造を含有するモノマーの単位を結合して１〜約４またはそれ以上のセレクチン結合成分を有する分子を形成することができる。

このような多価の形態の１つの例は、単位が、次の成分：ｎおよびｍは同一であるか、あるいは異なり、そして２〜１２の整数であり、ＹはＯまたはＳであり、そしてＷはＯｌＳまたはＮＨである）により連鎖している。あるいは部分は２つの置換基を有する５〜１４員の環であり、各置換基は式％式％）を有し、そして置換基はシスまたはトランスの関係にある。

ＳＬＸおよび関係する構造はまた、種々の複素環化合物（例えば、窒素原子を含んでなるもの）に結合することができる。この場合において、成分は好ましくは環の窒素原子に結合し、各窒素は１つの成分に連鎖している。この目的に適当なペテロサイクルの化合物の例は、ピペラジンおよびホモピペラジンを包含する。

あるいは、ＳＬＸまたはｌ１ｆＳＬＸの多価の形態は、所望の成分を多数の結合部位をもつ前板て形成した担体成分に結合することによってつくることができる。例としてＳＬＸをリジンおよびリジンを含有するペプチド、タンパク質、糖タンパク質またはこのような化合物のアスパラギン側鎖のアミノ基に結合することが挙げられる。

ＳＬＸの多価のセレクチン結合化合物を調製する他の方法は、所望の単糖残基を多糖に付加することである。例えば、ＳＬＸの線状コア構造を有する反復単位（すなわち、フコース残基をもたない）を含有する多糖を酵素のフコジル化により多価のＳＬＸを含有する多糖に転換することができる。群Ｂのストレプトコッカスから得られた天然の多糖Ｔａ、ＩＩまたは■型の使用が好ましい。これらの多び■型、＾ＴＣＣＮｏ、３１５７７）から標準の手順により分離することができる。例えば、Ｊｅｎｎｉｇｓ　ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２２１２５８ −１２６３　（１９８３）およびＰＣＴ出願公開第８７０６２６７号を参照のこと。これら両者をここに引用によって加える。

これらの多糖は次の式の反復単位からなる。

上の構造における矢印は各多糖分子の主鎖を示す。埋鮮されるように、１ａ型はＳＬＸの線状のコア構造を有する反復単位を含有する。池の２つの多糖は、主鎖はＳＬＸのコア構造を含んでなる。下に記載する標孕的技術に従いα１，３−フコシルトランスフェラーゼを枕用するこれらの多糖の酵素的フコシル化は、多価のＳＬＸ化合物を生ずる。フコシル化後、反復単位は次の式で示されるＩａ整次の中間体を発生させる。グリコジル転移反応は、最適には、アルカリ性ホスファターゼ（例えば、子ウシ腸から、ＣＩＡＰ）を添加して、反応を阻害することがあるヌクレオシドホスフェート副生物を消費して実施することができる。

ＳＬＸに類似する炭水化物基の調製用酵素的合成のために一般的な条件は知られている（参照、Ｔ’ｏｏｎｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　４５：５３６５−５４２２（１９８９）　；　Ｗｏｎｇら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、４７：５４１ｆ３−５４１８　（１９８２）　：　Ｕｎｖｅｒｚａｇｔよつて加える）。

主要な酵素反応の各々は示されている（Ｂｅｙｅｒら、こＪ二側用によって加える）、調製用反応のために、ガラクトシルトランスフェラーゼおよび！または２以上のシアリルトランスフェラーゼを天然源から精製する（　Ｂｅｙｅｒら、前掲およびＷｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５７二１３８３５−１３８４４　（１９８２）　、これをここに引用によって加える）。フコシルトランスフェラーゼはまた、ＣｒａｗＩｅｙおよび定することができる。ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼのＤＮＡはクローニングされており（ＰａｕｌｓｏｎおよびＣｏ１１ｅｙ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６４：１７６１５−１７６１８　（１９８９）　、これをここに引用によって加える）、大規模な調製的合成のための可溶性組み換え酵素の製造が可能にされた（Ｃｏｌｌｅｙら１．ＬＢｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６４　：１７６１９−１．７６２２　（１９８９））。

大規模の反応のために十分な量のフコシルトランスフェラーゼを得るために、当業者のあるものはこの酵素をクローニングし、そして組み換え体の可溶性酵素として発現することができる。好ましい方法として、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１８：５２１４−５２９９　（１９７９）に記載されているように、ＲＮＡを野生型ＣＨ（’Ｊ細胞およびＬＥＣＩＩ細胞から抽出し、そしてポリＡ＋ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）−セルロースのクロマトグラフィーにより分離することができる。次に、ＬＥＣ−１１細胞からのｃＤＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）　、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（これをここに引用によって加える）に記載されているようにして調製することができる。ｅＤＮＡは、Ｄａｖｉｓ（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆεｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｕｎｏｌｇｙ、　Ｖｏｌ、２．　ｐｐ、ｌ−１３（＋９８６）の方法により、野生型ＣＨＯ細胞からの過剰のボｌＪＡ＋ＲＮＡを使用して抽出することができ、このＣＨＯ細胞は所望のフコシルトランスフェラーゼを発現しないが、それ以外はＬＥＣＩＩ細胞のｍＲＮＡＦＩＩの大部分を存する。次いて、ｃＤＮＡライブラリー〇ＤＭ８発現ベクターの中で抽出したｃＤＮＡを使用して構成することができる（Ｓｅｅｄ、　Ｎａｔｕｒｅ　３２９：８４０−８４２　（１９８７戸。フコシルトランスフェラーゼを発現するクローンは、Ｌａｒｓｅｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　８６３２２７−８２３１（＋９８９）に記載されている発現クローニングにより、ＣＯ３−１細胞のトランスフェクションを使用しそしてＦＨ６抗体またはＳＬＸ抗原に対して特異的な他の抗体でＳＬＸ抗原を発現する細胞をスクリーニングすることによって分離することができる。次いで、フコシルトランスフェラーゼの全長のクローンを使用して、Ｃｏ１１ｅｙら、前掲により教示されているようにし、可溶性組み換え酵素を産生ずることができる。

ＳＬＸの他の源はα１−酸性糖タンパク質であり、これは血漿機タンパク質であり、その炭水化物部分をフコシル化してＳＬＸを生成することができる（参照、Ａｌｐｈａ、　−Ａｃｉｄ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ：Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｐｈｙｓｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ。

Ｂａｕｍａｎら編（Ｗｉｌｅｙ　１９８９）　、およびＷａｌｚ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２５０　：１１３２−１１３５（１９９０）　、それらの両者をここに引用によって加える）。

ＳＬＸ化合物の酵素的合成または組み合わせた化学的および酵素的合成は好ましいが、化学的合成は、また、下の反応のスキーム■および■ａに示すようにして可能である。

スキームＩｆスキームＩＩ　ａＳＬＸ化合物の酵素的合成または組み合わせた化学的および酵素的合成は好ましいが、化学的合成は、また、下の反応の概要■およびＩＩａに示すようにして可能である。

ＳＬＸ構造の成分片は合成されている。例えば、ＳＬＸを包含するシアル酸を含有するグリコシドは、欧州特許出願第８８３１１３１２．８号、（これをここに引用によって加える）に開示されている。Ｎ１ｃｏＬａｏｕら（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　１１２：３６９３　（１９９０））は、グリコスフィンゴリピドの腫瘍に関連するＬｅｘ族の完全な合成を発表した。スキーム■に示すように、その中に保護された三糖Ｇａｌβ１．４　（Ｆｕｃα１．３）ＧｌｃＮＡｃ　（Ａ）の合成が記載されている。この中間体と適当なグリコジルアクセプター（例えば、アルコール部分）との反応は化合物（Ｂ）を生ずる。グルコサミン成分の選択的脱保護およびアセチル化は、本質的にＮ１ｃｏｌａｏｕらに記載されているようにして実施して化合物（Ｃ）を得る。（Ｃ）と前述したようなシアリルトランスフェラーゼとの反応は所望の生成物５ＬＸ−Ｒを与えるが、これは反応スキーム■を使用して比較的低い収率て生成することができる。

修飾されたフコシドを、合成の反応スキームに含めて、この成分が異るＳＬＸ類似体を得ることができる。例えば、α−Ｄ−アラビノシルグリコシドは、既知の手順、Ｎ１ｃｏｌａｏｕら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　１１２：３６９３ −３６９５　（１９９０）に従い、トリー〇−ベンジルアラビノシルハライドを使用して合成することができる。他のアリールまたはアルキルおよびその中の参考文献）、そして同一方法において三糖の中に導入することができる。これらのすべてをここに引用によって加える。

別の反応スキームＩＩａに従い、三糖（トリサツカリド）（Ａ）を部分的脱保護して（Ｄ）を生成し、引き続いてこれを過了セチル化シｃ４　（１９９１Ｘこれらをここに引用によって加える）に記載されている手順に従い、クロマトグラフィーによる精製後（Ｆ）を生成する。

（Ｆ）を順次にメチルヒドラジンとの反応、Ｎ−アセチル化、０−脱アセチル化およびエステルのハイブリダイゼーションで処理すると、５ＬＸ−Ｒが得られる。

反応スキーム■およびＩＩａの好ましい例は、次のものを包含する：アルキル（直鎖状、分枝鎖状、飽和、１不飽和および多不飽和）：セリン（ＤまたはＬ）：セリンを含有するペプチドニジおよびトリーアルカノールアミン（例えば、（ＨＯ（ＣＨｚ）、）ｔ　ＮＨ。

（ＨＯ（ＣＨ２）−）　ｘ　Ｎ　；ここでｎ　＝　Ｃ２Ｃ２＋１、直鎖状、分枝鎖状、不飽和、■不飽和および多不Ｉ＠和として）。Ｒもまた、当業者が所望の使用に包含するように、アリール、置換アリール（例えば、Ｍｅ、　ＯＨ，Ｔ　；　”’Ｉを包含する単独または組み合わせ）、アルキルアリール、アリールアルキルまたは池の成分であることができる。フェノール系化合物、例えば、チロシンの中へのヨウ素の導入はこの分野において知られている。ラジカルの基を含有するフェノール類は１２′夏放射性同位元素の導入のために有用であり、診断において有用である化合物を生成する。

ＳＬＸ及び関連構造を含んで成る化合物はまた、セレクチンにより仲介される細胞間の付着を阻害することができる他の化合物の存在について測定するために使用することができる。ある数の方法を使用して、セレクチン仲介応答を阻害する能力について試験化合物の生物学的活性をアッセイすることができる。理想的には、本発明のアッセイは種々の化合物の大規模の試験管内または生体内のスクリーニングを可能とする。

スクリーニングすべき試薬または被験化合物は、典型的には、合成または天然に生産された生物分子、例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質（例えば、モノクローナル抗体）、炭水化物（例えば、オリゴＮ）、糖接合体、核酸などであろう。化合物は、例えば、前述のオリゴ糖を合成する方法を使用して合成的に生産される（さらにＫｂｄｅｍ、　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（Ａｃａｄｅ＋ｎｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州すンディエゴ、１９８８を参照のこと）、これをここに引用によって加える）。定められた組成のポリペプチドを合成する方法はこの分野においてよく知られている（参照、Ａｔｈｅｒｔｏｎら、５ｏｌｉｄＰｈａｓｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード、１９８９）これをここに引用によって加える）。合成被験化合物がポリマー（例えば、ポリペプチドまたは多１］りである場合、それらは好ましくは系統的方法で変更して、所望の作用を有するモノマーの配列を同定する（参照、例えば、米国特許第４．８３３．０９２号、これをここに引用によって加える）。被験化合物はまた、任意の天然源、例えば、動物、植物、菌類、またはバクテリアの細胞から前述の標準の手順に従い単離することができる。

潜在的に有用なモノクローナル抗体は、下により詳細に記載する標準的方法に従い調製することができる。

本発明の測定は、リガンド分子の拮抗因子または作動因子として作用する化合物を同定するとき有用である。拮抗因子はリガンドの生理学的作用を逆転するか、あるいはレセプターへのリガンドの結合を排除する化合物である。拮抗因子は、通常、レセプター結合部位についてリガントと直接または間接的に競争し、こうして、レセプターに結合するリガンド分子の比率を減少させる。典型的には、拮抗因子は天然リガンドのトポグラフィ−的同等物であり、そしてセレクチン上の結合部位についてリガンドと直接的に競争する。このような化合物をここにおいてｒｔＭ　（ｍｉｍｅ　ｔ　ｉ　Ｃ）　Ｊと呼ぶ。

１ｔｉｓＬＸ　（ＳＬＸ　ｍ　ｉｍｅ　ｔ　ｉ　ｃ）は、それがセレクチンレセブターにより認識されることにおいてＳＬＸ成分の代替因子としてコンフォメーション的および機能的に働く分子である。あるいは、リガンドおよび被験化合物がレセプターに同時に結合することができる場合、化合物は非競争的である。非競争的阻害因子は、レセプターに結合したリガンド分子の比率を減少するよりむしろ、レセプター−リガンドの相互作用の引き続く生理学的作用を減少または阻害することによって作用する。最後に、本発明の測定法を使用して、合成または天然に存在する作動因子、すなわち、レセプターに結合し、そして天然リガンドの生理学的応答に類似する応答を開始する化合物を同定することができる。

リガンド−レセプターの相互作用の阻害因子を試験管内でスクリーニングする多数の直接的および間接的方法が利用可能であり、そして当業者に知られている。

例えば、特定のセレクチンを発現する細胞へのＳＬＸを有する細胞の付着を阻害する能力を決定することができる。前述したように、セレクチンレセブターはクローニングされており、こうして遺伝子を広範な種層の細胞、例えば、ＣＯ８細胞、ＣＨＯ細胞などにおいて挿入および発現することができる。

さらに、通常ＳＬＸを発現しない細胞は、形質転換された細胞にリガンドを合成する能力を与える、■または２以上のグリコジルトランスフェラーゼ遺伝子で形質転換することができる。（参照、例えば、Ｌｏｗｅら、Ｃｅ１ｌ　６３：４７５−４８４　（１９９０）、これをここに引用によって加える。）典型的には、被験化合物または試薬を、標識したＳＬＸを有する細胞および固体表面上に固定化された活性化内反細胞とインキュベーションする。次いで、細胞の付着の阻害は、適当な洗浄後、表面に結合した標識を検出することによって決定される。下に記載する例示する測定において、前骨髄球ＨＬ−６０細胞および活性化されたヒト内皮細胞または活性化された血小板を使用する。

セレクチンレセブターに対して特異的なリガンドが今回同定されたので、単離したリガンド分子もまた測定において使用することができる。用語「単離されたセレクチン結合因子」または「単離されたＳＬＸ部分」は、ここで使用するとき、その天然状態以外において、例えば、リガンドを通常発現する細胞の細胞膜に関連しない、セレクチン結合性化合物を意味する。こうして、単離されたＳＬＸ部分は単離された分子、例えば、オリゴ糖または糖液自体の１つの成分であることができる。単離された分子は合成することができ、又はＳＬＸを有する細胞の膜から調製することができる。あるいは、単離されたセレクチン結合因子またはＳＬＸ成分は、測定において使用する前に、リポソームに含金させるか、あるいは固体表面に取り付けることができる。セレクチンを有するリポソームを調製する方法および撹々の生物分子を固定化する方法は、下に詳細に説明する。

典型的には、本発明の試験管内測定は、レセプターまたはリガンドに結合することが知られている化合物の結合を競争的に阻害する被験化合物の能力を検出する、競争測定である。ＳＬＸとレセプターまたはリガンドとの間の結合を通常試験する。他の結合相互作用の阻害もまた、適当であり、例えば、モノクローナル抗体（例えば、ＦＥ（６）とＳＬＸとの間またはｍ５Ｌｘとセレクチン阻害因子との間の結合の阻害を使用することができる。競争測定の多数のタイプか知られている（参照、例えば、米国特許第３．３７６、１１０号、米国特許第４．０１６．０４３号、およびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ａしａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｕｂｌｃａｔｉｏｎｓ、ニューヨーク（１９８８）　、これをここに引用によって加える）。

本発明のアッセイはまた、競争測定を使用してよりむしろ、１つの成分単独への被験化合物の結合の測定にも適する。例えば、免疫グロブリンを使用して、ＳＬＸ成分を含有する化合物を同定することができる。モノクローナル抗体のための標準的手順、例えば、ＥＬＩＳＡを使用することができる（参照、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前掲）。ＳＬＸ抗原を含んでなるグリコリピドを測定するとき、モノクローナル抗体と抗原との反応性をＴＬＣ免疫染色により本来（１９８３）に記載されているように固相ラジオイムノアッセイによって測定することができる。これら文献をここに引用によって加える。糖タンパク質は標準的イムノブロッティング手順によりＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前掲に記載されているようにして測定することができる。サンドイッチアッセイのフォーマットもまた、適当である（参照、例えば、米国特許第４．６４２．２８５号および米国特許第４．２９９．９１６号および米国特許第４．３９１．９０４号、およびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前掲それらのすべてをここに引用によって加える）。典型的には、結合測定において同定された化合物をさらに試験して、レセプター−リガンドの相互作用を阻害する能力について決定することができる。

他の測定のフォーマットは、相互作用から生ずるリガンドまたはセレクチンを育する細胞における種々の生理学的変化の存在または不存在を検出することを含む。適当な測定の例は、次のものを包含する：結合により誘発される転写活性の変化の測定（参照、例えば、ＥＰＯ公開Ｎｏ、３７１２８２０）　、種々の細胞仲介細胞外作用の検出（参照、例えばＰＣＴ公開Ｎｏ、９０１００５０３　）　、および個々の細胞の膜ポテンシャルの変化の検出（参照、例えば、米国特許第４．３４３．７８２号）、それらのすべてをここに引用によって加える。あるいは、単離されたレセプターまたはリガンドにおけるコンフォメーションの変化を検出することができる：参照、例えば、米国特許ｉ！　４．８５９．６０９号、これをここに引用によって加える。

リガンド、レセプターまたは被験化合物を包含する、測定の任意の成分を固体表面に結合することができる。固体表面上に生物分子を固定化する多数の方法はこの分野において知られている。例えば、固体表面は膜（例えば、ニトロセルロース）、マイクロタイタープレート（例えば、ＰＶＣまたはポリスチレン）またはビーズであることかできる。所望の成分を非特異的結合を通して共有結合的または非共有結合的に取り付けることができる。

広範な種類の天然または合成の有機および無機のポリマーを、固体表面の材料として使用することができる。例示するポリマーは、次のものを包含する：ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、レーヨン、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、セルロースアセテート、ニトロセルロースなど。使用できる他の材料は、紙、ガラス、セラミック、金属、メタロイド、半導体材料、サーメットなとを包含する。さらに、次のものが包含されるニゲルを形成する物質、例えば、タンパク質、例えば、ゼラチン、リボ多糖類、シリケート、アガロースおよびポリアクリルアミドまたはいくつかの水性相を形成するポリマー、例えば、デキストラン、ポリアルキレングリコール（２〜３炭素原子のアルキレン）または界面活性剤、例えば、両親媒性化合物、例えば、リン脂質、長鎖（１２〜２４炭素原子）アルキルアンモニウム塩など。固体表面が多孔質であるとき、種々の孔大きさを系の性質に依存して使用することができる。

表面を調製するとき、複数の異なる材料、とくにラミネートを使用して、種々の性質を得ることができる。例えば、タンパク質のコーティング、例えば、ゼラチンを使用して、非特異的結合を回避し、共有結合の接合を簡素化し、シグナルの検出の増強などをすることができる。

化合物と表面との間の共有結合を望む場合、表面は通常多官能性であるか、あるいは多官能性化されることができる。表面上に存在しかつ連鎖に使用することができる官能基は、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基などを包含することができる。広範な種類の化合物を種々の表面に結合する方法はよく知られており、そして文献において詳細に例示されている。参照、例えば、［ｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｅｎｚｙｍｅｓ、　Ｉｔｉｒ。

Ｃｈｉｂａｔａ、　Ｈａｌｓｔｅｄ　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９７８、およびＣｕａｔｒｅｃａｓａｓ。

Ｊ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２４５３０５９（１９７０）　、これをここに引用によって加える。

共有結合に加えて、アッセイ成分を非共有結合により結合する種々の方法は典型的には表面への化合物の非特異的吸収である。典型的には、表面を第２化合物でブロッキングして、標識した測定成分の非特異的結合を防止する。あるいは、表面は１つの成分を非特異的に結合するが、他の成分を有意に結合しないように設計する。例えば、レクチン、例えば、コンカナバリンＡを有する表面は炭水化物を含有する化合物と結合するが、グリコジル化を欠如する標識したタンパク質と結合しない。測定成分の非共有結合による取り付けのための種々の固体表面は、米国特許第４．４４７．５７６号および米国特許第４．２５４．０８２号（これらをここに引用によって加える）において概観されている。

多数の測定フす−マットは、標識した測定成分、例えば、ＳＬＸリガンド、損ＳＬＸ、免疫グロブリン、レセプター、または被験化合物を使用する。標識はこの分野においてよく知られている方法に従い測定の成分に直接または間接にカップリングすることができる。

広範な種類の標識を使用することができる。成分はいくつかの方法の１つにより標識することができる。検出の最も普通の方法は２　Ｈ。

１２″ｒ、２５ｓ、＋−ｃまたは”Ｐ［識した化合物などを使用するオートラジオグラフィーである。放射性アイソトープの選択は、合成の容易さ、種々の安定性、および選択したアイソトープの半減期のための研究の好ましさに依存する。

