JPH05502445A - 室内塵から単離したヒトｔ細胞反応性猫蛋白質（ｔｒｆｐ）及びその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 室内塵から単離したヒトＴ細胞反応性猫蛋白質（ＴＲＦＰ）及びその利用 背景 人口の約１０％にのぼる遺伝的に素因を与えられた人間は、彼らがさらされてい る種々の環境源からの抗原に過敏（アレルギー性）になる。

人々に即時型及び／又は遅延型過敏を引き起こすことができる抗原をアレルゲン と呼ぶ。Ｋｉｎｇ、Ｔ、Ｐ、、Ａｄｖ、Ｉｍｍｕｎ、、２３ニア７−１０５　（ １９７６）。枯草熱、喘息及びじんましんの症状は、草の生産物、木、雑草、動 物のふけ、昆虫、食物、薬品及び化学品などの種々のアレルゲンにより引き起こ されるアレルギーの形態である。アレルギーに含まれる抗体は、主に免疫グロブ リンのＩｇＥの種類に属する。

ＩｇＥは、肥満細胞及び好塩基球と結合する。特定のアレルゲンが肥満細胞と結 合したＩｇＥと組み合わさると、ＩｇＥは細胞表面で架橋し、ＩｇＥ−抗原相互 作用の生理学的効果を起こす。脱顆粒により、他の物質の中でもヒスタミン、ヘ パリン、好酸球のための走化性因子及びロイコトリエン、Ｃ４、Ｃ４ならびにＥ ４が放出され、気管支平滑筋細胞の長期間の収縮を引き起こす。　Ｈｏｏｄ、Ｌ 、Ｅ、等、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

ｇｙ、（第２版）　、ｐｐ４６０−４６２、Ｔｈｅ　Ｂｅｎｊａｍｉｎ／ＣＣｕ ｍｍ１ｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、Ｉｎｃ、（１９８４）。

これらの放出物質は、ＩｇＥと特定のアレルゲンの組み合わせにより起こるアレ ルギー症状を招く媒介物である。それらを通してアレルゲンの効果が現れる。そ のような効果は木賃的に全身的又は局所的であり、抗原が体に入った経路及びＩ ｇＥ及び肥満細胞の沈着の様式に依存する。

一般に局所的の場合は、アレルゲンが体に入った位置の上皮表面に現れる。全身 的効果は、（血管内）循環抗原に対するＩｇＥ−好塩基球応答の結果であるアナ フィラキシ−（アナフィラキシーンヨック）を含む。

合衆国には約−千万人の猫アレルギーの患者がいると見積もられている。Ｊ、Ｌ 、、ａｎｄ　５ｕｎｄｉｎ、Ｂ、、ＣＩ　ｉｎ、Ｒｅｖ、Ａ、１１ｅｒｇｙ、旦 ＋３７−４７　（１９８７）。多くの人々に特異的にかかわるアｌノルゲンは、 家庭の猫の皮膚及び唾液線アレルゲン、Ｆｅｌｉｓｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓアレル ゲンＩ（Ｆｅｌ　ｄ　ｌ）であり、アレルゲン１１キヤツト■及び抗原４とも呼 ばれる。Ｆｅｌ　ｄ　ｌは、サイズ排除ＨＰＬＣによる分子量が約３９，０００ 、及び非還元条件下におけるゲル電気泳動において１７，０００の酸性非−共有 結合ホモダイマーであると記載されている。Ｃｈａｐｍａｎ、Ｍ、Ｄ、、等、土 工上ｍｍｕｎｏｌｏｇＬ　１４０　（３）：８１２−８１８　（１９８８）。Ｃ ｈ　ａ　ｐｍａ　ｎ等は、Ｆｅｌ　ｄ　Ｘの含有率の高い（５０Ｕ／ｍｌ）室内 塵粗抽出物からの、単クローン性抗体アフィニティークロマトグラフが非共有結 合により結合した、分子量が３５．０００の二量体であり、３つの同種ア１ノル ゲン形態として存在するとも記載されている（ｐＩ　３．５−４．　１）　。Ｏ ｈｍａｎ、Ｊ、　Ｌ、　、等、Ｊ、Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｃ１Ｌ６、等、Ｊ、Ｉｍｍ ｕｎｏｌ、、１１３：１６６８　（１９７４）；Ｌｅｒ　ｙ　Ｃｈｉｎ、Ｔｍｍ ｕｎ、ｏｌ、、ヱ４　：１４７　（１９８４）。

猫アレルゲンへの暴露は、動物への暴露又は猫アレルゲンを含む室内塵との接触 により起こる。これらのア１ノルゲンを唾液、皮膚の削りくず、猫の洗浄液、血 清、唾液腺、猫の毛、猫のふけ及び室内塵で調べた。

猫アレルゲンへのアレルギ一応答及び猫アレルゲンそのものが非常な注目を受け てきたにもかかわらず、猫に過敏性の患者に悪影響を与えると思われるＦｅｌ　 ｄ　ｉアｌノルゲンの構造及び成分の定義又は特性化は完全からは程遠（、現在 の脱感作治療は複雑な、はっきりしない動物のふけからの抽出物を用いた治療を 含んでいる。

発明の要約 本発明は、猫を飼っている数軒の家庭から集めた室内塵のアフィニティー精製に より単離した、ＴＲＦＰとも呼ばれる、約４０．ＯＯＯＭＷの実質的に純粋なヒ トＴ細胞反応性猫蛋白質、ＴＲＦＰ又はペプチドの全体又は一部をコードするＤ ＮＡ、そのような蛋白質又はペプチド、あるいは蛋白質又はペプチドの一部を含 む組成物；及びＴＲＦＰ又はペプチドと反応性の単クローン性抗体に関する。

本発明は又、組み替え法により生成したＴＲＦＰ　（組み替えＴＲＦＰ）又は組 み替えＴＲＦＰあるいはペプチドの一部にも関する。さらに本発明は、少なくと も１個のアミノ酸の付加、欠失又は置換、あるいは他の（アミノ酸でない）成分 の存在により、自然に存在するＴＲＦＰとアミノ酸配列が異なる、修正（又は変 異）ＴＲＦＰとも呼ばれるＴＲＦＰに関する。そのような組み替えＴＲＦＰは、 使用した宿主細胞に依存してグリコジル化又は非グリコジル化であることができ る。本文に記載する通り、天然のＴＲＦＰはグリコジル化である（すなわち炭水 化物−含有である）ことが分かっている。

本発明はさらに、猫への暴露が猫アレルギー患者に通常与える悪影響を軽減する 又は予防する（すなわち猫アレルゲンに対して患者を脱感作する、又はアレルゲ ンの効果を遮断する）ために、いずれかの形態のＴＲＦＰ　（すなわち実質的に 純粋なＴＲＦＰ、組み替えＴＲＦＰ、修正ＴＲＦＰ）又はその一部、又はある形 態のＴＲＦＰ又はその一部を含む組成物を投与する方法にも関する。

本発明は又、猫アレルゲンに対する感応性を診断する、又は脱感作養生法に有用 なペプチド又はアミノ酸配列を予測する方法に関する。例えば本文に記載する通 り、猫アレルギー患者からのＴ細胞を重大に刺激する数種類のペプチドがＴＲＦ Ｐ内に存在することが示された。それらのペプチドはさらに種々の方法でリンフ 才力イン分泌プロフィールに影響し、ある場合にはＴ細胞をアネルギー化又は耐 性化してＴＲＦＰに応答しないようにすることが示された。そのようなペプチド は、猫アレルゲンに対する患者のアレルギ一応答を軽減する又は無くすために投 与することができる。さらに、これらのペプチドは、どれが敏感性を引き起こす かを決定するために、猫アτノルギー患者に投与する又は生体外診断試験に使用 することができる。適用できると決定したペプチドを、猫−過敏性患者の脱感作 に選択的に使用することができる。本文で“脱感作”という言葉は、猫、猫のふ け又はその生産物への暴露に対する猫−過敏性患者のアレルギー反応を、（脱感 作しなければ猫−過敏性患者が経験するであろう程度以下に）軽減することと定 義する。

本発明はさらに、Ｔ細胞エピトープから成る修正ＴＲＦＰペプチド又は蛋白質； 修正ＴＲＦＰ蛋白質又はその一部を含む組成物：及び非修正の“天然に存在する ”蛋白質が猫−過敏性患者に与える悪影響を軽減する又は予防するために、修正 ＴＲＦＰ蛋白質又はその一部を単独であるいは組み合わせて投与する方法に関す る。

ＴＲＦＰの全体又は一部をコードする本発明のＤＮＡは、他の種（例えばやぎ、 羊、犬、兎、馬）に存在する同等の配列の位置決定のためのプローブとして使用 することができ、診断及び／又は治療の意味で有用図１は、ＴＲＦＰ、　＠１、 リーダーＡ（下線）のＤＮＡ記列及び推定アミノ酸配列である。

図２は、ＴＲＦＰ、鎖２、リーダーＢ（下線）のＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配 列である。

図３は、ＴＲＦＰ、鎖２の長鎖の形態（４７６ヌクＩノオチド）のＤＮＡ配列及 び推定アミノ酸配列である。

図４は、ＴＲＦＰ、鎖２の短鎖の形！（４６９ヌクレオチド）のＤＮＡ配列及び 推定アミノ酸配列である。

図５は、ＴＲＦＰ、鎖２の先端を切った形態（４６５ヌク１／オチド）のＤＮＡ 配列及び推定アミノ酸配列である。

図６は、リーダーＡ及びリーダーＢ（上部２本線）を含むＴＲＦＰ、鎖ｌの蛋白 質配列である。ｃＤＮＡの配列決定によりリーダー及び鎖１（Ｃ１）のアミノ酸 配列を推定し、鎖１の蛋白質配列（ＰＲＯ）を蛋白質配列決定法により決定し、 蛋白質配列決定法により決定した第１アミノ酸に基づいてアミノ酸の番号をつけ た。各リーダー配列中のイニシェーターと推定されるメチオニンは、ボールド体 である。（−）は、（−）の上に挙げたアミノ酸残基との完全な一致又は同一性 を示す。

図７は、リーダー配列を含むＴＲＦＰ、　＠２の蛋白質配列である。ＣＤＮＡの 配列決定により、リーダー及び鎖２　（Ｃ２）のアミノ酸配列を推定した。鎖２ の蛋白質配列（ＰＲＯ）を蛋白質配列決定法により決定し、記載の蛋白質配列決 定法により検出した第１アミノ酸及び多量性に基づいてアミノ酸の番号をつけた 。Ｃ２Ｌ　：長鎖型の鎖２（９２アミノ酸）；Ｃ２Ｓ：短鎖型の鎖２（９０アミ ノ酸）；Ｃ２５Ｔ　先端を切った短鎖型の鎖２（８０アミノ酸）。リーダー配列 中のイニシェーターと推定されるメチオニンは、ボールド体であり、Ｎ−グリコ ジル化部位の可能性のある部分を下線で示す。（−）は、（−）の上に挙げたア ミノ酸残基との完全な一致又は同一性を示す。

図８は、アフィニティー精製うさぎ抗−ペプチド抗体（抗−Ｆｅ１２、Ｆｅ１． ４．及びＦｅ１１８）＋単りローン性抗−Ｆｅｌ　ｄ■　抗体（６Ｆ９）及びプ ールされた猫アレルギー性ヒト血清１ｇＥをプローブとした、アフィニティー精 製ＴＲＦＰの還元条件下におけるＳＤＳ／ＰＡ、ＧＥウェスターン法の結果を示 す。抗−Ｆｅｌ　２．Ｆｅ１４抗血清は、鎖ｌに特異的である。抗−Ｆｅｌ　１ ８抗血清は、鏑２に特異的である。

図９は、種々の抗原及びペプチドで刺激した患者１３１からの末梢血リンパ球の Ｔｍ胞２次応答のグラフ図である。

発明の詳細な説明 本文に記載の通りＴＲＦＰは、猫を飼っている数軒の家庭から集めた掃除機バッ グの室内塵のアフィニティー精製により単離精製した。本文に記載する研究によ り、ＴＲＦＰ蛋白質の単離精製、ＴＲＦＰをコードするヌクレオチド配列及びＴ ＲＦＰのアミノ酸配列の決定（図１−７）：ＴＲＦＰが、共有結合した２個のペ プチド鎖（＃１１及び２と示す）から成ることの立証、ＴＲＦＰ蛋白質中に存在 するＴ細胞反応性ペプチド又はアミノ酸配列の同定及び単離、及びＴＲＦＰの特 性化を行うことができた。又、本研究により、Ｅ、ｃｏｌｉ中におけるＴＲＦＰ のクローニング及び発現ならびに得られた組み替えＴＲＦＰ蛋白質の特性化を行 うことができた。実施例４に記載の通り、ＴＲＦＰ鎖１又は鎖２の全体又は一部 をコードするｃＤＮＡクローンを、組み替え融合蛋白質としてＥ、ｃｏｌｉ中に 発現することができた。２本鎖ＴＲＦＰ蛋白質の鎖１か２個の２者択一的なリー ダー配列を持ち、鎖２が２種類の主な形態（長鎖及び短鎖と示す）を有すること の発見は、注目に値する。

