JPH05503212A - 組換え体タンパク質の回収方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換え体タンパク質の回収方法 本発明は概して組換え体タンパク質の回収方法に関し、特に高分子量タンパク質 不純物を含有するタンパク質洛液から組換え体タンパク質を回収する方法に関す る。

発明の背景 組換え体タンパク質を製造する方法は当分野でよく知られており、組換えＤＮＡ 技術を使って特殊なタンパク質の遺伝コードを指定する非相同ＤＮＡセグメント を宿主微生物中に挿入するものである。

タンパク質の表現を誘発する条件下で形質転換微生物を増殖させることによって 、インシュリンやソマトトロピンやインターロイキンやインターフェロンやソマ トメジン等の非相同タンパク質を製造することができる。

あいに（、形質転換微生物によって産生される非相同タンパク質は微生物中で転 写される時に適切な三次構造をとらないためにしばしば生物学的に活性でない。

非相同タンパク質は「封入体」として細胞内に認めることができる集塊を形成す る傾向がある。いくつかのタンパク質分子を結合させて不溶性複合体を形成する 分子間共有ジスルフィド結合の形成によってもこれらの封入体は生じさせられる ことがある。封入体は一般的にほとんど非相同のタンパク質と宿主微生物タンパ ク質不純物の小フラクションを含有する。

微生物から封入体を抽出してその中に含まれている非相同タンパク質を天然の母 タンパク質すなわち非組換え体タンパク質と一致する自然のままの生物活性を有 するタンパク質に換えるためにいくつかの方法が開発されている。これらの方法 は、一般的に、微生物細胞を破壊し、細胞片から封入体を分離し、タンパク質を 変性させる変性剤／界面活性剤中で封入体タンパク質を可溶化させ、不溶性不純 物から非相同封入体タンパク質を分離し、変性剤／界面活性剤を除去することに よって非相同タンパク質を生物学的に活性な三次配座へと再生させ、溶液中に残 っているタンパク質不純物からそのタンパク質を分離するものである。

この一般的方法の後に出されたいくつかの組換え体タンパク質精製案が当分野で 知られており、０１ｓｏｎ等に与えられた米国特許番号４、５１１．５０３およ び４．５１８．５２６とＢｕｉｌｄｅｒ等に与えられた米国特許番号４．５１１ ．５０２および４．６２０．９４８は、（１）強力な変性剤と還元剤中で封入体 を可溶化させ、（２）可溶化させられたタンパク質溶液から不溶性不純物を取り 除き、（３）強力な変性剤を弱い変性剤と置き換えて、（４）分子状酸素と金属 陽イオンや四チオン酸ナトリウム等の触媒を使ってスルフヒドリル基をジスルフ ィド結合に酸化することによってタンパク質を再生させ、（５）膜分離法または クロマトグラフィー処理によってタンパク質を他のタンパク質不純物から分離す る多段階法を開示する。

参考のために本明細書中に記載されているＲａｕｓｃｈ等の米国特許番号４．６ ７７、１９６は、上記の一般案の変法である特殊なタンパク質精製活性化法を開 示する。その方法は、ＳＤＳ中で封入体を可溶化させ、透析または他の好適な技 法をつかって溶液から過剰のＳＤＳを取り除き、イオン遅延樹脂を使って５ＤＳ −タンパク質溶液をクロマトグラフィーにかけて、得られた溶液を陰イオン交換 樹脂を使ってクロマトグラフィーにかけてタンパク質を回収するものである。

これらの既知の方法はいずれも共通の問題点を持っている。変性剤／界面活性剤 が除去された時のタンパク質溶液が組換え体タンパク質と低分子量タンパク質不 純物と非タンパク質不純物と高分子量タンパク質不純物を含んでいるのである。

高分子量タンパク質不純物はしばしば組換え体タンパク質のたいてい二量体とオ リゴマーと集塊であるが、細胞消化物からの非組換え体タンパク質も含んでいる 。これらの不純物特に組換え体タンパク質二量体、オリゴマーおよび集塊から組 換え体タンパク質を分離するのはしばしば困難であり時間がかかり高価につく。

クロマトグラフィー法と膜分離法が不純物から組換え体タンパク質を分離するの に効果的であるかもしれないが、めんどうで長ったらしく高価につき、タンパク 質回収の収率が低いことがしばしばである。