他の非放射性標識は、標識した抗体に結合するリガンド、蛍光団、化学発光剤、酵素、および標識したリガンドのための特異的結合対のメンバーとして働くことができる抗体を包含する。標識の選択は、要求される感度、化合物との接合の容易さ、安定性の要件、および入手可能な計器に依存する。

−非放射性標識は間接的手段によりしばしば達成される。一般に、リガンド分子（例えば、ビオチン）は分子に共有結合される。次いで、リガンドは抗リガンド（例えば、ストレプトアビジン）分子に結合し、ここで抗リガンド分子は本来的に検出可能であるか、あるいはシグナル系、例えば、検出可能な酵素、蛍光性化合物、または化学発光性成分に共有結合することができる。リガンドおよび抗リガンドは広く変化することができる。リガンドが天然抗リガンド、例えば、ビオチン、チロキシンおよびコーチゾルおよびコーチゾルを有する場合、それは標識した、天然の抗リガンドと組み合わせて使用することができる。あるいは、ハプテンまたは抗原性化合物を抗体と組み合わせて使用できる。

分子はまた、シグナル発生化合物に、例えば、酵素または蛍光団との結合により、直接接合させることができる。標識として問題の酵素は、主として、ヒドラーゼ、とくにホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、またはオキシドレダクターセ、とくにペルオキシダーゼであろう。蛍光性化合物は、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどを包含する。化学発光性化合物は、ルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えば、ルミノールを包含する。使用することができる種々のシグナル生成系の概観については、米国特許第４．３９１．９０４号を参照のこと。これをここに引用によって加える。

前述したように、アクセス可能なＳＬＸ単位または４ｕＳＬＸを含んでなる種々の阻害因子の化合物に加えて、本発明はまた、セレクチンにより仲介される細胞間の付着を阻害することができるモノクローナル抗体ならびにこのような抗体を同定する方法を提供する。

モノクローナル抗体は、セレクチンのリガンドまたはレセプターに結合し、そして細胞の付着をブロッキングする。こうして、種々の免疫グロブリン分子の生成および操作について当業者に入手可能な複数の技術を応用して細胞間の付着を阻害することができる。

ここで使用するとき、用語「免疫グロブリン」は免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされる１または２以上のポリペプチドから成るタンパク質を意味する。認識される免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミューの定常領域の遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリンの可変領域の遺伝子を包含する。免疫グロブリンは、抗体以外の種々の形態、例えは、Ｆｖ、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ’）ｔで、ならびに−重鎖で存在することができる（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｔ　１．　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８５：５８７９−５８８３（１９８８）およびＢｉｒｄら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４２：４２３−４２６　（１９８８））これらをここに引用によって加える。（参照、一般に、１（ｏｏｄら、（ｍｍｕｎｏ　ｉｏｇｙ、第２版、Ｂｅｎ　ｊａｍｉ　ｎ、ニューヨーク（１９８４）、およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒおよびＨｏｏｄ、　Ｎａｔｕｒｅ　３２３：１５−１６　（１９８６）　、これらをここに引用によって加える。）ＳＬＸ抗原と結合する抗体は、種々の手段により生成することかできる。ヒト以外の、例えば、ネズミ、ウサギ目、ウマのモノクローナル抗体の産生はよく知られており、そして動物をＳＬＸ抗原、あるいは抗原を含んでなる糖タンパク質またはグリコリピドを含有する調製物により免疫することができる。免疫した動物から得られた抗体産生細胞を不滅化しそしてスクリーニングするか、あるいはまずウィルス表面のタンパク質とレセプター分子との相互作用を阻害する抗体の産生についてスクリーニングし、次いで不滅化する。

モノクローナル抗体の産生についての一般手順の説明については、ｔ（ａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ！　（１９８８）、前掲を参照のこと。

ヒト抗原（ヒト組織から分離されたＳＬＸ単位の場合において）に対してヒトモノクローナル抗体の発生は、普通の技術とともに異なることがある。こうして、ヒト以外の抗体の抗原結合領域、例えば、Ｆ（ａｂ’）ｔまたは超可変領域を、組み換えＤＮＡ技術によりヒトの一定領域（Ｆ　ｃ）またはフレームワーク領域に転移して、実質的にヒト分子を産生ずることができる。このような方法は一般にこの分野において知られておりそして、例えば、米国特許第４．８１６．３９７号、欧州特許発行第１７３，４９４号および欧州特許発行第２３９．４００号（これらをここに引用によって加える）に記載されている。あるいは、ヒトＳＬＸに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその一部分をコードするＤＮＡ配列は、Ｈｕｓｅら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４８：１２７５−１８１　（＋９８９）（これをここに引用によって加える）の一般の手順に従いヒトＢ細胞からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、次いで所望の特異性の抗体（または結合性断片）をコードする配列をクローニングおよび増幅することによって単離することができる。

多数の現在入手可能なモノクローナル抗体を本発明に従い使用して、セレクチンにより仲介される細胞間の付着を阻害することができる。例えば、Ｃ３ＬＥＸ− １（参照、（：ａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

２５９：１１２０８−１１２１４　（１９８４））　、Ｓ　Ｌ　Ｘとわずかに異なる配列を認識するＶＩＭ−２（参照、Ｍａｃｈｅｒら、前掲）、ＦＨ６（米国特許第４．９０４．５９６号に記載されている）（すべて参考文献をここに引用によって加える）、あるいはＳ、Ｈｋｏｍｏ　ｒ　ｉ博士（ＢｉｏｍｅｎｂｒａｎｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、ワシントン州シアトル）により発生されたＳＨ，またはＳＨ，。

免疫グロブリンを包含する本発明の化合物は、後述するように医薬製剤の調製において使用することができる。化合物がオリゴ糖または糖液合体である場合、ＳＬＸまたは擬ＳＬＸ部分は種々の形態て提供することができるが、セレクチンレセブター、例えば、ＥＬＡＭ−１，ＧＭＰ−１，４０またはＭＥＬ−１４抗原と有効に結合し、これにより細胞間の付着を阻害することができるべきである。

本発明の医薬組成物は、多数の疾患に関連する細胞の付着をブロッキングまたは阻害することができる。例えば、多数の炎症性疾患は脈管内皮細胞および血小板上に発現されるセレクチンに関連する。

用語ｒ炎症」はここにおいて特異的および非特異的のＩＷ者のＦＪ理系の反応を意味する。特異的防御系の反応は抗原に対する特異的免疫系の反応である。特異的防御系反応の例は、抗原例えばウィルスに対して抗体の応答、および遅延型過敏性を包含する。非特異的防備系反応は、一般に免疫学的記憶が不可能である白血球により仲介される炎症応答である。このような細胞は、マクロファージ、好酸球および好中球を包含する。非特異的反応の例は、蜂の刺創後の直ちの腫脹、バクテリアの感染部位におけるＰＭＮ白血球の集まり（例えば、細菌性肺炎における肺の浸潤および膿瘍における膿の形成）を包含する。

他の処置可能な疾患は、次のものを包含する１例えば、慢性関節リウマチ、虚血後の白血球仲介組織の損傷（再潅流傷害）、凍傷の損傷又はショック、急性白血球介在肺傷害、（例えば、大人の呼吸困１１ｆｆｌ症候群）、喘息、外傷性のショック、敗血症性ショック、腎炎、および急性および慢性の炎症、例えば、アトピー性皮膚炎、乾癖、および炎症性の腸の病気。種々の血小板仲介病理学的事象、例えば、アレローム性動脈硬化症および凝固もまた、処置することかできる。

さらに、腫瘍の転移は循環する癌細胞の付着の阻害により阻害または防止することができる。この例には結腸癌および黒色腫が包含される。

１例として、再潅流傷害は本発明の組成物による処置がとくに可能である。ＧＭＰ−１４０セレクチンーリガンドの相互作用を阻害する組成物は、とくに再潅流傷害の処置または防止に有用であることがある。本発明は心臓外科の前に予防的に使用して、外科後の回復を増強することかできる。

ＧＭＰ−１４０は血小板および内皮細胞のウエイベルーバレイド（Ｗｅｉｂｅｌ −Ｐａｌａｄｅ）体の中に貯蔵され、そしてトロンビンにより活性化された後に解放されて、好中球および単球の付着を仲介するので、ＧＭＰ−１４０−リガンドの相互作用の阻害因子は、血栓性疾患をしばしば伴う組織の損傷を最小とする場合に特に有用であることがある。例えば、このような阻害因子は、最近の発作、心筋梗塞、深部静脈の血栓症、肺塞栓症などを経験した患者において、とくに療法的価値を有する。化合物は血栓溶解治療において特に有用である。

本発明の組成物は、敗血症性ショックまたは散在性腺管内凝固（ＤｒＣ）の二次作用を治療するために特に使用される。敗血症性ショックまたはＤＩＣの間の組織の中への白血球の遊走は病理学的組織の破壊をしばしば生ずる。さらに、これらの患者は広く微小循環の血栓症および拡散性炎症を有することがある。ここにおいて提供される医薬組成物はこれらの部位における白血球の遊走を阻害し、そして組織の損傷を緩和する。

セレクチンーリガンドの相互作用の阻害因子はまた、外傷性のショックおよびそれに関連する急性組織の損傷の処置において有用である。セレクチンは損傷の部位への白血球の補充、とくに作用損傷および炎症の場合にＥＬＡＭ−１の補充において役割を演するので、それらの阻害因子を局所的または全身的に投与して、このような傷害に関連する組織の損傷を抑制することができる。そのうえ、炎症部位に対するこのような阻害因子の特異性のために、例えば、ＥＬＡＭ−１が発現される場合、これらの組成物は、伝統的抗炎症剤と比較したとき、より有効であり、そして合併症を引き起こす可能性がより少ない。

こうして、本発明はまた、前述の状態を処置するとき使用できる医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、生物分子またはＳＬＸ単位を含んでなる他の化合物、ＳＬＸに結合する抗体、またはＳＬＸリガンドとセレクチンレセブターとの間の相互作用を阻害する他の化合物、および製剤学的に有効な担体から構成されている。

本発明の生物分子は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質（例えば、免疫グロブリン）、炭水化物（例えば、オリゴ糖または多８ｉ類）、糖液合体（例えば、グリコリピドまたは糖タンパク質）、核酸なとであることができる。医薬組成物は種々の薬物供給系における使用に適当である。薬物を供給する本発明の簡単なｌ！観については、Ｌａｎｇｅｒ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４９　：　１５２７− １５３３（１９９０）を参照のこと。これをここに引用によって加える。

哺乳動物における炎症の応答の復雑さに照らして、当業者は容易に認識するように、本発明の医薬組成物はＳＬＸを育する化合物と、他の細胞付着分子の機能を妨害することが知られている他の化合物とを混合してなることができる。例えば、付着分子のインテグリン族の構成員は感染点における白血球の管外遊走にある役割を演すると考えられる。セレクチンレセブターを包含する、細胞間付着レセプター、およびそれらの役割の免疫機能の概観については、Ｓｐｒｌｎｇｅｒ。

Ｎａｔｕｒｅ　３４６　：　４２５−４３４（１９９０）を参照のこと。これをここに引用によって加える。さらに、本発明の医薬組成物を使用する首尾よい処置はまた、処置すべき状態の進展の状態により決定することができる。

異なる付着分子は病気または状態の過程の間に種々の因子に対する応答において上下に調節することができるので、当業者は認識するように、異なる医薬組成物は異なる炎症性状態の処置のために要求されることがある。

１つの態様において、医薬組成物のＳＬＸリガンドを使用して、普通の抗炎症性薬剤または他の薬剤を組織の損傷の特異的部位へ集中させることができる。セレクチン結合成分、例えば、ＳＬＸリガンドまたは擬ＳＬＸを使用して、薬物をセレクチンレセブター、例えば、脈管内皮細胞上のセレクチンレセブターへ集中させることによって、このよ・うな薬物は損傷部位におけるより高い濃度を達成することができる。普通の抗炎症性化学療法剤からの副作用は、より低い投与量、損傷部位への薬剤の局在化および／または供給前の薬剤の封入により実質的に軽減することができる。

集中（ターゲツティング）成分、すなわち、ＳＬＸリガンドまたは所望のセレクチンに結合する擬ＳＬＸは化学療法剤に直接または間接的にカップリングすることができる。一般にこの分野において知られている手段により実施することができるカップリングは、リガンドがレセプターに結合する能力を実質的に阻害してはならないか、あるいは化学１！法剤の活性を実質的に減少すべきではない。種々の化学療法剤をターゲツティングのためにカップリングすることができる。例えば、カップリングすることができる化学療法剤は、次のものを包含する二本発明のＳＬＸを有する化合物、免疫調節因子、血小板活性化因子（ＰＡＦ）アンタゴニスト、シクロオキシゲナーゼ阻害因子、リポキシゲナーゼ阻害因子、およびロイコトリエンアンタゴニスト。いくつかの好ましい成分は、シクロスポリンＡ、インドメタシン、ナプロキセン、ＰＫ−５０６、マイコフェノール酸などを包含する。同様に、酸化防止剤、例えば、スーパーオキサイドジムターゼは、ＳＬＸリガンドまたは擬ＳＬＸによりターゲツティングするとき、再潅流傷害の処置において有用である。同様に、抗癌剤はＳＬＸリガンドまたは擬ＳＬＸを化学療法剤にカップリングすることによってターゲツティングすることができる。カップリングすることができる因子の例は、ダウロマイシン、ドキソルビシン、ビンブラスチン、プレオマイシンなどを包含する。

セレクチンレセブターのターゲツティングは、また、水溶液の中に集合体として存在する両親媒性物質または二重特性の分子（極性。

非極性）を経て達成することができる。百Ｈ媒性物質は、非極性の脂質、極性脂質、単糖および三糖、スルファチド、リソレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸および塩類を包含する。これらの分子は、乳濁液および泡、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質の分散液および薄板状層として存在することができる。これらはここにおいて一般にリポソームと呼ぶ。これらのｇＩｉＩ！物において、供給すべき薬物は、リポソームの一部分として、ＳＬＸリガンドまたはセレクチンレセブターに結合する擾ｓＬＸと組み合わせて組み込まれる。

こうして、所望の化学療法剤を充填したリポソームを所望の組織の損傷部位にセレクチンー３ＬＸリガンドの相互作用により向けることができる。リポソームが影響を受けた細胞の近傍に送られるとき、リポソームは選択した療法組成物を供給する。

本発明のリポソームは標準的小胞形成性脂質から形成され、これらの脂質は一般に中性および負に帯電したリン脂質およびステロール、例えば、コレステロールを包含する。脂質の選択は、一般に、例えば、リポソームの大きさおよび血流の中のリポソームの安定性を考慮して決定される。

典型的には、リポソームの中の主たる脂質成分はホスファチジルコリンである。

種々の鎖長さおよび飽和度の種々のアシル鎖の基を有するホスファチジルコリンは入手可能であるか、あるいはよく知られた技術により分離または合成することができる。一般に、小さい飽和度のホスファチジルコリンは、濾過滅菌の目的で、とくにリポソームを約０．３ミクロン以下の大きさにしなくてはならないとき、いっそう容易に大きさが決められる。リポソームの大きさの決定および濾過滅菌のとき使用する方法を下に記載する。リン脂質のアシル鎖の組成はまた、血液中のリポソームの安定性に影響を与えることがある。１つの好ましいホスファチジルコリンは部分的に水素化された卵のホスファチジルコリンである。

種々のターゲツティング因子（例えば、リガンド、レセプターおよびモノクローナル抗体）を使用するリポソームのターゲツティングはこの分野においてよく知られている。（参照、例えば、米国特許第４．９５７．７７３号および米国特許第４．６０３．０４４号、これら両者をここに引用によって加える）。種々の分子量の糖タンパク質およびグリコリピドをターゲツティング因子として使用することができる。

典型的には、約３００．０００ダルトン以下、好ましくは約４０．０００〜約２５０、０００ダルトン、より好ましくは約５７．０００〜約１５０．０００ダルトンの分子量を育する塘タンパク質を使用する。約１０．０００ダルトン以下、好ましくは約６００〜約４．０００ダルトンの分子量のグリコリピドを使用する。

ターゲツティング因子をリポソームにカップリングする探準的方法を使用することができる。これらの方法は、一般に、液体の成分、例えば、ターゲツティング因子の取り付けのために活性化することができるホスファチジルエタノールアミン、あるいは誘導体化された親油性化合物、例えば、脂質誘導体化プレオマイシンを、リポソームの中に組み込むことを包含する。抗体ターゲラテッドリポソームは、例えば、プロティンＡを組み込んだリポソームを使用して構成することができる（参照、Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６５１６３３７−１６３４２（１９９０）およびＬｅｏｎｅｔｔｉ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ターゲツティングのメカニズムは、一般に、ターゲツティング因子がセレクチンレセブターとの相互作用に利用可能であるような態様で、ターゲツティング因子をリポソームの表面上で配置することを必要とする。リポソームは、典型的には、コネクタ一部分が膜の形成の時に膜の中にまず組み込まれるような方法で構成される。コネクタ一部分は、膜の中にしっかり埋め込まれかつ定着される親油性部分をもたなくてはならない。それは、また、リポソームの水性表面上で化学的に利用可能である親水性部分をもたなくてはならない。親水性部分は、後に添加されるターゲツティング因子と安定な化学結合を形成するために化学的に適当であるように、選択される。

したがって、コネクター分子は、ターゲツティング因子と反応しかつ親水性反応性基をその正しい位置に、リポソームの表面から外に伸びた状態で、保持するために適当な親油性および親水性の両者の反応性基をもたなくてはならない。ある場合において、ターゲット因子をコネクター分子に直接取り付けることができるが、はとんどの場合において、化学架橋として作用する第３分子を使用して、こうして膜の中に存在するコネクター分子を小胞表面の中から外に、３次元的に、伸びたターゲット因子と連鎖させることがいっそう適当である。

リポソームの電荷はリポソームを血液からクリアーするとき重要な決定因子であり、負に帯電したリポソームは網状内皮系によりいっそう急速に取り上げられ（Ｊｕｌｉａｎｏ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ。

６３　：　６５１（１，９７５））、こうして血流の中でより短い半減期を有する。延長した循環半減期をもつリポソームは、典型的には、治療および診断の使用に望ましい。血流の中で８，１２または２４時間まで維持することができるリポソームは、本発明のセレクチンーリガンド阻害因子の持続した解放を提供するか、あるいは網状内皮系により除去される前に、阻害因子（これは標識して生体内の診断の像映を提供することかできる）を所望の部位にターゲツティングすることを促進することができる。

典型的には、約５〜１５モル％の負に帯電したリン脂質、例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルイノシトールを有するリポソームを調製する。添加した負に帯電したリン脂質、例えば、ホスファチジルグリセロールは自発的リポソームの凝集を防止し、こうして不所望のリポソームの凝集の形成の危険を最小することができる。膜剛性化因子、例えば、スピンゴミエリンまたは飽和中性リン脂質（少なくとも約５０モル％の濃度において）および５〜１５モル％のモノシアリルガングリオシドは、一般に米国特許第４．８３７．０２８号（これをここに引用によって加える）に記載されているように、血流の中のリポソーム調製物の循環を増加することができる。

さらに、リポソームの懸濁液は、貯蔵のときの遊離基および脂質の過酸化による損傷に対してリポソームおよび薬物を保護する脂質保護因子を含むことができる。親油性遊離基のクエンチャ−１例えば、アルファトコフェロールおよび水溶性鉄特異的キレート剤、例えば、フェリオキアニンが好ましい。

例えば、５ｚｏｋａら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｂｉｏｅｎｇ、　９　：　４６７（１９８０）、米国特許第４．２３５．８７１号、米国特許第４．５０１．７２８号および米国特許第４．８３７．０２８号（これらをここに引用によって加える）に記載されているように、リポソームを調製する種々の方法が利用可能である。

１つの方法は、不均一な大きさの多層小胞を生成する。この方法においては、小胞形成脂質を適当な有機溶媒または溶媒系の中に溶解し、そして真空下にまたは不活性気体中で乾燥して、薄い脂質のフィルムを形成する。必要に応じて、このフィルムを適当な溶媒、例えば、第３ブタノールの中に溶解し、次いで凍結乾燥して、より均質な液体混合物を形成し、これはいっそう容易に水和する粉末様形態である。このフィルムをターゲラテッド薬物およびターゲツティング成分の水溶液でカバーしそして、典型的には１５〜５０分間撹拌しながら、水和させる。

生ずる多層状小胞の大きさの分布は、より激しいセレクチンレセブターの条件下に脂質を水和するか、あるいは可溶化洗浄剤を添加することによって、より小さい大きさにシフトさせることができる。

水和媒体は、最終のリポソーム懸濁液の中の内部の体積において所望の濃度で、ターゲラテッド薬物を含有する。典型的には、薬物溶液は１０〜１００ｍｇ／ｍｌを緩衝化生理的塩類溶液の中に含有する。ターゲツティング成分Ｘ分子またはセレクチンと結合する擬ＳＬＸの濃度は、一般に、約０．１〜２０ｍｇ／ｍｌである。

リポソームの調製後、リポソームの大きさを規制して、所望の大きさの範囲およびリポソームの大きさの比較的狭い分布を達成することができる。１つの好ましい大きさの範囲は約０．２〜０．４ミクロンであり、これは普通のフィルター、典型的には０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過することによって、リポソームの懸濁液の滅菌を可能とする。フィルターの滅菌法は、リポソームが約０．２〜０．４ミクロンに低下する場合、高い生産量の基準で実施することができる。