Ｆｅｌ　ｄ　Ｋとして周知のＦｅ１ｔｓ　ｄｏｍｅｓｔｆｃｕｓアレルゲンＩと 反応する単クローン性抗体を、掃除機バッグの標本からの単一蛋白質の単離に使 用した。この方法で単離したアフィニティー精製Ｔ細胞反応性蛋白質をヒトＴ細 胞反応性電量白賀（ヒトＴＲＦＰ）と呼ぶ。

ＴＲＦＰは生物活性（ヒトＩｇＥ結合能力）を有し、うさぎ抗−Ｆｅｌｄｌ抗血 清と交叉反応性を有することが示された。本発明のペプチド又は蛋白質に関連し て本文で使用する“アレルゲン性”という言葉は、ＩｇＥと結合する及び／又は Ｔ細胞を刺激するペプチド又は蛋白質を言う。

ＴＲＦＰの鎖１及び２のアミノ酸配列の決定の他に、ＭａｒｔｉｎＣＩコ、　ａ 　ｐ　ｍ　ａ　ｎの提供によるＦｅ１　ｄ　ｌ蛋白質標本を分析し、蛋白質を単 離し、配列を決定した。アフィニティー精製ＴＲＦＰのアミノ酸配列及び公開さ れたＦｅｌ　ｄ　ｌ蛋白質配列の比較により、Ｆｅ１ｄｌ及びＴＲＦＰの鎖１の 間でアミノ末端における最初の３３アミノ酸の配列に高度の相同性があることが 示された。

以下は、２個の共有結合する鎖から成る単一の蛋白質を室内塵から単離する方法 、ならびにＴＲＦＰをコードするＤＮＡの同τ及び単離に使用した方法の記載で ある。さらに、組み替えＴＲＦＰ鎖１及び２を形成するのに使用した方法も記載 する。さらに、ＴＲＦＰ蛋白質からのヒトＴ細胞エピトープを同定し、本文に記 載する。

掃除機バッグ標本からの単一蛋白質の単離Ｍ、Ｄ、Ｃｈａｐｍ、ａｎ等の方法に 基づ（方法により、掃除機バッグの内容物から蛋白質標本を抽出した。Ｃｈａｐ ｍａｎ、Ｍ、Ｄ、、等、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１４０　（３）：８１２−８１ ８　（１９８８）。

Ｃｈａｐｍａｎ等により製造されたＦｅｌ　ｄ　Ｋと反応する単クローン性抗体 を標本中の蛋白質の同定に使用した。ｄｅ　Ｇｒｏｏｔ　Ｈ。

等、Ｊ、ＡＩｌｅｒｇｙ　Ｃ１１ｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、８２ニア７Ｂ−７８８ （１９８８）、、Ｆｅｌ　ｄ　Ｘ本来の蛋白質ヲｌｆｆ、１ｍ１Ｊｌｆした単ク ローン性抗体（ＩＯ２及び６Ｆ９と示す）を用いて蛋白質をアフィニティー精製 し、それを室内塵試料からのヒトＴ細胞反応性猫蛋白質（ＴＲＦＰ）と呼ぶ（Ｖ ＣＢ又は掃除機バッグ蛋白質とも呼ばれる）。

これは周知の方法を用いて所望の単クローン性抗体を生成し、それを腹水から大 量に単離し、セファロース４Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｔａ）に固定することにより 行う。蛋白質標本は、猫を飼っている数軒の家庭から得た室内塵の掃除機バッグ から抽出した。掃除機バッグ水性抽出物を最初にゲル濾過して脱色し、続いてア フィニティークロマトグラフィー精製をした。掃除機バッグ水性抽出物に単りロ ーン性抗体−含有力うム上を通過させ、蛋白質増を溶離した。この方法により単 離した蛋白質は、ウェスターン法及びＥＬＩ　ＳＡ法を用いて、ヒトＩｇＥと結 合することが示され、従ってＴＲＦＰがアレルゲン活性を有することが示された 。アフィニティー精製ＴＲＦＰに関して多数の蛋白質化学的方法を行い、−次ア ミノ酸配列データを誘導した。ＴＲＦＰから誘導した配列を図６及び７に示す。

蛋白質配列分析に用いた方法はさらに実施例１に記載する。

非還元性条件下におけるウェスターン法により４０ｋＤ及び２０　ｋ　Ｄの種の 存在が示され、還元性条件下で１０−１８　ｋ　Ｄ及び５ｋＤの種が検出された （図８）。

５ｋＤのバンドは、鎖工蛋白質配列から誘導したペプチドに対して誘起されたア フィニティー精製抗−ペプチド抗血清（抗−Ｆｅｌ　２及び抗−Ｆｅ）　４）と 相互作用をし、１Ｏ−１８ｋＤのバンドは、鎖２蛋白質配列から誘導したペプチ ドに対して誘起された抗ペプチド抗血清（抗−Ｆｅｌ　１８）と相互作用をする 。従って５ｋＤバンド及び１Ｏ−１８ｋＤバンドはそれぞれＴＲＦＩ’ｌｌｌ及 び鎖２から誘導されたものである。アフィニティー精製ＴＲＦＰの約４０ｋＤと いう分子量（おそらく鎮１及び鎖２ヘテロダイマーの二量体であろう）、及びア フィニティー精製前のゲル濾過において検出される約１３０ｋＤの種が示す通り 、ＴＲＦＰは集合した形態で存在することができる。

ヒトＴ細胞反応性猫蛋白質（ＴＲＦＰ）をコードするＤＮＡ挿入物を含むクロー ンの同定 アフィニティー精製ＴＲＦＰの蛋白質化学的分析により、ＴＲＦＰが２個の共有 結合したペプチド鎖（鎖１及び２と示す；詳細は実施例１を参照）から成ること が決定された。さらにペプチド配列分析により、鎖１（７０アミノ酸；図６を参 照）及び鎖２（８３アミノ酸；図７を参照）の両方に関するかなりの一次配列デ ータが決定された。アミノ酸配列データは、ＴＲＦＰｌｍｌ及び２をコードする ｃＤＮＡ及びゲノムクローンのクローニング及び完全なヌクレオチド配列決定を 可能にする種々のクローニング戦略の案出に使用した（詳細を実施例２及び３に 示す）。

ＴＲＦＰのクローニングのためのｍＲＮＡの単離に最も良い組織材料を決定する ために、種々の猫の組繊を単クローン性抗体（Ｆｅｌ　ｄＩに対する）を用いた ＥＬＩＳＡ法により調べた。い（つかの唾液腺及び皮膚がかなりの量のＴＲＦＰ を含み、従ってＴＲＦＰをコードするクローンｃＤＮＡ配列を得る有用な材料と なることが決定された（表１を参照、表中−ｍ−は分析を行わなかったことを示 す）。

表１ マイクログラムＴＲＦＰ／ダラム組織 組織　猫１　猫２　猫３　猫４　猫５ 耳下腺　１，０３　１．４１　０．８１　０．３２　０．３０下顎　０．４１　 ２．３９　７．５０　２．５０　４．６６舌下　０．７７　−−−−　０．５０ 　３．１８　３．８２はぼ　−−−−−−−−２，０７８，５０１０，９臼歯　 −−一−−−−−７，５８１，４７２５，００口蓋　−−−−−−−−１，０３ ０，５３０，７７洗浄皮膚　５，８０　２．３０　−−−−　−−−−　−−− −ＴＲＦＰコードｃＤＮＡのクローニングのために、λｇｔｌｏ又はλｇｔｌｌ 　ｃＤＮＡライブラリのオリゴヌクレオチドスクリーニングを含む数種の方法を 使用することができる。別法として、ＴＲＦＰアミノ酸配列（図６及び７を参照 ）と反応性の抗−ペプチド抗血清を、標準的方法を用いたｇｔｌｌライブラリの スクリーニングに使用することかで３）。ＤＮＡを反応性クローンから単離し、 Ｓａｎｇｅｒ等の方法を用ヒトＴ細胞反応性猫蛋白質をコードするＤＮＡをクロ ーニングする他の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて猫の唾液 腺ｍＲＮＡからのＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを増幅してクローニングする方法であ る。混合オリゴヌクレオチド　プライマー（前向き及び逆向き）を既知のアミノ 酸配列から推定し、ＰＣＲにおいて使用し、部分的ｃＤＮＡクローンを生成する 。ｃＤＮＡの混合オリゴヌクレオチド感作増幅（ＭＭＯＰＡＣ（及び誘導法）は 、ＴＲＦＰ鎖１及び２をコードする部分的及び全長ｃＤＮＡの両方の単離に使用 した（詳細を実施例２に記載し、ヌクレオチド配列を図１−６に図示する）。Ｐ ＣＲ誘導ｃＤＮＡクローンは、実施例３に記載の猫ゲノムＥＭＢＬ４ライブラリ のスクリーニングのための３２ｐ−標識クローンとして使用した。

本文に記載の研究の結果、ＴＲＦＰのＭｌｌ及び鎖２をコードするｃＤＮＡ及び ゲノムクローンをクローニングし、単離し、配列を決定し；コードされる蛋白質 のアミノ酸配列を推定し、ＴＲ，ＦＰから誘導されるペプチドを周知の方法を用 いて同定し単離した。ＴＲＦＰの両鏡をコードする完全なヌクレオチド配列を図 １−５に主す。各ゲノムクローンのハイブリッド形成パターンは、鎮１及び鎖２ のｃＤＮＡが異なる遺伝子の生産物であることを証明する。猫の唾液腺ＲＮＡの ノザン法も、２種類の別のｍ、　ＲＮ　Ａの存在を示している。ゲノムクローン の配列決定によりハイブリッド形成の結果が確認された。実施例２に記載の通り 、ＰＣＲにより生成された各全長鎖１クローンは、その５゛末端において２種類 の異なる配列を持つことが示され、鎮１が２種類の二者択一的リーダー配列を有 することを示唆している。これは、鎖ｌゲノムクローンのＤＮＡ配列分析により 確認され、その分析はひとつの＠Ｉ１１の遺伝子が構造遺伝子の５′末端で近接 して結合する両方の２者択−的ジーダー配列を持つことを示している（図１，２ 及び６を参照）。

実施例４に記載の通り、ＴＲＦＰの鎮１又は鎖２の全体又はフラグメントをコー ドするｃＤＮＡクローンは、Ｅ、ｃｏｌｉ発現ベクター中にサブクローンされ、 調べた組み替えＴＲＦＰ蛋白質を発現した。＃ｌ［１配列又は鎖２配列のいずれ かに対するうさぎ抗−ペプチド抗血清を用いたウェスターン法は、適した結合特 異性を示した。

主題であるヒトＴ細胞反応性猫蛋白質（ＴＲＦＰ）及びそれをコードするＤＮＡ の利用 本文に記載の研究により得られる材料ならびにこれらの材料を含む組成物は、猫 アレルギーの診断、治療及び予防の方法に使用することができる。さらにｃＤＮ Ａ、（又はｃＤＮＡの逆転写のもとであるｍＲＮＡ）は、池の種（例えば羊、や ぎ、犬、うさぎ、馬）における類似配列の同定、従ってＴＲＦＰ　ｃＤＮＡとハ イブリッド形成するのに十分な相同性を有する配列の同定又は“抽出”に使用す ることができる。他の種からのそのような配列は、人間におけるこれらの動物に 対するア！ノルギーの治療に有用な蛋白質をコードし得る。これは例えば低緊縮 条件下で行うことができ、本文に記載の方法を用いてさらに評価するために十分 な相同性（一般に４０％以上）を有する配列を選ぶことができる。別法として、 高緊縮条件を用いることができる。この方法の場合本発明のＤＮＡは、他の種類 の動物（例えば犬、うさぎ、羊、やぎ、馬）において、ＴＲＦＰと類似のアミノ 酸配列を有するペプチドをコードする配列の同定に使用する、二とができる。こ れは、ハイブリッド形成文はＰＣＲクローニング法により行うことができる。従 って本発明は、本発明のＤＮＡ配列によりコードされるＴＲＦＰ又はペプチドの みでなく、本発明のＤＮＡとハイブリッド形成するＤＮＡによりコードされる他 のＴＲＦＰ−類似蛋白質又はアレルゲン性ペプチドも含む。

本発明のｃＤＮＡによりコードされるＴＲＦＰペプチドは、例えば猫−アレルギ ー患者の治療のための組成物において、猫アレルギーの診断法において、又は猫 アレルギーの診断あるいは治療の主要試薬であるアレルゲン抽出物の標準化にお いて、“精製”ＴＲＦＰとして使用することができる。本発明の蛋白質の使用に より、終始一貫した、定義の明確な組成及び生物活性を持つアレルゲン標本を作 ることができ、治療の目的で（例えば猫−過敏性患者の猫アレルギーに対するア レルギ一応答を修正するために）投与することができる。そのような蛋白質又は ペプチド（あるいは下記に記載するその修正物）は、例えば猫アレルゲンに対す るＢ−細胞応答、猫アレルゲンに対するＴ−細胞応答又は両応答を修正すること ができる。その精製ＴＲＦＰ又はペプチドも、猫ア１ノルギーの免疫療法の機構 の研究、及び免疫療法において非修正（“天然に存在する”）蛋白質又はペプチ ドより有用な修正誘導体又は類似体の設計に利用することができる。