従って、高分子量タンパク質不純物を含有する溶液から高収量の組換え体タンパ ク質を容易にすばや（安価に回収する新奇な改良された方法が必要とされる。

発明の要約 従って、高分子量タンパク質不純物を含有するタンパク質溶液から高収量の組換 え体タンパク質を容易にすばやく安価に回収する新奇な方法を提供することが本 発明の目的である。

本発明のもう一つの目的は、組換え体タンパク質溶液から高分子量タンパク質不 純物を取り除くことによって、組換え体タンパク質の容易ですばやく安価な回収 を可能にする方法を提供することである。

これらの目的と他の目的は高分子量タンパク質不純物と組換え体タンパク質を含 有する溶液にＩＩＡ属金属塩を高分子量タンパク質不純物を選択的に沈澱させる に十分な量だけ直接添加することによって達成される。これらの化合物は、組換 え体タンパク質の分子量の約１５倍よりも大きい分子量を持つタンパク質、特に 組換え体タンパク質の分子量の約１．　５倍よりも大きい分子量を持つ組換え体 タンパク質二量体、オリゴマーおよび集塊の優先的沈澱を引き起こす。沈澱物は 溶液から分離されて、組換え体タンパク質と低分子量タンパク質不純物と他の非 タンパク質不純物が溶液中に残る。組換え体タンパク質は既知の技法を使って溶 液から回収され、処理されて所望のタンパク質製品を得る。

好ましい態様では、ＩＩＡ属金属塩が０．１−５体積％溶液を生じさせるに十分 な量だけ溶液に直接添加される。高分子量タンパク質不純物は、濾過や遠心分離 等の従来の手段によって沈澱し溶液から取り除かれる。組換え体タンパク質と低 分子量タンパク質不純物と他の非タンパク質不純物を含有する得られたタンパク 質溶液は、組換え体タンパク質を回収するためにクロマトグラフィー等の従来技 法を使って更に処理される。

本研究の他の目的と利点と新奇な特徴は下記の発明の詳細な説明から明らかにな るだろう。

発明の詳細な説明 本明細書中に用いられている「組換え体タンパク質」という用語は、比較的純粋 な形で回収したいと望み、自然のままのタンパク質のアミノ酸配列を持つタンパ ク質と、置換されたが欠失したが取り替えられたか別のやり方で修飾された配列 を持つそれらの類似物とミューティンを含むタンパク質を意味する。

本明細書中に用いられている「組換え体ソマトトロピンＪ　（ｒＳＴ）という用 語は、自然のままのソマトトロピンのアミノ酸配列を持つかそれにかなり似てい るアミノ酸配列を持つかまたはそれがカットされて短くされた配列を持つ組換え 体タンパク質および置換されたか欠失したか取り替えられたが別のやり方で修飾 された配列を持つそれらの類似物とミューティンを含む。特に、本明細書中に用 いられているｒＳＴは自然のままのソマトトロピン（ＳＴ）と同じ配列を持つが そのアミノ末端から欠失したアミノ酸が有るタンパク質を含む。その様なタンパ ク質の例はゾルターフ組換え体豚ソマトトロピンやデルタ−４組換え体ウシソマ トトロピン等を含むがそれらに限られていない。

本明細書中に用いられている「高分子量タンパク質不純物」という用語は組換え 体タンパク質の分子量の約１．５倍よりも大きい分子量を持つタンパク質、特に 組換え体タンパク質の分子量の約２倍よりも大きい分子量を持つ組換え体タンパ ク質二量体、オリゴマーおよび集塊のことをいう。

本明細書中に用いられている「低分子量タンパク質不純物」という用語は組換え 体タンパク質の分子量の約１５倍よりも小さい分子量を持つタンパク質のことを いう。

本明細書中に用いられている「非タンパク質不純物Ｊという用語は、典型的には タンパク質溶液中に存在する沈澱剤や可溶化剤や酸化剤や還元剤等の比較的低分 子量の物質のことをいう。

本発明に従えば、高分子量タンパク質不純物を含有するタンパク質溶液から組換 え体タンパク質を回収する方法が提供される。その方法は、高分子量タンパク質 不純物と組換え体タンパク質を含有する溶液にｌｌＡｌ＊金属塩を高分子量タン パク質不純物を選択的に沈澱させるに十分な量だけ直接添加することから成る。