リポソームを所望の大きさにサイジングするいくつかの技術を利用可能である。

１つのサイジング法は米国特許第４．７３７．３２３号（これをここに引用によって加える）に記載されている。浴またはプローブ超音波処理によるリポソーム懸濁液の超音波処理は、約Ｏ，Ｏ５ミクロンより小さいサイズの小さい単一層の小胞への漸進的大きさの減少をもたらす。均質化は、大きいリポソームをより小さいものに断片化する剪断エネルギーに頼る他の方法である。典型的な均質化手順において、多層小胞を標準の乳濁液ホモジナイザーに通して再循環させて、選択した大きさ、典型的には約０．１〜約０．５ミクロンが観測されるようにする。両者の方法において、粒子サイズの分布は普通のレーザービームの粒子サイズの弁別によりモニターすることができる。

小孔を有するポリカーボネートの膜または非対称のセラミック膜を通すリポソームの押出しもまた、リポソームの大きさを比較的よく定められた大きさの分布に減少する有効な方法である。典型的には、懸濁液を、所望のリポソームの大きさ分布が達成さるまで、膜に１または２回以上を通して循環させる。リポソームは連続的により小さい孔の膜を通して押出して、リポソームの大きさを徐々に制限する。

最も効率よい封入によってさえ、初期のリポソーム懸濁液は遊離の（封入されていない）形態の５０％またはそれより多くの薬物およびターゲツティング因子を含有することがある。したがって、遊離の薬物またはターゲツティング因子を最終の注射可能な懸濁液から除去することが重要である。

リポソーム懸濁液から捕捉されない化合物を除去するためにいくつかの方法を利用することができる。１つの方法においては、懸濁液の中のリポソームを高速遠心により沈澱させて、遊離の化合物および非常に小さいリポソームを上澄み液の中に残す。他の方法は、懸濁液を限外濾過により濃縮し、次いで濃縮されたリポソームを薬物不含置換媒体の中に再懸濁させることを包含する。あるいは、ゲル濾過を使用して大きいリポソーム粒子を溶体分子から分離することができる。

遊離の薬物および／またはターゲツティング因子を除去する処理の後、リポソームの懸濁液を静脈内投与のために所望の濃度にする。

これは、リポソームが濃縮されている場合、例えば、遠心または限外濾過によるか、あるいは、薬物の除去工程が合計の懸濁液の体積を増加する場合、懸濁液を濃縮することによって、注射媒体の中にリポソームを再懸濁させることができる。次いで、懸濁液を前述したように濾過により滅菌する。リポソーム−リガンドの調製物は非経口的または局所的に投与することができ、ここで投与量は、例えば、投与の方法、供給すべき薬物、処置する特定の病気などに従い変化する。

ＳＬＸリガント、および／またはセレクチンレセブターの結合する擬ＳＬＸを含んでなる医薬組成物について、化合物の投与量は、例えば、特定の化合物、投与方法、処置する特定の病気およびその程度、患者の全体の健康および状態、および処方する医師に従い変化するであろう。例えば、再潅流傷害の処置のために、投与量は７０ｋｇの患者について約５０μｇ〜２，０００ｍｇ／日の範囲である。理想的には、治療の投与は心筋梗塞または池の損傷後できるだけ早く開始すべきである。医薬組成物は、非経口的、局所的、経口的または局所的投与のために、例えば、エアゾールによりまたは経皮的に、予防的および／または治療学的処置のために意図される。医薬組成物は、投与方法に依存して、種々の単位投与形態で投与することができる。

例えば、経口的投与に適当な単位投与形態は、粉末、錠剤、ピル、カプセル剤および糖剤を包含する。

好ましくは、医薬組成物は静脈内に投与する。こうして、本発明は、医薬として許容されつる担体、好ましくは水性担体の中に溶解または懸濁した化合物の液からなる、静脈内投与のための組成物を提供する。種々の水性担体、例えば、水、緩衝化水、０．４％の生理的食塩水などを使用することができる。これらの組成物は、普通の、よく知られた滅菌技術により滅菌するか、あるいは濾過滅菌することができる。生ずる水溶液はそのまま包装するか、あるいは凍結乾燥することができ、凍結乾燥した調製物は投与の前に無菌の水溶液と組み合わせる。組成物は、近似の生理学的状態に要求されるように、医薬として許容される補助側、例えば、ｐＨ調節剤および緩衝剤、張度調節剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、テリエタノールアミンオレエートなどを含有することかできる。

医薬製剤における効能を増加するために、他のＳＬＸリガンドまたは擬ＳＬＸと組み合わせて「カクテル」を形成することができる、ＳＬＸリガンドまたは擬ＳＬＸの濃度は、広く、例えば、約０．０５％より低い濃度から、通常少なくとも１重量％からｌθ〜３０重量％程度に高くまで変化することができ、そして主として流体の体積、粘度などにより選択した特定のモードに従い選択されるであろう。カクテルはまた、セレクチンレセブターに結合するモノクローナル抗体、例えば、ＥＬＡＭ−１またはＧＭＰ−１４０に対するモノクローナル抗体を、ＳＬＸリガンド、擬リガンドまたはリガンドに対するモノクローナル抗体と組み合わせて含んで、リガンド−レセプターの相互作用を効率よく阻害することができる。前述したように、カクテルの成分はリポソーム調製物を経て供給することができる。

こうして、静脈内注入のための典型的な製剤学的組成物は、２５０ｍ１の無菌のリンゲル溶液、および２５ｍｇの化合物を含有するように構成することができる。非経口的に投与可能な化合物を調製する実際の方法は当業者に知られているか、あるいは明らかでありそして、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｅｉｎｃｅｓ、第１７版、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｒ＋ｇ　Ｃｏ［ｌ１ｐａｎｙ、ペンシルベニア州イーストン（１９８５）（これをここに引用によって加える）により詳細に記載されている。

固体の組成物について、普通の無毒の固体の担体を使用することができ、これらは、例えば、製剤学的等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを包含する。経口的投与のために、製剤学的に許容されうる無毒組成物は、正常使用される賦形剤、例えば、前に列挙した任意のもの、および一般に１０〜９５％の活性成分、すなわち、本発明の１種または２種以上のＳＬＸリガンドまたは擬ＳＬＸ、好ましくは２０％を組み込むことによってドメインされる（参照、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ”Ｓ、前掲）。

エアゾールの投与のために、化合物は好ましくは微粉砕した形態で界面活性剤および噴射剤と一緒に供給される。ＳＬＸオリゴ糖のリガンドまたは擬リガンドの典型的な百分率は０．０５〜３０重量％、好ましくは１−１０重量％である。界面活性剤は、もちろん、無毒であり好ましくは噴射剤の中に可溶性である。このような物質の代表的なものは、６〜２２個の炭素原子を含有する脂肪酸、例えば、カプロン酸、オクタン酸、バルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リルン酸、オレステアリン酸およびオレイン酸と脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物、例えば、エチレングリコール、グリセロール、エリスリトール、アラビトール、マンニトール、ソルビトール、ソルビトールから誘導されたヘキシトール無水物、およびこれらのエステルのポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレン誘導体とのエステルまたは部分的エステルである。混合エステル、例えば、混合または自然のグリセリドを使用することができる。界面活性剤は組成物の０．１〜２０重量％、好ましくは０．２５〜５重量％を構成する。組成物の残部は通常噴射剤である。液化した噴射剤は典型的には周囲条件において気体であり、そして圧力下に凝縮される。

適当な液化した噴射剤の例は、５個まで炭素を含有する低級アルカン、例えば、ブタンおよびプロパン、好ましくはフッ化またはフッ化塩化されたアルカンである。上の混合物を、また、使用できる。

エアゾールを調製するとき、適当な弁を装備した容器に、微粉砕した化合物および界面活性剤を含有する、適当な噴射剤を充填する。

こうして成分は、弁の作用により解放されるまで、高圧下に維持される。

化合物を含有する組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与される。治療的応用において、組成物は、前述したように、病気に既に悩まされる患者に、病気およびその合併症の症状を治癒するか、あるいは少なくとも部分的に阻止するために十分な量で投与される。これを達成するために適切な量は「治療的有効投与量Ｊとして定義される。この使用のために有効な量は、病気のひどさおよび患者の体重および全体的状態に依存するが、一般に７０ｋｇの患者について約０．５ｍｇ〜約２．０００ｍｇのＳＬＸオリゴ糖または擬ＳＬＸ／日の範囲であり、約５ａ＋ｇ〜約２００＋ｎｇの化合物７日の投与量を普通に使用する。

予防の適用において、本発明の化合物を含有する組成物は特定の病気に感受性であるか、あるいはそうでなければその病気の危険がある患者に投与される。このような量は「予防的有効量」であると定義される。この使用において、正確な量は再び健康の患者の状態および体重に依存するが、一般に約０．５ｍｇ〜約１．０００ｍｇ／　７０ｋｇの患者、普通に約５ｍｇ〜約２００ｍｇ／　７０ｋｇの体重の範囲である。

組成物の単一または多数の投与を実施することができ、投与のレベルおよびパターンは処置の医者により選択される。いずれの場合においても、医薬配合物は患者を有効に処置するために十分な量のＳＬＸオリゴ糖または擬ＳＬＸを提供すべきである。

本発明の化合物はまた、診断試薬として使用することができる。

例えば、障識した化合物を使用して、炎症を育することが疑われる患者において炎症または腫瘍の転移の区域を捜し出すことができる。

この使用のために、化合物は１１１１．　＋４（またはトリチウムで潔識することができる。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明を限定しない。

ＬＥＣＩ　１．ＨＬ−６０，ＨＴ−２９、ある種の腺癌（とくに、ｃｏｌｏ２０５細胞）および多形核白血球（ＰＭＮ、好中球）は、非常に特異的なフコシルトランスフェラーゼＩを含有し、これはフコースをＧＤＰ−フコースからシアル化された基質ＮｅｕＡｃα２゜３Ｇａｌβｌ、４ＧＩｃＮＡｃまたはＮｅｕＧｃａ２，３Ｇａｌβ１．４Ｇ］ｃＮＡｃに転移させることができる。

この分野においてよく知られているように、フコースはゴルジ装置の内腔の中のオリゴ糖鎖に特異的フコシルトランスフェラーゼを経て転移され、これは５ｃｈａｃｔｅｒおよびＲｏｓｅｍａｎ、　ｒＴｈｅ　ＢｉＯＣｈｅｍｉＳｔｒ’１０ｆ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ」　、Ｗ、Ｌｅｎｎａｒｚｌ！、　ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ、ニューヨーク、ｐｐ、　８５−１６０（１９８０）（これをここに引用によって加える）に総説されている。フコシルトランスフェラーゼの細胞下の局在位置はゴルジ装置の中であるので、これらの酵素を分離する最初の工程はこの新規なかつ特異的α１．　３−フコシルトランスフェラーゼを発現するゴルジ装置の分画を分離することである。

ゴルジ装置由来の小胞分画を、Ｂａ１ｃｈら、Ｃｅ１ｌ　３９　：　４０５　（＋９８４）（これをここに引用によって加える）に記載されている手順の変法により調製する。ＬＥＣ１１，ＨＬ−６０，ＨＴ−２９，ＰＭＮ。

ｃｏ１ｏ２０５またはα１，３−フコシルトランスフェラーゼＩを含有する他の細胞系を、はぼ５ＸＩＯ’細胞／の１の密度に懸濁液中で増殖させる。細胞を懸濁培養物から２．ＯＯＯｘｇにおける遠心により収得する。１２リツトルの懸濁液（６Ｘ１０”）から生ずる沈澱物を、トリス−ＣＩ（ＩＯミリモル）　、　ｐＨ７，０、加熱不活性化した胎児仔ウシ血清（７％）およびアプロチニン（１００μｇ／ａ＋ｌ、　Ｓｉｇａ＋ａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、、ミゾリー州セントルイス）を含有する３体積（包装した細胞体積）の氷冷した０、　２５Ｍスクロース（Ｗ／Ｖ）の中に再懸濁させる。

細胞を緊密に適合するウニトン（Ｗｈｅａｔｏｎ）ガラスのダウンス（ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザーでＡ乳鉢を使用して破砕する（はぼ６０ストローク）。ホモジネートを机上臨床用遠心機でｓｏｏ　ｘｇにおいて５分間遠心する。遠心機の中の溶液の上部に残留する脂質および不溶性物質を廃棄する。くもった上澄み液をきれいな管に移し、次いで上澄み液のスクロース濃度をトリス−ＣＩ　（２０ｍＭ）、ｐｉ（７，０の中の４０％（Ｗ／Ｖ）のスクロースに反射計の助けにより調節する。この懸濁液の５ｍｌを超遠心管に移し、そして順次に２．５ｍｌのトリス−ＣＩ　（１０［１１Ｍ、　ｐＨ７，０）の中の３５％（ｗ／ｖ）のスクロースおよび２．０ｍｌの１０ｄのトリス−ＣＩ緩衝液の中の３９％（ｗ／ｖ）のスクロースで層状にする。この勾配を５Ｗ−４１０−ター（Ｂｅｃｋｍａｎ）中で５℃において１１０．０００Ｘｇで１時間遠心する。ゴルジ装置に富んだ小胞は２９％から３５％のスクロースの内部相から集められる。他の細胞下の分画は勾配の中の他の内部相において見いだされる；例えば、小胞はゴルジ誘導小胞などの下の粗いおよび滑らかな内質の小網のバンドから誘導される。２９％〜３５％の内相から除去されたバンドは、シアリルトランスフェラーゼ活性の存在および量について分析する。

酵素シアリルトランスフェラーゼはゴルジ間開誘導小胞内に見いだされることのみが知られており、そして当業者により２９〜３５％の内相から集められた結合の真実性を評価するためにマーカーとして使用されている。シアリルトランスフェラーゼのアッセイは、Ｂｒ１ｌｅｓら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｌｌｌ、　２５２　＋　１１０７　（１９７７）に記載されているように、アクセプターとしてアシアロフェツインを使用して実施する。ＬＥＣ細胞からのすぐれたゴルジ装置誘導小胞の調製物は、３．０ナノモル／ｍｇタンパク質／時間の比活性を育する。

次いで、生ずるゴルジ装置の調製物を、前述の酵素の合成において使用するα１．３−フコシルトランスフェラーゼＩ源として使用する。

ＥＬＡＭ−１を発現する活性化された内皮細胞に結合するＬＥＣ１１細胞（ＳＬＸを発現する）の能力を、構造Ｌｅ！すなわちＳＬＸの非シアル化形態を発現する、ＣＨＯ細胞および他のグリコジル化変異体ＬＥＣ１２の能力と比較した。

材料ゼラチンコーティングした４８ウエルのアッセイプレート上で増殖させた継代培養５のヒト談静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣＸＣｌ　ｏｎｅｔｉｃｓ）を、内皮細胞源として使用した。細胞をＴＬ−Ｉβ（Ｇｅｎｚｙｍｅ）で３０μｇ／ｍｌにおいて刺激した。細胞は正確に４時間刺激した。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣＮｏ、　ＣＣＬ２４０）を、対照のリガンドを有する細胞の源として使用した。これらは、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）／ストレプトマイシン（１００μｇ　／＋ｎ１ＸＩｒｖｉｎＳｃｉｅｎｔｉｆｃ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）（Ｉｒｖｉｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｃ）および１０％の胎児ウシ血Ｎ（Ｈａｚｌｅｔｏｎ）を含有するＲＰＭＩＩ６４０（以後ＣＲＰＭＴと呼ぶ）の中の塊状培養から収穫した。ＬＥＣ１１、ＬＥＣＩ２およびＣＨＯ−に１は、Ｐ、５ｔａｎｌｅｙ博士により提供された。それらは、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチド（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）／ストレプトマイシン（１００単位／ｍ１）（［ｒｖｉｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｃ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）（Ｉｒｖｉｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｃ）１０％の胎児ウシ血清（ＨａＺｌｅｔｏｎ）を含有するアルファＭＥＭの中の懸濁培養において増殖させた。

手順１、、ＬＥＣＩ　１．ＬＥＣＩ２およびＣＨＯ−に１を収得し、そしてＣＲＰＭＩ中で洗浄した。生存細胞の計数をトリバンブルーを使用して行った。各型の３ ×ｌＯ・細胞を１０ｍ１の試験管内で沈澱させ、そして３００μｍの”　Ｃｒ　（４５０μＣｉ）（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）を各沈澱物に添加した。試験管をおだやかに撹拌しなから３７°Ｃにおいて１時間インキュベーションした。

２、標識した細胞を培地中で３×洗浄し、そして２　Ｘ　１０’　／４００μｍ（６ｍｌ）に再懸濁させた。次いで、試験管を４°Ｃの水浴の中に入れた。

３、ＩＬ−１βと４時間インキュベーションした後、活性化されたＨＵＶＥＣを含有するアッセイプレートをインキュベーターから取り出し、そしてこのプレートを４℃の水浴の中に入れることによって１５分間冷却した。

４、両者の試料の中の温度が平衡になったとき、培地を測定ウェルからパスツールピペットで１度に数ウェルで取り出した。

５、標識した細胞をウェルに２Ｘ１０’細胞／ウエルに等しい４００μｌの体積で添加した。各細胞懸濁液の３つの４００μｍのアリコートをガラス管の中にインプットＣＰＭの決定のために入れた。

６、プレートを氷水浴の中で３０分面インキユベーシゴンした。

７、結合しない細胞をアッセイブレートのウェルから、パスツールピペットを使用する系統的再懸濁および引き続（０，７ｍｌの培地の添加および除去により除去した。

８、培地のすべてをウェルから除去し、そして０．１２５モルのトリス、２％のＳＤＳおよび１０％のグリセリンの溶液を添加した（０．３ｍ１）。

プレートを３０分間放置し、次いで０．５ｍｌのｄＨ２０を各ウェルに添加した。

９、各ウェルにおける流体をＰ１００Ｏピペットで再懸濁させ、そしてガラス試験管に移した。ＰｌｏｏＯの先端を試験管の中に入れた。

ＩＯ１入力ＣＰＭ試料を含有するものを包含する試験管をガンマカウンターでカウントした。

１１、各ウェルにおいて結合したＣＰＭを各試料についての入力ＣＰＭて割って、結合した％を決定した。３回の反復アッセイの点の平均および標準偏差をプロットした。

この実験において得られた結果を表１に示し、これが示すように、ＳＬＸを発現する細胞はＥＬＡＭ−１を発現する活性化された脈管内皮細胞に有効に結合する能力を育する。これらのデータが示すように、高いレベルの独特な炭水化物のＳＬＸを発現するＬＥＣＩＩ細胞は例外的によ＜ＩＬ−１β活性化ＨＵＶＥＣに結合するか、育意の量のこの炭水化物を欠如するＬＥＣ１２およびＣＨＯ−Ｋｌは活性化されたＨＵＶＥＣの劣った結合因子である。この結論は、さらに、この結合が、４℃において起こるという、ＥＬＡＭ−１仲介結合の特徴を示す観察により支持される。

実施例■ ＳＬＸに対して特異的なモノクローナル抗体による細胞間の付着の阻害ＥＬＡＭ−１についての好中球上のリガンドが、末端の糖がＮｅｕＡ、ｃα２，３Ｇａｌβ１．４　（α１．．３Ｆｕｃ）ＧｌｃＮＡｃ（ＳＬＸ）である、オリゴ糖を含有することを証明する、２組の実験を記載する。

これらの実験は、ＩＬ−１β刺激されたＨＵＶＥＣへのＨＬ−６０細胞のＥＬＡＭ−１仲介付着をブロックする、シアル化Ｌｅ”および非シアル化形態Ｌｅにに対して特異的なモノクローナル抗体の能力をアッセイすることによって実施する。

本発明の実験のために開始した培養物からの継代培養３のＨＵＶＥＣを前述したように使用した。２組の３回反復試験のウェルを対照として放置した。４つの３回反復試験物をＴＬ−１β（Ｇｅｎｚｙｍｅ）で１０μｇ／ｍｌにおいておよび２０μｇ／ｍｌにおいて４回刺激した。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手したＨＬ−６０細胞をリガンドを有する細胞源として使用した。これらは、ペニシリン（１００単位／１ｌｌ）、ストレプトマイシン（１００ μｇ／ｍ１）（ｉｒｖｉｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｃ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）（Ｉｒｖｉｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｃ）および１０％の胎児ウシ血清（Ｈａｚｌｅｔｏｎ）を含有するＲＰＭ１１６４０　（以後ｃＲＰＭＩと呼ぶ）の中の塊状培養から収得した。

モノクローナル抗体の調製物は５ＮＨ３（ＩｇＭ）を約２０μｇ／ｍｌておよびＳＨＩ　（１ｇＧ３）を約１０μｇ／ｍｌで含んでいた。５ＮＨ３はＳＬＸに対して特異的であるが、ＳＨＩは非シアル化構造を認識する。

手順１、ＨＬ−６０を収得し、そしてＣＲＰＭＩ中で洗浄した。生存細胞の計数をトリバンブルーを使用して行った。３ＸＩＯ’個の細胞を２×ｌＯｍｌの試験管内に入れ、そして３００μｍの”Ｃｒ　（４５０μＣｉ）（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌ、ｅａｒ）を各試験管に添加した。試験管をおだやかに撹拌しなから３７°Ｃにおいて１時間インキュベーションした。