他の研究者の研究により、免疫療法の間のアレルゲンの大量の投薬が一般に最も 良い結果（すなわち症状を最も軽減）を与えることが示された。しかし多くの人 々は、アレルゲンに対する不利な反応のためにアレルゲンの大量の投薬に耐える ことができない。

本発明は、現在のアレルゲン免疫療法と類似又はそれ以上の効力を持ち、そのよ うな治療の形態に通常伴う不利な反応のない、猫アレルギー患者のための治療法 を示すことができる。改良された治療は、修正天然ＴＲＦＰ又はペプチド、本文 で同定されたＴＲＦＰ遺伝子又はその適当な修正物（変異体）の発現生成物、又 はＴＲＦＰあるいはその修正物の構造から誘導したペプチドを使用して行うこと ができる。

例えば天然のＴＲＦＰ又はペプチドは、Ａ、、５ｅｈＯｎ等のポリエチＩノング リコール法を用いて、あるいは天然のアＩノルゲンのＩｇＥ反応性を減少させる 他の方法で修正することができ、それによってその不利な反応の可能性を減少さ せることができる。

他の場合、本文で定義するＴＲＦＰ　ｃＤＮＡ又はその一部は、適した系におい て発現し、治療活性が強いがＴｇＥと結合して不利な反応を起こす力が非常に弱 められた蛋白質を生産することができる。これを容易にするために、有効な精製 の助剤として鎖１及び／又は２のポリペプチドバックポーンにリポータ−基を加 えることができる。そのようなリポータ−基のひとつはポリヒスチジンであり、 これは固定金属イオンアフィニティークロマトグラフィー上で組み替え蛋白質を 精製するために有効に使用されてきた（Ｈｏｃｈｕ　１　ｉ、Ｅ、等、Ｂｉｏ／ Ｔｅｃｈｎ且±旦呈ヱ　旦＋１３２１−１３２５　（１９８８））。特異的切断 部位をリポータ−基及び鎖１及び２のポリペプチド配列の間に導入し、これらの 部位における切断により不適切な配列を含まないＴＲＦＰ鎖又はフラグメンＩ・ の単離を容易にすることができる。ＴＲＦＰ鎖１及び２の修正の他の例は、ジス ルフィド複合体を還元するためにシスティン残基をセリン（又は他の残基）など の他のアミノ酸残基で置換する例である。

ＴＲＦＰ　ｃＤＮＡの特定部位の突然変異誘発は、鎖１及び２の構造の修正にも 使用することができる。２本の鎖はそれぞれ＜４００ｂｐのコード配列から成る ので、そのような方法はＰＣＨにより（Ｈｏ等、Ｇ且旦至　ヱユ：　５１−５９ 　（１９８９））　、又は突然変異遺伝子の全合成により（Ｈｏ　ｓ　ｔ　ｏｍ ｓ　ｋｙ、Ｚ、等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、１６ １　：　１０５６−１０６３　（１９８９））行うことができる。細菌における 発現を強化するために、前記の方法を他の方法と組み合わせて使用し、構築物の 哺乳類のコドンをＥ、ｅｏｌ±で使用し易いコドンに変えることができる。

ＴＲＦＰ遺伝子の他の修正には遺伝子キメラの構築が含まれ、その場合は鎖１及 び２又はそれらの一部を結合して１本の連続した鎖を形成することができる。例 えば鎖１の全体又は一部を鎖２のｃＤＮＡの全体又は一部と結合し、得られたキ メラを組み替えハイブリッドとすることができる（Ｈｏｒｔｏｎ等、Ｇｅｎｅ　 ヱユ：６１−６８　（１９８９））。

又、多重結合遺伝子を構築し、発現生成物の安定性を増す、又はその治さらに本 文に記載の研究により、猫アレルギー患者からのＴ細胞を強力に刺激するペプチ ド　エピトープ配列を含むＴＲＦ・Ｐ蛋白質のある領域を同定することができた 。これらのＴ細胞エピトープは本質的に、猫アレルギーの臨床的症状に対応する 猫アレルゲンに対する免疫応答の開始及び永続に含まれると思われる。天然の猫 アレルゲンからのそのようなエピトープは、抗原提示細胞の表面の適当なＨＬＡ 分子と結合して関連したＴ細胞下部集団を刺激することにより、アレルギーカス ケードの初期の現象をＴヘルパー細胞の１ノベルで開始させると思われる。これ らの現象がＴ細胞の増殖、リンフ才力インの分泌、局所的炎症反応及びその部位 への免疫細胞の補充、ならびにＢ細胞カスケードの活性化を導き、抗体が生成さ れる。これらの抗体のひとつのイソタイプであるＩｇＥは、アレルギ一応答の発 生に基本的に重要であり、その生成はカスケード現象の初期のＴヘルパー細胞の レベルで分泌されるリンフ才力インの性質に影響される。従って外部から投与さ れたＴ細胞エピトープペプチドは、猫アレルゲンに対するアレルギ一応答の発生 又は永続に影響し、猫アレルギー患者の治療に利点を与える。従って猫アレルギ ー患者を本文の記載の通りに同定されたＴ細胞エピトープペプチドに暴露すると 、相当するＴ細胞下部集団が耐性になり、又はアネルギー化してもはや猫アレル ゲンに応答せず、そのような暴露に対する免疫応答の増加に関与しない。

別の場合、Ｔ細胞エピトープペプチドの投与により、リンフ才力イン分泌の様相 が天然のア１ノルゲンに暴露した場合とは異なった方向に向くことができ（例え ばＩＬ−４の減少及び／又はＩＬ−２の増加）、局所的炎症が軽減し、及び／又 は抗体の分泌の様相を有利に変えることができる。別の場合、Ｔ細胞エピトープ ペプチドへの暴露により、通常猫アレルゲンへの応答に関与するＴ細胞下部集団 を、通常のアＩノルゲンへの暴露の部位（鼻粘膜、皮膚、肺）からペプチドの治 療的投与の部位に引っ張ることができる。このＴ細胞下部集団の再分布は、通常 の暴露の部位でアレルゲンに対して通常の免疫応答を開始する患者の免疫系の能 力を改善する又は減少させることができ、アレルギー症状を軽減することができ る。

ＴＲ，ＦＰの構造内からの種々の大きさのペプチドを合成し、従来の方法で精製 し、ヒト猫アレルギー患者から得たＴ細胞ライン及びクローンに対する生物学的 効果を調べた。使用した方法を実施例５．６及び７に記載する。

ＴＲＦＰの構造内からのペプチドは、ＴＲＦＰ感作Ｔ細胞培養における増殖応答 を刺激することが示された。実際ある場合には（図９）、ペプチドを用いて得ら れた増殖応答は、ＴＲＦＰ又は猫皮膚試験アレルゲン標本を用いて得られる応答 以上である。

ＴＲＦＰ配列のある領域が弱いＴ細胞刺激活性を持ち（例えばＦｅ１４−３、Ｆ ｅ１２８−１）、他のある領域が強い活性を持つ（例えばＦｅ１ｔ９−３、Ｆｅ １１４）ことも明らかである（表２及び３）。この活性の範囲は、純粋な一次配 列の差、又は−欠配列の変化により誘起された生理化学的差から起こる。猫アレ ルギー患者からのＴ細胞との反応性の高い、ＴＲＦＰの構造内からの主要ベブチ ドエピトーブは、本発明及び周知の方法を用いて同定することができる。

さらに、治療管理条件をまねた条件下の試験管内でＴ細胞をエピトープペプチド に暴露すると、アレルゲン（ＴＲＦＰ）へのその後の応答をアレルゲンのみを用 いた場合の応答と比較して非常に抑制することができることが示された（実施例 ６９表４）。このデータは、本研究により同定されたエピトープペプチドを選択 し、猫アＩノルギー患者において猫アレルゲン暴露に対する応答を抑制するよう 設計した治療例にそれを適用する明確な機会を示している。

さらに猫アＩノルギー患者からのＴ細胞をＴＲＦＰからの種々のエピトープペプ チドに暴露することにより、明確に異なるリンフ才力イン分泌の様相が現れるこ とが示された（実施例７１表５）。従って本発明を用いて、猫アＩノルギー患者 の治療上有利な応答と一致する様相でリンフ才力インを分泌させるエピトープペ プチドを、治療に使用するために選ぶことが可能である。

実質的に純粋なＴＲＦＰ、組み替えＴＲＦＰ又は修正ＴＲＦＰであることができ る本発明のＴＲＦＰ蛋白質又はペプチドの、脱感作したい患者への単独の、又は 組み合わせた投与は、周知の方法を用いて行うことができる。ペプチド又は２種 類かそれ以上のペプチドの組み合わせは、例えば適した緩衝液、キャリヤー及び ／又はアジュノくシトをも含む組成物として患者に投与することができる。その ような組成物は一般に注射、吸入、経皮膚適用、鼻孔自適用、経口適用又は経直 腸投与により投与する。現在得られる構造に関する情報を用いて、猫アレルギー 患者に十分な量で投与した場合に猫アレルゲンに対する患者のア１ノルギ一応答 を改良することができるＴＲＦＰ又はペプチドを設計することができる。これは 例えばＴＲＦＰの構造を調べ、ペプチドを生成して猫アＩノルギー患者のＢ−細 胞及び／又はＴ−細胞応答に影響する能力を調べ、細胞が認識する適したエピト ープを選ぶことにより行うことができる。エピトープの配列に似せてあり、猫ア １ノルゲンに対するア１ノルギ一応答をダウンレギュレーションすることができ る合成アミノ酸配列を製造することができる。本発明の蛋白質、ペプチド又は抗 体は、周知の方法で猫アレルギーの検出及び診断に使用することもできる。例え ば猫アレルゲンに対する感応性を評価するべき患者から得た血液を、ＴＲＦＰの 単離ペプチドと、血液中の成分（例えば抗体、Ｔ細胞、Ｂ細胞）のペプチドとの 結合に適した条件下で合わせる。その後直接（例えばＴ細胞活性の決定）又は間 接法により結合が起きた程度を測定する。

ここで、猫アレルギー患者においてアレルギー反応を起こす猫アレルゲンの能力 を遮断する又は阻害することのできる試薬又は薬剤を設計することもできる。そ のような試薬は、例えば対応する抗−猫アレルゲンＩｇＥと結合し、ＩｇＥ−ア レルゲン結合及びその後の肥満細胞の脱顆粒を防ぐように設計することができる 。別の場合、免疫系の細胞成分と結合し、猫アレルゲンへのアレルギ一応答を抑 制する、又は脱感作する試薬を設計することができる。これらの中で非−制限的 な例は、本発明のヒトＴ細胞反応性猫蛋白質のｃＤＮＡ／蛋白質構造に基づく適 したＢ−及びＴ−細胞エピトープペプチド、又はそれらの修正物を利用して猫ア レルゲンに対するアレルギ一応答を抑制する例である。これは、猫−過敏性患者 からの血液細胞を用いた試験管内研究により、Ｂ−及びＴ−細胞機能に影響する Ｂ−及びＴ−細胞エピトープペプチドの構造を定義することにより行うことがで きる。この方法は実施例５に詳細に記載す治療又は予防効率、安定性（例えば保 存できる期間の長さ）及び体内におけるＴＲＦＰペプチドの分解に対する抵抗性 の増進のために、ＴＲＦＰのエピトープを修正する、エピトープを結合する、又 はその両方を行うこともできる。例えばエピトープ機能に必須のアミノ酸残基を 周知の方法（例えば各残基を置換しＴ細胞活性の存在又は不在を決定する）を用 いて決定することができる。必須であることが示されたアミノ酸残基を（例えば Ｔ細胞活性を強化することが示された他のアミノ酸により置換することにより） 修正することができるし、Ｔ細胞活性に不必要な残基を（例えば挿入することに よりＴ細胞活性を強化する他のアミノ酸により置換することにより）修正するこ ともできる。

２個又はそれ以上のＴＲＦＰエピトープを、例えば治療効果の増進のために結合 させることもできる。例えば最初の３ＯＮ−末端アミノ酸内に存在する２個のエ ピトープのアミノ酸配列を生成してリンカ−により結合することができる。エピ トープを結合するリンカ−は、いずれの非−エビトープアミノ酸配列、又は他の 適した結合試薬であることもできる。このようにして結合するエピトープは、Ｔ ＲＦＰの同−鎖からのエピトープ、又は異なるＴＲＦＰ鎖からのエピトープ（例 えば１個が鎖１からであり他が鎖２から）であることができる。得られる２−エ ピトープ構築物は、猫−過敏性患者の治療に使用することができる。別の場合、 ＴＲＦＰの第１鎖に存在するエピトープ及び第２鐘に存在する１個（又はそれ以 上）のエピトープを結合して単一のエピトープペプチドより治療効果の大きい構 築物とすることができる。さらに各エピトープを物理的に混合して治療薬として 投与することができる。