ｒＩＡ！Ｅ金属塩は組換え体タンパク質の分子量の約１．５倍よりも大きい分子 量を持つタンパク質、特に組換え体タンパク質の分子量の約２倍よりも大きい分 子量を持つ組換え体タンパク質二量体、オリゴマーおよび集塊の沈澱を優先的に 引き起こす。この方法は、高分子量タンパク質不純物を含有する溶液から高収量 の組換え体タンパク質を容易にすばやく安価に回収する改良法を提供する。

好ましい態様では、高分子量タンパク質不純物と組換え体ソマトトロピンを含有 する溶液にｌｌＡｌ金属塩を高分子量タンパク質不純物を選択的に沈澱させるに 十分な量だけ直接添加することによって組換え体ソマトトロピン（分子量約２万 ）を回収する方法が提供される。ＩＩＡ属金属塩は組換え体ソマトトロピンの分 子量の約１２５倍よりも大きい分子量（約３万よりも大きい分子量）を持つタン パク質、特に組換え体ソマトトロピンの分子量の約２倍よりも大きい分子量（約 ４万よりも大きい分子量）を持つ組換え体ソマトトロピンニ量体、オリゴマーお よび集塊の沈澱を優先的に引き起こす。

従って、本方法は、組換え体ソマトトロピンを生物学的に不活性なその二量体、 オリゴマーおよび集塊から分離する方法を提供する。

組換え体タンパク質、非タンパク質不純物、高分子量タンパク質不純物および低 分子量タンパク質を含有する本発明で有用な溶液は当分野で知られている方法に よって得られる。典型的には、組換え構機生物によって産生されたタンパク質封 入体を処理して脂質と細胞片を取り除いた後に、組換え体タンパク質とタンパク 質不純物特に高分子量組換え体タンパク質二量体、オリゴマーおよび集塊を含有 する得られた比較的に純粋な封入体を塩酸グアニジンや硫酸ドデシルナトリウム （ＳＤＳ）やトリトン等の強力な変性剤または界面活性剤中で可溶化させる。

得られたタンパク質溶液を不溶性物質から分離した後に強力な変性剤または界面 活性剤を除去して、その自然のままの生物学的に活性な形態に再生された組換え 体タンパク質と高分子量タンパク質不純物と低分子量タンパク質不純物と他の非 タンパク質不純物を含有するタンパク質溶液を得る。この様な溶液は、典型的に は、約１−５０ｍｇ／ｍｌの総タンパク質と約０．０５−５ｍｇ／ｍｌの組換え 体タンパク質を含有する。

この様な溶液の単量体に対する重合体の比（Ｐ／Ｍ）は単量体に対する空間率ピ ークを含む集塊の質量比を含み、従って溶液の純度の尺度である。この溶液は、 典型的には、Ｐ／Ｍ比が約０．　５以下に下げられる「前精製」段階を経る。そ の後に、この溶液を、典型的にはＤＥＡＤセファロースまたは他の好適なカラム を使って、更に精製処理して量終生成物を得ることができる。本発明は、より高 い単量体回収率とより低いＰ／Ｍ比を同時に達成しながら高分子量タンパク質不 純物を除去する方法を提供する。

高分子量タンパク質不純物を沈澱させるために、本発明に従って、ＩＩＡ属金属 塩がこの溶液に添加される。ＩＩＡ属金属塩の添加と同時に沈澱する高分子量タ ンパク質不純物は、濾過や遠心分離等の従来の手段で溶液から取り除かれる。組 換え体タンパク質と低分子量タンパク質不純物と場合によっては他の非タンパク 質不純物を含有する得られたタンパク質溶液は、低分子量タンパク質不純物およ び沈澱剤や可溶化剤や酸化剤や還元剤等の他の非タンパク質不純物を除去するた めに必要に応じて更に処理される。典型的には、そのような非タンパク質不純物 は透析、クロマトグラフィーまたは他の好適な手段で除去されるのに対して、低 分子量タンパク質不純物はイオン交換または他の種類のクロマトグラフィーで組 換え体タンパク質から分離される。