２、抗体はハイブリドーマの培養上澄み液として供給し、そして０．０１％のＮａＮｚおよび０．０５％のチメロサルを含有した。これらの保存剤を除去するために、５１１１の各抗体を３　Ｘ　５００ｍ１の旧式の組織培養培地の各々に対して７２時間かけて透析した。

３、抗体を透析から集め、そして３．５ｍｌの各々をｌ０ｍ１の試験管に入れた。残部をＨＬ−６０の結合についてのＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用するために保持した。７ｍｌのＲＰＭＩ１６．５％のＦｅ２を第４の試験管に対照として使用するために入れた。

４、標識したＨＬ−６０をＣＲＰＭＩの中で３回洗浄し、そして１本の管の中にプールした。次いで、それらを遠心し、そして培地の中で１ｍｌに再懸濁させた。

５．　２００μｍの細胞懸濁液を抗体を含有する試験管の各々に添加し、そして４００μｍを対照の管に添加した。管をおだやかに撹拌しなから３７°Ｃにおいて２０分間インキュベーションした。

６、刺激したＨＵＶＥＣのアッーセイプレートをインキュベーターから取り出し、そして培地をウェルからパスツールピペットで、１度に数ウェルで、取り出した。

７、　０．５ｍｌの細胞懸濁液を３回反復試験のウェルの各々に添加した。対照の細胞を刺激しないおよび刺激したＨＵＶＥＣ上で両者のＩＬ−１β濃度においてプレートした。試験細胞を刺激したウェルにのみ添加した。

８、各細胞の０．５ｍｌの了りコートをガラス管に添加して、インプットＣＰＭを決定するために使用した。

９、アッセイのプレートをインキュベーター（５％のＣＯ２，３７”Ｃ）へ３０分間戻した。

１０、各細胞懸濁液の了りコートを等しい体積のトリパンブルーと混合し、そして細胞を顕微鏡で生存について検査した。

結果は次の通りであった：対照＝９８％、５ＨＩ＝９２％、および５ＮＨ３＝９９％。

１１、結合しない細胞をアッセイプレートのウェルからパスツールピペットを使用する系統的再懸濁および引き続＜　０．７ｍｌの培地の添加および除去により除去した。

１２、培地のすべてをウェルから除去し、そして０．１２５Ｍ　ｌ−リス、２％のＳＤＳ　（Ｂ　ｉ　ｏ−Ｒａ　ｄ）および１０％のグリセリン（Ｆ　ｉ　５ｈｅｒ）の溶液を添加した（０．３ｍ１）。プレートを３０分間放置し、次いで０１６ｍ１のｄＨ２０を各ウェルに添加した。

１３、各ウェルにおける流体をＰ１００Ｏピペットで再懸濁させ、そしてガラス試験管に移した。ＰｌｏｏＯの先端を試験管の中に入れた。

１４、入力カウント７分（ＣＰＭ）試料を含有するものを包含する試験管をガンマカウンターでカウントした。

１５、各ウェルにおいて結合したＣＰＭを各試料についてのインプットＣＰＭて割って、結合した％を決定した。３回の反復アッセイの点の平均および標準偏差をプロットした。

反復実験は、高ＩＬ−１βを使用して内皮細胞を誘発した実験において最良であると判定された。

結果は、モノクローナル抗体５ＮＨ３がＥＬＡＭ−ルセブターを介してのＩＬ− １β刺激ＨＵＶＥＣへのＨＬ−６０細胞の結合をブロックすることを示した。ＳＬＸ決定基と結合しない対照の抗体ＳＨＩは、ＥＬＡＭ−１へのＨＬ−６０細胞の結合をブロックしなかった。これが示唆するように、リガンドの中の末端のシアル酸はＥＬＡＭ−１への結合に必要である。

Ｂ、モノクローナル抗体のパネル２セラチンでコーティングした４８ウェルのアッセイブレート（Ｃ。

５ｔａｒ）上で増殖させた継代培養３のＨＵＶＥＣを内皮細胞源として使用した。プレートを前述したように調製した。２ｆｆｌの３回反復試験のウェルを対照として刺激しないで放置した。各プレート上の７つの３回反復試験物を０．５［０１７７）　Ｅ　Ｇ　Ｍ　−ＭＶ中のＩＬ−１βて３０μｇ／ｍｌにおいて刺激した。細胞は正確に４時間刺激した。ＨＬ−６０，Ｉｆｆ胞（ＡＴＣＣ）をリガンドを有する細胞源として使用した。

これらをＣＲＰＭＩ中中の塊状培養から収得した。モノクローナル抗体を含有する新鮮なハイブリドーマの上澄み液は次のものを含んでいた：ＦＨ６（ＩｇＭ）より低い親和性のｍＡｂ；５ＮＨ−３（Ｉ　ｇＭＸ２０Ｊｉｇ／ｎ＋１）　：　ＳＨ−１（Ｉ　ｇＧｓ　）（１０μｇ／ｍｌ）　；ＦＨ−２（ＪｇＭ）、Ｌｅ” 反応性ｍＡｂ　：５ＮＨ−４（Ｉ　ｇＧ３）高い親和性の抗体：およびＣ３ＬＥＸ−１（ＩｇＭＸＰ、Ｔｅｒａｓａｋｉ博士により提供された、ＵＣＬＡ、精製された免疫グロブリンとして、２．８ｍｇ／ｍｌ　このアッセイにおいて使用するために５％のＦｅ２を含有するダルベツコ変更イーグル培地（ＤＭＥＭ）の中で９μｇ／ｍｌに希釈した）。抗体の比活性は次の通りであった。

ＦＨ６，５ＮＨ−４，５ＮＨ３およびＣ３ＬＥＸ−１はＳＬＸに対して特異的であった：ＦＨ２およびＳＨＩは非シアル化Ｌｅ”に対して特異的であった。

手順１．８Ｌ−６０を収得し、そしてＣＲＰＭＩ中で洗浄した。生存細胞の計数をトリバンブルーを使用して行った。３Ｘ１０＠細胞を２ＸＩＯｍｌの試験管内に入れ、そして３００μｍの”　Ｃｒ　（４５０μＣｉ）　（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）を各試験管に添加した。試験管をおだやかに撹拌しなから３７°Ｃにおいて１時間インキュベーションした。

２、［識しｔ、−ＨＬ−６０を５９６（ＤＦＣ３’ｃ含有するＤＭＥＭ（以後ｃＤＭＥＭと呼ぶ）の中で３回洗浄し、そして１本の管の中にプールした。次いで、それらを遠心し４そして同一培地の中で４Ｘ１０’細胞／１ｍｌに再懸濁させた。

３、　３．２ｍｌの各モノクローナル抗体の培養上澄み液、および３．２ｍｌのｆｆｊｌｌしたＣ５ＬＥＸ−１（２９μｇ）を別々の試験管に添加した；対照の試験管には６．４ｍｌの培地を添加した。

４、　２００μｍの細胞懸濁液（約８Ｘ１０’ＪＩ胞に等しい）をモノクローナル抗体を含有する試験管に添加し、そして４００μｍを対照の管に添加した。管をおだやかに撹拌しなから３７°Ｃにおいて２０分間インキュベーションした。

５、刺激したＨＵＶＥＣのアッセイブレートをインキュベーターから取り出し、そしてウェルをｃＤＭＥＭで１回洗浄し、そして培地をウェルからパスツールピペットで、１度に数ウェルで、取り出した。

６、　０．４ｍｌの細胞懸濁液を２つのプレートの１つの各ウェルに添加した。

対照の細胞を刺激しないおよび刺激したＨＵＶＥＣ上で両者のＩＬ−１β濃度においてプレートした。抗体処理した細胞を刺激したウェルにのみ添加した。

７、各細胞懸濁液の０．４ｍｌのアリコートをガラス管に添加して、入力ＣＰＭを決定するために使用した。

８、アッセイブレートを３７℃において３０分間インキュベーションした。

９、各細胞懸濁液の残部およびアッセイブレートを水浴の中にいれて２０分間冷却した。

１０、細胞懸濁液を上の３７℃のプレートについてのように冷却したプレート上でプレートした。このプレートを４０℃において３０分間インキュベーションした。

このアッセイの残りの工程は上の節Ａの工程１１〜１５に記載するように実施したが、ただし工程１２において、プレートを３０分でなく１５分間放置した。

第２Ａ図に示す結果が示すように、すべてＳＬＸに対して特異的であるモノクローナル抗体５ＮＨ−３，ＰＨ６，５ＮＨ−４およびＣ３ＬＥＸ−１は、３７°Ｃにおいてインキュベーションしたとき、ＥＬＡＭ−ルセブターを介してのＩＬ− １β刺激したＨＵＶＥＣへのＨＬ−６０細胞の結合を有意にブロックした。Ｌｅ ”に対して特異的であるモノクローナル抗体（ＰＨ２および５ＨＩ）は有効な阻害因子ではない。こうして、ＥＬＡＭ−１のためのリガンドは細胞表面の糖タンパク質またはグリコリピドにおいて見いだされるシアル化Ｌｅ”抗原または同様な構造体を含有する。

４°Ｃにおいてインキュベージタンするとき（第２Ｂ図）、抗体ＦＨ６および５ＮＨ−３（両者はＩｇＭ）は結合を増強した。これらの試験において、ウェルの中のＨＬ−６（１１胞の有意の凝集が存在するように思われ、これはこの観察を説明することができる。

この組の実験において、ＴＬ−１β刺激ＨＵＶＥＣへのＬＥＣ１１細胞（これはＳＬＸを発現する）およびＬＥＣ１２細胞（これはＬｅ”を発現する）のＥＬＡＭ−１仲介付着をブロックする、ＳＬＸおよびシアル化されてない形態Ｌｅ”に対して特異的なモノクローナル抗体の能力。

述したように調製した。２組の３回反復試験物ウェルを対照として放置した。各プレート上の７つの３回反復試験物を０．５ｍｌの体積のＥＧＭ−ＭＶの中でＩＬ−１βで３０ｕｇ／ｍｌにて刺激した。細胞を正確に４時間刺激した。一般に５ｔａｎｌｅｙら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６３　：１１３７４　（１９８８）に記載されている、ＬＥＣＩＩおよびＬＥＣ１２細胞はＰ、５ｔａｎｌｅｙ博士により提供された。それらは、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチド（Ｇｂｃｏ）、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）／ストレプトマイシン（１００単位／ｍ１）（ｌｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）　、Ｌ−グルタミン（２ｍＭＸｆｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１０％のＦＢＳ　（Ｈａｚｅ　１　ｔｏｎ）を含有する完全アル７ｙ　Ｍ　Ｅ　Ｍの中て懸濁培養で増殖させた。これらの実験において使用したモノクローナル抗体は、上の節已に記載されている。それらは次のものを包含する：ＦＨ［３，５ＮＨ−３，５Ｈ− １，ＰＨ−２，３ＮＨ−４およびＣ５ＬＥＸ−１゜手順１、ＬＥＣｌｌおよびＬＥＣ１２細胞を収得し、モしてＣＲＰＭ■の中で洗浄した。生存細胞の計数をトリバンブルーを使用して行った。３Ｘ１０’！胞を２ＸＩＯｍｌの試験管内に入れ、そして３００μＩの”　Ｃｒ　Ｃ４５０ｕ　Ｃｉ）（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）を各試験管に添加した。

試験管をおだやかに撹拌しなから３７°Ｃにおいて１時間インキュベーションした。

２、放射線標識した細胞をｃＤＭＥＭＯ中で３回洗浄し、そして１本の管の中にプールした。次いで、それらを遠心し、そして同一培地の中で４Ｘ１０’！胞／１ｍｌに再懸濁させた。

３、　１．６ｍＩの各モノクローナル抗体の培養上澄み液、および１．６［１１１の精製したＣ３ＬＥＸ−１（１５ｕｇ）を別々の試験管に添加した。

対照の試験管には３．２ｍｌの培地を添加した。

４、　４　ＸＩＯ’　ＬＥＣ１１マタハＬＥＣ１２細胞に等しイ２００μｍの細胞懸濁液をモノクローナル抗体を含有する試験管に添加し、そして４００μｍを対照の管に添加した。管をおだやかに撹拌しなから３７℃において２０分間インキュベーションした。

５、刺激したＨＵＶＥＣのアッセイプレートをインキュベーターから取り出し、そしてウェルをｃＤＭＥＭで１回洗浄し、そして培地をウェルからパスツールピペットで、１度に数ウェルて、取り出した。

６、細胞懸濁液およびアッセイのプレートを水浴の中に入れて２０分間冷却した。

７、　０．４ｍｌの細胞懸濁液を前述のアッセイのプレートの各ウェルに添加した。対照の細胞を刺激しないＨＵＶＥＣおよび刺激したＨＵＶＥＣ上でプレートした。抗体処理した細胞を刺激したウェルのみに添加した。

８、各細胞懸濁液の０．４ｍｌのアリコートをガラス管に添加して、入力ＣＰＭを決定するために使用した。

９、アッセイのプレートを３７°Ｃにおいて３０分間インキュベーションした。

このアッセイの残りの工程は上の節Ａの工程１１〜１５に記載するように実施したが、ただし工程１２において、プレートを１５分間放置した。

第３Ａ［ｇおよび第３Ｂ図に示す結果が示すように、モノクローナル抗体５ＮＨ −３，ＰＨ６，５ＮＨ−４およびＣ５ＬＥＸ−１（すべてはＳＬＸに対して特異的である）は、ＥＬＡＭ−ルセプターを介してのＩＬ−１β刺激ＨＵＶＥＣへのＬＥＣＩＩ細胞の結合を有意にブロックした。ＳＬＸエピトープを発現しないＬＥＣｌ　２細胞は活性化された内皮に結合しなかった。Ｌｅ’　（ＰＨ２および５ＨＩ）に対して特異的なモノクローナル抗体は、ＬＥＣＩＩの結合の小さい阻害を引き起こした。

ＳＬＸはＥＬＡＭ−ルセブターの主要なリガンドであるというさらなる証明は、ＬＥＣｌ　１およびＨＬ−６０細胞からシアル酸を除去することによって提供された。これらの実験において、付着アッセイの前にＬＥＣ１１および１１２細胞をクロストリジウム・ぺにおいて５ＩＣｒ標識っけの間に処理した。第４図に示す結果は、シアリダーゼは活性化された内皮細胞へのＬＥＣＩＩおよびＨＬ−６０細胞の付着を７０〜８５％だけ減少することを証明している。

この実施例は、ＳＬＸ、Ｌｅ”または同様であるが、同一ではない化合物である末端の炭水化物単位をもつ、種々の生合成的に産生されたグリコスフィンゴリピドを含有するリポソームの調製を記載する。ＩＬ−１βで処理することによってＥＬＡＭ−１を発現するように刺激された内皮細胞への、ＳＬＸを発現するＨＬ −６０℃胞およびＬＥＣＩＩ細胞の結合をブロックするＳＬＸまたは擬ＳＬＸを含有するリポソームの能力を示す。

材料この実験において使用したグリコスフィンゴリピドを表１に示す。

それらはＢｉｏｍｅｎｂｒａｎｅ　！ｎ５ｔｉｔｕｔｅ　、ワシントン州シアトルから入手し、そして精製するか、あるいは生合成的に産生され、そしてＮＭＲおよび質量スペクトルにより、Ｈａｋｏｍｏｒｉ、　Ｓ、１．ら、Ｊ、　Ｂｉａｌ、　Ｃｈｅｆｆｉ。

２５９　：　４６７２　（１９８４）　、およびＦｕｋｕｓｈｊ　Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２５９　：　１０５１１　（１９８４）　（これらをここに引用によって加える）に一般に記載されているように、特性決定した。３−ｄｉＬｅ’″　（ＳＬＸ）は、酵素源としてｃｏｉｏ２０５ｍ胞系および基質としてＳＨを使用してフコシル残基を付加することによって酵素的に合成した。フコシル化しないｄｉＬｅ ”は基質としてｎＬｃ６および細胞系ＮＣＩ　Ｈ−６９を使用して同様に合成した。参照、Ｈｏｌｍｅｓ　ｅｔ　ａｌ、。

ＳＨから末端のシアロシル残基を化学的に除去することによって産生された。

グリコスフィンゴリピドを含存するリポソームを次のようにして調製した・　１００μｇのグリコリピドをクロロホルム−メタノール（２：１）中の３００μｇのホスファチジルコリン（Ｓｉｇｍａ、卵黄）および５００μｇのコレステロール（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）に添加し、そして全体の溶液をＮ２により１５ｍ１のねじ付きふたをもつ管の中で蒸発乾固した。

セラチ〉をコーティングした４８ウエルのアッセイプレート（Ｃ。

５ｔａｒ）上の全面成長に成長させた、継代培養３のＨＵＶＥＣを内皮佃胞源として使用した。プレートを前述したように調製した。

２組の３回反復試験のウェルを刺激しないで放置した。１４の３回反復試験物を０．５ｍｌの体積のＥＧＭ−ＭＶの中でＩＬ−１βで３０℃ｇ／ｍｌにおいて刺激した。細胞を正確に４時間刺激した。ＨＬ−６０細胞およびＬＥＣＩ＋細胞を前述したように培養した。

手順１、セラチン上でコンフルエントに増殖したＨＵＶＥＣを含有する１枚の４８ウエルのＣｏ５ｔａｒのクラスター皿をインキュベーターから取り出し、そして各ウェル中の媒体をパスツールピペットで除去し、そして０．５ｍｌの新鮮なＥＧＭ−ＭＶまたは３０℃ｇ／ｍｌのＩＬ−１βを含有する同一培地で置換し、次いてプレートをインキュベーターに４時間戻した。

２、ＨＬ−６０およびＬＥＣＩＩ細胞を収得し、モしてＣＲＰ　ｔＬ＝ｆＩＯ中で洗浄した。生存細胞の計数をトリパンブルーを使用して行った。各細胞型の６ＸＩＯ”細胞を次のようにして放射線標識した。

各型の３×１０１細胞を２ＸＩＯｍｌの試験管の中に入れ、そして３００μｍの ”　Ｃｒ　（４５０μＣｉＸＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）を各試験管に添加した。試験管をおだやかに撹拌しながら３７℃において１時間インキュベーションした。

３　放射線標識したＨＬ−６０およびＬＥＣｌ　１細胞をＣＲＰＭＩの中で３回洗浄し、そして１本の試験管の中にプールした。次いで、それらを遠心し、そして同一培地の中に２ＸＩＯ’細胞／ｍｌに再懸濁させた。

４、Ｎ激したＨＵＶＥＣアッセイブレートをインキュベーターから取り出し、そしてウェルを５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＲＰＭ１１６４０で２回洗浄した。

５、リポソームは次のようにして調製した：蒸発させた沈澱物を１００ｍ１の無水エタノール中に溶解し、そして２分間超音波処理した。

超音波処理しながら２ｍｌのＰＢＳを試験管に２分かけてゆっくり添加した。このストックを使用直前にＲＰＭ１１６４０の中でｌ：１０に希釈し、そして５０ μｍのＢＳＡの原溶液を１００ｍｇ／ｍ！において各１ｍｌの希釈したリポソームに５ｍｇ／ｌｌ１ｌのＢＳＡの最終濃度に添加した。

６、培地を”アッセイブレートのウェルからパスツールピペットで、１度に数ウェルで除去し、そして０．３ｍｌのリポソーム懸濁液を６のＩＬ−１β刺激したアッセイのウェルの各々に添加した。対照ウェルに、リポソームを含有するウェルにおけるのと同一濃度でエタノール、ＲＰＭＩＩ６４０およびＢＳＡを含有するリポソーム緩衝液を入れた。対照緩衝液は刺激しないＨＵＶＥＣおよび刺激したＨＵＶＥＣ上でプレイティングした。リポソームを含存する試料を刺激したウェルにのみ添加した。

７、プレートを３７℃にて４０分間インキュベーションし、次いで５０ＩＩｌｌのＨ（：ｒ標識したＨＬ−６０またはＬＥＣ１１細胞をアッセイのウェルに添加した。各細胞系を各リポソーム調製物について３回反復試験物でアッセイした。

各細胞！！！濁液の５０工１の３つのアリコートを入力ＣＰＭの決定に使用するガラス管に添加し、そしてアッセイプレートを３７°Ｃにおいて３０分間インキュベーションした。

８．結合しない細胞はアッセイプレートのウェルから、系統的再懸濁によりパスツールピペットを使用して、次いで０．７ｍｌの培地の添加および除去により除去した。すべての培地をウェルから除去し、そして０．１２５Ｍ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ、２％のＳＤＳおよび１０％のグリセリンを添加した（０．３ｍ１）。プレートを１５分間放置し、次いで０．５ｍｌのｄＨ，Ｏを各ウェルに添加した。

９、各ウェルの中の流体を再懸濁させ、そしてガラスの試験管に移した。ピペットの先端を管の中に入れた。インプットＣＰＭ試料を含有するものを包含する管をガンマカウンターでカウントした。

