JPH05505304A

JPH05505304A - 酵素加水分解物の製造方法

Info

Publication number: JPH05505304A
Application number: JP91501797A
Authority: JP
Inventors: ローサン、ピエール、シー．; ブレッソリエール、フィリップ、アール．; ジュリアン、レイモンド、エー．; プジョアン、クロード、エイチ．; ヴェルニーユ、ベルナルド、ジー．
Original assignee: テッセンデルロ　ケミ　エヌ．ヴィー．
Priority date: 1990-01-12
Filing date: 1991-01-11
Publication date: 1993-08-12
Also published as: WO1991010369A1; ATE123925T1; EP0511970B1; US5356637A; DE69110663D1; BE1003298A3; EP0511970A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】酵素加水分解物の製造方法本発明はタンパク質分解酵素を用いてジペプチドとトリペプチドを含有する酵素加水分解物をタンパク質混合物から製造する方法に関する。

本発明の主題はまたジペプチドとトリペプチドが豊富な加水分解物である。

ジペプチドとトリペプチドが豊富であり、遊離アミノ酸含量が低い加水分解物の重要性は数多くの科学研究によって広く認識されている。

ジペプチドとトリペプチドの腸内吸収が生理学的に重要である事が見出されたのは今から約１３年前である。遊離アミノ酸のための腸内輸送システムとは異なった別の腸内輸送システムが小分子量のペプチドの為に存在すること、小分子量のペプチドが豊富に存在する混合食物からタンパク質の供給が得られる際、吸収効果がより大きいということが、スライ七ンガーら（ＳＬＥＩＳＥＮＧＥＲｅｔ　ｉｆ、）の論文“インビトロでのハムスターの空腸によるジペプチドとトリペプチドの吸収のための単一共通キャリヤーの証拠”　〔学会誌“ガストロエンテロロジー（Ｇａｓｔｒｏ＠ｎ＋ｓｒｏｌｏｇｙ）　”　、　７１巻・７６〜７８頁（１９７６））の中に示されている。

ジペプチドとトリペプチドが豊富な組成物は、幼児、病気回復者、貧血の人々への栄養補給ばかりでなく、腸内吸収に異常の認められる。６者、例えば、ハートナツプ病、又はシスチン尿症患者のための栄養補給をなす食事療法において多大な関心を集めている。

ハートナツプ病を患っている者ばかりでなくシスチン尿症を患っている者でも、アミノ酸がジペプチド状で存在するならば腸粘膜によって正常に吸収される。〔アール、アール、ブリンジン（ＢＲＴＮＳＯＮ、Ｒ，Ｒ，）　；ニス、ケイ。ハヌマンツ（ＨＡＮＵＭＡＮＴＨＵ、　Ｓ、に、　）とダブリニラ。エム、ビッツ（ＰＩＴＴＳ、Ｗ、Ｍ、）　（１９８９）：　″ペプチドを用いた腸用のフオーミュラの再評価：臨床応用”、二ニートリッジ５ナルインクリニカルプラクチス（Ｎｕ４ｒｉｊｉｏｎａｌ　ｉｎ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ）　４　：　２１１−２１７；およびエフ、ナヤブ（ＭＡＹＡＢＵ、　Ｆ、　）とエイ、エム、アサトオア（ＡＳＡＴＯＯＲ，Ａ、Ｍ、）　（１９７０）　：　“ハートナツプ病患者のアミノ酸とジペプチドの腸内吸収についての研究“ガツト（ＣＵＴ）　：ジャーナルオブザブリティッシュササイアティ　フォーガストロエントロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂｒ１ｔｉｓｈ　５ｏｃｉｅ＋７　ｆｏｒ　Ｇｍｒｌｒａｅｎｔｏｌｏｇ７）　１１巻、３３７−３７９頁（１９７０）を参照〕。

特に、人工栄養物を口から、又は、腸内もしくは腸外、特に静脈点滴による投与に用いることができる。

事故による身体損傷、外科手術、食道の損傷による機能不全のため、もしくは正常な食物摂取が不可能な一般の生理状態（昏睡状態、火傷）の理由で食物を正常に摂取することが出来ない患者にとっては人工栄養は必要不可欠である。

他の可能な利用例としては、免疫刺激もしくは動物栄養食、特に魚の餌、または成長刺激剤としての用途が挙げられる。

ジペプチドとトリペプチドを含有するタンパク質加水分解物の調製法として種々の方法が知られている。即ち、アルカリまたは酸による加水分解、酵素による加水分解、化学合成法などの方法が知られている。しかしながら、これらの公知の方法では、いづれも、動物性および／または植物性タンパク質から７５モル％以上のジペプチドとトリペプチドを含む加水分解物を調製することができない。