本発明のいずれの具体化においても、使用するＤＮＡは本文で得たＣＤＮＡであ ることができ、又は別の場合、図１−７に示すアミノ酸配列の全体又は一部をコ ードするいずれのオリゴデオキシヌクレオチド配列又はその機能的同等物である こともできる。そのようなオリゴヌクレオチド配列は、周知の方法を用いて化学 的に又は機械的に生成することができる。オリゴヌクレオチド配列の機能的同等 物は、図１−７の配列（又は対応する配列部分）がハイブリッド形成することが できる相補的オリゴヌク１７オチド配列とハイブリッド形成することができる配 列、及び／又は図１−７の配列（又は対応する配列部分）によりコードされる生 成物と同一の機能的特性を持つ生成物をコードする配列である。機能的同等物が ひとつ又は両方の基準を満たすかどうかは、その利用に依存するであろう（例え ばオリゴプローブとしてのみ使用する場合、第１の基準のみを満たせば良（、ア レルゲンの生成に使用する場合は、第２の基準のみを鵬たせば良い）。

図１−７のアミノ酸配列から得られる、又は推定することができる構造に関する 情報（例えばＤＮＡ、、蛋白質／ペプチド配列）は、猫アレルギー反応において 重要なＴ細胞エピトープペプチド及び／又はＢ細胞エピトープペプチドの同定又 は定義、及びこれらの反応が起こる機構の媒介物（例えばインターリューキン− ２、インターリューキン−４、ガンマインターフェロン）の解明にも使用するこ とができる。これを知ることにより、ペプチドに基づ（猫アレルゲン治療薬、又 はこれらの応答の軽減に使用できる薬剤の設計が可能になる。

ここで以下の実施例により本発明をさらに説明するが、これはいかようにも本発 明を制限するものではない。

実施例１．７細胞反応性猫蛋白質（ＴＲＦＰ）の単離及び蛋白質配列分室内層抽 出物からのＴ細胞反応性電量白質の単クローン性アフィニティー精製 猫を飼っている数軒の家庭から集めた室内塵試料を使用してＴＲＦＰを単離、精 製した。単クローン性抗体ＩＧ９又は６Ｆ９をセファロース４Ｂとカップリング し、公開された案に従った精製に使用した。Ｃｈａｐｍａｎ、　Ｍ、　Ｄ、　、 等、Ｊ、Ｉｍ、ｍｕｎｏｌｏｇｙ、１４０　（３）：８１２−８１８　（１９８ ８）、精製ＴＲＦＰを、４ＮのＮａＣｌを用いてフェニル−セファロースカラム （Ｐｂ　ａ　ｒｍａ　ｃ　ｉ　ａ）に負荷ｊハ２Ｍ及びＩＭのＮａＣｌを用いて 溶離することにより脱色した。２Ｍ及びＩＭ塩塩溶初物蒸留水に対して透析する することにより回収し、凍結真空乾熾した。アフィニティ−精製の前に室内塵抽 出物をセファクリル２００カラム（Ｐｈａ　ｒｍａｃ　ｉ　ａ）に通過させるこ とによっても脱色を行った。

ＴＲＦＰペプチドの調製 アフィニティー精製ＴＲＦＰを最初にジチオトレイトールで還元し、その後４− ビニルピリジンでアルキル化した。セファデックスＧＩＯカラムで脱塩した後１ 、還元及びアルキル化ＴＲＦＰをシアノーゲンブロミド（ＣＮＢｒ）を用いて化 学的に、又は以下の酵素のひとつを用いて酵素的に切断した。エンドペプチダ− ゼ　Ｇｌｕ−Ｃ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、！ンドプロテイ ナーゼ　Ａ、５ｐ−Ｎ（Ｂｏｅｈｒｉｒ＋ｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、エンド ペプチダ−ゼ　Ｌｙｓ−Ｃ（Ｂｏｅｈｒ　ｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅ　ｉｍ、） ｏ又、アフィニティー精製ＴＲＦＰを、還元及びアルキル化をせずにトリプシン （Ｗ。

ｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）により消化した。消化生成物をＡｑｕａｐｏｒｔＲＰ３０ ０カラム（Ｃ８）上で０．　１％の三フッ化酢酸（ＴＦＡ）中のアセトニトリル の濃度勾配を用いて分離した。各ピークを蛋白質配列分析装置にかけた。

ペプチド及び蛋白質配列分析 Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　４７７Ａ気相配列分析装 置を単線フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）７ミ／酸分析（Ｍｏｄｅｌ　１２ ＯＡ）と共に用いた。アミノ酸回収を改良するために、抽出プログラムの修正、 多重ブチルクロリド抽出を使用した。プロリンがアミノ末端に位置する場合は第 １アミンの遮蔽のためにＯ−フタルアルデヒドを用いた。Ｂｒａｕｅｒ、Ａ、Ｗ 、、等、　Ａ、ｎａｌ、Ｂｔｏｃｈｅｍｓｔｒｙ、１３ユ８１３４−１４２　（ １９８４）、非求核的還元剤、トリブチルホスフィンを用いてｉ２撮アルキル化 を行い、それに付随してエチルモルホリン緩衝液中で４−ビニルピリジンにより アルキル化を行った。Ａｎｄｒｅｗｓ、Ｐ、Ｃ，ａｎｄ　Ｄｔｘｏｎ、Ｊ。

Ｅ、、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　、ＩＦＩ：５２４−５２８（１９８ ７）。完全なＴＲＦＰ蛋白賃蛋白−末端蛋白質配列分析により、１個の主要なア ミノ酸配列及び数個の微量アミノ酸配列があることが明らかになった。主要な配 列（図６の鎖ｌ）は、公開されたＦｅｌ　ｄＩＮ−末端３３アミノ酸残基に対応 するが、２つの重大な差がある。

Ｃｈａｐｍａｎ、Ｍ、Ｄ、等、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１４０　（３）：８ １２−８１８　（１９８８）。最も多い微量配列（主要配列の５５％の量）を鎖 ２とする（図７）。池の微量配列は、鎖２のＮ−末端を切断した種々の形態であ る。鎖１の４番目の残基及び鎖２の７番目の残基がプロリンなので１、それぞれ エドマン分解の第４循環又は第７循環の前に鎖２又は鎖１の配列を遮蔽するため に、Ｏ−フタルアルデヒドを適用した。ｔＬ（６８Ｎ−末端アミノ酸残基）及び 鎖２（５８Ｎ−末端アミノ酸残基）の蛋白質配列に関する情報は、鎖１及び鎖２ に関するそれぞれ第３２循環及び第３７循環の前の別のＯＰＡ遮蔽によりさらに 増加した。

蛋白質配列は、酵素的又は化学的消化ペプチドの配列分析により確認され、拡張 された。配列分析装置のガラスフィルター円板上でのＴＲＦＰの時間依存性その 場ＣＮＢ　ｒ；１！ｌ化により、さらに蛋白質配列に関する情報を得ることがで きた。Ｓｉｍｐｓｏｎ、Ｒ，Ｊ、ａｎｄ　Ｎ１ｃｅ。

Ｅ、　（：ｌ、　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｔｎｔｅｒｎａｔｉ、ｏｎａｌ、　Ｆ ３：　７８７−７９１　（１９８４）、ｅＯ盪ＣＮＢｒ消化の前に、５回の配列 分析循環を行い、その後蛋白質試料を酢酸無水物で処理してすべてのアミノ基を 遮蔽した。これらの段階により、測鎖からＮ−末端５残基が除去され、測鎖及び 試料中の他のすべてのペプチドから次の残基のアミノ基が遮蔽された。＋＋７） 擾ＣＮＢｒ消化の５時間後、ひとつの主要ペプチド配列、ＣＢ−１及び主要ペプ チド配列の６０％（ＣＢ−２）　、３８％（ＣＢ−３）及び１２％（ＣＢ−４） のシグナルレベルを持つ３個の微量ペプチドが同定された。ＣＢ−１は、鎖２の 残基４３から出発し、鏑２のＮ−末端配列を６８残基まで伸びていた。ＣＢ−２ は、鎖２の精製ＣＮＢ　ｒペプチド配列と同一であった（７５−８０）。ＣＢ− ３は、鎖２の短鎖の形態のペプチド配列６５−６８に対応した。ＣＢ−４は、鏑 １のペプチド配列５０−６６に対応した。トリプシンペプチド、ＴＲＹＰ−１（ 鎖２の短鎖型、５８−８０）を１、エンドペプチダーゼ　Ａｓｐ−Ｎ生成ペプチ ド、Ｄ−１０（鎖２．７２−８３）を用いて６８残基Ｎ−末端ペプチドと結合し 、鎖２を８３アミノ酸残基まで伸長した。エンドペプチダーゼ　Ｌｙｓ−Ｃ生成 ペプチド、Ｋ１３　（！１．６４−７０）は、鎖１を７０アミノ酸残基まで伸長 した。他の酵素及びＣＮＢｒ生成ペプチドにより、鎖１及び鎖２のＮ−末端配列 を確認した。短鎖トリプシンペプチド、ＴＲＹＰ−２（長鎖型鎖２．５８−６９ Ｌ及びエンドペプチダーゼ　Ａｓｐ−Ｎペプチド、Ｄ−１０の配列は、鎖２の残 基６５−７２に配列の多重性があることを明らかにした。蛋白質配列分析法によ り得られたＴＲＦＰ鎖１及び２の一次アミノ酸配列をまとめて図６及び７に示す 。ｃＤＮＡ由来のアミノ酸配列、Ａ　ｓ　ｎ３３−Ａ　Ｉ　ａ、、−Ｔｈ「、５ には、有力なＮ−グリコジル化部位が存在する。蛋白質配列分析は、鎖２のＡ、 Ｉａ、、、及びＴｈｒ３．、を同定したが、３３位にはなにも同定できなかった 。これは、鎖２のＡｓｎ、、６において翻訳後修正が起こり、その修正が蛋白質 配列分析の間の三フフ化酢酸処理に安定であることを示唆している。この仮定は 、５ＤＳ−ＰＡ、ＧＥ／ウェスターン法において鎖２の大きさを７−１２ｋＤに 減少させるＮ−ペプチダーゼ　Ｆ（Ｂｏｅｈｒｔｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ） を用いてＴＲＦＰを処理することにより確認された。さらに両鏡は、β−説離に より修正することができ、〇−結合グリコシル化を有することを意味する。２本 の鎖は、ジスルフィド結合により互いに共有結合している（約２０ｋＤ）。

実施例２６　ヒｌ−Ｔ細抱反応性猫蛋白質（ＴＲＦＰ）のｆｉｎ及び２をコード するｃＤＮＡのクローニング ＭＯＰＡＣ（及び誘導法）を、ＴＲＦＰ＠Ｉ及び２をコードする部分的及び全長 ｃＤＮＡの単離に使用した。使用したＰＣＲ法を下記に詳細（こ記載する。

ＴＲＦＰ！ｊ［１のｃＤＮＡのクローニング第１鎖ｃＤＮＡの合成を、１μｇの ポリアデニル酸及び猫の耳下腺及び下顎腺のプール試料からオリゴｄＴプライマ ーを用いて単離したＲＮＡを用いて行つた。

鎖１の内部のＭＯＰＡＣＰＣＲ増幅（Ｌｅｅ等、５ｃｉｅｎｃｅ２３９　：１２ ８８−１２９１　（１９８８））は、それぞれ鎖１のアミノ酸１−６及び５０− ５４をコードする退化オリゴヌクレオチドブライマーのセンス／アンチセンス対 を用いて行った（下記参照）。これらのオリゴヌクレオチド（プライマー１及び ２）は、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ　ＰＣＲキットと共に用い、以 下のサイクルを用いて上記のｃＤＮＡのアリコートを増幅した１９４℃　１分　 （変性） ４５℃　１分３０秒　（アニーリング）７２℃　１分　（重合）　５サイクル ９４℃　１分　（変性） ５５℃　１分３０秒　（アニーリング）７２℃　１分　（重合）　２０サイクル 上記ＰＣＲ反応物の１０分の１を３％ＮｕＳｉｅｖｅ　Ａｇａｒｏｓｅゲル上で 分別した。予想した大きさのＤＮＡバンド（１７２塩基対）が観察された。その 後このゲルを変性条件下にてＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎＰｌｕｓナイロン膜上で“サ ザズ分析し、３５℃にて５ｘＳＳＣ中で３２ｐ末端櫟識特異的オリゴヌクレオチ ドプローブ（Ｆ、ｅｌ　１）とノ＼イブリッド形成させ、４８℃で２ｘＳＳＣで 洗浄した。１７３塩基対ノくンドが鎖１特異的プローブにハイブリッド形成した 。