各ウェルにおいて結合したＣＰＭを各試料について入力ＣＰＭで割って、結合した％を決定した。３回反復試験のアッセイの点の平均および標準偏差をプロットした。

第５図に示すように、ＳＬＸ　（Ｓ−ｄ　ｉＬｅ”　、表１）を含有する末端配列を有する選択したグリコリピドを含有するリポソームは、４°Ｃにおいて活性化された内皮細胞へのＨＬ−６０細胞の付着を劇的に阻害した。Ｌｅ’　（ｄｉ −Ｌｅ’）または他の関係する構造（表１）をもつグリコリピドを含有するリポソームは、炭水化物基の構造に依存しない最小の阻害を示した。同様な結果はＬＥＣＩＩ細胞の付着で得られた。実験を３７°Ｃにおいて実施したとき、ＨＬ− ６０細胞の付着はＳＬＸ構造（Ｓ−ｄ　ｉＬｅ”　、７０％）をもつグリコリピドを含有するリポソームにより減少し、そしてまた、より少ない程度にＬｅ”　（ｄｉ−Ｌｅ”、４０％）を含有するリポソームにより減少し、Ｌｅ”はまた、ＥＬＡＭ−１と、より低い親和性で、相互作用することができることが示唆される。これらの実験が示すように、生合成的に産生されたＳＬＸまたは同様な擬ＳＬＸ化合物は、リポソーム組成物に配合するとき、例えば、炎症部位の中への白血球の浸潤の減少のための療法的化合物として働くことができる。

ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞は、ＥＬＡＭ−ルセブターを介しての活性化された内皮細胞へのＨＬ−６０およびＬＥＣｚの付着と対照的に、主としてＶ− ＣＡＭ　（内皮細胞）−ＶＬＡ−４（Ｊｕｒｋａｔ細胞）付着対を通してＩＬ− １活性化された内皮細胞に結合する。Ｊｕｒｋａｔ細胞の付着はＳＬＸを含有するリポソームにより阻害されず、インテグリン分子ＶＬＡ−４のαサブユニットに対するモノクローナル抗体により完全に阻害された。この結果が証明するように、ＨＬ−６０およびＬＥＣＩＩ細胞のＳＬＸリポソームの阻害は内皮細胞へのリポソームの結合に帰属される立体的作用でなく、ＳＬＸリポソームはＥＬＡＭ −１のリガンドの結合部位と直接競争することによって付着を阻害するという結論が支持ＳＬＸに対する抗体は活性化されたヒトプレートへのＧＭＰ−１４０仲介績合を阻害するこの実施例において、活性化されたヒト血小板へのＨＬ−６０細胞のＧＭＰ−１４０仲介付着をブロックする、ＳＬＸおよびシアル化されないＬｅ”に対して特異的なモノクローナル抗体の能力を決ＨＬ−６０細胞は前述し、そしてリガンドを有する細胞源として使用した。Ｊｕｒｋａｔ細胞をリガンドをもたない対照として使用した。モノクローナル抗体５Ｈ−１，ＦＨ−２，５ＮＨ−４およびＣ３ＬＥＸ−１は、また、前述した。

２．０．ｇ；クエン酸ナトリウム２．４９ｇ；およびクエン酸１．２５ｇ　；　ｄ　８２０で１００＋ｎｌとする）を含有する注射器に６部の血液／１部の抗凝固剤の比で抜き出した。

血小板は分別遠心分離により次のようにして分離した：血液を８００ｒｐｍ（はぼ９０ｘｇ）で室温において】５分間遠心した。上澄み液を集め、そして１２０Ｏｒｐｍ（はぼ４ｏｏｘｇ）で６分間遠心した。上澄み液を取り出し、そして２００Ｏｒｐｍ（１２００Ｘ　ｇ　）で１０分間遠心した。血小板のボタンをタイロード−ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ６，５（Ｎａ　Ｃ１８，Ｏｇ　：に、　Ｃ１，０，２ｇ　；　Ｎ　ａ　Ｈｚ　ＰＯ２・Ｈ２００，０５７ｇ　；　Ｍｇ　Ｃ１２・６　Ｈ２００，１８４ｇ　；　Ｎａ　ＨＣＯｓ　Ｏ，ｊｇ　：デキトロース１．Ｏｇ：およびＨＥＰＥＳ　２．３８３ｇ　＋　Ｄ　Ｉ水で１リツトルとする、ＩＮ　ＮａＯＨでｐＨ６，５に調節する）で２回洗浄し、次いでＰＢＳ中で１回洗浄した。血小板をＰＢＳ中で１０’　／ｍｌの濃度に懸濁させた。

２、血小板を最後に再懸濁するほぼ２０分前に、４８ウエルのプレートを０．１％のゼラチンでコーティングし、そして３７℃において１５分間インキュベーションした。過剰のゼラチンを血小板の添加直前にピペットで除去した。血小板を０．２５単位のトロンビン／ｍｌ　（ＳｉｇｍａＴ−６７５９）の血小板懸濁液の添加により活性化した。血小板を室温において２０分間放置した。

３６結合し、活性化された血小板を調製するために、３００μｍの血小板懸濁液をゲルコーティングしたプレートの各ウェルに添加した。プレートを３７℃において１５分間インキュベーションし、次いで８００ｒｐｍ　（９０Ｘ　ｇ　）で２分間回転した。プレートをＰＢＳで３回洗浄することによって、結合しない血小板を除去した。

４、血小板は高度に反応性のＦｃレセプターを有するので、抗体ｍ＊物から凝集したＩｇＧの吸収を防止するために、血小板のＦｃレセプターを次のようにしてブロックした：ｆｆ１ＨシたマウスＩｇＧＷ６／３２　（Ｉ　ｇＧ２．）を２７ｍｇ／ｍｌにおいて６３℃に５分間加熱することによって凝集させた。３００ｍ１のＰＢＳ中の加熱した調製物を２０ｇｇ／ｍｌにおいて血小板コーティングしたプレートの各ウェルに添加した。プレートを３７°Ｃにおいて１５分間インキュベーションし、次いでＰＢＳで洗浄した。

５．８Ｌ−６０およびＪｕｒｋａｔ細胞を収得し、そしてＣＲＰＭｌの中で洗浄した。生存細胞のカウントをトリパンブルーを使用して行い、冬型の３Ｘ１０” 細胞を２Ｘ１０ｍｌの試験管の中に入れ、そして３００μｍのＳ１Ｃｒ　（４５０μＣｉ）（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）を各試験管に添加した。試験管をおだやかに撹拌しなから３７°Ｃにおいて１時間インキュベーションした。

６、放射線障識した細胞をＣＲＰＭＩの中で３回洗浄し、そして１本の試験管の中にプールした。次いで、それらを遠心し、そして同一培地の中に２×１０″細胞／ｍ細胞外懸濁させた。

７、　１．６ｍｌの各モノクローナル抗体の培養懸濁液、および１．６ｍｌの精製したＣ３ＬＥＸ−１（１５ｇｇ）を別々の試験管に添加した。

対照の試験管には１．６ｍｌの培地を添加した。

８、Ｊｕｒｋａｔｍ胞の懸濁液（４Ｘ　ｔｏ’細胞を含有する）の１００μｍの標識したＨＬ−６０を、モノクローナル抗体を含有する試験管の各々に添加した。それらを３７°Ｃにおいておだやかに撹拌しながら２０分間インキュベーションした。このインキュベーション期間後、０、３ｍｌの各細胞の懸濁液（７，５Ｘ　１０’細胞を含有する）を、結合した活性化された血小板を含有する前述のアッセイプレートの各ウェルに添加した。

９、アッセイプレートを９０％ｇで２分間遠心し、次いで室温において５分間インキュベージコンした。プレートを放射性廃棄物の容器の中に逆さにし、そしてプレートをタオル上にブロッティングすることによって、結合しない細胞をアッセイプレートの各ウェルから除去した。３００μｍのＰＢＳを各ウェルに注意して添加し、そしてプレートを逆さしかつブロッティングすることによって、ウェルを３回洗浄した。培地のすべてをウェルから除去し、そして０．１２５モルのトリス、２％のＳＤＳおよび１０％のグリセリンの０．３ｍｌの溶液を添加した。プレートを１５分間放置し、次いて０．６ｍｌのｄＨ２０を各ウェルに添加した。

１０、各ウェルの中の流体をピペットで再懸濁させ、そしてガラスの試験管に移した。先端を管の中に入れた。入力試料を含有するものを包含する試験管をガンマカウンターでカウントした。各ウェルにおいて結合したＣＰＭを各試料について入力ＣＰＭで割って、結合した％を決定した。入力ＣＰＭは工程８に記載する各細胞懸濁液の０．３ｍｌの了りコートをカウントすることによって決定した。

第６図に示す結果が示すように、ＳＬＸに対して特異的なモノクローナル抗体５ＮＨ−４およびＣ３ＬＥＸ−１は、活性化された血小板上のＧＭＰ−１４０へのＨＬ−６０細胞の結合をブロックした。

Ｌｅ”に対して特異的なモノクローナル抗体（ＦＨ２および５Ｈ−１もまた、この結合をブロックしたが、その程度は低かった。この実施例か示唆するように、ＳＬＸおよびＬｅ”の両者はＧＭＰ−１４０のためのリガンドであることができるが、ＳＬＸの構造はＬｅ”の構造よりＧＭＰ−１４０についてより高い親和性を有することがこの実施例は、トロンビンで処理することによってＧＭＰ−１４０を発現するように刺激された血小板への、ＳＬＸを発現するＦ（Ｌ−６０細胞およびＰＭＮの結合をブロックする、ＳＬＸまたは擬ＳＬＸを含有するリポソームの能力を証明する。このアッセイは、一般に、Ｌａｒｓｅｎら、Ｃｅ１ｌ　６３　：　４６７−４７４　（１９９０）　（これをここに引用によって加える）に記載されているプロトコールに従った。

材料グリコスフィンゴリピドは実施例■に記載されているようにして調製した。血小板は実施例■に記載されているように調製したが、ただしＦｃレセプターのブロッキングは実施しなかった。ＨＬ−６０細胞は前述したように調製した。

ＰＭＮはボランティアのドナーからヘパリン処理したバキュテイナー（ｖａｃｕｔａｆｎｅｒ）管の中に抜き出した全血５０ｍ１から調製し、前記管は倒立して血液を混合した。すべての工程は２２〜２４°Ｃにおいて実施した。各２５１１の血液を１５ｍ１のモノ−ポリ溶解培地（Ｍｏｎｏ−Ｐｏｌｙ　Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｆｌｏｗ−Ｌａｂｓ）の上に層状にした。管を８００× ｇて２５分間、次いで１３００Ｘ　ｇでさらに２５分間遠心した。ＰＭＮ層を除去し、そしてきれいな５０ｃｃの遠心管の中に入れた。２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（Ｇｔｂｃｏ）および０．２％のグルコース（Ｆｉｓｈｅｒ）を含有する３０ｍ１のバンクの均衡塩溶液（Ｇ　ｉ　ｂ　ｃ　ｏ）を容管に添加し、次いでこれらを１９００Ｘｇで３分間遠心した。ＰＭＮを同一緩衝液の中で１９００Ｘｇで３分間遠心することによって３回洗浄した。

ＰＭＮを血球計でカウントし、２　ｘｌＯ’　／ｍｌに再懸濁させ、そして使用するまで室温において保持した。

手順ｌ、２０μＩの活性化された血小板の調製物を２８本の１．５ｍｌのエッペンドルフ管（１４の二重反復実験の試料）の各の中に入れた。

２．２０μｍの希釈したリポソームを１Ｇａｇ＋　５μｇまたは２μｇで、あるいは２０μｌの対照緩衝液を各二重反復実験の適当な管に添加した。

３□血小板をリポソーム調製物と室温において２０分間インキュベーションした。

４、好中球またはＨＬ−６０細胞の各々を２　Ｘ　１０’細胞／ｍｌで１組のリポソーム処理した血小板に添加した。２０μＩの細胞懸濁液を容管に添加した。

５、管を混合し、そして室温において２０分間放置した。次いでそれらを血球計に適用し、そして細胞に陽性（付着した血小板２個以上、／セル）または陰性（付着した血小板２個未満／セル）とスコアを付けた。

第７図に示すように、ＳＬＸを含有する末端の配列を有する選択されたグリコリピド（Ｓ−ｄｉＬＥ”、表１）を含有するリポソームは、活性化された血小板へのＨＬ−６０細胞の付着を劇的に阻害した。Ｌｅ”　（ｄ　１−Ｌｅ”　）または他の関係する炭水化物の構造をもつグリコリピド（表１）は、炭水化物基の構造に依存しなし）、最小の阻害を示した。同様な結果はＰＭＮ細胞の付着を使用して得られた（第８図）。これらの実験が示すように、生合成的に産生されたＳＬＸまたは同様な擬ＳＬＸ化合物は、リポソーム組成物に配合するとき、例えば、炎症性部位における血小板への白血球の結合を減少するための、療法的化合物として働くことができる。

実施例■ ヘキササツカリドＳＬＸは血小板へ、の好中球の結合をプロ・ツクするユニ、− −一一一閑鼎→−−鼎一剛−−−１−剛一−１′“雫−一一一一一一一１　０この実施例において、ＧＭＰ−１４０の付着を阻害する最小のテトラサツカリドＳＬＸの能力をペンタ−およびヘキササ・ツカリドの能力と比較しまた。簡単に述べると、血小板および好中球を前述の方法で分離した。血小板をトロンビンで活性化し、次（Ｘで種々のオリゴ糖の希釈物とインキュベーションした。好中球を添加し、そして活性化された血小板への好中球の付着に対するサツカリドの作用を決定した。使用したオリゴ糖は次の通りであった：　ＳＬＸ　（ｈｅｘａ）、ＮｅｕＡ、ｃα２．３Ｇａ　Ｉβ１，４　（α１．３Ｆｕｃ）ＧｌｃＮＡｃβ１．３Ｇａｌβ１．４Ｇ１ｃｍ０−ＣＨｚ　ＣＨ２ＳｉＭｅｘ　（岐阜大学のハセガワ教授提供）、ＳＬＸ　（ｐｅｎｔａ）ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４　（Ｆｕｃαｌ、３）ＧＩｃＮａｃβ１．３Ｇａｌβ、およびＳＬＸ　（ｔｅｔｒａ）、ＮｅｕＡｃα２゜３Ｇａ　Ｉβ１．４　（αｔ、３Ｆｕｃ）Ｇ１ｃＮＡｃａ手順１、血小板を前述したように分離し、そしてトロンビンと０．２５０／ｍｌの最終濃度で室温において２０分間インキュベーションすることによって活性化した（　２　Ｘ　１０’　／ｍｌ）。

２、好中球は、前述したように、モノ−ポリ溶解培地（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ−Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の上にヘパリン処理した血液を層状にし、次いで２０００ｒｐｍにおいて２５分間遠心し、次いで２５００ｒｐｍでさらに２５分間遠心することによって分離した。

３、アッセイのために、２０１．ｔｌの血小板懸濁液（２Ｘ　１０＠；’　ｍｌ）をエッペンドルフ遠心管の中に入れた。等しい体積のオリゴ糖の調製物を５００μｇ／＋ｎｌ〜２．０μｇ／ｍｌの濃度において、あるいはグリコリピド−リポソーム調製物（前述したように調製した）を２μｇ／ｍ１−０．２５μｇ／ｍｌの濃度において添加し、そして管を室温において２０分間放置した。次いで２０μｍの好中球の調製物（２Ｘ　１０”　／ｍｌ）を添加し、そして管を室温においてさらに２０分間放置した。

４４好中球への活性化された血小板の付着を顕微鏡的にアッセイした。１００の好中球を評価した。それらに、２またはそれ以上の血小板が取り付けられている場合は陽性と、そして２より少ない血小板が取り付けられている場合は陰性とスコアを付けた。２またはそれ以上の結合した血小板をもつ細胞の百分率を計算した。

３個の同じ実験の結果の平均を表２に示す。

表　２５０％の阻害に要求される量オリゴ糖　（μモル）ＳＬＸ　（ｈｅｘａ）　１．８ＳＬＸ　（ｐｅｎｔａ）　２．２ＳＬＸ　（ｔ　ｅ　ｔ　ｒ　ａ）　５４．０Ｌｅ’　４３．０表２に示すように、トロンビンで活性化された血小板への好中球のＧＭＰ−１４０仲介結合を５％阻害するために、５ＬＸ−ｈｘａサツカリドよりほぼ２０倍以上の５ＬＸ−ｔｅｔｒａす・ツカリドが要求される。要求されるテトラ−サツカリドの量は、非シアル化Ｌｅ”を使用したとき、同様な程度の阻害に必要な量にほぼ等しい。ペンタサツカライドは、ヘキササツカライドによる５０％阻害のために必要な濃度に類似する濃度において５０％阻害を与え、これは最大阻害のための最小構造がペンタサツカライドに近いことを示している。

この実施例は、リポソーム上で種々のグリコリピド構造体を試験する実験を記載する。とくに、ＳＹ２、すなわち、フコースがＳＬＸにおけるように究極のＧｌｃＮＡ、ｃに取り付けられるのではなく終わりから２番目のＧｌｃＮＡｃに取り付けられるシアル化多糖、を試験した。血小板および好中球を前述の方法により分離した。血小板をトロンビンで活性化し、次いて前述したように調製したリポソームの中に埋め込まれた種々のグリコリピドの希釈物とインキュベーションした。好中球を添加し、そして活性化された血小板への好中球の付着へのグリコリピドの作用を決定した。

検査した種々のグリコリピドの構造は次の通りである：　５ＤｉＹ２゜ＮｅｕＧｃａ２．３Ｇａｌβ１．４（Ｆｕｃα１．３）ＧｌｃＮａｃβ１．３Ｇａｌβ１．４（Ｆｕｃαｌ。

３）Ｇ１ｃＮＡｃβ１．３Ｇａｌβ１．４Ｇｌｃβ１．　ＩＣｅｒ；　ＳＬＸ、　ＮｅｕＧｃａ２．３Ｇａｌβ１゜４（Ｆｕｃα１．３）Ｇ１ｃＮＡｃβｌ、　３Ｇａｌβ１．４Ｇ１ｃβ１．　ｆｃｅｒ　；　ＳＹ２．　ＮｅｕＧｃａ２゜３Ｇａ　ｌβ１．４Ｇ１ｃＮＡｃＪ１．３Ｇａｌβ１．４（Ｆｕｃα１．３）Ｇ１ｃＮＡｃβ１．３Ｇａｌβ１゜４Ｇｌｃβ１．　ＩＣｅｒ　；　ＳＨ，ＮｅｕＧｃａ２．３Ｇａｌβ１．４ＧｌｃＮＡｃβ１．３Ｇａｌβｌ。

４Ｇ１ｃＮＡｃβ１．３Ｇａｌβ１．４Ｇ１ｃβ１．　ＩＣｅｒ　；　ＳＰＧ、　ＮｅｕＧｃａ２．３ＧａｌβＩ。

４ＧｌｃＮＡｃβ１．３Ｇａｌβ１．４ＧＩＣβ１．　ＩＣｅｒ。

２つの同一の実験の結果を表３に示す。

表　３５０％の阻害に要求される量オリゴ糖　（μモル）ＳＹ２　（実験１　）０．３２５ＳＹ２　（実験２　）　０．３４５ＳＬＸ　（ｈｅｘａ）　０．３０ＳｄｉＹ２　０．３６ＳＰＧ　阻害せずＳＨ阻害せずこれらの結果が示すように、ＳＹ２は、ＳＬＸおよび５ＤｉＹ２と同様によく、トロンビン活性化された血小板への好中球のＧＭＰ−１４０仲介付着を阻害した。

この実施例は、ＧＭＰ−１４０についてのシアル化Ｌｅ”　（ＳＬＸ）の親和性が、末端のシアル酸がＮ−アセチルネウラミネート（ＮｅｕＡｃ）またはＮ−グリコールネウラミネー）　（ＮｅｕＧｃ）であるかどうかにかかわらず同一であることを証明する。すべての材料は前述したように調製した。血小板および好中球を記載した方法により分離した。血小板をトロンビンで活性化し、次いてリポソームの中に含有された種々のグリコリピドの希釈物とインキュベーションした。好中球を添加し、そして活性化された血小板への好中球の付着に対するグリコリピドの作用を決定した。

合成のＳＬＸ　（Ｎｅ　ｕ、Ａ、ｃ）およびウシ赤血球から精製されたソアリルバラグロボシドの酵素的フコシル化により調製されたＳＬＸの調製物ＳＬＸ　（ＮｅｕＧｃ）を直接比較した実験の結果を表４に示す。

表　４５０％の阻害に要求される量オリゴ糖　源　（μモル）ＳＬＸ　（ウシ赤血球）　０．７４（ＮｅｕＧｃ）ＳＬＸ　（合成）　０．６７（ＮｅｕＡｃ）これらの結果が示すように、５ＬＸ−ヘキササツカリドは、シアル酸がＮｅｕＡｃまたはＮｅｕＧｃであるにかかわらず、トロンビン活性化された血小板への好中球のＧＭＰ−１４０仲介付着を等しくよく阻害した。この結果が示すように、シアル酸のＮ−アセチルまたはＮ−グリコリル誘導体はＧＭＰ−１４０により認識される。

同様の結果がＥＬＡＭ−１を用いて得られた。

種々のグリコリピドもまた、同一アッセイにおいて試験した。試験したグリコリピドの構造は次の通りである：　５ＬＸ（ｈｅｘａ）、　ＮｅｕＧｃα２゜３Ｇａ　ｌβ１．４（Ｆｕｃα１．３）ＧｌｃＮａｃβ１．３Ｇａｌβ１．４４Ｇｌｃβ１．　ＩＣｅｒａｍｉｄｅ；ａ２．　３　ＳＬＸ　ｃａｒ、ＮｅｕＡｃａ２．　３Ｇａｌβ１．　４（Ｆｕｃα１．　３）ＧｌｃＮＡｃβ１゜３Ｇａ　ｌβ １．４Ｇｌｃβ１．　ＩＣｅｒａｍｉｄｅ：　ａ２．６　ＳＬＸ　ｃｅｒ、　ＮｅｕＡｃα２．６Ｇａｌβ１．４（ｆｕｃα１．３）Ｇ１ｃＮａｃβ１．３Ｇａｌβ１．４Ｇ１ｃβ１．　ＩＣｅｒａｍｉｄｅ：　ＳＨ。