工業規模で加水分解物を製造するために使用できるタンパク質は例えば、次の通りである。

−卵タンパク（卵白アルブミン） −乳タンパク、即ち、カゼイン、乳清、ラクトアルブミン、ラクトアルブミンなど −採血含有タンパク質：血漿、血清アルブミン、脱色ヘモグロビンなど −水産漁業製品、および急告詰め製品 −植物性タンパク質°即ち、大豆、ムラサキャマゴヤシタンパク質など強酸または強塩基を用いて、ラクトアルブミン、卵白アルブミン、乳清、およびカゼインなどのようなタンパク質の混合物を高温でアルカリ加水分解もしくは酸加水分解を行ない化学結合を切断する。この方法では、遊離アミノ酸含有量が大で、除去が困難な塩類（ＣＩ″″、Ｎａ”）がしばしば多量に混入した混合物が製造される。

公知の化学的方法は実施し易く、多数のペプチド結合を切断することによって、高レベルの加水分解が可能である。しかし、この化学的方法は過激であり、必須アミノ酸を分解するので、タンパク質の栄養価を低下させるだけでなく、望ましくない副反応も引き起こす。

このように、高温（１００〜１１０℃）でのアルカリ加水分解では、しばしば毒性の強い副生成物のリシノアラニンが生成する。さらに、目的生成物の加水分解の程度を制御することが困難である。

酵素加水分解に使用されるタンパク質分解酵素はバクテリア、菌類、動物および／又は植物に由来する酵素である。

これら酵素の一種または複数種が上記タンパク質の一種または複数種に作用すると、ジペプチドとトリペプチドを５０％以下含んだ加水分解物が得られる。

例えば、トリペプチドより大分子量のポリペプチドやジペプチドとトリペプチドを１０〜５０重量％含有する酵素タンパク質加水分解物から、ジペプチドとトリペプチドをクロマトグラフによって抽出して、人工栄養物や食事療法用食品に使用できるジペプチドとトリペプチドを豊富に含有するペプチド混合物を製造する方法は、特許公報ＥＰ−Ａ−０，２７４，９３９に開示され公知である。

酵素加水分解の基質は、例えば、卵、ミルク、採取血液および／又は大豆もしくはムラサキャマゴヤシ由来のタンパク質といった一種あるいは複数種の動物又は植物性タンパク質からなる。酵素加水分解物は限外濾過により精製され、精製された加水分解物はイオン交換樹脂カラムに入れ、混合物中のジペプチドとトリペプチドの割合を増加させる。

酵素の混合物を使用しているにも拘らず、イオン交換樹脂カラム中で濃縮していない酵素加水分解物は、５０％以下のジペプチドとトリペプチド、７％以上の遊離アミノ酸、及び過剰％のイオンを含有する。（上記特許公報第８頁第１表を参照）。

酵素加水分解物は、陽イオン交換樹脂カラムで精製して、混合物中のジペプチドとトリペプチドの割合を増加させ、塩濃度を減少させる。このジペプチドとトリペプチドの割合を増加させる工程は、生産物の収量を減らすだけでなく、面倒で、費用がかかるという欠点を有する。

特許公報ＥＰ−Ａ−０，１４８，０７２には、人間や動物にとって嗜好性の高い風味と味を有する栄養物として適したタンパク質加水分解物を得る為の血漿タンパク質の分解方法が記載されている。この方法では、加水分解の基質として使用される血漿は、抗凝血剤存在下で採取全血液を遠心分離して得る。遠心分離によって、遠心管の中には、黄色の上層の血漿と赤い下層の血餅が得られる。

加水分解に先立ち７０〜１００℃において、ｐＨ５〜７を維持したまま、３０分未満の時間でタンパク質の熱処理を行い、血漿のタンパク質変性を行なう。この処理で加水分解物収量が増加する。

次に、ｐＨ５〜７，８０℃以下の温度、カルシウムイオン存在下で、サーモリシンを加えた水性反応媒体に血漿タンパク質を加えて、血漿タンパク質の加水分解が行なわれる。

５０〜６０℃の温度条件下で行なえば、好中温性（ｍｅｓｏｐｂｉｌｉｃ）バクテリアの増殖を抑制できる。

酵素の選択と加水分解条件を細かに調整することで、所望される所定の分子量のペプチドが得られる。

この公知の方法の欠点は、なかでも、タンパク質加水分解より得られるジペプチドとトリペプチドの重量収量の低さである。実際、バイオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）Ｐ６を用いた加水分解物の濾過により、分子量２０００未満のペプチド、すなわち遊離アミノ酸と、２〜１０個のアミノ酸を含んだペプチドの混合物で、ジペプチドとトリペプチド含量が非常に低いペプチドの混合物の存在が認められる。人工栄養物として、３個を越えるアミノ酸からなるペプチドは上述の吸収性で動的利益を与えることはない。

本発明の主題は、タンパク質分解酵素の存在下でタンパク質混合物からジペプチドとトリペプチドを豊富に含有する酵素加水分解物を製造する方法にして、出発タンパク質混合物をコンディショニングのために熱処理にかけ、コンディショニングされたタンパク質混合物を酵素加水分解し、得られた加水分解物を固液分離によって抽出し、該加水分解物から、分子量１０，０００を越えるペプチド並びに部分加水分解可溶性のタンパク質を限外濾過により除去した後、殺菌および乾燥のための処理にかけることを特徴とする酵素加水分解物の製造方法にある。