ＰＣＲ反応物の残りを立上ａｌ及びにユニ　Ｉを用いて制限消化し、分取３％Ｎ ｕＳｉｅｖｅアガロースゲル上で分別し、１７３塩基対バンドを切り出した。フ ラグメントを立上ａ　Ｉ／Ｘｈｏ　Ｉ消化ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔプラスミド（Ｓ ｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に連結し、５ｅｑｕ　＆　ｌｉ　ａ　Ｓ　ｅキット（Ｕ Ｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いてＳａｎｇｅｒ／ジデオキシＤＮＡ配列 分析を行った。図１に示すこの分析によるデータは、ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメ ントの配列が、翻訳されるとＴＲＦＰの鎖１の蛋白質配列の内部と一致すること を示している。

ＴＲＦＰをコードする鎖１ｃＤＮＡの３′末端をＲＡ、ＣＥ　ＰＣＲ法に従って クローニングした。Ｆｒｏｈｍａｎ、Ｍ、Ａ、、Ｄｕｓｌｉ、、Ｍ。

Ｋ、ａｎｄ　Ｍａｒｔｉｎ、Ｇ、Ｒ，５ｃｉｅｎｃｅ　８５：８９９８−９００ ２　（１９８８）。

第１鎖ｃＤＮＡの合成を、１μｇのポリアデニル酸及び猫の耳下腺及び下顎腺の プール試料からＥＤＴプライマー及び５ｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素を用い て単離したＲＮＡを用いて行うた。

プライマー３及びＥＤプライマーをそれぞれ５′及び３′特異的プライマーとし て使用して、鎖１のカルボキン末端部分のＲＡＣＥ　ＰＣＲ増幅を行った。プラ イマーをＰｅｒｋｉｎ　Ｅ１ｍｅｒ／ＣｅｔｕｓＰＣＲキットと共に用い、以下 のサイクルを用いて上記ｃＤＮＡのアリコートを増幅した： ９４℃　１分　（変性） ５５℃　１分３０秒　（アニーリング）７２℃　１分　（重合）　３０サイクル 上記ＰＣＲ反応物の１０分の１を２％アガロースゲル上で分別した。

上記のようなＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓナイロン膜上へのゲルの“サザン ”分析、及び鎖１特異的オリゴヌクレオチドプローブ（Ｆｅ１１）へのハイブリ ッド形成の後、ＴＲＦＰ鎖１の３′末端をコードするｃＤＮＡと考えられるバン ドは検出されなかった。

鋳型として最初のＰＣＲ反応生成物の１／１００アリコートを用い、プライマー としてプライマー４（プライマー３でコードされるアミノ酸のちょうど３′のア ミノ酸をコードする）及びＥＤオリゴヌクレオチドを用い、第１の増幅の場合に 用いたサイクルと同一サイクルで第２のＰＣＲ反応を行った。この“ネスト”Ｐ ＣＲ反応は、ＴＲＦＰ鎖１のｃＤＮＡから誘導した第１のＰＣＲ反応の生成物を 特異的に再増幅する。

この第２のＰＣＲ反応物の１０分の１を２％アガロースゲル上で分別した。上記 のようなＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ、Ｐｌｕｓナイロン膜上べのゲルの“サザン”分 析、及び＠１特異的オリゴヌクレオチドプローブへのハイブリッド形成の後、約 ３５０塩基対の長さのＤＮＡバンドが検出された。

第２のＰＣＲ反応物の残りを立上ａＩ及びｘｈ旦　Ｉを用いて制限消化し、分取 １％Ｓ　ｅ　ａ　Ｐ　１　ａ　ｑ　ｕ　ｅアガロースゲル上で分別し、３５０塩 基対バンドを切り出した。フラグメントを９工ａ　Ｉ／Ｘｈｏ　Ｉ消化Ｂｌｕｅ ｓｃｒｔｐｔプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に連結し、５ｅｑｕｅｎａ ｓｅキツト（ＵＳ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いＴｓａｎｇｅｒ／ジデオ キシＤＮＡ配列分析を行った。図１に示すこの分析によるデータは、ＰＣＲ増幅 ３５０塩基対ＤＮＡフラグメントの配列が、翻訳されるとＴＲＦＰの鎖１のカル ボキシ末端の蛋白質配列と一致することを示している。ＤＮＡ配列分析は、７２ の位置のシスティンコドンに隣接する停止コドンも明らかにしており、ＴＲＦＰ の鎖１の蛋白質配列分析が完全に行われたことを示している。さらに、３５０塩 基対フラグメントの３゛非翻訳ＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡの３゛末端に特異的な原 型的ポリアデニル化信号を有する。

ＫＤＴプライマー ５　’　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｔ　ＣＴ　ＣＴ　Ａ　Ｇ　Ａ、　ＣＴ　Ｇ　ＣＡ 　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ｉｓ　−３’ＥｃｏＲＩ　Ｘｂａ　Ｉ　Ｐａｔ　Ｉ ＴＲＦＰ鎖２のｃＤＮＡのクローニング第１鏡ｃＤＮＡを、５匹の猫の耳下腺／ 下顎線のプールから調製したｍＲＮＡのオリゴ（ｄＴ）感作を用いて市販のキッ トにより合成した。

ＭＯＰＡ、Ｃを用いて鎖２の内部配列を決定した。

ヒトＴ細胞反応性電量白質鎖２の蛋白質配列に基づいて２個の過剰オリゴマーを 合成した： オリゴマー＃５６ に れは、アミノ酸２−８　（ＫＭＡＥＰＣＴ）をコードするコード鎖配列に対応す る。

オリゴマー＃５７ これは、アミノ酸４２−４８　（ＭＫＫｆＱＤＣＹ）と相補的な非−コード鎖配 列に対応する。

オリゴマー５６は、クローニングのために付加されたＥｃｏ　ＲＩ制限部位を持 ち（下線）、オリゴマー５７は、クローニングのために付加リボマーにおいてイ ノシン（Ｕ）を１回用いて最終的オリゴマーの過剰性を減少させた。

１００ピコモルの各プライマー及び第１鎖ｃＤＮＡを用い、増幅のために以下の 条件を用いてＰＣＲを行った；９４℃にて１分間の変性；４５℃にて１．５分間 のプライマーアニーリング；７２℃にて２分間の伸長、繰り返しサイクル４回。

上記の変性：５５℃にて１．５分間のアニーリング；上記の伸長；第２の繰り返 しサイクル１９回（合計２５サイクル）。

鎖２の配列を含む２個のｃＤＮＡクローンを同定した。両クローンは同一の配列 を持っていた。原型クローンは、Ｆ２．ｍである。

ＴＲＦＰをコードする鎖２のｃＤＮＡのＣ０ＯＨ末端をＲＡＣＥ　ＰＣＲ法に従 ってクローニングした。第１鎖ｃＤＮＡを上記の記載の通りにｍＲＮＡから合成 した。

鎖２の増幅に使用したオリゴマーは・ オリゴマー＃５９　５’　ＧＧＡＴＣＧＡ、ＴＧＡＡＴＴＣＧＧＴＧＧＣＣＡＡ ＴＧＧＡＡＡ、ＴＧ、これは鎖２のアミノ酸１９−２３　（ＶＡＮＧＮ）をコー ドするコード鎖配列に対応し、クローニングのためのＣ１ａＩ及びＥｃｏ　ＲＩ 制限部位を含む。

オリゴマー＃６１　５’　ＡＴＴＡＣＴＧＴＴＧＧＡＣＴＴＧＴＣＣＣＴ、これ は鎖２のアミノ酸２３−２８　（ＬＬＬＤＬＳ）に対応する。

及び上記のＥＤ／ＥＤＴプライマー。

“ネストプライマー”を用いて２回のＰＣＲ反応を行った。最初のＰＣＲ反応で は、１００ピコモルのオリゴマー５９及び３：１の比率のＥＤ及びＥＤＴプライ マーを１００ピコモル使用した。増幅条件は、鎖２の内部配列を得る場合に使用 した条件と同一である。プライマーＰＣＲの０．０１体積を、１００ピコモルの オリゴマー＃６１（“ネストプライマー”）及び１００ピコモルのＥＤプライマ ーを用い、標準的条件で再増幅した。

増幅フラグメントをクローニングし、配列分析をして鎖２のＣ０ＯＨ末端を得た 。２種類の原型クローン・Ｆ１５．ａ及びＦ１５．ｄがあった。Ｆ１５．ａは、 鎖２の主要蛋白質配列のひとつと一致し、Ｆ１５ｄは、第２の蛋白質配列と一致 した。Ｆｌ！５．ａを、“長鎖“配列と呼び、Ｆ１５．ｄを“短鎖”配列と呼ん だ。Ｆ１５．　ａ′ｙＡびＦ１５．ｄの間には７群のアミノ酸の違いがあり、５ 群はアミノ酸の変化であり、２群はＦ１５．ａｌ：対してＦ１５．ｄのアミノ酸 の欠失である（図６及び７参照）。

２匹の猫の皮膚からのｍＲＮＡ、ならびにプールされた唾液腺からのｍＲＮＡか ら、鎖２を単離した。皮膚の試料は別々の採取した。皮膚Ａ（唾液腺プールの形 成に使用した５匹の猫の１匹）は、鎖２の短鎖の形態のみをコードするｍＲＮＡ 、を有していた。皮膚Ｂ（唾液腺プールの形成に使用した５匹の猫に含まれない ６番目の猫から）は、−２の短鎖及び長鎖の両形態のためのｍＲＮＡを３：１（ Ｓ：Ｌ）の比率で含んでいた。皮膚中に鎖２の３番目の形態が見いだされた。こ れを先端を切り落とした短鎖という意味で“ＳＴ”と呼ぶ（図５）。ＳＴは、連 続した１６個のアミノ酸が短鎖型と異なり、短鎖の配列の最後の１０アミノ酸が 欠失している。このクローンの例は、皮膚Ａ及び皮膚Ｂの両方からのｍＲＮ　Ａ 、に見いだされた。鎖２の長鎖は、唾液腺の鎖２の主要形態である（２３／２４ クローン）。鎖２の短鎖は、皮膚の饋２の主要形態であり（２匹の猫から２０／ ２５クローン）、長鎖の形態（皮膚Ａでは０／１３クローン、皮膚Ｂでは３／１ ２クローン）及びＳＴ形（２匹の猫から２／２５クローン）は微量形態であるこ とがわかる。上記の方法にょうて得たＴＲＦＰ鎖１及び２の完全なヌクレオチド 配列のまとめを図１−５に示す。

鎖２の長鎖の多型性が１匹の猫からの皮膚のｍ、　ＲＮ　Ａ中に検出された。

この多型性には、アミノ酸５５におけるイソロイシンのロイシンへの置換、及び 位置７４におけるメチオニンのトレオニンへの置換が含まれる。

ＴＲＦＰ鎖１及び鎖２のＮＨ２末端のクローニング第１及び第２鎖ｃＤＮＡを、 市販のキットを用い、５匹の猫の耳下腺／下顎線のプールから調製したｍ　ＲＮ 　Ａ、のオリゴｄＴ感作により合成した。二重鎖ｃＤＮＡをプラントし、プラン トエンドを、アニールしたオリゴマー＃６８及び＃６９（下記参照）に連結した 。Ｒａｆｎ、ａｒ等式。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、印刷中、に記載のこれらのオリゴマーは、用するよ うに設計され、Ｒｏｕｘ　ａｎｄ　Ｄｈａｎａｒａｊａｎ、１９９０　ＢｉｏＴ ｅｃｈ、旦：４８−５７により修正された。これらのオリゴヌクレオチドは完全 に相同ではなく、従って自己感作をしない。

オリゴマーはすべてのｃＤＮＡにブラントエンドするであろう。

オリゴマー＃６８　鋳型、プラントアンカー５’　ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＧＴＡ ＣＣＧＴＣＣＧＡ、ＴＣＧＡ、ＴＣＡＴＴオリゴマー＃６９　リンカ−、プラン トアンカー５’　ｐ−ＡＡＴＧＡＴＣＧＡＴＧＣＴオリゴマー＃６４アンカープ ライマー（ＡＰ）は、５“　ＱＧＧＴＣＴＡ、ＧＡＧＧＴＡＣＣＧＴＣＣＧであ った。

ＴＲＦＰ鎖２のＮＨ，末端のクローニング鏑２の内部ヌクレオチド配列に基づい て２個のオリゴマーを合成した： オリゴマー１６０　５’　ＣＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＣＴＣ ＴＣＴＧＧＴＴＣＡ、ＧＴ、これはアミノ酸３５−４０　（ＴＥＰＥＲＴ）をコ ードする配列と相補的な非−コード鎖配列に対応する。

オリゴマー＃７０　５”　ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＡＴＴＣＴＡＧＴＣＡ、ＧＣＣＴ ＧＡＴＴＧＡ、これは、３’　ＵＴ領領域非−コード鎖配列に対応する。両オリ ゴマーは、アンチセンス鎖配列と一致し、クローニングのた“ネストプライマー ”を用いて２回のＰＣＲ反応を行った。増幅条件は、ＭＯＰＡＣで使用した条件 と同一である。策１の増幅反応は、オリゴマー＃６４　（ＡＰ）及び＃７０を用 いて行った。第１ＰＣＲの生成物の０．０１体積をオリゴマー＃６４及び＃６０ （これは“ネスト”、すなわちオリゴ＃７０に対して内部である）を用いて再増 幅した。増幅した素材を回収し、クローニングし、配列分析した。