ＮｅｕＧｃα２．３Ｇａｌβ１．、４ＧｌｃＮＡｃβ１．３Ｇａｌβ１．４ＧｌｃＮＡｃβ１．、３Ｇａｌβｌ。

４Ｇ１ｃβ１．　ＩＣｅｒａｍｉｄｅ。

この実施例は、合成ＳＬＸがＥＬＡＭ−１と結合し、そして活性化された内皮への好中球の付着を阻害することを証明する。この実施例もまた、シアル酸の連鎖がＥＬＡＭ−１への結合に影響を与えることを示す。

２つの合成化合物を調製した。１つは、天然に存在するＳＬＸにおけるように、 α２，３連鎖のシアル酸を含んでいた。第２は、レセプターの結合への連鎖の性質の重要性を検査するために、α２゜６連鎖のシアル酸からなっていた。

リポソームは、１２μｍの無水ＥＴＯＨを容管に添加し、５０°Ｃの水浴の中で短時間加温し、そして２分間超音波処理することにより調製した。２３８μｍの加温したリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）を容管にゆっくり添加し、その間超音波処理し、そしてさらに１０分間超音波処理した。ストックのリポソームの最終濃度は５％のＥＴＯＨ／ＰＢＳ中の４００μｇのグリコリピド／ｍｌであった。

手順１、ＨＵＶＥＣ，ＰＭＮ、およびリポソームを前述したように調製した。

２、刺激したＨＵＶＥＣアッセイブレートをインキュベーターから取り出し、そして試料を５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＲＰＭ１１６４０で２回洗浄した。

３、リポソームのスックをＨＢＳＳ／ＢＳＡ緩衝液中で希釈して次に等しい溶液を調製した：４０μｇ／１１．３０ｕｇ／ｍＬ　１５ｕｇ／ｍｌ、７．５μｇ／ｍｌ、３．７５μｇ／１Ｉｌｌおよび１．８７μｇ／ｍ１．同様な希釈物をＰＢＳ−５％のＥＴＯＨから成る対照ストックから調製した。

４、培地をアッセイプレートのウェルからパスツールピペットで、１度に数ウェルで、除去した。

５．０．０５＋ｎｌの各リポソーム懸濁液を刺激したアッセイプレート上の二重反復実験のウェルに添加した。対照のウェルに、リポソームを含有するウェルにおけるのと同一濃度でエタノール、ＨＢＳＳおよびＢＳＡを含有するリポソーム緩衝液を添加した。対照緩衝液を刺激しないＨＵＶＥＣおよび刺激したＨＵＶＥＣ上でプレイティングした。リポソームを含有する試料を刺激したウェルにのみ添加した。

６、プレートを３７°Ｃにおいて４０分間インキュベージコンし、次いで５０μ ｍのＰＭＮをアッセイのウェルに添加した。細胞の最終濃度は１００μｍ中で５Ｘ１０Ｓウエルであった。

７、アッセイブレートをインキュベーター（５％のＣＯ２，３７℃）に８分間戻した。

８、結合しない細胞をアッセイブレートから系統的再懸濁により、ｐ２００マルチチャンネルのピペットを使用し、次いで０．２ｍｌの培地を添加および除去することによって除去した。

９、培地のすべてをウェルから除去し、そして５０μｌの可溶化緩衝液を添加した。これは０．１％のＮｏ−４０洗浄剤を含有するクエン酸塩緩衝液（２４，３ｍｌの０．１Ｍクエン酸、１０．５ｇ／　５００ｍ１　：　２５．７ｍｌの０．２Ｍリン酸ナトリウム、１．４．２／　５００ｍ１およびＳＱＨ，ＯてＩＱＯｍｌ）から成っていた。

１０、　プレートをロータリー震盪器上で１０分間インキュベーションし、次いで０．０５［［＋１の０ＰＤＡ溶液（８ｍｇの０−フェニレン−ジアミン、Ｓｉｇｍａ　カタログＮｏ、Ｐ−１５２６，８ｍｌの３０％　Ｈ２Ｃ。

および１０ｍ１のクエン酸塩緩衝液（上のような）〕を各ウつルに添加した。この反応を１５分間進行させ、次いで２５μｍの４Ｎ硫酸を各ウェルに添加して反応を停止させた。

１１８試薬を１００μｍの体積の可溶化緩衝液および０ＰＤＡ溶液を５０μｍの４硫酸と混合することによって調製した。

１２、　１００μｌの上澄み液を２ウエルの各々から取り出し、そして柔軟なＥＬＩＳＡアッセイプ曇−ト（Ｆａｌｃｏｎ）に移した。プレートを分光光度測定的に４９２ｎｍにおいて３０分以内に走査した。

２つの実験の結果を下表５に表す。

表５（２，６）ＳＬｅｘ　（２，３）ＳＬｅｘ濃度　平均　平均１　２０ｕｇ／ｍｌ　Ｏ，６６３０，１５６２１５ｕｇ／ωｌ　Ｏ，６３６０，２７０３７，５μｇ／口１　０．６０２　０．３５９４　３．７５μｇ　／ｍｌ　Ｏ，６５５０，４８３５１，８７ａ　ｇ／ｍｌ　Ｏ，６９００，５８０６，４７ｔｔｇ／ｍｌ　Ｏ，６９５０，６４２７０μｇ　／ｍｌ　ｏ、７１０　０．７１６対照＋ＩＬ−］、８　対照−ＩＬ−ＩＢ濃度　平均　平均１　２０ｕ　ｇ／ｍｌ　Ｏ，６５７０，０１０２１５ｕｇ／ｍｌ　Ｏ，７４００，０１０３７，５μｇ／ｍｌ　Ｏ，６５８０，０１３４３、ア５ｕ　ｇ／ｍ１．　０．６９８　０．００９５　１．８７ｕ　ｇ／ｍｌ　Ｏ，７２５０，０１４６，４７μｇ／ｌ１ｌｌ　Ｏ，７８２０，０１８７０μｇ／＋ｍｌ　０１７０８　０．０１にれらの結果が示すように、合成α（２，３）シアリルＬｅ’″を含有するが、α（２，６）シアリルＬｅ”を含有しないリポソームは、ＥＬＡＭ−１依存績合アッセイにおいて、活性化された内皮への好中球の付着を阻害する。こうして、シアル酸のα２，３連鎖はＥＬＡＭ−１による認識のために必要であると思われる。さらに、結果が示すように、合成的に産生されたオリゴ糖、α（２，３）シアリルＬｅ”はＥＬＡＭ−１に結合し、そして活性化された内皮への好中球の結合をブロックする。ＧＭＰ　−１４０について同様の結果が得られた。

それを図９に示す。したがって、この化合物またはこの化合物の誘導体は潜在的抗炎症薬物の候補を構成する。

この実ｗｉ例は、ＨＬ−８０ＪＩ胞のシアル化Ｌｅ１の内部のβ−ガラクトース主鎖の糖連鎖がエンド−β−ガラクトシダーゼによる切断に対して感受性であるかどうかを決定する実験を記載し、ここでエンド−β−ガラクトシダーゼはポリラクトサミニル構造の中の内部のβ−ガラクトース連鎖を切断するが、Ｇａ１ＮＡＣがマンノースに結合しているとき（コア型構造）β−ｇａｌを切断しないことが知られている酵素である。

手順血小板を前述の方法により分離し、そしてトロンビンで活性化した。ｒＬ−１β で活性化されたＨＵＶＥＣを上記の様にして調製した。培養したＨＬ６０細胞を後述するようにエンド−β−ガラクトシダーゼで処理し、そして活性化された血小板へのＨＬ６（［１胞のＧＭＰ−１４０仲介付着への酵素処理の作用を決定した。

ＨＬ６０細胞の酵素処理は次のようにして実施した：１２．４Ｘ１０”細胞を２０ｍＭ　ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓおよび０．２％のグルコースを含有するハング均衡塩溶液で２回洗浄し、次いで通常の生理的塩類溶液で１回洗浄した。エンド−β− ガラクトシダーゼ（０，１単位、ｒｃＮ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ。

［ｎｃ、　、カリフォルニア州アービン）を２００μｌの通常の生理的塩類溶液および２００μｌの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０１）中に溶解した。２００μＩ　（０，０５単位の酵素を含有する）を３ＸｌＯ’のＨＬ６０細胞に添加し、そして２００μｍの酢酸塩緩衝液を緩衝液対照として使用する同様な数の細胞に添加した。両者の管を３７℃においておだやかに撹拌しながら６０分間インキュベーションした。次いで管を氷の中で冷却し、そして細胞をＨＥＰＥＳおよびグルコースを含有するＨＢＳＳ中で３回洗浄し、次いでカウントしそして２　ｘ　１０’　／ｍｌに懸濁させた。

ＧＭＰ−１４０アツセイのために、２０ｍ１のタイロード−ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，２）をエツベンドルフ管の中に入れた。同一体積の活性化された血小板（２ｘｌＯ”　／ｍｌ）　オヨびＨＬ６０ｍ胞（２ＸｌＯ＠／ｍｌ）を添加しそして、混合後、管を室温において２０分間放置した。

ＨＬ６０細胞への血小板の付着を活性化された血小板の好中球への付着について前述したように顕微鏡的に評価した。

これらの実験が示すように、エンド−β−ガラクトシダーゼでＨＬ８０細胞を処理すると、（１）トロンビン活性化された血小板へＨＬ６０細胞が結合する能力が８７．５％だけ阻害され、そして（２）ＩＬ−１βにより活性化されたＨＵＶＥＣについて４°Ｃにて７０％阻害された。こうして、ＧＭＰ−１４０のための最小のＳＬＸを含有するテトラサツカリドのリガンドは、多分、マンノースよりむしろラクトースまたはポリラクトサミニル構造に結合している。

実施例Ｘ■ フコシル化多糖は血小板への好中球の結合をブロックするこの実施例において、ＧＭＰ−１４０仲介付着を阻害するフコシル化多糖の能力を非フコシル化多糖のへキササツカリドのＳＬＸおよびＬｅ”のそれと比較した。簡単に述べると、血小板および好中球を前述の方法により分離した。血小板をトロンビンで活性化し、次いで種々のオリゴ糖の希釈物とインキュベーションした。好中球を添加し、そして活性化された血小板への好中球の付着へのサツカリドの作用を決定した。

使用したオリゴ糖は次の通りであった：天然多糖およびそのフコシル化誘導体（両者の調製は下に記載する）。

ＳＬＸへキササツカリド、ＬＮＦ　ＩＩ［（Ｌｅ”　）およびＬＮＦ　１（構造は前述した）。

ＳＬＸの線状コア構造を含有する多糖を多価のＳＬＸを含有する多糖に、酵素的フコシル化により転化した。天然多糖Ｉａ型は、Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、２２１２５８−１２６３（１９８３）　（これをここに引用によって加える）に記載されているように群Ｂのストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）から得た。適当なバクテリアの菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に受託され、そして受託Ｎｏ、　１２４００．３１５７４゜１２４０１、および３１５７５を有する。

フコシル化多糖を調製するために、１ｍｇの天然Ｉａ型多糖を６μｍの１モルの塩化マンガン、グアノシン５′−ジホスフェートβ−Ｌ−フコースと放射性トレーサー（比活性１．８２Ｘ　ｌＯ’ｃｐｍ／μモル）、９０μｍの水中の０．９ μモル、および水１３７μｌの混合物の中に溶解した。これに、Ｐｒ１ｅｅｌｓら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５６１０４５＆−１０４６３（１９８１）（これをここに引用によって加える）にすでに記載されているように、ヒト乳から分離された３／４フコーストランスフエラーゼの１００μｌの溶液を添加した。

この反応混合物を水と共に数回、膜（１００Ｋのカットオフ）に対して製線し、そして保持液を凍結乾燥して粉末にした。この固体を水に溶解し、そして弱い陽イオン交換カラムを通して残ったタンパク質を除去した。フコシル化されたポリサッカライドを含む放射性画分を集めそして凍結乾燥した。放射能の勤人により測定した場合、約５０の利用可能な側鎖がフコシル化された。

手順血小板を前述したように分離し、そして室温においてトロンビンと０．２５Ｕ／ｍｌの最終濃度で２０分間インキュベーションすることによって活性化した（　２　Ｘ　１０”　／ｍｌ）。

好中球は、前述したように、モノ−ポリ溶解培地（Ｆｉｃｏｌ　１−Ｈｙｐａｑｕｅ。

Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の上でヘパリン処理した血液を層状にし、次いで２００Ｏｒｐｍで２５分間遠心し、次いで、さらに２５分間２５００ｒｐｍで遠心することによって分離した。

アッセイのために、２０μｍの血小板懸濁液（２Ｘ　１０’　／ｍｌ）をエッペンドルフ管の中に入れた。等しい体積のオリゴ糖の調製物を５００μｇ／ｍｌ〜２，０μｇ／＋ｎｌの濃度で添加し、そして管を室温において２０分間放置した。次いで、２０μｌの好中球調製物（２Ｘ１０’／ｍｌ）を添加し、そして管をさらに２０分間室温において放置した。

好中球への活性化された血小板の付着を顕微鏡的に評価した。

１００好中球を評価した。それらは、２またはそれ以上の血小板か結合している場合は陽性と、そして２より少ない血小板が結合していた場合は陰性とスコアをつけた。２またはそれ以上の結合した血小板をもつ細胞の百分率を計算した。

表６に示すように、フコシル化多糖は、トロンビン活性化された血小板への好中球のＧＭＰ−２４０仲介結合を非常に効率よく阻害した。

５０％の阻害はｌμｇ／ｌ１１１より小さい量で達成された。これは、天然多糖に要求される２０μｇ／層Ｉに匹敵し、そして同様な程度の阻害についてＳＬＸヘキササツカリドの８μｇ／ｍｌに匹敵する。

表６５０％の阻害に要求される量オリゴ糖　（μモル）天然多糖　１５フコシル化多糖　０．７ＳＬＸヘキササツカリド　８ＬＮＦ　ＩＩ（Ｌｅり　３５ＬＮＦ　Ｉ　阻害なしこの例はりポリサッカライドにより誘導される死の動物モデルにおけるｍＡｂ　Ｐ２Ｈ４（係属中の米国特許出願Ｎｏ、　０７／　６４５．８７８に記載されている機能的抗−ヒトＥＬＡＭ−１ｍＡｂであるネズミＩｇ０３Ｋ）の効果を示す。Ｐ２Ｈ４はＥＬＡＭ−１に対するラット相当物と交叉反応することが知られているので、ラットの系か選択された。

材料及び方法大腸菌０１１２：８４からのＬＰＳ　（Ｓｉｇｍａ）を、使用の１日前に、単一ロットから、無菌のパイロジエン不含塩溶液に５　ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解することにより調製する。溶液を、ＴｅｋｍａｒｋＳｏｎｉｃ破砕機を用いて３０秒間氷上で音波処理した。使用の直前に、材料を３０秒間２回目として音波処理した。体重２００ｇ±１０ｇの雌性ＬｅｗｉｓラットをＣｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　Ｌａｂｓから購入し、そして購入後少なくとも７日間飼育した（１ｍ化のため）。特にことわらないかぎり、複数の群（１０動物）を使用した。すべての試薬は尾静脈を通して非経口的に注射した。負対照として、動物に無菌のＬＰＳ−不含１ｒ塩溶液、又はネズミＩｇ０３に骨髄腫タンパク質（Ｊ　６０６、低パイロジエン−＜２ｎｇ／ｍｇタンパク質）を与えた。

結果Ｐ６Ｅ２投与量／スケジュールプロトコールは、ラットに予防的に投与されたＰ２Ｈ４により本発明者らが得た薬理動能データから実験的に得た。「最少ｊ　ＬＤ、。。量は実験的にこれらのラットについて７．５ｍｇ／ｋｇであると決定された。

１つの実験においては、チャレンジの１時間前に１．Ｏｍｇ／ｋｇにより処理した。チャレンジの３時間後にブーストを投与した。４／１０の処理された動物はＬＰＳに対して生き残こった。他方、１０匹すべての（塩溶液を注射された）対照は死んだ。２４時間の観察期間において、生き残こった動物は、ＬＰＳ処理された動物に特徴的な臨床症状をほとんど示さなかった。

次に本発明者らは、第１の実験において使用されたｌｏｍｇ／ｋｇの投与量より（１）２倍高い投与量及び（２）１オーダー低い投与量のＰＳＥ２の投与を試みた。この結果が示すところによれば、Ｐ２Ｈ４は存意な効果を有しており、８０％の動物が＋ｏｍｇ／ｋｇ量で生存した（Ｉｇｌｏ）。なお、１匹の動物は塩溶液対照群において生き残こり、この群の動物は「ヒツト」されなかったことを示した。

Ｐ２Ｈ４の療法的価値を示すために他の研究を行った。Ｉ、ＰＳチャレンジの１時間前、又は２．４もしくは６時間後にｌ０ｍｇ／ｋｇのＰ２Ｈ４をポルス投与した。

やはり、１０動物中の１匹は、塩溶液により処理された群において、及び＋ｏｍｇ／ｋｇのＪ６０６骨髄腫タンパク質で処理された群において（Ｔ＝６０分）生き残こった（図１１）。Ｐ２Ｈ４は、ＬＰＳの２又は４時間後に投与された場合でも保護効果を有していた。

時論Ｃｙｔｅｌ　ｍＡｂ　Ｐ２Ｈ４について見られる保護は、致死的疾患の動物モデルにおけるＥＬＡＭ−１の重要性を示している。

この例は、生物源から単離されそしてリボゾームに導入されたシアリル化Ｌｅｗｉｓ　ｘ　（ＳＬＸ）及びシアロパラグロポシド（ＳＰＧ）が、活性化されたラビット細静脈中で［ローリングＪ　（ｒ。

１１ｉｎｇ）することを示す。

「ローリング」は白血球と内皮細胞壁との間の被期細胞間相互作用である。白血球は内皮細胞上を「ローリング」する。白血球は次に、（１）循環中にもどるか、又は（２）内皮細胞に付着し、そして炎症に達する初期事象が始まる。セレクチンは「ローリング」のグリコスフィンゴリピドを含有するリボゾームを次の様にして形成した。５０μｇのグリコリピドを、クロロホルム／メタノール（２゜１）中１５０μｇのホスファチジルコリン（Ｓ　ｉ　ｇｍａ、卵黄）、２５０μ ｇのコレステロール（Ｓｉ　ｇｍａ）及び１ｍＭカルボキシフルオレッセイン（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）に加え、そして溶液全体をスクリューキャップ付ガラス管中で蒸発乾固した。各チューブに１２，５μｌの純エタノールを加え、水浴中で短時間加温し、そして２分間音波処理することによりリボゾームを調製した。音波処理しながら各チューブに温ＰＢＳを徐々に加え、そして音波処理を合計１ｏ分間続けた。

ＰＢＳによりリボゾームをＩ［ｌ１１にし、そして１４．　ＯＯＯｒｐｍにて２分間遠心分離して過剰のＥｔＯＨ及びカルボキシフルオレッセインを除去した。

上滑を捨て、そしてリボゾームを１ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、ヘマチトメーター上で計数し、そして５ＸｆＯ’　リボゾーム／ｍｉに調製した。ＩＬ−１により４時間前に活性化されたラビットに注射した。

Ａｃｆｒｉａｎらにより記載されているようにして生体内顕微鏡を用いてローリングを観察した。ＴＬ−１で活性化されたラビット腸間膜を外に出し、そしてＩＩ微鏡ステージの３７°Ｃに加熱されたガラスウィンドー上に拡げた。腸間膜を、Ｎ２中５％　ＣＯｚで平衡化された３６，５°Ｃの塩溶液につけた。リボゾーム−内皮相互作用を、５０Ｘ塩水浸漬対物レンズを育する生体内顕微鏡により観察した。リボゾームは蛍光に暴露することにより可視化した。選択された腸管脈細管（直径２０〜４０μｍ）のセグメントを１分間にわたり計数した。

結果ＩＬ−１により活性化されたラビット細胞上でのりボゾームのロヒト好中球　４（ローリングの最高量）Ｓ　Ｌ　ｅ　ｘ　リボゾーム　２ＳＰＧリボゾーム　０（ローリングなし）結論Ｌ　Ａ　Ｍ　−１（ｖａｎ　Ａｄｒｉａｎら）に加えて、ＥＬＡＭ−１及びそのリガンドは白血球辺縁趣向（ｍａｒｇｉｎａｔ　１ｏｎ）又は「ローリング」の存在に関与するようである。

本発明を理解を明瞭とする目的で多少詳細に例示および実施例により記載したが、明らかなように、ある種の変化および変更は添付する請求の範囲を逸脱しないでなすことができる。