本発明の本方法は、例えば、７０重量％以上のタンパク質をジペプチドとトリペプチドを７５モル％以上含んだペプチド断片に変えることができるという利点を有する。

タンパク質の熱処理は、熱がタンパク質本来の構造を保つのに重要な役割を果している結合力の弱い部分に作用し、タンパク質の三次元構造を変えてしまう。その三次元構造の破壊によって、−次元構造を構成しているペプチド結合の露出量が増加し、基質の酵素への接近が容易になる。

本発明の一つの態様によると、墓質すなわちタンパク質混合物を水に溶解させて得られる溶液を７０〜１００℃の温度範囲で好ましくは４５分未満の時間、初期ｐＨ値のまま、又は酸性もしくは中性付近のｐＨで熱処理してタンパク質の懸濁液を作り、タンパク質懸濁液を最後にタンパク質分解酵素の存在下で加水分解する。基質すなわちタンパク質混合物を水中に溶解して得られるタンパク質水溶液をその基質すなわちタンパク質濃度が１００　ｇ／Ｑ未満、特に約７０ｇ／α（ＮＸ６．２５）　となるように調製することが好ましい。熱処理は好ましくは、３０〜４５分間行う。加水分解はｐＨ値６．５〜９、特に７〜７．５．５０〜６０℃の温度範囲で５時間〜９時間の条件下で行うことが好ましい。

加水分解はｐＨｔが６．５〜９で行なうことができるが、ｐＨ値７〜９の間で行なうのが好ましい。

本発明の方法は、多様なタンパク質源に適用できる。すなわち、採取血液タンパク質：カゼイネート、乳清、α−ラクトアルブミン、β−ラクトアルブミンなどの乳タンパク質；大豆、エントウ豆及び／又は小麦タンパク質、魚単離物、卵白タンパク質等のさまざまなタンパク源に適用できる。

本発明の方法の具体例をあげると、動物の血液を４ｇ／Ｑ未満の抗凝血剤を添加して採集し、遠心分離して、即使用可能な血液製剤、あるいは凍結保存、散布乾燥による乾燥に適した血液製剤を得る。次に、血漿を、例えばｐＨ４，５〜５の酸性ｐＨに調節した後７０℃〜８０℃の温度範囲で４５分未満好ましくは３０〜４５分間熱処理し、次に正接的なミクロ濾過、もしくは遠心分離により又は加圧もしくは真空下で濾過（好ましくはフィルタープレスで濾過）により固液分離を行い、再懸濁後にタンパク質分解酵素の存在下で最終的に加水分解される熱凝結固形物質を得る。

加水分解で使用される酵素は、アルカリ性の媒体中で使用できるプロテアーゼ、特にセゾン含有アルカリプロテアーゼが好ましく、その具体例としてはバシラス　リヘニフォルミスサブチリジン〔ベスカラーゼ（ｐｅｓｃａｌａｓｅ）　、ギストブロカーデス（Ｇｉｓｔ　Ｂｒｏｃａｄｅｓ）社製：及びアルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）　、ノボ（ＮＯＶＯ）社製〕、バシラスサチリスサブチリジン〔オリエンターゼ１００　（Ｏｒｉｅｎｔａｓｅ）　、日本国阪急社製〕、バシラスアミロクファシエンスサブチリジン〔サブチリジンＢＰＮ’、カールスペルグレスエム（Ｃａｒｌｓｂｅ＋ｇ　Ｒｅｓ、Ｃｏｍｎｕｎ、）第４１巻、第５号、第２３８−２４１頁、１９７６、アイ　ピースベンドセン（１，Ｂ、５ＶＥＮＤＳＥＮ）　）を挙げることができる。　本発明の方法を使用することにより、ジペプチドおよびトリペプチドを豊富に含有する加水分解物であって、マイルドな風味を有し且つ美味である微粉、好ましくは白色の微粉状であり、且つ以下の成分ニー　ジペプチドとトリペプチドを７５モル％以上、−アミノ酸を５モル％未満 −３個を越えるアミノ酸からなり且つ平均鎖長が約６．２であるペプチドを２０モル％未満を含有することを特徴とする加水分解物を調製することが可能となった。動物および／又は植物性のタンパク質を出発材料として用いて単なる加水分解を行ない加水分解物を調製することは今までになし得なかったことである。

さまざまな基質に関連した本発明の特徴および詳細を次に例示するが、これらの例は本発明を限定するものでない。

下記の実験は工業化を想定した装置（２０−３００リツトルの反応装置）で、試験的な規模で行なわれる。使用されるタンパク源は下記に示すように調製される。

１、動物血液血漿血液は、赤血球、白血球、血小板といった血液構成成分が懸濁している血漿と呼ばれる液体で構成される。抗凝血剤を添加してから遠心分離を行なうと一方では血漿（６０〜６５容量％）が、他方では血餅を構成している血液構成成分（３５〜４０容量％）が回収される。

採取血液から本発明の組成物を調製する方法は、次の四つの不可欠な工程を包含する。

不可欠な工程：１、動物の血漿のコンディショニング、２、酵素による加水分解、３、ジペプチドとトリペプチドを多量に含む両分の抽出と精製、および４、ジペプチドとトリペプチドを多量に含む画分の殺菌と乾燥。