ＴＲＦＰ鎖１のＮＨ，末端のクローニング鎖１の内部配列に基づくオリゴマーを 合成した：オリゴマー＃６６５°　ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＴＴ ＣＡＧＴＡＴＴＣＴＧＧＣＡ、これは鎖１のアミノ酸３８−４３　（ＡＲＩＬＫ Ｎ）をコードする配列と相補的な非−コード鎖配列に対応する。クローニングの ために、制限部位Ｐｓ±　Ｉ及びｘ立旦　■を付加した。

７ネストプライマー”を用いて２回のＰＣＲ反応を行った。増幅条件は、ＭＯＰ ＡＣで使用した条件と同一である。第１の増幅反応は、プライマー２（上記）及 び＃６４（ＡＰ）を用いて行った。第１ＰＣＨの生成物の００１体積をオリゴマ ー＃６４及び＃６６（これは“ネスト″、すなわちプライマー２に対して内部で ある）を用いて再増幅した。増幅した素材を第１ＰＣＲから回収し、クローニン グし、配列分析した。２種類の５“配列を得、リーダーＡ及びＢと名付けた（図 １及び２）。

リーダーＡを持つ鎖１は、唾液腺及び皮膚ｍＲＮＡの両方において主要配列であ る。皮膚Ａからのｍ　ＲＮ　Ａ標本中にリーダーＢ配列を持つ鎖１を検出するこ とはできなかった。リーダーＢ配列を持つ！Ｊ１１は、唾液腺及び皮膚Ｂのプー ル標本の両方においてｍＲＮＡの微量成分であった。

実施例３．ＴＲＦＰをコードするＤＮＡを含むクローンの同定のための猫ゲノム ＤＮＡライブラリのスクリーニング出発材料として猫肝臓ＤＮＡを用いたＥＭＢ Ｌ４猫ゲノムライブラリを、Ｆｒ１ｓｃｈａｕｆ、Ａ、−Ｍ、等、Ｊ、Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、１７０　：　８２７−８４２　（１９８３）に記載の推奨法を用いて 構築した。ＥＭＢＬ４猫ゲノムライブラリを、プローブどして３２ｐ−標識鎖１ 及び鎖２ｃＤＮＡを用いてスクリーニングした。ライブラリをプレート化し、ス クリーニングすることにより、鎖１又は鎖２ｃＤＮＡプローブのどちらかとハイ ブリッド形成するが両方とはしない各ゲノムクローンを得た。

このハイブリッド形成パターンは、鎖工及び鎖２ｅＤＮＡが異なる遺伝子の生産 物であることを証明した。ＵＰ−標識ＴＲＦＰ＃ＩＡＩ又は２のＣＤＮＡを用い て試験した猫唾液腺ＲＮＡのノザン分析も、２種類の異なるｍＲＮＡの存在を示 した。ゲノムクローン（ＣＴＧｃｂｌ及びＣＴ　Ｇｃ１〕２と呼ぶ）のＤＮＡ配 列を決定し、ハイブリッド形成の結果を確認した。

各ＰＣＲ生成生成全１全長クローン施例２）は、その５゛末端に２種類の配列を 有することか示された（図１及び２参照）。鎖１が２個の二者択一的リーダー配 列を持つというのがひとつの説明である。鎖１ゲノムクローン（ＣＴＧｃｈｌ） のＤＮＡ配列はこの説明を実証し、１個の鎖１遺伝子は構造遺伝子の５′末端で 近接して結合する二者択一的配列の両方を持つことを示した。

鎖２ゲノムクローン（ＣＴＧｃｈ２）のＤＮＡ配列は、猫ケノム中に鎖２の長鎖 及び短鎖型（図３及び４参照）をコードする異なる遺伝子セグメントが存在する ことを示した。ＴＲＦＰ鎖２をコードする２種類の遺伝子が単離されることは、 猫皮膚及び唾液腺における２種類のｍ、ＲＮＡの形態の組織特異的発現と矛盾し ない（図３，４及び７；実施例２参照）。

ゲノム配列を単離ｃＤＮＡの配列と比較すると、ＴＲＦＰが配列の機具原性を有 することが示されることは注目に値する。

実施例４２組み替えＴＲＦＰ鎖］、及び２の発現ＴＲＦＰ鎖１又は鎖２の全体又 は一部をコードするｃＤＮＡクローンをＥ、ｃｏｌｉ発現ベクター、特にｐＳＥ Ｍ−１，−２及び−３にサブクローニングした（Ｋｎ、ａｐｐ、Ｓ、Ｂｒｏｋｅ ｒ、Ｍ、ａｎｄ　Ｅ。

Ａｍａｎｎ、ＢｔｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　８：２８０−２８１゜これらのベク ターは、ベータガラクトシダーゼ（Ｂｅｔａ−ｇａｌ、）のＮ−末端３７５アミ ノ酸をコードする、先端を切った型のＥ、ｃｏｌｉｌａｃ　Ｚ遺伝子（ｌａｃＺ ’）を持つ。ＰＣＲ法を用いて、５′末端が構造内ポリ−ビスチジン配列及びそ れに続（酸感応性ａｓｐ−ｐｒｏ結合を有するように、ＴＲＦＰの＠１及び鎖２ をコードするｃＤＮＡクローンを変えた。鎖１又は２発現構築物を含む培養は、 ＩＰＴＧ誘導により実質的量の組み替え融合蛋白質を生産した。ポリ−ヒスチジ ンリポータ一群の存在により、固定金属−イオンアフィニティークロマトグラフ ィーを用いて組み替え体を高度に精製することができる（Ｈｏｃｈｕｌｉ、　Ｅ 　等、見上ｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：１３２１−１３２５（１９８８）。Ａ ｓｐ−Ｐｒｏ部位の緩和−酸切断により、完全な全長ＴＲＦＰ鎖１又は鎖２蛋白 質が放出される。標準的蛋白質精製法により、不適切な配列を持たない実質的Ｉ の組み替え蛋白質を得る。精製ペプチドの蛋白質配列分析により、配列の信頼性 が実証された。！１１の配列（Ｆｅ［１，ＥＩＴＰＡＶＫＲＤＶＤＬＦＬＴＧＴ ；Ｆｅｌ　２、ＤＶＤＬＦＬＴＧＴＰＤＥＹＶＥＱＶ：Ｆｅ１４、ＮＡＲＩＬＫ ＮＣＶＤＡＫＭＴＥＥＤＫＥ）又は鎖２の配列（Ｆｅ１１８．ＬＬＬＤＬＳＬＴ ＫＶＮＡＴＥＰＥＲＴＡＭＫＫＩＱＤＣ）に対する、うさぎ抗−ペプチド抗血清 を生成しメ；。抗−ペプチド抗血清は、ウェスターン法にて組み替え蛋白質（上 記）と反応する。

組み替え鎖１及び８２ペプチド、ならびにそのフラグメント又は修正物は、脱感 作治療薬として使用することができる。

実施例５．精製Ｔｍｍ及反応蛋白質を用いたＴ細胞研究猫アレルギー患者からの ６０ｍ１のヘパリン血から抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）を精製した。その後ＰＢ ＭＣを下記のように処理したが、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−４を用いた培養の時 間及び刺激に用いた特異的ペプチドは変えた。

患者１３１からの、濃度が１０’／ｍ１のＰＢＭＣｌｏｍｌを、プールされた５ ％のヒｌ−Ａ、　Ｂ血清を補った精製ＴＲＦＰ５マイクログラム／ｍｌ　Ｒｒ’ ＭＩ−１６４０の存在下で３７℃にて７日間培養した。Ｆｉｃｏｔ　１．−Ｈｙ ｐａｑｕｅ遠心により生存細胞を精製し、５単位の組み替えヒト　ＫＬ−２／ｍ ｌ及び５単位の組み替えヒト　ＩＬ−４／ｍｌにて３週間培養した。その後休止 Ｔ細胞を、濃度が５ｘｌＯ５／ｍ＋の照射（３５００Ｒａｄｓ）オートロガスＰ ＢＭＣの存在下で濃度力２Ｘ１０’／ｍｌのＴＲＦＰ５マイクログラムを用いて ３日間再刺激（二次）し、Ｆｉｃｏｌ　Ｉ−Ｈｙｐａｑｕｅ遠心により精製し、 ５単位のＩＬ−２及び５単位のＩＬ−４／ｍｌ中で２週間成育した。分析のため に２ｘ１０４個の休止Ｔ細胞を、９６−ウェル丸底分析プレート中で５ｘｌＯ’ 個の照射（３５００Ｒａｄｓ）オートメガスＰＢＭＣ又は２ｘｌＯ’個の形質転 換Ｂ細胞（２０，０００Ｒａｄｓ）の存在下、２００マイクロリツトルの体積中 種々の濃度のアレルゲン又はそのフラグメントを用いて再刺激（三次）した。そ の後各ウェルに、１マイクロキユーリーのトリチウム化（メチル）チミジンを１ ６時間与えた。挿入されたカウントをガラス繊維フィルター上に集め、液体シン チレーションカウンターにかけた。

使用抗原：Ｔ細胞反応性電量白質（ＴＲＦＰ）、Ｈｏ１ｌｔｓｔｅｒ−３ｔｉｅ ｒ猫上皮細胞皮膚試験試薬（Ｃ８Ｔ）、ＩＰＣぶたくさ花粉抽出物（ｐｏｌｌｅ ｎ）、及びＴＲＦＰ蛋白質配列から誘導した合成ペプチド（図６及び７参照）。

重要なＴ細胞の多量性は一般に培地標準（Ｔ細胞及び抗原提示細胞のみ）の２． ５倍以上であると思われる。

別法としてＰＢＭＣを以下のように処理した・−次刺激細胞をｆＬ−２／ＩＬ− ４中で２週間培養した。この培養からの休止Ｔ細胞を、上記アＩノルゲンの全部 ではなくい（つかを用いた二次分析において調べた。

これらの評価の結果を表２及び３に示す。図９は、患者１３１からのＴ細胞がＦ ｅ１１．５及び８ペプチド中に存在するＴ細胞エピトープに応答することを示し ている。この種のエピトープ分析により、ＴＲＦＰ中に存在するＴ細胞エピトー プを定義することができる。より大きな患者団を用い、陽性指数を得ることによ り、不均一集団の主要エピトープ（ＰＩ）を示した。ＰＩは、応答集団の平均刺 激指数に、ペプチドに対して陽性応答を示した患者のパーセントを乗することに より得る。この分析を表２及び３に示す。

このデータは、ＴＲＦＰ蛋白質のほとんどが何人かの患者からのＴ細胞を刺激す ることができるＴ細胞エピＩ・−ブを含むが、ＴＲＦＰ分子の異なる部分を用い て得たＴ細胞応答の強度に大きな差があることを示している。データは、各エピ トープが何人かの患者に作用し、各患者は特徴的応答パターンを有することを示 した。例えば、Ｆｅｌ　２ｇはＴＲＦＰの領域を含む最も弱いＴ細胞エピトープ であるが（表３）、はとんどの主要Ｔ細胞エピトープは、Ｆｅ１．８ペプチドに 含まれる（表２）。

表２ 鎖＃ＩＴＲＦＰペプチドに対する、猫ア１ノルギー患者の応答ペプチド　アミノ 酸　ＰＩＩ　ＳＩ２　Ｎ５Ｆｅｌ　１’　１−１７．３Ｔ　３９２　５．６　１ ２１１−２　１−１７　３１１　７．４　８３１−３　４−１７　４２２　６． ２　２６１−４　６−１７　８１６　９．６　３２１−５８−１７　２８６　５ ．２　２５１−６　１０−１７　３１２　５．２　２６Ｆｅ１２　９−２５　４ １６　７．３　３０Ｆｅ１．　３６　１８−３３　６７４　９．５　１２３３１ Ｐ、３２Ｄ ３−１　１８−３３　６３８　９．４　４０３−１０　１８−３１　５０４　５ ．９　２８３−１１　１８−３０　８６３　１０．４　１２３−１５　１８−２ ９　１０４０．１０．４　１３３−１３　１８−２８　６９０　１１．５　１４ ３−１４　１８−２７　２６０　６．２　１０Ｆｅｉ　８　１−３０　１３９３ 　１８．１　８６８−１　５−３３　１３７４　１５．　１　４７８−２　６− ３３　１３５３　１５．２　４７８−３　７−３３　１４３７　１６．９　４７ Ｆｅｌ　１４　１８−４３　１０５４　１３．．７　１２５：１．４−１　２３ −３６　８７１　９．９　８８１４−３　２５−３６　６２１　６．９　９０１ ４−４　２６−３６　４７４　６．０　７９１４−５．２７−３６　２８６　５ ．４　５３１４−２　２９−４２　３３６　５．６　６０Ｆｅｄ、４　３７−５ ５　６０１　７．７　１２０４−１　３７−５２　８２２　９．９　２０４−２ 　３７−４９　３７８　６．２　１５４−３　３７−４６　１８５　３．７　１ ３Ｆｅｌ　３０−１　２５−４９　２６８　５．６　２３３０−２　２５−４８ 　２４８　４．２　２２３０−３　２５−４７　２３０　４．８　２３３０−４ 　２９−５５　１０７９　１１．６　４４３０−５　２９−５４　７９２　１１ ．０　４３３０−６　２９−５３　４１５　６．２　４３３０−７　２６−５５ 　３３９　５．３　１４３０−８　２８−５５　２６２　４．１　１４Ｆｅ１． 　１５　４４−６０　４４０　１１．０　６０Ｆｅｌ　２３　５１−６６　３４ ３　６．６　６３Ｆｅｌ　２１’　５６−７０　３６０　５．８　６６ＯＲ ’ＰＩ：調べた中の総ての応答患者の平均３１に、陽性応答を示した患者のパー セントを乗じた数 ２３Ｉ：Ｔ細胞及び抗原に対する抗原提示細胞多型性のｃｐｍの平均を、Ｔ細胞 及び応答患者からの抗原提示細胞のみのｃｐｍで割った数。ＳＩ≧２．５が陽性 と考えられる。