その目的とする使用のために好適なタンパク質またはタンパク質組成物を得るた めに、タンパク質溶液は、典型的には凍結乾燥によって更に処理される。これら の方法は当分野でよく知られている。

本発明で有用なＩＩＡ属金属塩は、周期律表のＩＩＡ属の元素（ベリリウム、マ グネシウム、ストロンチウム、バリウムおよびラジウム）のあらゆる塩を含む。

好ましい化合物はマグネシウム、カルシウム、バリウムおよびストロンチウムの 塩を含む。

本発明の化合物はマグネシウム、カルシウム、バリウムおよびストロンチウムの 硫酸塩（ＳＯ，）　、塩化物（Ｃ１２）　、および硝酸塩（ＮＯ３）を含むのが 最も好ましい。好ましい化合物は硫酸カルシウム（ＣａＳ０４）、無水ＣａＳＯ ４，ＣａＳＯ４半水塩、硝酸カルシウム（Ｃａ（ＮＯ３）２）、乳酸カルシウム 、硫酸マグネシウム（ＭｇＳ０４）　、塩化マグネシウム（ＭｇＣ１２）、塩化 バリウム（ＢａＣ１□および塩化ストロンチウム（ＳｒＣ１２）を含む。

沈澱を引き起こすのに必要とされるＩＩＡ属金属塩の量はタンパク質濃度やタン パク質の特性や添加される化合物によって異なるが、ＩＩＡ属金属塩は、典型的 には、化合物の約０．１−５体積％、好ましくは約１−３％体積％の溶液を得る に十分な量だけ溶液に添加される。

本発明の方法を使って回収可能な組換え体タンパク質は、典型的には封入体中で 組換え構機生物によって産生される約５０００よりも大きい分子量を持つどんな タンパク質であってもよい。これらはソマトトロピンとインシュリンとソマトメ ジンとソマトスタチンとプロラクチンと胎盤性ラクトゲン等を含む。

本発明の方法を使って組換え体ソマトトロピン（分子量約２万）が回収されるの が最も好ましい。組換え体ソマトトロピンはどんな種からの組換え体ソマトトロ ピンであってもよいが、ウシ、豚、鳥、またはヒトの組換え体ソマトトロピンで あるのが好ましく、豚またはウシの組換え体ソマトトロピンであるのが最も好ま しい。

これらの組換え体タンパク質を得る方法は当分野でよく知られており、例えば、 米国特許番号４．６０４．３５９および４．３３２．７１７はヒトの組換え体ソ マトトロピンを得る方法を開示しており、米国特許番号４、４３１．７３９は組 換え体ソマトトロピンを得る方法を開示しており、ヨーロッパ特許出願０１０４ ９２０は豚の組換え体ソマトトロピンを得る方法を開示しており、米国特許番号 ４．４４３．３５９はウシの組換え体ソマトトロピンを得る方法を開示しており 、５ｃｈｏｎｅｒはＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ邦Ｌ３（２）：１５１−５４で組換え 体ソマトトロピンを得る方法を開示しており、ＢｕｅｌｌはＮｕｃｌｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、　１３．１９２３−３８　（１９８５年）で組換え体ソマト トロピンＣを得る方法を開示している。

また、ヨーロッパ特許出願公告番号０１０３３９５はラムダＰＬプロモーターー オペレーターのコントロール下でデルタ９　（Ｓｅｔ）ウシソマトトロピン（そ の９Ｎ末端アミノ酸が欠けておりＮ末端に追加のセリン残基を有するソマトトロ ピン）の遺伝コードを指定する第一のプラスミドを含有しバクテリオファージｍ ｕに由来するシャインーダルガルノの領域を有する大腸菌の形質転換株の構造に ついて述べている。この形質転換株は、ｐｃＩ８５７ＦＭ度感受性リプレッサー タンパク質の産生の遺伝コードを指定する第二のプラスミドｐｃ■８５７も含有 する。温度を約　４２°Ｃまで上げることによってこのリプレッサータンパク質 を不活化してデルタ９　（Ｓｅｒ）ウシソマトトロピンの表現を誘発することが できる。この種の形質転換採火ＭｔｉｉＨＢ　１０１　（ＰＬ−ｍｕ−デルタ９ 　（Ｓｅｔ）ウシソマトトロピンおよびｐｃＩ８５７）はメリーランド州のロッ クビルに所在するアメリカ種培養コレクション（ＡＴＣＣ）に預けられており登 録番号５３０３０を割当られている。