１、動物血漿のコンディショニング屠殺場にて屠殺動物の全血を抗凝血剤の存在下に採取する。

抗凝血剤としては４ｇ／Ｑ以下のシュウ酸、クエン酸、又はポリリン酸のカリウム塩又はナトリウム塩を加える。次にこの血液を遠心分離にかける。

こうして得た血漿をそのまま直ぐに用いてもよいし、即座に凍結するか乾燥させて保存し、後の使用に供してもよい。

凍結又は散布乾燥した血漿は約７０ｇ／Ｑ　（Ｎｘ６．２５）濃度に再溶解した後、ｐＨ値を６未満に調整し、６５℃を越える温度に加熱する。条件は血漿タンパク質の沈澱が最大となるように選択する。

好ましくは、動物血漿のｐＨ値を食品用強酸（ＨＣＩ、Ｈ２ＳＯ４、好ましくは４〜６　Ｎ　Ｈ３Ｐ　Ｏ４）を用いて４．５〜５．０に下げ、タンパク質溶液の温度を約３０分未満の間に７０℃に上げ、この温度を３０分間維持した後、急激に（５〜１０分間で）約２０℃に下げる。次に、９５重量％のタンパク質窒素を、平均タンパク質含量１６０〜２２０　ｇ／ｋ　ｇの凝固物の形で回収する。

リン酸イオンは二価の陽イオン、特に、酵素加水分解などに用いられるＣａ（ＯＨ）ｚアルカリによって提供される二価の陽イオンと不溶性沈澱物を形成する性質があるので、一般にリン酸を動物血漿のｐＨ値の低減に用いる。こうして、予備的な基質のコンディションユング段階でリン酸を用いることにより、最終製品中のカルシウムレベルを大幅に下げることができる。

熱処理の後、血漿の固液分離を行う。

固液分離は正接的なミクロ濾過、遠心分離又はフィルタープレス濾過により行う。現在のところ、プレートとフレームを含むフィルタープレスでの濾過が最もよい結果が得られる。

この熱処理と固液分離には次のような利点がある。

−基質の酵素への接近性を増大する； −プロテアーゼ阻害因子の大部分を破壊する；−好中温性の雑菌が大幅に減る；一遊離アミノ酸や他の非タンパク質性低分子（脂質、糖、尿素など）が除去される；一瀘過や遠心分離を用いた固液分離によるイオンの除去によってタンパク質／基質溶液のイオン強度が下がる。

部分的に脱塩したタンパク質凝固物は直ぐに酵素反応器にて使用するか、さもなければ、冷凍機にて一２０℃で保存する。

２、酵素加水分解Ａ、酵素（プロテアーゼ）の選択加水分解に用いるプロテアーゼとしては、血漿タンパク質の酸性媒体中の可溶化度（トリクロロ酢酸中１００ｇ／Ω濃度のタンパク質のうちの酸への可溶分の、加水分解を行ったタンパク質総量への割合）が９０％を越え、かつ、ジペプチドとトリペプチドのモル濃度がジペプチドとトリペプチドを豊富に含有する画分の７５モル％以上となるものであればよい。

最も適したプロテアーゼは、カールスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）のスブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）（ＥＣ３，４，４，１６）を主成分とする、バシラス　リへエフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のセリン含有のアルカリプロテアーゼ型のものである。

例えば、アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）２．　４　１（ＮＯＶＯ社）又はペスカラーゼ（Ｐｅｓｃａｌａｓｅ）５６０（Ｇ　Ｉ　ＳＴ　ＢＲＯＣＡＤＥＳ社）のような工業用のタンパク質分解酵素を用いることができる。

１）Ｈ値７〜９、好ましくは７．０〜７．５を得るためには、ウシ血漿加水分解反応にアルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ、登録商標）（ＮＯＶｏ社）かベスカラーゼ（Ｐｅｓｃａｌａｓｅ、登録商標）（ＧＩＳＴ　ＢＲＯＣＡＤＥＳ社）を用いるのが望ましい。尚、これらの比較的中性ｐＨに近いｐＨ値においては、タンパク質分解中にｐＨを維持するために必要なアルカリの量が、アルカリ性ｐＨ値（８〜９）における場合よりかなり少なくてすむ。製造工程の最終段階でイオンを除去するのが困難であることを考えると、このことは見のがすべきではない。

加水分解反応中にｐＨ値を維持するためのアルカリとしては、ＫＯＨ，Ｃａ　（ＯＨ）ｚ、ＮａＯＨなど種々多様のものが使用できる。加水分解物のイオン強度を抑えるためには、ｐＨの調節と維持に用いるアルカリとしては一般に石灰［Ｃａ　（ＯＨ２）　］が用いられる。