３Ｎ、調べた患者の数 ′Ｉ　二アミノ酸３がＴに変化 Ｓ　＝アミノ酸７０がＲに変化 ８　＝アミノ酸３１及び３２がそれぞれＰ及びＤに変化。

表３ 鎖＃２ＴＲＦＰペプチドに対する猫アレルギー患者の応答ペプチド　アミノ酸　 ＰＩ　ＳＩ　Ｎ Ｆｅ１　１６　１−２２　２８３　５．９　５２Ｆｅｌ　１７　１２−３３　４ ２１　６．１　１１４Ｆｅｌ　３２−１　１２−２４　４４２　６．６　２１３ ２−２　１４−２４　４２４　５．３　２０３２−３　１６−２４　２７０　３ ．７　２２Ｆｅｌ　１８　２３−４８　４６６　６．３　９９Ｆｅｌ　３３−１ 　２６−３６　３４０　５．４　６３３３−２　２６−３８　２１０　４．２　 ５０３３−３　２６−４０　２３５　５．０　４７Ｆｅｉ　３１−１　１４−４ ０　７３３　９．４　３６３１−２　１４−３９　５９９　８．１　３５３１− ３　１４−３８　５９８　８．３　３６３１−４　１４−３７　６２２　８．４ 　３５３１−５　１４−３６　５３９　７．６　３７３１−６　１５−４０　２ ９５　４．４　３３３１−７　１５−３６　２６７　５．８　３３Ｆｅｌ　２０ −１　３４−５９　３９５　５．９　７９Ｆｅ１．　２５　４９−６８　３５０ 　７．６　５６Ｆｅｌ　２８　６０−８２　９４　３．６　４３Ｆｅｌ　２８− １’　６０−８２　１７６　５．！５　４４Ｆｅ１．　２９　７４−９２　２５ ９　５．５　４７１　短鎖型鎖２配列（Ｃ２Ｓ）に基づ（。

実施例６．ペプチドを含むＴＲＦＰ　Ｔ細胞エピトープにょるＴ細胞アペプチド 特異的Ｔ細胞をその特異的なペプチドに暴露することにより、Ｔ細胞エピトープ を含む蛋白質に対するアネルギーを誘導することができる（Ｊｅｎｋｉｎｓ、Ｍ 、に、ａｎｄ　Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｒ，ＨＪ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、よ６５　：　３ ０２−３１９　（１９８７））　。いずれの強いＴ細胞エピトープも全ア１ノル ゲンに対する耐性の誘導に使用することができると予想される。その結柔患者は 自然のアレルゲンに対して応答しなくなる。患者は、ヘルパーＴ細胞の刺激によ り応答しないであろう。ヘルパーＴ細胞がない場合、変化したリンフ才力イン応 答及び／又はＩｇＥ応答の不在が起こり、その結果猫アレルゲンに対するアレル ギ一応答が減少する。

、働者１５５のＴＲＦＰ二次感作Ｔ細胞（２，５ｘｌＯ’）を休止させ、１２ｘ ７５ｍｍのポリプロピレンスナップキャップ管中で１０％ＡＢ血清を含む１ｍｌ の完全ＲＰＭＩ中の（２，５ｘｌＯ’）オートロガス照射エプスタイン−バール ウィルス形質転換Ｂ細胞（ＥＢＶ）を用いて培養し、連続５日間で抗原の量を増 加させた。Ｔ細胞培養を０日に５μｇ／ｍｌのＴＲＦＰ、その後５μｇ／ｍｌ、 １０μｇ／ｒｎｌ、１０μｇ／ｍｌ及び２０μｇ／ｍ＋に暴露した。ペプチド処 理培養を０日に１Ｍｇ／ｍｌのペプチド、その後ｌμｇ／ｍｌ、Ｉμｇ／ｍｌ、 ２μｇ／ｍ、１及び５μｇ／ｍｌに暴露した。さらに第２日に０．５ｍｌの新し い培地を置換した。その後細胞を洗浄し、２ｘｌＯ’Ｔ細胞及び２ｘｌＯ’照射 （２５００Ｒａｄｓ）ＥＢＶならびに種々の投薬量の抗原を用い”で冬型性分析 を開始した。第９日にトリチウム化チミジンの挿入として”ｌ胞子型性を測定し た。アネルギー又は耐性の試験管内誘導を表４に示す。

この実験は、ＴＲＦＰ及びそのペプチドの抗原特異的Ｔ細胞ラインにおけるアネ ルギー又は耐性誘導能力を示す。

表４ Ｆｅ１８−３又はＴＲＦＰに暴露されたＴＲＦＰ−感作Ｔ細胞培養の抗原応答 抗原の挑発後のＴ細胞多型性（ｃｐｍ）：耐性処理：　ＴＲＦＰ　Ｆｅ１８−３ 　ぶたくさペプチド −１，５３０５８，８９０５８，８９０２，１３０Ｆｅ１．８−３　１．２７０ 　１２．３２０　３．８５ＯＳ、１３０ＴＲＦＰ　２．１９０　３３．１６０　 ３６，０３０　６．６７０ペプチド　９２０　６４．０５０　４５．０２０　３ ．５９０実施例７．精製ＴＲＦＰ又はＴＲＦＰ蛋白質配列から誘導した合成ペプ チドに応答するＴ細胞のサイトカインプロフィール実施例５に記載の通りに抹消 血単核細胞（ＰＢＭＣ）を猫アレルギー患者から精製した。５ｘｌＯ’個のＰＢ ＭＣを２ｘｌＯ’／ｍｌの濃度において培地のみ、あるいは精＠ＴＲＦＰ２０μ ｇ／ｍｌ又はペプチド５０μｇ／ｍｌの存在下で３６時間培養した。その後細胞 をリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｐｈ７．２）で２回洗浄し、２ｍｌの０．４Ｍ グアニジニウムイソチオシアナート、０．　５％５ａｒｋｏｓｙｌ、５ｍＭのク エン酸ナトリウム、０．１Ｍ２−メルカプトエタノール、ｐＨ７，０を用いて細 胞溶解した。その後溶解細胞を２６ゲージ針を通してゲノムＤＮＡをせん断じ、 ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）−処理水中の５．７ＭのＣｓＣ］、Ｏ， ＯＩＭのＥＤＴＡ、、ｐＨ７，５から成る２ｍｌのクッション上の層とした。溶 解細胞を、Ｂｅｃｋｍａｎ　５Ｗ４１０−ター中で３５．ＯＯＯＲＰＭ、２０℃ にて１８時間遠心した。ＲＮＡベレットを０．４ｍｌのＴＥ（１０ｍＭトリス、 １ｍＭＥＤＴＡ、）、ｐＨ７，５，０，１％ＳＤＳ中に再懸濁し、Ｑ、５ｍｌフ ェノール１０．２ｍｌクロロホルムを用いて３回抽出した。その後ＲＮＡをドラ イアイス上でＤＥＰＣ−処理水中の２．５体積の水冷エタノール、１／１０体積 の３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５，２を用いて沈澱させ、ＤＥＰＣ−処理水中の７ ０％エタノールを用いて１回濯ぎ、乾燥した。ＲＮＡベレットをＤＥＰＣ−処理 水中の２μｌのＴＥ、ｐＨ７，５に再懸濁した。

細胞ＲＮＡ全体を５ｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔキツト（ＢＲＬ、　Ｂ　ｅ　ｔ、　ｈ ｅ　ｓ　ｄ　ａ、　ＭＤ）を用いてｃＤＮＡに変換した。２μｍのＲＮＡをｌ　 μｍのオリゴ（ｄＴ）＋ｚ−Ｌａ　（５００Ｕｇ／ｍｌ）及び９μｍの水に加え た。試料を７０℃に１０分間加熱し、氷で急冷した。４μｍの５Ｘ緩衝液を０． １ＭのＤＴＴ２μｍ及び１μｍのｄＮＴＰ混合物（それぞれ１０ｍＭのｄＡＴＰ 、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）と共に試料に加えた。１μＩの逆転写酵素（ ２００Ｕ）を加え、４２℃で１時間反応させた。試料を９０℃にて５分インキュ ベートすることにより反応を終結させ、−８０℃で保存した。

１０ｍＭのＴＲｌ５．ｐＨ７，５中でＴ細胞ｃＤＮＡを連続して１０倍に希釈し た液を、標準キット及びＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ　（Ｒｅｄｗｏ ｏｋ　Ｃ１ｔｙ、ＣＡ）推奨の案を用いて増幅シタ。

各試料に２６．６５μｌの水、５μｍのＩＯＸ　ＰＣＲ緩衝液、８μｍのｄＮＴ Ｐ混合物（それぞれ１．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ） 　、０．１μＩのアルファ３２Ｐ−ｄＣＴＰ　（３０００Ｃ１／ミリモル）、０ ．２５μｍのＡｍｐ　１１Ｔａｑ、５ｔｔ１のｃ　ＤＮＡ及び５μｍのサイトカ イン特異的５′及び３′プライマー（２０μモル）を加えた。はとんどのサイト カイン及びベーターアクチン標準に使用したプライマーはＣ１，ｏｎｔｅｃｈ　 （Ｒｅｄｗｏｏｄ　Ｃｉ　ｔｙ、ＣＡ）から購入した。ヒトＩＬ−４プライマー は、Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）か ら購入し、以下の配列をもつ： ５°　ｈｌＬ−４プライマー ５’　−ＧＴＣ−ＣＡＣ−ＧＧＡ、−ＣＡＣ−ＡＡＧ−ＴＧＣ−ＧＡＴ−ＡＴＣ −ＡＣＣ−３’ ３’　ｈＩＬ−４プライマー ５°−ＧＴＴ−ＧＧＣ−ＴＴＣ−ＣＴＴ−ＣＡＣ−ＡＧＧ−ＡＣＡ、−ＧＧＡ− ＡＴＴ−Ｃ−３’ 各試料を１滴の鉱油と共に載せた後、プログラム可能熱サイクル機（ＭＪ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ、Ｃａｍｂｒｉｄ＋ｚｅ、ＭＡ、）で以下のプログラムにより反応 を行った。

３　７２℃　２分 ４　段階１に循環、２９回 ５　７２℃　７分 ６　４℃　保持 ＰＣＲ生成物を２５μＩのクロロホルムを用いて１回抽出し、２５μｌの各試料 を８％ポリアクリルアミドゲル上で２５０■にて電気泳動させた。ゲルを乾燥し 、予備−フラッシュ　Ｘ−線フィルムに露出した。

その後Ｓｈｉｍａｚｕのフライングスポット１ノーザーデンシトメーターを用い て各ゲルの数回の露出を走査した。滴定の直線部分の値を培地標準値と比較し、 各試料について刺激指数を得た。一般的ｃＤＮＡ、量の参照標準として、ベータ アクチンのためのプライマーを各試料に加えた。

培地標準値が検出されない場合、最低測定可能応答を１．００に設定した。他の 実験の場合、サイトカインｃＤＮＡの量を、標準として前に増幅したサイＩ・カ イン特異的ｃＤＮＡと直接比較することができる。従って特定のサイトカインｃ ＤＮＡの絶対量をひとつの試料から多の試料へ、及びひとつの実験から多の実験 に比較することができる。代表的実験の結果を表５に示す。この実験でＩＬ−２ ，ＩＬ−４及びＩＦＮ−ガンマ量を測定した。示される通り、この特定の猫アレ ルギー患者の場合、Ｆｅ１１８などのペプチドが、ある他のＴＲＦＰ−誘導ペプ チド（Ｆｅ１１４及びＦｅｌ−１７）より多量のＩＬ−４を生成する。この分析 は、ＩＬ−５，ＩＬ−８，ＩＬ−９，ＴＧＦ−ベータなどのアレルギ一応答の形 成に含まれる他のサイトカインの研究に拡張されるであろう。