デルタ７豚ソマトトロピン（その最初の７つのＮ末端アミノ酸が欠けている）の 産生の遺伝コードを指定する類似の形質転換株の構造がヨーロッパ特許出願公告 番号０１０４９２０中に記載されている。

この種の形質転換株大腸菌ＨＢ　１０１　（ＰＬ−ｍｕ−デルタ７豚ソマトトロ ピンおよびｐｃＩ８５７）はＡＴＣＣに預けられており登録番号５３０３１を割 当られている。

株５３０３０および５３０３１はそれぞれデルタ９　（Ｓｅｒ）ウシソマトトロ ピンとデルタ７豚ソマトトロピンを多量に産生ずる。いずれの例でも、表現され たタンパク質は顕微鏡下で目に見える不溶性で生物学的に不活性な封入体の形で 細胞内に隔離されている。多くの類似のタンパク質についての他の方法は当分野 で知られている。

好ましい態様では、約１−５０ｍｇ／ｍｌの総タンパク質と約０．０５−２ｍｇ ／ｍｌの組換え体ソマトトロピンを含有する組換え体ソマトトロピン溶液を約１ −３％Ｃａ５Ｏ，で処理して高分子量タンパク質不純物を沈澱させる。沈澱を遠 心分離によって除去して、組換え体ソマトトロピンを上記の従来の手段を使って 得られた溶液から回収する。

上記の回収方法は組換え体タンパク質の回収を意図するものであるが、その方法 は非組換え体タンパク質の分離と回収にも同様に適用可能である。例えば、（１ ）「有用なかあるいは望まれるタンパク質」と（２）高分子量タンパク質（有用 なタンパク質の分子量の約１．５倍よりも大きい分子量）と（３）低分子量タン パク質（有用なタンパク質の分子量の約１．５倍よりも小さい分子量）を含有す る溶液を本発明に従って処理して高分子量タンパク質を沈澱させて、高分子量タ ンパク質を有用なタンパク質および低分子量タンパク質から分離する。高分子量 タンパク質は溶液から分離されて廃棄されるかまたは望みに応じて更に処理され る。沈澱物を再溶解させて溶液から高分子量タンパク質を回収することによって 高分子量タンパク質を回収することができる。

有用なタンパク質を従来の手段によって低分子量タンパク質から分離してから所 望の場合には更に処理してタンパク質製品を得る。

有用なタンパク質から分離された低分子量タンパク質は廃棄されるかまたは望み に応じて更に処理される。典型的には、クロマトグラフィーかまたは類似の分子 量を持つタンパク質を分離するのに好適な他の手段を使って低分子量タンパク質 を有用なタンパク質から分離することができる。多くのその様なタンパク質分離 手段は当業者によく知られており、本発明で同様に利用可能である。

本発明について一般的に説明したので、本発明の実施と利点をはっきり示すため に本発明の特別の態様として下記の実施例を示す。

実施例は説明のために示されているのであり明細書または後に記する請求の範囲 に限界を設けるためのものではないことが理解されるべきである。特に、実験で 使われている封入体はゾルターフ豚ソマトトロピンを産生ずる形質転換させられ た大腸菌株から調製された。

ゾルターフｐＳＴの遺伝コードを指定する第一のプラスミド（ＰＬ−ｍｕ−ゾル ターフｐＳＴ）と温度感受性ラムダファージ抑制タンパク質の遺伝コードを指定 する第二のプラスミド（ｐｃＩ８５７）で形質転換された大腸菌宿主株ＨＢＩＯ １から封入体を単離した。

多くの他の微生物株が本発明で機能するだろう多種の組換え体タンパク質を含有 する封入体を産生ずる。同様に、封入体を産生ずるこれらの微生物を培養する方 法は当分野でよく知られている。