最適の反応温度は５０〜６０℃であり、この範囲では、タンパク質分解が迅速に進み、かつ、酵素の変性が最小限に抑えられる。

この際、反応温度を６０℃とすると反応時間を短縮でき（５０℃では９時間要するが、５時間ですむ）、その上さらに重要なことに、加水分解中の細菌の増殖を抑制できる。

中性又は実質的に中性のｐＨ（７〜７．５）と５０〜６０℃の温度を組合せ、プロテアーゼとしてアルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ、登録商標）（ＮＯＶＯ社）かペスカラーゼ（Ｐｅｓｃａｌａｓｅ、登録商標）（ＧＩＳＴ　ＢＲＯＣＡＤＥＳ社）を用い、反応時間を５〜９時間とすると、酸性媒体中の血漿タンパク質可溶化度が９０％を越え、また、ジペプチド及びトリペプチドのレベルを７５％以上とすることができる。

重量比は下記式によってめられる。

酵素の量（Ｅ）　ＥＸ　１００　＝　−％タンパク質基質の量（Ｓ）　Ｓ上記式中、酵素の量は反応媒体中に導入された工業用酵素であるアルカラーゼ又はベスカラーゼの量に等しい。基質の量は反応器に導入された血漿タンパク質の量に等しい。基質の量はケルプール法（Ｋｉｅｌｄｉｈｌ　ｍ５ｔｈｏｄ）（窒素量ｘ６．２５）で測定する。

酵素とタンパク質基質の重量比は１〜４％となるべきである。

尚、反応器中のタンパク質基質の濃度は、媒体の均一性を保ちながら、最大となるべきである。

例えば、Ｅ／Ｓ比を２％とし、基質濃度を約９０　ｇ　／　Ｑとするのが最適のようである。

Ｂ、酵素の破壊タンパク質分解反応が完了したとみなされる時点で食品用強酸（ＨＣ１＋　Ｈ２Ｓ　ｏ４．　Ｈ３ＰＯ２など）、好ましくはＨ３Ｐ０．を添加してｐＨ値を５．５〜６．５の範囲に下げることによって酵素の破壊を行なう。

媒体のｐＨ値を下げるとともに温度を上げることが最も好ましい。

温度は７０〜８０℃の範囲に急激に（１０〜２０分間で）上ｉｆてから５〜４５分間維持する。この熱処理の後、媒体の温度を１５〜２０℃の範囲に急激に下げる。

好ましくは、ｐＨ値を６．５に下げ、温度を８０℃で２０分間維持する。この特殊な操作条件によって、確認テストで検出可能ないかなる活性の痕跡も残さずにプロテアーゼを完全に破壊すると共に、リシノアラニンなどの毒性誘導体の生成を防ぐことができる。

３、ジペプチドとトリペプチドを豊富に含有する加水分解物の精製ａ、不純物の除去動物血漿の酵素加水分解のあと、反応媒体を遠心分離もしくは濾過（正接的なミクロ濾過、フィルタープレス濾過など）のいずれかによって不純物除去処理をおこなう。この処理によりリン酸カルシウムのごとき無機沈澱物ばかりでなく不溶性タンパク質残渣、残留血漿脂質を取り除く。

例えば、珪藻土タイプのフィルター助材〔スペンダライトエヌ（Ｓｐｅｎｄａｌｉｔｅ　Ｎ）　）を３０〜５０ｇ／ｋｇの濃度で使用し、プレートとフレームを含むフィルタープレスを用いる。

ｂ、限外濾過濾過処理により不純物を除去した加水分解物を、中空糸型モジュール〔（アミコン社）　（Ａｍｉｃｏｎ）　）　、もしくは平型モジュール〔（ミリボア化）　（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）　）　、もしくは渦巻型（ｓｐｉｒａｌ）モジュール〔（ミリボア化、アミニン社）　（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ−Ａｍｉｃｏｎ）　］の形で充填した有機タイプの膜（ボリスルンホン）を用いて限外濾過処理にかける。

あるいはまた、多重チャンネルモジュール〔テクセプ社（Ｔｅｃｈ　５ｅａ）　）の形で充填された無機タイプ（セラミック）の膜上で限外濾過を行う。分子量が１０，０００を越えるペプチドばかりでなく部分的に加水分解された可溶性タンパク質を限外濾過により除去した後、該加水分解物を殺菌処理および乾燥処理に付す。限外濾過液のなかに回収されたペプチド画分はジペプチドとトリペプチドを豊富に含有する組成物を構成する。上記の膜の分離分子量は１，０００〜１０，０００の範囲にあるべきである。

４、ジペプチドとトリペプチドを豊富に含有する組成物（ＤＴＰ）の除菌濾過と乾燥処理限外濾過によって得られたジペプチドとトリペプチドを豊富に含有する混合物をなるべく早く　（＋４℃の冷蔵庫内の保存で２４時間を越えない時間内で）除菌濾過処理にかけて、該混合物内に残存するすべての雑菌を除去する。

この目的のため、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）型、サルトリアス（Ｓａｒ＋ｏｒｉｕｓ）型瀘過システム等を用いることができる。

産生物の濾過性が非常に良好なので、用いられる濾過システムは簡壜なものであり、２〜０．６５ミクロンのプレフィルタ−と０．２２ミクロンの完全フィルターで構成される。

このように濾過した産生物を無菌容器に集めた後、脱水処理を行なう。水分の除去は、真空下の蒸発による予備濃縮と共に或いは予備濃縮を行なわずに、凍結乾燥或いは散布乾燥により達成できる。