各処理からのｃＤＮＡの試料は、一度付加的すイト力インを同定し、配列を決定 した後、後の分析のために保存することができる。アレルギ一応答を形成し易い 範囲のサイトカインを生成するペプチドは、猫ア１ノルギーの治療において治療 に使用するのを避けることができる。同様に、アレルギ一応答を減少させるサイ トカイインを生成することが示されたＴＲＦＰ−誘導ペプチド、例えばＩＦＮ− ガンマ及びＩＬ−１０を、猫アレルギーの治療のために選ぶことができる。

表５ ＰＣＲｌ：、Ｊ：６ＩＬ−２，ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４測定患者４０９の３６時 間−次培養 培地　１．０　１．０ ＴＲＦＰ−−２，１３，８鉤９ Ｆｅ１８　１．０　１．８　０．３　３．３　６．０Ｆｅｌ１４　１０６．９　 ７５．０　１．９　５６．３　３９．５Ｆｅ１４　−−　２５．８　１０．０　 ２．６Ｆｅ１．２１　２３．９　４１．６　．３．２　７．５　１３．０Ｆｅｌ １７　３１５．１　８２．４　７．５　４２．０　１１．０Ｆｅｌ１８　４．６ 　５，６　１２．０　０．４　０．５Ｆｅ１２０−１　−−　１２．０　４．６ 　２．６Ｆｅ１２５　２．９　１２．７　２．５　１．２　５．ｌＦｅ１２８　 −　３．８０．５　７．６Ｆｅ１２９　１．２　３．０　１．１　１１　２．７ ＴＲＦＰ鎖１．リーダーＡ Ｔ工ＧＵＲＥ　２＋ ＴＲＦＰ鎖ｌ、リーダーＢ Ｆ工ＧσＲＥ）。

ＴＲＦＰＭ２．長鎖型 ＴＲＦＰ　Ｉ　鎖２．短鎖型 ＴＲＦＰ鎖２．先端を切った短鋳型 Ｃべ　〉１−１ ｏｈ　Ｑ＜ｌ　ｕ１１ 寡　ぺ　−１！−＋１ −ｓ４ト　自　に　Ｉ Ｕ　属　４　１　べ　ｌ 冨　ロ　１　ロ　ｌ ＜　閣　ＩＩＩ ａ　Ｃ１５ｌｌｌ ←　菌　ＩＩＩ べ　＞１１１ −　ψ　ｉ＋ｉ −べ　ｉ　＋ 閲　Ｉｃｆ、！ 蛸　に　２Ｓ　ψ２ １−１　１　ｆ−４１ ｈ　＜　ｃＱ　ｌ５４ ０　ｌ　ｌ　Ｉ　−薯 ０１１１　Ｘ１１ ｄＦｅｌ−２ｃＬＦｅｌ−４ｄ　Ｆｅ１−１８　８ｉｏ＋　２°ＡｂのみＦ９ ＦＩＧ、８ 患者メ１３１．２２°（ＴＲＦＰ：１つ国際調査報告 Ｉｎ＋ｅ町−−・＾−１６５１１ａａ　Ｔｌ瓢ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０６５４Ｂ 国＠調査報告

Claims (37)

【特許請求の範囲】
1. １．分子量が約４０，０００の、実質的に純粋な共有結合ヒトＴ細胞反応性蛋白 質、又はその一部。
2. ２．ａ）【配列があります】 ｂ）【配列があります】 ｃ）【配列があります】 ｄ）【配列があります】及び ｅ）【配列があります】 から成る群より選んだアミノ酸配列の全体又は一部を有する、ヒトＴ細胞反応性 蛋白質。
3. ３．修正ヒトＴ細胞反応性蛋白質である、請求項２に記載のヒトＴ細胞反応性蛋 白質。
4. ４．それを投与した猫アレルゲン−過敏性患者において、猫アレルゲンへのアレ ルギー応答を修正することができる、請求項１に記載のヒトＴ細胞反応性蛋白質 。
5. ５．猫アレルゲンに対するＢ−細胞応答、猫アレルゲンに対するＴ−細胞応答、 又はその両方を修正することができる、請求項４に記載のヒトＴ細胞反応性蛋白 質。
6. ６．ａ）図６に示すＴ細胞反応性蛋白質鎖１；ｂ）図７に示すＴ細胞反応性蛋白 質鎖２；ｃ）図７に示すＴ細胞反応性蛋白質鎖２の短鎖型；ｄ）図７に示すＴ細 胞反応性蛋白質鎖２の切断短鎖型；及びｅ）その機能的同等物から成る群より選 んだアミノ酸配列の全体又は一部を含むヒトＴ細胞反応性蛋白質の単離アレルゲ ンペプチド。
7. ７．ＩｇＥと結合しない、請求項６に記載の単離ペプチド。
8. ８．猫アレルギー患者からのＴ細胞を刺激する、請求項６に記載の単離ペプチド 。
9. ９．ＩｇＥと結合しない、ヒトＴ細胞反応性蛋白質の修正ペプチド。
10. １０．Ｔ細胞を刺激する、ヒトＴ細胞反応性蛋白質の修正ペプチド。
11. １１．ＩｇＥと結合せず、Ｔ細胞を刺激するヒトＴ細胞反応性蛋白質の修正ペプ チド。
12. １２．それを投与した猫アレルゲン−過敏性患者を脱感作することができる、請 求項９，１０又は１１に記載の修正ペプチド。
13. １３．猫−過敏性患者に投与すると、猫アレルゲンに対する患者のアレルギー応 答を軽減する、ヒトＴ細胞反応性蛋白質の修正ペプチド。
14. １４．リンカーにより結合した少なくとも２個のＴ細胞反応性エピトープを含む ヒトＴ細胞反応性蛋白質の修正ペプチド。
15. １５．Ｔ細胞反応性エピトープの少なくともひとつが鎖１エピトープであり、Ｔ 細胞反応性エピトープの少なくともひとつが鎖２エピトープである、請求項１４ の修正ヒトＴ細胞反応性蛋白質。
16. １６．組み替えヒトＴ細胞反応性蛋白質鎖１又はその一部。
17. １７．組み替えヒトＴ細胞反応性蛋白質鎖２又はその一部。
18. １８．ａ）図６のアミノ酸配列の全体又は一部、あるいはｂ）図７のアミノ酸配 列の全体又は一部を有する、請求項１６又は１７に記載の組み替えヒトＴ細胞反 応性蛋白質。
19. １９．さらに５′末端に構造内ポリヒスチジン配列及びそれに続くａｓｐ−ｐｒ ｏ酸−感応性結合を含む、請求項１６又は１７に記載の組み替えヒトＴ細胞反応 性蛋白質。
20. ２０．組み替え融合蛋白質生産物としてＥ．ｃｏｌｉ中に発現した、請求項１６ 又は１７に記載の組み替えヒトＴ細胞反応性蛋白質。
21. ２１．ヒトＴ細胞反応性蛋白質鎖２のアミノ酸配列に結合したヒトＴ細胞反応性 蛋白質鎖１のアミノ酸配列、及び該アミノ酸配列の修正物を含む組み替えＴ細胞 反応性蛋白質。
22. ２２．ａ）１）アミノ酸３がＴであるアミノ酸１−１７；２）アミノ酸１−１７ ； ３）アミノ酸４−１７； ４）アミノ酸６−１７； ５）アミノ酸８−１７； ６）アミノ酸１０−１７； ７）アミノ酸９−２５； ８）アミノ酸３１がＰであり、アミノ酸３２がＤであるアミノ酸１８−３３； ９）アミノ酸１８−３３； １０）アミノ酸１８−３１； １１）アミノ酸１８−３０； １２）アミノ酸１８−２９； １３）アミノ酸１８−２８； １４）アミノ酸１８−２７； １５）アミノ酸１−３０； １６）アミノ酸５−３３； １７）アミノ酸６−３３； １８）アミノ酸７−３３； １９）アミノ酸１８−４３； ２０）アミノ酸２３−３６； ２１）アミノ酸２５−３６； ２２）アミノ酸２６−３６； ２３）アミノ酸２７−３６； ２４）アミノ酸２９−４２； ２５）アミノ酸３７−５５； ２６）アミノ酸３７−５２； ２７）アミノ酸３７−４９； ２８）アミノ酸３７−４６； ２９）アミノ酸２５−４９； ３０）アミノ酸２５−４８； ３１）アミノ酸２５−４７； ３２）アミノ酸２９−５５； ３３）アミノ酸２９−５４； ３４）アミノ酸２９−５３； ３５）アミノ酸２６−５５； ３６）アミノ酸２８−５５； ３７）アミノ酸４４−６０； ３８）アミノ酸５１−６６；及び ３９）アミノ酸７０がＲであるアミノ酸５６−７０；から成る群より選んだ猫蛋 白質の鎖１のアミノ酸、ｂ）１）アミノ酸１−２２； ２）アミノ酸１２−３３； ３）アミノ酸１２−２４； ４）アミノ酸１４−２４； ５）アミノ酸１６−２４； ６）アミノ酸２３−４８； ７）アミノ酸２６−３６； ８）アミノ酸２６−３８； ９）アミノ酸２６−４０； １０）アミノ酸１４−４０； １１）アミノ酸１４−３９； １２）アミノ酸１４−３８； １３）アミノ酸１４−３７； １４）アミノ酸１４−３６； １５）アミノ酸１５−４０； １６）アミノ酸１５−３６； １７）アミノ酸３４−５９； １８）アミノ酸４９−６８； １９）アミノ酸６０−８２； ２０）アミノ酸７４−９２； ｃ）ヒトＴ細胞反応性蛋白質の鎖２の短鎖型のアミノ酸６０−８２；及び ｄ）上記アミノ酸配列ａ）、ｂ）又はｃ）の修正物から成る群より選んだアミノ 酸配列を持つヒトＴ細胞反応性猫ペプチド。
23. ２３．刺激指数が少なくとも約４．０であるか又は陽性指数が少なくとも約２５ ０である、ヒトＴ細胞反応性猫ペプチド。
24. ２４．それを投与した猫アレルギー患者においてアネルギーを形成することがで きる、又はそれを投与した猫アレルギー患者においてＴ細胞のリンフォカイン分 泌プロフィールを修正することができる、ヒトＴ細胞反応性猫ペプチド。
25. ２５．ａ）【配列があります】 ｂ）【配列があります】ｃ）【配列があります】ｄ）【配列があります】及び ｅ）【配列があります】 から成る群より選んだアミノ酸配列の全体又は一部を有する、ヒトＴ細胞反応性 猫ペプチドをコードする単離ＤＮＡ。
26. ２６．ヒトＴ細胞反応性蛋白質又はペプチドを含む治療用組成物。
27. ２７．ヒトＴ細胞反応性蛋白質又はペプチドか：ａ）請求項２に記載のアミノ酸 配列； ｂ）請求項２２に記載のアミノ酸配列；及びｃ）ａ）又はｂ）のアミノ酸配列の 修正物から成る群より選んだアミノ酸配列を有する、請求項２６に記載の治療用 組成物。
28. ２８．ヒトＴ細胞反応性蛋白質又はペプチドのアレルゲンペプチドと特異的に反 応する抗体。
29. ２９．ａ）請求項２に記載のアミノ酸配列；及びｂ）請求項２２に記載のアミノ 酸配列から成る群より選んだアミノ酸配列を有するヒトＴ細胞反応性蛋白質又は ペプチドのアレルゲンペプチドと特異的に反応する、請求項２８に記載の抗体。
30. ３０．猫アレルゲンへの過敏性の治療の薬剤として使用するための、図１−５の アミノ酸配列の全体又は一部を有するヒトＴ細胞反応性蛋白質から誘導したペプ チド、あるいは図１−５のアミノ酸配列の全体又は一部を有する免疫原性修正ペ プチド。
31. ３１．ペプチドが請求項１６又は請求項１７に記載のペプチドである、請求項３ ０に記載のペプチド。
32. ３２．患者のペプチドへのアレルギー応答を決定するための診断薬として使用す るための、請求項１３に記載のペプチド。
33. ３３．患者から得た血液試料を、血液成分とペプチドの結合に適した条件下で猫 のＴ細胞反応性蛋白質の単離アレルゲンペプチドと混合し、そのような結合が起 こる程度を決定することを含む、患者の猫アレルゲンへの感応性を検出するため の試験管内法。
34. ３４．Ｔ細胞機能、Ｔ細胞多型性、Ｂ細胞機能、血液中に存在する抗体へのペプ チドの結合、又はそれらの組み合わせにより結合の程度を決定する、請求項３３ に記載の方法。
35. ３５．猫アレルゲンへの過敏性の治療薬の製造のための、図１−５のアミノ酸配 列の全体又は一部を有するヒトＴ細胞反応性蛋白質から誘導したペプチドの利用 。
36. ３６．ペプチドが請求項１６又は１７に記載のペプチドである、請求項３５に記 載の利用。
37. ３７．患者のペプチドに対するアレルギー応答が起きたことを決定するための診 断薬の製造のための、請求項１３に記載のペプチドの利用。