実施例１ （１）炭酸緩衝液（２５ｍＭ　ＮａＨＣＯ：＋と２１ｍＭ　Ｎａ２Ｃ０３）に硫 酸ドデシルナトリウムを溶かした溶液中に封入体を溶解させ、（２）溶液から不 溶性不純物を取り除き、（３）組換え体豚ソマトトロピン（ｒｐＳＴ）を酸化す るために酸化剤を添加し、（４）溶液からＳＤＳを除去してｒｐＳＴをその生物 学的に活性な形態に再生させることによって微生物封入体からｒｐＳＴを回収し た。得られたタンパク質溶液はｒｐＳＴと高分子量タンパク質不純物と低分子量 タンパク質不純物と他の非タンパク質不純物を含有していた。

Ｐ／Ｍ比が５．１で０．６７ｍｇ／ｍｌのｒｐＳＴ単量体を含有していた上記の 再生タンパク質溶液（２２−２５°ＣでｐＨ９，８）にＣａ５Ｏ，・２Ｈ，，０ を２，５％（ｗ／ｖ）濃度で添加して２時間混合した。混合物を約ｘ５０００Ｇ で１０分間遠心分離して上清を回収した。

上清のｒｐＳＴ単量体とＰ／Ｍ比を５ｕｐｅｒｏｓｅ−１２高速タンパク質液体 クロマトグラフィーによって分析した。結果は、Ｐ／Ｍ比が０゜３に下げられた ことと単量体回収率が８３，０％だったことを示した。データは、タンパク質集 塊不純物と高分子量タンパク質不純物がＣａＳＯ４・２Ｈ２０によって選択的に 沈澱させられて単量体が溶液中に残されたことを示した。

実施例２ 他のカルシウム塩（無水ＣａＳＯ４と半水ＣａＳＯ４と硝酸カルシウム（Ｃａ（ ＮＯｘ）２）を使って実施例１を繰り返した。結果を表１に示す。

表１に言及すると、データはこれらのカルシウム塩の添加によって集塊不純物と 高分子量タンパク質不純物が選択的に沈澱させられたことを示す。

実施例３ マグネシウムとバリウムとストロンチウムのアルカリ金属塩を使って実施例１を 繰り返した。結果を表２に示す。

表２に言及すると、データはこれらのアルカリ金属塩によって集塊不純物と高分 子量タンパク質不純物が選択的に沈澱させられたことを示す。

実施例４ Ｐ／Ｍ比が４．７で０．４ｍｇ／ｍｌのｐＳ丁単量体を含有した実施例１の再生 タンパク質溶液にＣａＣＬ　・２Ｈ２０を０，４％（ｗ　／　ｖ）濃度で添加し て室温（２２−２５°Ｃ）で約３０分間混合した。

混合物のｐＨを約９．０に調整して、ｘ５０００Ｇで１０分間遠心分離した後に 混合物の上清を採取した。得られた上清を５ｕｐｅｒｏｓｅ−１２高速タンパク 質液体クロマトグラフィーで分析した。

結果は、Ｐ／Ｍ比が０．４に下げられて単量体の回収率が９２゜１％だったこと を示した。このデータは、ＣａＣ］。・２Ｈ２０が単量体を溶液中に残してタン パク質集塊と高分子量タンパク質不純物を選択的に沈澱させることを示す。

実施例５ 実施例１の再生されたタンパク質溶液を約２倍濃縮してからｐＨ９、０の８０ｍ Ｍエタノールアミン緩衝液を使って透析濾過した。

Ｐ／Ｍ比が３．５で０．６７ｍｇ／ｍｌのｒｐＳＴ単量体を含有していた透析濾 過タンパク質溶液にＣａＣ１ｚ　・２Ｈ２０を０．４％（ｗ／ｖ）濃度で添加し て２２−２５°Ｃで３０分間混合した。上清をｘ５０００Ｇの遠心分離で１０分 間分離した。上清を５ｕｐｅｒｏｓｅ−１２高速タンパク質液体クロマトグラフ ィーで分析した。

結果はＰ／Ｍ比が０．２２に下げられて単量体回収率が９１．５％だったことを 示した。このデータはＣａＣｌ２　・２Ｈ２０がエタノールアミン緩衝液系中に タンパク質集塊と高分子量タンパク質不純物を選択的に沈澱させることを示す。

上記の教示にかんがみて本発明の多（の修正法と変法が可能であることは明らか である。従って、付記されている請求の範囲の範囲内で具体的に述べられている のとは別のやり方で本発明を実施してもよいことが理解されるべきである。