ペプチド成分であるアミノ酸残基の数に基づいて行なうペプチドの分離と定量化は、明らかに解決困難な問題であるが、この問題は新しい高性能配向子交換クロマトグラフィー（ＨＰＬＥＣ）法を用いることにより解決された。

ゲル浸透クロマトグラフィーは、新しい特殊な技術である。

しかしながら、この技術は、分子量という単一の基準だけでは小分子量のペプチドを分離することはできない。なぜなら、いろいろな分子量を有するジペプチドとトリペプチドの溶出ゾーンが重複するからである。このことはとりわけ、多くのペプチド／ゲル相互作用の存在に関係する。更に、いろいろな大きさの族（ｆａｍｉｌｉｅｓ）の分子量領域が重複しているため、分子量の分布によって小分子量のペプチドの複合混合物を大きさの基準に基づき特徴づけることはできない。これら総ての理由により、一般にジペプチドとトリペプチドの定量化は正確にはなされていない。

銅を塗布したシリカによる高性能配向子交換クロマトグラフィー（ＨＰＬＥＣ）法にエドマン化学分解法を組みあわせた技術を開発することにより、アミノ酸と非塩基性ジペプチドの直接定量、及びトリペプチドの間接定量が可能となった。

非塩基性ジペプチドと大分子量ペプチドのアミノ酸の定量化は、ペプチドをアミノ酸に還元後、蛍光分光測定法により行う。

本発明のこの方法により得られる加水分解物はマイルドな風味で美味な白色の微粉状物質であり、それは以下の組成を有するニージペプチドを４０モル％以上、トリペプチドを３５モル％以上、一アミノ酸を５モル％未溝、 −３個を越えるアミノ酸からなり平均鎖長が約６．２のオリゴペプチドを２０モル％未満含有し、かつ−１リットル当りの遊離窒素１１．２ｇの濃度における浸透性が２５０ミリオスモル／リットル。

本処理の最終段階で得られるパウダーの固形分は９４〜９６％である。

次の段落において、本発明の方法を乳清及び種々のタンパク質単離物に応用した。

■、乳清、魚巣難物、エントウ豆凧離物、大豆単離物及び小麦１＃離物種々の基質を本発明の方法によって処理した。これらの基質は主として以下の通りであるニー化学的、生物学的に不溶化したカゼインの固液分離によって得られるチーズ産業の副産物である乳清、−７２〜７４重量％のタンパク質、３〜６重量％の脂肪、１２〜１５重量％の無機物、３〜５重量％の残留湿度を含有する高吸湿性でないライトベージュ色のパウダー状魚タンパク質濃縮物、一選択され、さやをむいたエントウ豆種子から抽出した天然植物性エキスからなるエントウ豆単離物、−約８６重量％のタンパク質を含有する白色或いはベージュ色のパウダー状で味覚は無味である小麦単離物、及び−９０重量％を越之るタンパク質を含有する大豆単離物。

工業的には、大豆タンパク質を好ましくは溶解性にし、次に不溶性副産物から分離する。タンパク質溶液と不溶性副産物の固液分離の効率により調製された単離物の精製度が規定される。次工程で、タンパク質を等電点における精製により遺択的に回収する。

大豆タンパク質単離物の高い精製度（逆に言えば塩、脂質及び繊維の含有量が低い）により余分な精製工程が省略可能となる。

１、Ｘｔのコンデショユング各々の基質に対する熱処理条件は以下の通りであわだ。

乳清タンパク濃縮物、魚巣難物、エントウ豆単離物、大豆単離物及び／又は小麦巣離物を食品用強酸（ＨＣ１、Ｈ２ＳＯ４、或イハ好適に１−１４〜６ＮのＨ３Ｐ０４）ｉ、ｍよりｐＨ４゜６に酸性化し、約３０分未満で８５〜１００℃に加熱し、この温度で４５分未満、たとえば３０分間保持した。次に温度を急激に低下させ（５〜１０分間）約６０℃にした。基質の精製度が高く、逆に言えば灰分の含有量が低いため、熱処理後の固液分離工程が省略可能となった。

２、酵素加水分解酵素加水分解の条件は以下の通りであるニー中性、アルカリ性ｐＨ７〜９、一温度は３０〜７０℃、好ましくは５０〜６０℃、−加熱時間は好ましくは５〜９時間の範囲。

酵素加水分解工程は、酵素活性を破壊することにより、例えばｐＨを食品用強酸を添加して５．５〜６．５に下げ、７５〜８０℃で５〜３０分間加熱することにより破壊させ、中止した。