ｂ恢　ｌモノクローナル抗体による血小板の付着の阻害ＦＩＧ、６゜リポソーム濃度（ｕｑ／ｍｌ）リポソーム濃度（４ｑ／ｍ１）ＦＩＧ、＆生存体（％）ｈＣ〃要約書本発明は、炎症を低下又は抑制するため、並びに細胞間付着により介在される炎症性疾患過程及び他の病的状態を治療するための組成物および方法に関する。セクレチンレセプターに選択的に結合しそして少なくとも１つのセレクチン結合成分を有する組成物が本発明により提供される。セレクチン結合成分は一般式：　ＲＩ−Ｇａ　１βｌ、４　（Ｆｕｃαｌ、３）ＧｌｃＮＡｃ−（Ｒｚ）を有し、ここてＲ１はオリゴサツカライド又はＲ’！　−Ｒ４Ｃ（Ｃｏ□Ｈ）−であり、ここでＲ３及びＲ４は同一であるか又は異り、そして−Ｈ１−ＣＩ　−Ｃ８アルキル、−ヒドロキシＣｌ−Ｃ８アルキル、−アリールＣ１−Ｃ８アルキル、又は −アルコキシＣｌ−Ｃ８アルキルであり、ここでＲ２はβ１，３Ｇａｌ、ａｉ　２Ｍａｎ又はαｌ、６ＧａｌＮａｃであり、モしてａは０又は１である。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の７第１項）１　特許出頴の表示ＰＣＴ／ＵＳ９１１０４２８４　２　発明の名称細胞間付着仲介因子。

３　特許出願人住　所　アメリカ合衆国、カリフォルニア　９２１２１．サンディエゴ、ジジン　ホブキンス　コート３５２５名　称　サイチル　コーポレイション請求の範囲１、医薬として許容される担体、およびセクレンレセプターに選択的に結合する成分を含んでなる化合物を含んでなり、前記成分は式：％式％）Ｒ１はシアル酸、シアル酸を含んでなるオリゴ環および式を有する基から成る群より選択されるメンバーであり、Ｒ３およびＲ４は個々に同一であるか、あるいは異なり、そして−Ｈ，Ｃ，−Ｃ，アルキル、ヒドロキシ（Ｃ，−Ｃ，アルキル）、アリール−（ｃ、−ｃ、アルキル）および（Ｃ，−Ｃ，アルコキシ）（ＣＩ　Ｃｓアルキル）であるか、あるいはＲｆｆおよびＲ４は一緒になって４〜８員環を形成し、そしてＲ２はβ１，３Ｇａｔ、αｌ、２Ｍａｎまたはｃｒｌ、６ＧａｌＮａｃであり、そしてａはＯまたは１であり、そしてＸは−Ｈ２低級アルキル（Ｃ，−Ｃｓ）、アリールアルキル、ヒドロキシｃｃ、 −ｃｍ＞アルキルまたは（ＣＩ　Ｃｍ）アルコキシ−（ｃ。

−Ｃ３）アルキルである）を有する、医薬組成物。

２、前記化合物が生物分子である、請求項１に記載の組成物。

３、前記生物分子がオリゴ環、オリゴペプチド、タン）ｉり質または脂質である、請求項１に記載の組成物。

４、Ｒ３およびＲ４は４〜８員環を特徴する請求項１に記載の組成物。

５、前記４〜８員環が単糖である、請求項４に記載の組成物。

６、シアル酸はＮｅｕＡ、ｃα２，３またはＮｅｕＧｃα２，３である、請求項１に記載の組成物。

７、前記オリゴ環がＮｅｕＡｃ＋ｒ２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，３またはＮｅｕＧｃα２．３Ｇａｌβ１，４Ｇ１ｃＮＡＣβ１，３である、請求項１に記載の組成′＃ｙ。

８、前記化合物が多糖である、請求項１に記載の組成物。

９、前記オリゴ環が式。

↑ を有する反復単位を含んでなる、請求項８に記載の組成物。

１０、前記オリゴ環が式：を有する反復単位を含んでなる、請求項８に記載の組成物。

１１、前記多糖類が群Ｂのストレプトコッカスのフコシル化Ｔａ型多糖である、請求項８に記載の組成物。

１２、前記多糖類が群Ｂのストレプトコッカスの■型の多糖である、請求項８に記載の組成物。

１３、前記多糖類が約５，０００〜３００．０００の分子量を有する、請求項８に記載の組成物。

１４、前記多ｗ類が約５〜約２００のフコシル化反復単位を含んでなる、請求項８に記載の組成物。

１５、前記の多［ｒが約２５〜約１００のフコシル化反復単位を含んでなる、請求項１４に記載の組成物。

１６、前記生物分子がスフィンゴリピドである、請求項１に記載の組成物。

１７、前記生物分子がガングリオシドである、請求項１６に記載の組成物。

１８、前記セレクチンレセプターが脈管内皮細胞または血小板上で発現される、請求項Ｉに記載の組成物。

１９、前記セレクチンレセブターがＥＬＡＭ−１またはＧＭＰ−１４０である、請求項１８に記載の組成物。

２０、医薬として許容される担体、およびセレクチンレセブターに選択的に結合する化合物を有するリポソームを含んでなる医薬組成物。

２１、前記リポソームが抗炎症性化学療法荊を封入している、請求項２０に記載の組成物。

２２、前記抗炎症剤がシクロスポリンＡ、インドメタシン、ナプロキセン、ＦＫ −５０６またはマイコフェノール酸である、請求項２３に記載の組成物。

２３、前記化合物が、式：％式％）：３Ｃ；ａ　ｌβ１．４ＧｌｃＮＡｃβ１．３から成る群より選択され、Ｒ２はβ １．３Ｇａ　Ｉ、　β１．２Ｍａｎまたは（Ｘｌ、６ＧａｌＮＡｃであり、そしてａは０または１であり、そしてＸばタンパク質または脂質である）を有する、請求項２１に記載の組成物。

２４、Ｘが４０．０００〜約２５０．０００ダルトンの分子量を有する糖タンパク質である、請求項２３に記載の組成物。

２５、Ｘが約６００〜約４，０００ダルトンの分子量を有する糖脂質である、請求項２３に記載の組成物。

２６、前記化合物が式：％式％Ｘは−Ｈ５低級アルキル（Ｃ，−ＣＩ）、アリールアルキル、ヒドロキシ（Ｃ， −Ｃ，）アルキルまたは（自−０８）アルコキシ−（Ｃ。

−〇、）アルキルである）を有する成分を含んでなる、請求項２ｏに記載の組成物。

２７、前記セレクチンレセブターが脈管内皮細胞または血小板上で発現される、請求項２０に記載の組成物。

２８、医薬として許容される担体、およびセレクチンレセブターに選択的に結合する化合物を含んでなり、前記化合物は、式：％式％）Ｒ３はシアル酸、Ｒｓ（Ｒａ）Ｃ（Ｃｏｔ　Ｈ）−１またはシアル酸を含んでなる三糖であり、Ｒ１およびＲ４は同一であるか、あるいは異なり、そして−Ｈ２−ＣＩ−Ｃ８アルキル、−ヒドロキシル置換Ｃ１−Ｃ８アルキル、−アリール置換ＣＩ−ＣＢアルキル、または−アルコキシ置換Ｃｌ−Ｃ８アルキルであり、そしてＲ２はβ１．３Ｇａ　１．ｉｒｌ、２Ｍａｎ、またばβ１．６ＧａｌＮａｃであり、そしてａは０または１であり、そしてＸは−Ｈ５低級アルキル（Ｃ，−Ｃ，）、ヒドロキシアルキル（ＣＩ−Ｃ６）、アルコキシ（Ｃ，−Ｃ，）、アルキル（ＣＩ−Ｃｓ＞、−アリール、−アルキルアリールおよび−アリールアルキルから成る群より選択される）を有する、医薬組成物。

２９、前記化合物が弐：ＮｅｕＡ、ｃα２，３Ｇａｌβ１．４　（Ｆｕｃｃｒｌ、３）ＧｌｃＮＡｃ−（Ｒ）、　、ＮｅｕＧｃα２，３Ｇａ　ｌβｌ、４　（Ｆｕｃ＋ｒｌ。

３）Ｇ　Ｉ　ｃＮＡｃ−（Ｒ）−およびＮｅｕＧｃｔｘ２．３Ｃ；ａｌβ１゜４ＧＩｃＮＡｃβＬ、３Ｇａｌβ１，４　（Ｆｕｃ＋ｒ１．３）ＧｌｃＮＡｃ−（Ｒ）、（ここでＲはβ１，３Ｇａｌ、β１．２Ｍａｎまたはαｌ、６Ｎａｃであり、そしてａはＯまたは１である）を有する、請求項２８に記載の組成物。

３０、医薬として許容される担体、およびセレクチンレセプターに選択的に結合することができる２またはそれより多くの反復単位を有する化合物を含んでなり、前記反復単位がセレクチン結合性成分を含んでなりそしてリンカ一部分により連鎖されており、各反復単位は式：％式％）Ｒ３はシアル酸、シアル酸を含んでなるオリゴ糖、および式：を有する基から成る群より選択されるメンバーであり、Ｒ３およびＲ４は個々に同一であるが、あるいは異なり、そして−Ｈ，、Ｃ，−Ｃ，アルキル、ヒドロキシＣＣ，−Ｃ，アルキル）、アリール−（Ｃ，−ｃ、アルキル）および（ＣＩ−ＣＳアルコキシ） −（Ｃ，−Ｃ，アルキル）であるか、あるいはＲ３およびＲ１は一緒になって４〜８員環を形成し、そしてＲ８はβ１，３Ｇａｌ、ｔｘｉ　２Ｍａｎまたはｃｒｌ、６ＧａｌＮａｃであり、そしてａはＯまたは１であり、そしてＸは−Ｈ１低級アルキルＣＣ＋　Ｃｓ）、アリールアルキル、ヒトｏ＋シ（ＣＩ　Ｃｏ）フルキルまたは（ＣＩ　ＣＩ）７７Ｌ／Ｄキシ′−（ＣＩ−０８）アルキルである）を有する、医薬組成物。

３１、前記リンカ−成分が式：ｎおよびｍは同一であるか、あるいは異なり、そして２〜１２の整数であり、Ｙ　＋、ｔ　ＯまたばＳであり、そしてＷはＯ４ＳまたはＮＨである）を有する、請求項３０に記載の組成物。

３２、前記リンカ一部分が２つの置換基を有する５〜１４員環であり、各置換基は式：％式％）を有し、そして置換基はンスまたはトランスの関係にある、請求項３０に記載の組成物。

３３、前記置換基が１．２〜１、（ｐ／２）＋１の配置にあり、ここでｐは５〜工４の整数であり、そして環の大きさに相当する、請求項３２に記載の組成物。

３４、医薬として許容される担体、および２つの窒素原子および２つのセレクチン結合性成分を有する複素環化合物を含んでなり、各成分は窒素原子の１つに連鎖されており、そして式：％式％（）Ｒ１はシアル酸、Ｒｊ（Ｒ，）Ｃ（ＣＯｆｆｉ　Ｈ）−１またはシアル酸を含んでなる三糖であり、Ｒ１およびＲ４は同一であるか、あるいは異なり、そして−Ｈ１−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−ヒドロキシル置換Ｃ１−Ｃ８アルキル、−アリール置換ｃｉ−ｃｓアルキル、または−アルコキシ置換Ｃｌ−Ｃ８アルキルであり、そしてＲ２はβ１．３Ｇａ　Ｉ、ａｌ、２Ｍａｎ、またはα１．６ＧａｌＮａｃであり、そしてａはＯまたは１である）を有する、医薬組成物。

３５゜前記複素環化合物がピペラジンまたはホモピペラジンである、請求項３４に記載の組成物。

３６、医薬として許容されうる担体、およびＮｅｕＡｃ＋ｒ２，３Ｇａ　Ｉｓｌ、４　（Ｆｕｃαｌ、３）ＧＩｃＮＡｃ−（Ｒ）Ｉｌ−１ＮｅｕＧｃａ２．３Ｇａｌβ１，４　（Ｆｕｃｃｒｌ。

３）Ｇｌ　ｃＮＡｃ−（Ｒ）−一およびＮｅｕＧｃα２，３Ｇａｌβ１．４ＧｌｃＮＡｃβ１．３Ｃａｌβ１．４　（Ｆｕｃαｌ、３）ＧｌｃＮＡｃ　（Ｒ）− （ここでＲはβ１．３Ｃａｌ、αｌ、２Ｍａｎ、またはα１．６Ｎａｃであり、そしてａｌ、ｔＯまたばＩである）から成る群より選択されるセレクチン結合性オリゴ糖成分に連鎖したアミノ酸を含んでなる医ｔｉ組成物。

３７、前記アミノ酸がリジン、ホモリジン、オルチニン、ジアミノ酪酸、アスパラギンまたはジアミノプロピオン酸である、請求項３６に記載の組成物。

３８、前記アミノ酸がオリゴペプチドの中に組み込まれている、請求項３６に記載の組成物。

３９、前記オリゴペプチドが次のものの１つまたは２つ以上からなる：リジン、ホモリジン、オルチニン、ジアミノ酪酸、アスパラギンまたはジアミノプロピオン酸、請求項３日に記載の組成物。

４０、前記オリゴペプチドが次のものの１つまたは２つ以上からなる：アラニン、チロシンまたは放射性ヨウ化チロシン、請求項３９に記載の組成＠！Ｊ。

４１、前記オリゴペプチドが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ここでＲ１およびＲ２は同一であるか、あるいは異なり、そして任意のアミノ酸残基であり、そしてＬはオリゴ糖成分である）からなる、請求項３８に記載の組成物。

４２、医薬として許容される担体、およびセレクチン細胞表面レセプターにより認識されるオリゴ垢のリガンドに選択的に結合することができる免疫グロブリンを含んでなり、前記免疫グロブリンは炎症性状態を処１するために十分な量で存在する、医薬組成物。

４３、前記リガンドが式：％式％から成る群より選択される、請求項４２に記載の組成物。

４４、前記オリゴ糖成分が白血球により発現される、請求項４２に記載の組成物。

４５、前記セレクチンレセブターが脈管内皮細胞または血小板により発現される、請求項４２に記載の組成物。

４６、前記セレクチンレセブターがＥＬＡＭ−１またはＧＭＰ−１４０である、請求項４２に記載の組成物。

４７、前記組成物が単位投与形である、請求項４２に記載の組成物。

４８、医薬として許容される担体、およびセレクチンレセブターに選択的に結合する成分を含んでなる化合物を含んでなり、前記成分が式：％式％）キル−Ａｒａαｌ、３および（Ｒ，５）−５−アリール−Ａｒａｃｒｌ、３であり、そしてＲ８は１．３βＧａ　ｌ、１，２αＭａｎおよびｌ、６αＧａ１ＮＡｃであり、そしてａはＯまたは１であり、そしてＸは−Ｈ２低級アルキル（Ｃ，−Ｃ，）、アリールアルキル、ヒト０　＊　シ（Ｃ＋　Ｃｍ）　７　）Ｌｔキル、マタは（Ｃ＋　−Ｃｓ）アルコキシー（Ｃ，− Ｃ，）アルキルである）を有する、医薬組成物。

４９、前記化合物が生物分子である、請求項４８に記載の組成物。

５０、前記成分が脈管内皮細胞または血小板上で発現されたセレクチンレセブターに結合する、請求項４８に記載の組成物。

５１、前記セレクチンレセプターがＥＬＡＭ−１またはＧＭＰ−１４０である、請求項４８に記載の組成物。

５２、患者に療法的に有効投与量の、医薬として許容される担体およびセレクチンレセブターに選択的に結合する化合物を含んでなる医薬組成物を投与することを含んでなる、患者におけるセレクチン仲介細胞間付着を阻害する方法。

５３．前記化合物がセレクチンレセブターに選択的に結合する成分を含んでなり、前記成分が式：％式％）Ｒ１はシアル酸、Ｒ，（Ｒ，）Ｃ（Ｃｏｔ　Ｈ）−２またはシアル酸を含んでなる三糖であり、Ｒ１およびＲ４は同一であるか、あるいは異なり、そして−Ｈ１−Ｃ１−（ｌアルキル、−ヒドロキシル１換Ｃ１−Ｃ８アルキル、−アリール置換Ｃ１，−Ｃ８アルキル、または−アルコキシ置換Ｃ１−ＣＢアルキルであり、そしてＲ２はβ１．３Ｇａｌ、αｌ、２Ｍａｎ、またはαｌ、６ＧａｌＮａｃであり、そしてａはＯまたは１であり、そしてＸは−Ｈ１低級アルキル（Ｃ，−Ｃ，）、アリールアルキル、ヒドロキシ（Ｃ１Ｃｓ）アルキル、または（Ｃ，−Ｃえ）アルコキシ−ｃｃ、−ｃｓ＞アルキルである）を有する、請求項５２に記載の方法。

５４、前記化合物が（Ｃ，−Ｃ，）アルキル、（Ｃ，−Ｃ，）アルコキノ−（Ｃｔ　Ｃｔ）アルキルである、請求項５２に記載の方法。

５５、前記細胞間の付着が炎症性状態に関連する、請求項５２に記載の方法。

５６、前記炎症性状態が敗血症性ンＷ　ｙりである、請求項５５に記載の方法。

５７、前記炎症性状態が２、性呼吸困難症候群または創傷に関連する敗血病である、請求項５５に記載の方法。

５８、前記細胞間の付着が転移に関連する、請求項５２に記載の方法。

５９、前記セレクチンレセブターが内皮細胞への白血球、単球または好中球の付着を特徴する請求項５２に記載の方法。

６０、前記セレクチンレセブターがＥＬＡＭ−１またはＧＭＰ　−１４０である、請求項５２に記載の方法。

６１、前記化合物がリポソームの中に封入されている、請求項５２に記載の方法。

６２、前記化合物が多糖類である、請求項５２に記載の方法。

６３、患者に療法的に有効投与量の、セレクチンレセプターに選択的に結合する化合物を投与することを含んでなり、前記化合物は、式％式％）Ｒ３はシアル酸、Ｒ３（Ｒ，）Ｃ（ＣＯｚ　）（）−またはシアル酸からなる三糖であり、Ｒ３およびＲ１は同一であるか、あるいは異なり、そして−Ｈ１−ｃｔ−ｃｓアルキル、−ヒドロキシル置換Ｃ１−Ｃ８アルキル、−アリール置換ＣＬ−ＣＢアルキルまたは一アルコキシ置換Ｃｌ−０８アルキルであり、そしてＲｚはβ１．３Ｇａｌ、（ｒｌ、２ＭａＨまたはαｌ、６ＧａｌＮａｃであり、そしてａはＯまたは１であり、そしてＸは−Ｈ１低級アルキル（Ｃ，−ＣＩ）、アリールアルキル、ヒドロキシ（Ｃ， −ｃｍ＞アルキルまたは（Ｃ，−Ｃ，）アルコキシ−（Ｃ。

−Ｃ１）アルキルである）を有する、患者におけるセレクチンレセブターにより仲介される炎症性の病気のプロセス処置する方法。

６４、Ｘがオリゴ塘、オリゴペプチド、タンパク質または脂質である、請求項６３に記載の方法。

６５、前記セレクチンレセブターがＥＬＡＭ−１またはＧＭＰ−１４０である、請求項６３に記載の方法。

６６、工程：試験化合物をセレクチンレセプターおよび単離されたセレクチン結合剤と接触させ、そして前記レセプターと前記セレクチン結合剤との間の結合を被験化合物が阻害する能力を検出する、を含んでなる、セレクチン仲介細胞付着を阻害する能力について被験化合物を測定する方法。

６７、前記結合剤がＳＬχ成分または擬ＳＬＸ　（ＳＬＸ　ｍｉｍｅｔｉｃ）を含んでなる、請求項６６に記載の方法。

６８、前記レセプターまたは結合剤が固体表面上に固定化されている、請求項６６に記載の方法。

６９、前記被験化合物がオリゴ塘または糖接合体である、請求項６６に記載の方法。

７０、請求項６６に記載の方法により同定されたセレクチン仲介細胞付着をブロッキングすることができる化合物を含んでなる医薬組成物。

７１、式：％式％（ここで、Ｒはシアル酸である）を有する配列を含んでなる多糖をフコシル化することを含んでなる、セレクチンレセブターに選択的に結合することができるオリゴ糖成分を含んでなる化合物の製造方法。

７２、前記フコシル化工程がフコシルトランスフェラーゼを使用して寞施される、請求項７１に記載の方法。

７３、群Ｂのストレプトコッカスの多糖がＩａ型多糖である、請求項７２に記載の方法。

７４、前記多Ｗ類が群Ｂのストレプトコッカスの■型である、請求項７２に記載の方法。

７５、セレクチンレセブターに選択的に結合することができる複数の成分をリンカ−成分を使用して一緒に連鎖することを含んでなる、前記成分を含んでなる化合物の製造方法。

７６、前記成分が、式：％式％（）Ｒ１はシアル酸、Ｒ，、（Ｒ，）Ｃ（ＣＯｚ旧−またはシアル酸を含んでなる三糖であり、Ｒ３およびＲ４は同一であるか、あるいは異なり、そして−Ｈｌ−ＣＩ−０８アルキル、−ヒドロキシル置換Ｃｌ−Ｃ８アルキル、−アリール置換Ｃｌ−Ｃ８アルキル、または−アルコキシ置換ｃ１−Ｃ８アルキルであり、そしてａはＯまたは１である）を有する、請求項７５に記載の方法。

７７、前記リンカ−成分が式：ｎおよびｍは同一であるか、あるいは異なり、そして２〜１２の整数であり、ＹはＯまたはＳであり、そしてＷは０．３またはＮＨである）を有する、請求項７５に記載の方法。