表　１ １度　初ｔｉｌｌ　最終　単量体 慨水Ｃａ５０．　２．５　３．０　０．０３　Ｂ７．３ＣａＳＯ，半水塩　２． ５　３．６　０．０５　Ｂ３．７硝酸カルシウム　２・５　３．３　０．２　９ １．０乳酸カルシウム　２．５　４．１　０．０６　７２．５表２ ＭｑＳＯ，・ＩＨ，０２，５３，００，１７１，０ＭｇＣ１，１，０３，００， ３９２，０ＢａＣ１，１，６３，７０，５５Ｑ、０５ｒＣ１２・６Ｈ２０１，２ ２３，７０，Ｑ　４３．０補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の ８）平成４年７月２２日

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. １．高分子量タンパク質不純物と組換え体タンパク質を含有する溶液にＩＩＡ属 金属塩を高分子量タンパク質不純物を選択的に沈澱させるに十分な量だけ添加し て、溶液から沈澱物を分離して、溶液から組換え体タンパク質を回収することを 特徴とする高分子量タンパク質不純物と組換え体タンパク質を含有する溶液から 組換え体タンパク質を回収する方法。
2. ２．溶液の総タンパク質濃度が約１−５０ｍｇ／ｍｌで溶液の組換え体タンパク 質濃度が約０．０５−４ｍｇ／ｍｌである請求の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．ＩＩＡ属金属塩が０．１−１０体積％溶液を得るに十分な量だけ溶液に直接 添加される請求の範囲第１項に記載の方法。
4. ４．ＩＩＡ属金属塩がベリリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム 、バリウムおよびラジウム塩から成る群から選ばれる請求の範囲第１項に記載の 方法。
5. ５．ＩＩＡ属金属塩が硫酸塩（ＳＯ４）と塩化物（Ｃｌ２）と硝酸塩（ＮＯ３） から成る群から選ばれる請求の範囲第４項に記載の方法。
6. ６．ＩＩＡ属金属塩がマグネシウム、カルシウム、ストロンチウムおよびバリウ ム塩から成る群から選ばれる請求の範囲第１項に記載の方法。
7. ７．ＩＩＡ属金属塩が硫酸塩（ＳＯ４）と塩化物（Ｃｌ２）と硝酸塩（ＮＯ３） から成る群から選ばれる請求の範囲第６項に記載の方法。
8. ８．ＩＩＡ属金属塩が無水硫酸カルシウム（ＣａＳＯ４）とＣａＳＯ４半水塩と ＣａＳＯ４半水塩と塩化カルシウムと塩化カルシウム二水塩と硝酸カルシウム（ Ｃａ（ＮＯ３）２）と乳酸カルシウムと乳酸カルシウムと硫酸マグネシウム（Ｍ ｇＳＯ４）と塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）と塩化バリウム（ＢａＣｌ２）と 塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）から成る群から選ばれる請求の範囲第１項に 記載の方法。
9. ９．高分子量タンパク質不純物が約３万よりも大きい分子量を持ち回収しようと する組換え体タンパク質が約２号の分子量を持つ請求の範囲第１項に記載の方法 。
10. １０．組換え体タンパク質がソマトトロピンである請求の範囲第１項に記載の方 法。
11. １１．組換え体ソマトトロピンがウシ、豚、鳥、羊またはヒトのソマトトロピン である請求の範囲第１０項に記載の方法。
12. １２．組換え体ソマトトロピンが豚またはウシの組換え体ソマトトロピンである 請求の範囲第１１項に記載の方法。
13. １３．高分子量タンパク質不純物と組換え体ソマトトロピンを含有するタンパク 質溶液にＩＩＡ属金属塩を高分子量タンパク質不純物を選択的に沈澱させるに十 分な量だけ直接添加して、溶液から沈澱物を分離して、溶液から組換え体タンパ ク質を回収することを特徴とする高分子量タンパク質不純物と組換え体ソマトト ロピンを含有するタンパク質溶液から組換え体ソマトトロピンを回収する方法。