本漬では、前記の血漿処理法と同様に、次の工程で不純物除去、限外濾過、殺菌濾過、及び乾燥を行なった。

基質の組成、不純物除去及び限外濾過工程における窒素収率、及び得られた加水分解物の組成を各々表１〜３に示す。

型幅表２不純物除去、限外濾過工程における収率原料　不純物除去後の　限外濾過後の２、牛の乳清　８０％　７０％３、魚単離物　８６％４、大豆単離物　７３％　６５％５、エントウ豆本離物　７６％　６９％６、小麦単離物　７６％７、カゼインカルシウム　７８％　６８％８、卵白タンパク質　６２％　５８％コ　−０Ｑ　ヘ　ヘ　（１）　−り −１−６も　ヘ　ヘ　ヘ　ヘ　−　ヘ　へ：Ｌ−Ｑト　ロ　１１１１１１１ト　嘲　０（へ　膿　ロ　ト　ト　の　−り一　ロ　ロ　１　り　り　０　０ト　寸　マ　ω　の　−　マ　マ嗟　ｈ　り　１１１１１１１曙　０く　の　ロ　ロ　ロ　ロ　０　ロ　ロー　コ　△曽−ωのの円のも　み °（ｔｓｔｈ　で　マ　ω　マ　マ　寸　マ　マー＼６°く△△△△Δ△Δ△ Ｓ−謳碇一＼全　４ｆ−ｔ／〆　り　り　ト　り　寸　寸　寸　の＊螺ト　ＶＶミ亥疑；擢儒礪ｇＥｆ、ｌａｌ！Ａ　ｘ謡−１！普−暑χへ１Ｑ普１…へ掘を［寡　子井捩−Ｋｉ（÷只歇晒　−６゜、４ゆ−０ ■、カゼインカルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ　ｃａｓｅｉｎａ＋ｅ）カゼインをミルクから抽出するために現在使用されている方法は生物学的あるいは化学的手法を用いてこのタンパク質を不溶化することに基づいている。こうして乳清中のカゼインの懸濁液を得た後、固液分離及び水系媒体での洗浄によって容易に精製することができる。

この予備的なカゼイン精製工程によって、熱処理の後の固液分離工程を省くことができる。

カゼインは難溶性タンパク質である。カゼインの可溶化は工業的には高温下、塩基性ｐＨ値で行なわれる。こうした変性処理により、このタンパク質分子は単量体へと変化し、カゼインの水溶液が得られる。

カゼインカルシウムは乳酸発酵によって生成する新鮮なカゼインから得られる。

コンディショニング基質のコンディショニング条件は次の通りである。

−９０℃に加熱。

−ｐＨ値（初期のｐＨ値６，８）を変えずに、７７　ｇ／Ｑ（６，３８Ｎ）カゼインカルシウム溶液である基質を９０℃に３０分間保つ。

この実施例において、ｐＨを中性付近の値（ｐＨ６〜８）に調整することも可能であった。

夏！困水笈見次いで、温度を６０℃に下げ、この水溶液のｐＨ値を水酸化カルシウム溶液でｐＨ７，５に調整する。

更にこの基質に、血漿タンパク質について記載したのと同じ条件下で酵素加水分解、不純物除去、限外濾過および脱水処理を什なう。

これらの操作条件下では、不純物除去および限外濾過の収率は正常であり、タンパク質分解酵素の消化作用が良好であることがわかる（表２．７行目参照）。

カゼインカルシウムの加水分解物の分析結果を表３の７行卵白は等電点がｐＨ４〜１１の範囲にある約２０種類の異なるタンパク質の混合物である。これらの中には、熱に敏感でゲル化するものもあるし、耐熱性を有するものもある。

コンディショニング卵白がゲル化するのを防ぐため、以下の工程から成る予熱処理を行なう。

１）８５ｇ／ｋｇ濃度の卵白の溶液を８３ＰＯ４で酸性あるいは中性のｐＨ値（例えば、ｐＨ６，００）に調整する。

２）この混合液を激しく撹拌しながら７５℃に加熱し、４５分未満の時間、すなわち、３０分間上記温度に保つ。

次に温度を６０℃に下げ、水酸化カルシウム溶液でｐＨ値を７．５に調整する。

更に、この方法は血漿タンパク質のための操作、つまり、酵素加水分解、得られたジペプチドとトリペプチドを豊富に含有する酵素加水分解物の分離と精製及び乾燥を包含する。

タンパク質混合物の分子量分布は、カゼイン　カルシウムの加水分解物の分子量分布と一致する（表３参照）。

■、二ラクトース補足添加した乳清牛乳のミルクタンパク質にアレルギーを示す幼児を扱う専門の栄養学において抗原性は現実の問題である。

現在は、ミルクタンパク質に加水分解処理を行ないアレルギー誘発性を消去することによりこの問題を克服することが可能である。しかしながら、栄養分の炭水化物部分を担う食品用ラクトースをタンパク質加水分解物に添加する際に、残留タンパク質が混入するという問題が生じる（これは、結晶化によるラクトースの精製過程があるにも拘らず生じる）。

これらの残留タンパク質がアレルギー誘発性をもたらすことになる。

本発明の方法によってラクトースを豊富に含有する媒体中に存在する乳清タンパク質の酵素加水分解処理を行なうと、幼児の栄養摂取に直接使用できるペプチド加水分解物とラクトースの混合物を生産することができる。