７８、前記リンカ一部分が２つの置換基を有する５〜１４員環であり、各置換基は式：％式％）を有し、そして置ａ基はシスまたはトランスの関係にある、請求項７５に記載の方法。

７９、置換基が１．２〜１、（ｐ／２）＋１の配置にあり、ここでｐは５〜１４の整数であり、そして環の大きさに相当する、請求項７５に記載の方法。

国際調査報告１１１＋−一−＾−−一　Ｐσ／＋ＪＳ９１．１０４２８４

Claims

【特許請求の範囲】

１．医薬として許容される担体およびセレクチンレセプターに選択的に結合する成分を含んでなる化合物を含んでなり、前記成分が式：Ｒ１−Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃ−（Ｒ２）■（ここで、Ｒ１はオリゴ糖またはＲ３−Ｒ４−Ｃ（ＣＯ２Ｈ）−であり、Ｒ３およびＲ４は同一であるか、あるいは異なり、そして−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−ヒドロキシルＣ１−Ｃ８アルキル、−アリールＣ１−Ｃ８アルキルまたは−アルコキシＣ１−Ｃ８アルキルであり、Ｒ２はβ１，３Ｇａｌ、αｌ，２Ｍａｎまたはαｌ，６ＧａＩＮａＣであり、そしてａは０または１である）を有する、医薬組成物。
２．前記化合物が生物分子である、請求項１に記載の組成物。
３．前記生物分子がオリゴ糖、オリゴペプチド、タンパク質または脂質である、請求項１に記載の組成物。
４．Ｒ３およびＲ４が４〜８員の環を形成する、請求項１に記載の組成物。
５．４〜８員の環が単糖である、請求項４に記載の組成物。
６．前記単糖がシアル酸である、請求項５に記載の組成物。
７．前記シアル酸がＮｅｕＡｃα２，３またはＮｅｕＧｃα２，３である、請求項６に記載の組成物。
８．前記オリゴ糖がＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβｌ，４ＧｌｃＮＡｃβｌ，３またはＮｅｕＧｃα２，３Ｇａｌβｌ，４ＧｌｃＮＡｃβｌ，３である、請求項１に記載の組成物。
９．前記化合物が多糖である、請求項１に記載の組成物。
１０．前記オリゴ糖が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する反復単位を含んでなる、請求項９に記載の組成物。
１１．前記オリゴ糖が式：を有する反復単位を含んでなる、請求項９に記載の組成物。
１２．前記オリゴ糖が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する反復単位を含んでなる、請求項９に記載の組成物。
１３．前記多糖が群Ｂのストレプトコッカスのフコシル化Ｉａ型多糖である、請求項９に記載の組成物。
１４．前記多糖が群ＢのストレプトコッカスのＩＩ型またはＩＩＩ型の多糖である、請求項９に記載の組成物。
１５．前記多糖が約５，０００〜３００，０００の分子量を有する、請求項９に記載の組成物。
１６．前記多糖が約５〜約２００のフコシル化反復単位を含んでなる、請求項９に記載の組成物。
１７．前記多糖が約２５〜約１００のフコシル化反復単位を含んでなる、請求項１６に記載の組成物。
１８．前記生物分子がスフィンゴリピドである、請求項１に記載の組成物。
１９．前記生物分子がガングリオシドである、請求項１８に記載の組成物。
２０．前記セレクチンレセプターが脈管内皮細胞または血小板上で発現される、請求項１に記載の組成物。
２１．前記セレクチンレセプターがＥＬＡＭ−１またはＧＭＰ−１４０である、請求項２０に記載の組成物。
２２．医薬として許容されうる担体およびセレクチンレセプターに選択的に結合する化合物を有するリボソームを含んでなる医薬組成物。
２３．前記リボソームが抗炎症性化学療法剤を封入している、請求項２２に記載の組成物。
２４．前記抗炎症剤がシクロスポリンＡ、インドメタシン、ナプロキセン、ＦＫ −５０６またはマイコフェノール酸である、請求項２３に記載の組成物。
２５．前記化合物が、式Ｒ１−Ｇａｌβｌ，４（Ｆｕｃαｌ，３）ＧｌｃＮＡｃ−（Ｒ２）■−Ｘ（ここでＲ１はＮｅｕＡｃα２，３、ＮｅｕＧｃα２，３、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ ｌ，４ＧｌｃＮＡｃβｌ，３およびＮｅｕＧｃα２，３Ｇａｌβｌ，４ＧｌｃＮＡｃβｌ，３から成る群より選択され、Ｒ２はβｌ，３Ｇａｌ、αｌ，２Ｍａｎまたはαｌ，６ＧａｌＮＡｃであり、そしてａは０または１であり、そしてＸはタンパク質または脂質である）を有する、請求項２２に記載の組成物。
２６．Ｘが４０，０００〜約２５０，０００ダルトンの分子量を有する糖タンパク質である、請求項２５に記載の組成物。
２７．Ｘが約６００〜約４，０００ダルトンの分子量を有するである、請求項２５に記載の組成物。
２８．前記化合物が式：ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβｌ，４（Ｆｕｃαｌ，３）ＧＩｃＮＡｃ−（Ｒ）■ −、ＮｅｕＧｃα２，３Ｇａｌβｌ，４（Ｆｕｃαｌ，３）ＧｌｃＮＡｃ−（Ｒ）■−およびＮｅｕＧｃα２，３Ｇａｌβｌ，４ＧｌｃＮＡｃβｌ，３Ｇａｌβ ｌ，４（Ｆｕｃαｌ，３）ＧｌｃＮＡｃ−（Ｒ）■−（ここで、Ｒはβｌ，３Ｇａｌ、αｌ，２Ｍａｎまたはαｌ，６Ｎａｃであり、そしてａは０または１である）を有する部分からなる、請求項２２に記載の組成物。
２９．前記セレクチンレセプターが脈管内皮細胞または血小板上で発現される、請求項２２に記載の組成物。
３０．医薬として許容される担体およびセレクチンレセプターに選択的に結合する化合物を含んでなり、前記化合物は、式Ｒ１−Ｇａｌβｌ，４（Ｆｕｃαｌ，３）ＧｌｃＮＡｃ−（Ｒ２）■−Ｘ（ここで、Ｒ１はオリゴ糖またはＲ２−Ｒ４−Ｃ（ＣＯ２Ｈ）−であり、Ｒ３およびＲ４は同一であるか、あるいは異なり、そして−Ｈ、−低級アルキル（Ｃ１−Ｃ８）、 −ヒドロキシル低級アルキル、−アリールアルキルまたは−アルコキシアルキルであり、そしてＲ２はβｌ，３Ｇａｌ、αｌ，２Ｍａｎまたはαｌ，６ＧａｌＮａｃであり、そしてａは０または１であり、そしてＸは−Ｈ，−ＯＨ，−ＮＨ３，−ＮＨＲ３，−ＮＲ３Ｒ４，−ＯＲ２、Ｏアリール、−Ｏアルキルアリール、−Ｏアリールアルキル、−Ｒ３、−アリール、−アリールアルキルおよび−アルキルアリールから成る群より選択される）を有する、医薬組成物。
３１．前記化合物が式：ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβｌ，４（Ｆｕｃαｌ，３）ＧｌｃＮＡｃ−（Ｒ）■ 、ＮｅｕＧｃα２，３Ｇａｌβｌ，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃ−（Ｒ） ■およびＮｅｕＧｃα２，３Ｇａｌβｌ，４ＧｌｃＮＡｃβｌ，３Ｇａｌβｌ，４（Ｆｕｃαｌ，３）ＧｌｃＮＡｃ−（Ｒ）■（ここでＲはβｌ，３Ｇａｌ、αｌ，２Ｍａｎまたはαｌ，６Ｎａｃであり、そしてａは０または１である）を有する、請求項３０に記載の組成物。
３２．医薬として許容される担体およびセレクチンレセプターに選択的に結合することができる２またはそれ以上の反復単位を有する化合物を含んでなり、前記反復単位がセレクチン結合性成分を含んでなりそしてリンカー部分により連鎖されており、各反復単位は式：Ｒ１−Ｇａｌβｌ，４（Ｆｕｃαｌ，３）ＧｌｃＮＡｃ−（Ｒ２）■−Ｘ（ここで、Ｒ１はオリゴ糖またはＲ３−Ｒ４−Ｃ（ＣＯ２Ｈ）−であり、Ｒ３およびＲ４は同一であるか、あるいは異なり、そして−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−ヒドロキシルＣ１−Ｃ８アルキル、−アリールＣ１−Ｃ８アルキルまたは−アルコキシＣ１−Ｃ８アルキルであり、Ｒ２はβｌ，３Ｇａｌ、αｌ，２Ｍａｎまたはαｌ，６ＧａｌＮａｃであり、そしてａは０または１であり、そしてＸはリンカー成分である）を有する、医薬組成物。
３３．前記リンカー成分が式： ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼ （ここで、ｎおよびｍは同一であるか、あるいは異なり、そして２〜１２の整数であり、ＹはＯまたはＳであり、そしてＷはＯ，ＳまたはＮＨである）を有する、請求項３２に記載の組成物。
３４．前記リンカー部分が２つの置換基を有する５〜１４員環であり、各置換基は式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで（ＹはＯまたはＳである）を有し、そして置換基はシスまたはトランスの関係にある、請求項３２に記載の組成物。
３５．前記置換基が１，２〜１、（ｐ／２）＋１の配置にあり、ここでｐは５〜１４の整数であり、そして環の大きさに相当する、請求項３４に記載の組成物。
３６．医薬として許容される担体および２つの窒素原子および２つのセレクチン結合性成分を有する複素環化合物を含んでなり、各成分は窒素原子の１つに連鎖されており、そして式：Ｒ１−Ｇａｌβｌ，４（Ｆｕｃαｌ，３）ＧｌｃＮＡｃ −（Ｒ２）■（ここで、Ｒ１はオリゴ糖またはＲ３−Ｒ４−Ｃ（ＣＯ２Ｈ）−であり、Ｒ３およびＲ４は同一であるか、あるいは異なり、そして−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−ヒドロキシルＣ１−Ｃ８アルキル、−アリールＣ１−Ｃ８アルキルまたは−アルコキシＣ１−Ｃ８アルキルであり、Ｒ２はβｌ，３Ｇａｌ、αｌ，２Ｍａｎまたはαｌ，６ＧａｌＮａｃであり、そしてａは０または１である）を有する、医薬組成物。
３７．前記複素環化合物がピペラジンまたはホモピペラジンである、請求項３６に記載の組成物。
３８．医薬として許容される担体および：ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβｌ，４（Ｆｕｃαｌ，３）ＧｌｃＮＡｃ−（Ｒ）■−、ＮｅｕＧｃα２，３Ｇａｌβｌ，４（Ｆｕｃαｌ，３）ＧｌｃＮＡｃ−（Ｒ）■−およびＮｅｕＧｃα２，３Ｇａｌβｌ，４ＧｌｃＮＡｃβｌ，３Ｇａｌβｌ，４（Ｆｕｃαｌ、３）ＧｌｃＮＡｃ−（Ｒ）■を有し（ここでＲはβｌ，３Ｇａｌ、αｌ，２Ｍａｎまたはαｌ，６Ｎａｃであり、そしてａは０または１である）から成る群より選択されるセレクチン結合性オリゴ糖成分の連鎖したアミノ酸を含んでなる医薬組成物。
３９．前記アミノ酸がリジン、ホモリジン、オルチニン、ジアミノ酪酸、アスパラギンまたはジアミノプロピオン酸である、請求項３８に記載の組成物。
４０．前記アミノ酸がオリゴペプチドの中に組み込まれている、請求項３８に記載の組成物。
４１．前記オリゴペプチドが次のものの１つまたは２つ以上を含んでなる：リジン、ホモリジン、オルチニン、ジアミノ酪酸、アスパラギンまたはジアミノプロピオン酸、請求項４０に記載の組成物。
４２．前記オリゴペプチドが次のものの１つまたは２つ以上を含んでなる：アラニン、チロシンまたは放射性ヨウ化チロシン、請求項４１に記載の組成物。
４３．前記オリゴペプチドが、Ｎ末端からＣ末端の方向において、▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼ （ここでＲ１およびＲ２は同一であるか、あるいは異なり、そして任意のアミノ酸残基であり、そしてＬはオリゴ糖部分である）を含んでなる、請求項４０に記載の組成物。
４４．医薬として許容される担体およびセレクチン細胞表面レセプターにより認識されるオリゴ糖のリガンドに選択的に結合することができる免疫グロブリンを含んでなり、前記免疫グロブリンが炎症状態を処置するために十分な量で存在する、医薬組成物。
４５．前記リガンドが式：ＮｅｕＡｃα２，３０ａｌβｌ，４（Ｆｕｃαｌ，３）ＧｌｃＮＡｃ−（Ｒ）■ −、ＮｅｕＧｃα２，３Ｇａｌβｌ，４（Ｆｕｃαｌ，３）ＧｌｃＮＡｃ−（Ｒ）■−およびＮｅｕＧｃα２，３Ｇａｌβｌ，４ＧｌｃＮＡｃβｌ，３Ｇａｌβ ｌ，４（Ｆｕｃαｌ，３）ＧｌｃＮＡｃ−（Ｒ）■−（ここでＲはβｌ，３Ｇａｌ、αｌ，２Ｍａｎまたはαｌ，６Ｎａｃであり、そしてａは０または１である）から成る群より選択される、請求項４４に記載の組成物。
４６．前記オリゴ糖部分が白血球により発現される、請求項４４に記載の組成物。
４７．前記セレクチンレセプターが脈管内皮細胞または血小板により発現される、請求項４４に記載の組成物。
４８．前記セレクチンレセプターがＥＬＡＭ−１またはＧＭＰ−１４０である、請求項４４に記載の組成物。
４９．前記組成物が単位投与形である、請求項４４に記載の組成物。
５０．医薬として許容される担体およびセレクチンレセプターに選択的に結合する成分を含んでなる化合物を含んで、前記成分が式：Ｒ１−Ｇａｌβ１，４（Ｒ２）ＧＩｃＮＡｃ−（Ｒ３）■−（ここで、Ｒ１はＮｅｕＡｃα２，３、ＮｅｕＧｃα２，３、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ ｌ，４ＧｌｃＮＡｃβｌ，３またはＮｅｕＧｃα２，３Ｇａｌβｌ，４ＧｌｃＮＡｃβｌ，３であり、Ｒ２はＦｕｃαｌ，３、Ａｒａαｌ，３、（Ｒ，Ｓ）−５ −アルキル−Ａｒａαｌ，３および（Ｒ，Ｓ）−５−アリール−Ａｒａαｌ、３であり、そしてＲ３は１，３βＧａｌ、１，２αＭａｎおよび１，６αＧａｌＮＡｃであり、そしてａは０または１である）を有する、医薬組成物。
５１．前記化合物が生物分子である、請求項５１に記載の組成物。
５２．前記成分が脈管内皮細胞または血小板上で発現されたセレクチンレセプターに結合する、請求項５１に記載の組成物。
５３．前記セレクチンレセプターがＥＬＡＭ−１またはＧＭＰ−１４０である、請求項５１に記載の組成物。
５４．患者に療法的に有効投与量の、医薬として許容される担体およびセレクチンレセプターに選択的に結合する化合物を含んでなる俵薬組成物を投与することを含んでなる、患者におけるセレクチン仲介細胞間付着を阻害する方法。
５５．前記化合物がセレクチンレセプターに選択的に結合する成分を含んでなり、前記成分が式：Ｒ１−Ｇａｌβｌ，４（Ｆｕｃαｌ，３）ＧｌｃＮＡｃ−（Ｒ２）■（ここで、Ｒ１はオリゴ糖またはＲ３−Ｒ４−Ｃ（ＣＯ２Ｈ）−であり、Ｒ３およびＲ４は同一であるか、あるいは異なり、そして−Ｈ、−低級アルキル（Ｃ１−Ｃ８）、 −ヒドロキシル低級アルキル、−アリールアルキルまたは−アルコキシアルキルであり、そしてＲ２はβｌ，３Ｇａｌ、αｌ，２Ｍａｎまたはαｌ，６ＧａｌＮａｃであり、そしてａは０または１である）を有する、請求項５５に記載の方法。
５６．前記組成物が生物分子である、請求項５５に記載の方法。
５７．前記細胞間の付着が炎症性状態に関連する、請求項５５に記載の方法。
５８．前記炎症性状態が敗血症性ショックである、請求項５８に記載の方法。
５９．前記炎症性状態が急性呼吸困難症候群および創傷に関連するセプシスである、請求項５８に記載の方法。
６０．前記細胞間の付着が転移に関連する、請求項５５に記載の方法。
６１．前記セレクチンレセプターが内皮細胞への白血球、単球または好中球の付着を仲介する、請求項５５に記載の方法。
６２．前記セレクチンレセプターがＥＬＡＭ−１またはＧＭＰ−１４０である、請求項５５に記載の組成物。
６３．前記化合物がリボソームの中に封入されている、請求項５５に記載の方法。
６４．前記化合物が多糖である、請求項５５に記載の方法。
６５．患者に療法的に有効投与量のセレクチンレセプターに選択的に結合する化合物を投与することを含んでなり、前記化合物が、式：Ｒ１−Ｇａｌβｌ，４（Ｆｕｃαｌ，３）ＧｌｃＮＡｃ−（Ｒ２）■−Ｘ（ここで、Ｒ１はオリゴ糖またはＲ３−Ｒ４−Ｃ（ＣＯ２Ｈ）−であり、Ｒ２およびＲ４は同一であるか、あるいは異なり、そして−Ｈ、−低級アルキル（Ｃ１−Ｃ８）、 −ヒドロキシル低級アルキル、−アリールアルキルまたは−アルコキシアルキルであり、そしてＲ２はβｌ，３Ｇａｌ、αｌ，２Ｍａｎまたはαｌ，６ＧａｌＮａｃであり、そしてａは０または１であり、そしてＸは生物分子である）を有する、患者におけるセレクチンレセプターにより仲介される炎症性疾患の過程を処置する方法。
６６．Ｘがオリゴ糖、オリゴペプチド、タンパク質または脂質である、請求項６６に記載の方法。
６７．前記セレクチンレセプターがＥＬＡＭ−１またはＧＭＰ−１４０である、請求項６６に記載の組成物。
６８．工程：被験化合物をセレクチンレセプターおよび単離されたセレクチン結合剤と接触させ、そして前記レセプターと前記セレクチン結合剤との間の結合を被験化合物が阻害する能力を検出する、を含んでなる、セレクチン仲介細胞付着を阻害する能力について被験化合物を測定する方法。
６９．前記結合剤がＳＬＸ成分または擬ＳＬＸ（ＳＬＸ　ｍｉｍｅｔｉｃ）を含んでなる、請求項６９に記載の方法。
７０．前記レセプターまたは結合剤が固体表面上に固定化されている、請求項６９に記載の方法。
７１．前記被験化合物がオリゴ糖または糖接合体である、請求項６９に記載の方法。
７２．請求項６９に記載の方法により同定されるセレクチン仲介細胞付着をブロツキングすることができる化合物を含んでなる医薬組成物。
７３．式：Ｒ−Ｇａｌβｌ，４ＧｌｃＮＡｃ− （ここでＲはシアル酸である）を有する配列を含んでなる多糖をフコシル化することからなる、セレクチンレセプターに選択的に結合することができるオリゴ糖成分を含んでなる化合物を調製する方法。
７４．前記フコシル化工程がαｌ，３フコシルトランスフェラーゼを使用して実施される、請求項７４に記載の方法。
７５．群Ｂのストレプトコツカスの多糖がＩａ型多糖である、請求項７４に記載の方法。
７６．前記多糖が群ＢのストレプトコッカスのＩＩ型またはＩＩＩ型である、請求項７４に記載の方法。
７７．セレクチンレセプターに選択的に結合することができる複数の部分をリンカー成分を使用して一緒に連鎖することからなる、前記成分を含んでなる化合物を調製する方法。
７８．前記部分が、式：Ｒ１−Ｇａｌβｌ，４（Ｆｕｃαｌ，３）ＧｌｃＮＡｃ−（Ｒ２）■（ここで、Ｒ１はオリゴ糖またはＲ３−Ｒ４−Ｃ（ＣＯ２Ｈ）−であり、Ｒ３およびＲ４は同一であるか、あるいは異なり、そして−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−ヒドロキシルＣ１−Ｃ８アルキル、−アリールＣ１−Ｃ８アルキルまたは−アルコキシＣ１−Ｃ８アルキルであり、Ｒ２はβｌ，３Ｇａｌ、αｌ．２Ｍａｎまたはαｌ，６ＧａｌＮａｃであり、そしてａは０または１である）を有する、請求項７８に記載の方法。
７９．前記リンカー成分が式： ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼ （ここでｎおよびｍは同一であるか、あるいは異なり、そして２〜１２の整数であり、ＹはＯまたはＳであり、そしてＷはＯ，ＳまたはＮＨである）を有する、請求項７８に記載の組成物。
８０．前記リンカー成分が２つの置換基を有する５〜１４員の環であり、各置換基は式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで（ＹはＯまたはＳである）を有し、そして置換基はシスまたはトランスの関係にある、請求項７８に記載の組成物。
８１．前記置換基が１，２〜１、（ｐ／２）＋１の配置にあり、ここでｐは５〜１４の整数であり、そして環の大きさに相当する、請求項７８に記載の組成物。