14. １４．溶液の絵タンパク質濃度が約１−５０ｍｇ／ｍｌであり溶液の組換え体ソ マトトロピン濃度が約０．０５−４ｍｇ／ｍｌである請求の範囲第１３項に記載 の方法。
15. １５．ＩＩＡ属金属塩が０．１−１０体積％溶液を得るに十分な量だけ溶液に直 接添加される請求の範囲第１３項に記載の方法。
16. １６．ＩＩＡ属金属壇がベリリウム、マグネシウム、カルシウムストロンチウム 、バリウムおよびラジウム塩から成る群から選ばれる請求の範囲第１３項に記載 の方法。
17. １７．ＩＩＡ属金属塩が硫酸塩（ＳＯ４）と塩化物（Ｃｌ２）と硝酸塩（ＮＯ３ ）から成る群から選ばれる特許請求の範囲第１６項に記載の方法。
18. １８．ＩＩＡ属金属塩がマグネシウム、カルシウム、ストロンチウムおよびバリ ウム塩から成る群から選ばれる請求の範囲第１３項に記載の方法。
19. １９．ＩＩＡ属金属塩が硫酸塩（ＳＯ４）と塩化物（Ｃｌ２）と硝酸塩（ＮＯ３ ）から成る群から選ばれる請求の範囲第１８項に記載の方法。
20. ２０．ＩＩＡ属金属塩が無水硫酸カルシウム（ＣａＳＯ４）とＣａＳＯ４半水塩 とＣａＳＯ４半水塩と硝酸カルシウム（Ｃａ（ＮＯ３）２）と塩化カルシウムと 塩化カルシウム二水塩と乳酸カルシウムと蟻酸カルシウムと硫酸マグネシウム（ ＭｇＳＯ４）と塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）と塩化バリウム（ＢａＣｌ２） と塩化ストロンチウム（ＳｒＣ１２）から成る群から選ばれる請求の範囲第１３ 項に記載の方法。
21. ２１．高分子量タンパク質不鈍物が約３万よりも大きい分子量を持つ請求の範囲 第１３項に記載の方法。
22. ２２．タンパク質と高分子量タンパク質と低分子量タンパク質を含有するタンパ ク質溶液にＩＩＡ属金属塩を高分子量タンパク質不純物を選択的に沈澱させるに 十分な量だけ直接添加して、溶液から沈澱物を分離して、溶液から組換え体タン パク質を回収することを特徴とするタンパク質と高分子量タンパク質と低分子量 タンパク質を含有するタンパク質溶液からタンパク質を分離回収する方法。
23. ２３．溶液の総タンパク質濃度が約１−５０ｍｇ／ｍｌで溶液のタンパク質濃度 が約０．０５−４ｍｇ／ｍｌである請求の範囲第２２項に記載の方法。
24. ２４．ＩＩＡ属金属塩が０．１−１０体積％溶液を得るに十分な量だけ溶液に直 接添加される請求の範囲第２２項に記載の方法。
25. ２５．ＩＩＡ属金属塩がベリリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウ ム、バリウムおよびラジウム塩から成る群から選ばれる請求の範囲第２２項に記 載の方法。
26. ２６．ＩＩＡ属金属壇が硫酸塩（ＳＯ４）と塩化物（Ｃｌ２）と硝酸塩（ＮＯ３ ）から成る群から選ばれる請求の範囲第２５項に記載の方法。
27. ２７．ＩＩＡ属金属塩がマグネシウム、カルシウム、ストロンチウムおよびバリ ウム塩から成る群から選ばれる請求の範囲第２２項に記載の方法。
28. ２８．ＩＩＡ属金属塩が硫酸塩（ＳＯ４）と塩化物（Ｃｌ２）と硝酸塩（ＮＯ３ ）から成る群から選ばれる請求の範囲第２７項に記載の方法。
29. ２９．ＩＩＡ属金属塩が無水硫酸カルシウム（ＣａＳＯ４）とＣａＳＯ４半水塩 とＣａＳＯ４半水塩と硝酸カルシウム（Ｃａ（ＮＯ３）２）と塩化カルシウムと 塩化カルシウム二水塩と乳酸カルシウムと蟻酸カルシウムと硫酸マグネシウム（ ＭｇＳＯ４）と塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）と塩化バリウム（ＢａＣｌ２） と塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）から成る群から選ばれる請求の範囲第２２ 項に記載の方法。
30. ３０．高分子量タンパク質不純物が約３万よりも大きい分子量を持ち回収しよう とするタンパク質が約２号の分子量を持つ請求の範囲第２２項に記載の方法。