酵素加水分解のコンディショニングとその後の処理の操作条件は乳清に関連して説明したものと同一であり、得られる結果も同様である。

例えば、乳清に加えるラクトースは乳清に対して３００重量％にもなる量を加えることができる。

要約書ジペプチドとトリペプチドを豊富に含有する酵素加水分解物を、あらかじめ熱処理したタンパク質混合物の酵素加水分解により製造する。得られたジペプチドとトリペプチドを豊富に含有する酵素加水分解物は、固液分離によって抽出し、限外濾過の後、殺菌及び乾燥のための処理にかける。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法１８４条の８）平成４年７月１０日

Claims

【特許請求の範囲】

１．タンパク質分解酵素の存在下でタンパク質混合物からジペプチドとトリペプチドを豊富に含有する酵素加水分解物を製造する方法にして、出先タンパク質混合物をコンディショニングのために熱処理にかけ、コンディショニングされた混合物を酵素加水分解し、得られた加水分解物を固液分離によって抽出し、該加水分解物から分子量が１０，０００を越えるペプチド並びに部分加水分解可溶性タンパク質を限外濾過により除去した後、殺菌および乾燥のための処理にかけることを特徴とする酵素加水分解物の製造方法。
２．出発タンパク質混合物のコンディショニングを初動ＰＨ値のまま、又は、酸性もしくは中性に近いＰＨ値に調整した後、７０℃〜１００℃の温度範囲で熱処理によって行なうことを包含することを特徴とする請求項１に記載の方法。
３．タンパク質分解速度を増大させるために熱処理によりコンディショニングされた基質すなわちタンパク質混合物を、ＰＨ値が６．５〜９、好ましくは７．０〜７．５、温度が３０℃〜７０℃、好ましくは５０℃〜６０℃、処理時間が５時間〜９時間の条件下で加水分解処理を行なうことを特徴とする請求項１文は２に記載の方法。
４．該加水分解に使用される酵素がアルカリ性培地で使用されうるプロテアーゼであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
５．該プロテアーゼがセリン含有のアルカリプロテアーゼであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
６．加水分解反応が完了したとみなされる時点で７０℃〜８０℃の温度条件で５分〜４５分の間食品用強酸（ＨＣ１，Ｈ２ＳＯ４，Ｈ３ＰＯ４など）、好ましくはＨ３ＰＯ４を添加してｐＨ値を５．５〜６．５の範囲に下げることによって該酵素の破壊を行なうことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
７．熱処理によりコンディショニングされたタンパク質混合物をプレートとフレームを含むフィルタープレス上で濾過して、遊離アミノ酸および低分子量の他の非タンパク質性分子（脂質、糖類および尿素）を除去して遊離アミノ酸含有量が低く且つ低イオン強度の目的ジペプチド／トリペプチド混合物を得ることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
８．血漿を酸性ＰＨに調節した後７０℃〜１００℃の温度範囲で４５分未満の時間、熱処理し、次に、正接的なミクロ濾過、もしくは遠心分離により又は加圧もしくは真空下での濾過（好ましくはプレートとフレームを含むフィルタープレスでの濾過）により固液分離を行ない、再懸濁後にタンパク質分解酵素の存在下で加水分解処理を行なうことができる固形基質を得ることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
９．４ｇ／ｌ未満の抗凝血剤を採取血液に添加した後該血液を遠心分離はかけて、熟処理にかける血漿を調製し、即使用可能な血液製剤或いは、凍結保存または散布乾燥による乾燥に適した血液製剤を得ることを特徴とする請求項８に記載の方法。
１０．乳清タンパク質からなる原料のｐＨを４．０〜５．０に、特に４．６にした後、８５℃〜１００℃の温度範囲で４５分未満の時間、予熱処理を行ってタンパク質の懸濁液を調製した後、該懸濁液をタンパク質分解酵素の存在下で加水分解処理を行なうことを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
１１．予熱処理を行う前に乳清タンパク質に食品用ラクトースを添加することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
１２．大豆、エンドウ豆、小麦又は魚から単離したタンパク質から選ばれるタンパク質を原料として用い、その原料のｐＨを４〜５に、特に４．６に調節した後７０℃〜１００℃の温度範囲で４５分未満の時間、熱処理を行い、タンパク質懸濁液を調製した後、タンパク質分解酸素の存在下で加水分解処理を行うことを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
１３．ＰＨを６〜８、好ましくは６．８、７０℃〜１００℃の濃度範囲および時間が４５分未満の条件下でカゼイネートを熱処理することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
１４．ｐＨ値を酸性または中性に調節した卵白タンパク質を、温度範囲が７０℃ 〜１００℃、処理時間が４５分未満の条件下で、熱処理にかけることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
１５．タンパク質混合物の熱処理を４５分未満の時間行うことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
１６．請求項１〜１５までのいずれかに記載の方法によって動物および／又は植物性タンパク質より得られるジペプチドおよびトリペプチドを含有する加水分解物であって、マイルドな風味を有し且つ美味である微粉、好ましくは白色の微粉状であり、且つ以下の成分： −ジペプチドとトリペプチドを７５モル％以上、−アミノ酸を５モル％未満 −３個を越えるアミノ酸からなり且つ平均鎖長が約６．２であるペプチドを２０モル％未満を含有することを特徴とする加水分解物。