JPH05502046A - フィブロネクチン結合タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 フィブロネクチン結合タンパク質 技術分野 本発明は、フィブロネクチン結合タンパク質に関する。

本発明の目的は、最小フィブロネクチン結合タンパク質を得ることである。

別の目的は、化学合成により前記ペプチドを合成する可能性を得ることにある。

さらに他の目的は、次の説明から明らかになるであろう。

発明の背景 ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ−８５１０５５５３号は、フィブロネクチン、フィブリ ノーゲン、コラーゲン、および／またはラミニン結合能力を有する細菌細胞表面 タンパク質を開示している。その特許には、いろいろな細菌がフィブロネクチン 、フィブリノーゲン、コラーゲンおよび／またはラミニンに結合する能力を有す ることが示されている。さらに、フィブロネクチン結合タンパク質は１６５ＫＤ および／または８７ＫＤの分子量を有し、したがってより小さなタンパク質はよ り大きなタンパク質の一部であろうということが示される。

フィブロネクチンはジスルフィド結合をした二量体のグリコプロティン（Ｍ　ｒ 　４５０，０００）であり、血液の血しょうおよび他の体液中に可溶性の形で存 在し、ゆるんだ結合性組織の細胞外マトリックスの主要成分としてフィプリル状 の形で析出される。それはタイプＩ、■、および■同族と称せられる、３種の異 なる構造的モチーフからなり（ｐ６ｔｅｒｓｅｎ等、１９８３　、ＰＮＡＳ）　 、そのさまざまな生物学的活性をおのおの特定のドメインに帰することができる フィブロネクチン分子のモジュール組織を生じる。

フィブロネクチンの主要な生物学的役割は、別々の細胞表面受容体ともっばらタ イプ■同族単位からなる分子の１０５−ｋＤａ中心領域の間の特定の相互作用に よって細胞外マトリックスに対する真核生物の細胞の接着を仲介する能力に関係 するように思われる（　Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅ「およびＲｕｏｓｌａｈｔｉ 、　１９８４　、　Ｎａｔｕｒｅ３０９　：　３０〜３３）。細胞結合ドメイン は、３　］、　ｋ　Ｄ　ａヘパリン結合ドメインおよび３０ｋＤａフィブリン結 合ドメインによりそのＣ末端において続けられる。前述の細胞結合ドメインは４ ２ｋＤａゼラチン（コラーゲン）結合ドメインであり、Ｎ−末端２９ｋＤａドメ インはフィブリン、ヘパリンおよび細菌を結合する５個の結合したタイプＩの繰 返しからなる（ＹａＩＩａｄａｌ　９８３　、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃ ｈｅＩｌ。

５２ニア６１〜７９９）。

さまざまな病原性のグラム陽性１１ウ球菌および連鎖球菌は、もっばらフィブロ ネクチンの２９−ｋＤａＮ−末端ドメインに結合することが報告された（　５ｐ ｅｚｉａｌｅ等。

〜９２９）。グラム陽性腸内細菌のいくつか、すなわち２５−２２９　；　Ｂａ １ｏｄａ等、１９８５．ＦＥＭＳ　旧ｃｒｏｂｉ合された細菌、および第二の未 同定位置が報告された。

対照的に、スピロヘータＴｒｅｐｏｎｅｗａ　Ｐａ１ｌａｄｉｕＩｌ、およびト リパノゾーマ　Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｃｒｕｚ＋は−，’１０５　ｋ　Ｄ　 ａ真核生物細胞結合ドメインに対し特異性を示すことにおいて他のフィブロネク チン結合微生物と相違する（　Ｔｈｏｍａｓこれらの微生物とフィブロネクチン の相互作用に関する解離定数は、ヒト線維芽細胞に対する健全なフィブロネクチ ンの結合について報告されたものより１０２〜１０３倍高い親和力を示す（）ｌ ｏｏｋ等、１９８９　；　ＡｋｉｙａｌｌａおよびＹａｍａｄａ、１９８５．Ｊ ＢＣ２６０：４４９２〜４５００）。フィブロネクチンに対するこの結合活性は ヴイルレシス因子であり得て、フィブロネクチンが豊富なマトリックスが創傷の 修復の第１週および第２週の間に析出されることが知られている創傷組織および 血液凝固のコロニー化を促進する（　Ｋｕｒｊｋｉｎｅｎ等、１９８０．Ｌａ。

本研究の意図は微生物のフィブロネクチン結合タンパク質（ＦｎＢＰｓ）を特徴 づけること、および創傷伝染の危険を防止したり減少する可能性のある治療的応 用に関する受容体の類似体を開発することにある。

ＦｎＢＰｓに関する研究は、今までのところ主としてＳ、ａｕｒｅｕｓのＦｎＢ Ｐを主として取扱ってきた。２１０．０００のＭｒを持つＦｎＢＰが三つの研究 所から報告された（　ＥｓｐｅｒｓｅｎおよびＣ１ｅＩＩｌｏ＋ｅｎｓｅｎ、１ ９８２．　Ｉｎｆ’ｅｃｔ、　Ｉｍｕ２５−４のＦｎＢＰをコードする遺伝子は Ｅ、ｃｏｌｉについてクローンされそして発現された（　Ｆｌｏｃｋ等、１９８ ７゜ＥＭＢＯＪ、２３５１〜２３５７）。フィブロネクチン活性は６００個の塩 基対挿入物に局在化された。これはブドウ球菌のタンパク質Ａの２つのＩｇＧド メインをコードする遺伝子と融合されたとき、天然の２１０ｋＤａ受容体と同じ フィブロネクチン結合活性を有するＺＺ−ＦＲと称せられるタンパク質融合物を 生じた。後のＤＮＡ配列分析は６００個の塩基対挿入物は１８４個のアミノ酸を コードすることを明らかにしたが、その目立った特徴は３回、部分的に４分の１ 繰返された３８個のアミノ酸同族単位であった（　Ｓｊｇｎａｓ等、１９８９） 。

ＤＩ、Ｄ２、およびＤ３と称せられる、同族単位のおのおのに対する合成ペプチ ド類似体が、Ｓ、ａｕｒｅｕｓ８３２５−４に対するフィブロネクチン結合の有 効な阻害剤であることが見出された。第三の同族単位上に組立てられたペプチド Ｄ３はフィブロネクチン結合の阻害剤として５０〜１００倍より効果的であった が、基本的な同族単位から著しい偏差を示した。本発明において、さらに化学的 変性、タンパク質加水分解開裂、およびＤ３配列を包含する多数のより小さなペ プチドの化学合成の手段によって、Ｄ３同族単位内のフィブロネクチン結合決定 因子が定義された。

本発明の説明 本発明は、構造 Ｒ’　−ＰＳＹＱＦＧＧＨＮＳＶＤＦＥＥＤＴ−Ｒ２（式中、Ｒ１は水素、Ｋま たはＤＫであり、Ｒ２はヒドロキシ、Ｌ、ＬＰ、またはＬＰＫでありＮ　Ａｓｎ 、アスパラギン Ｄ　Ａｓｐ、アスバルチン酸 ＣＣｙｓ、システィン Ｅ　Ｇｌｕ、グルタミン酸 Ｑ　Ｇｌｎ、グルタミン ＨＨｉｓ、ヒスチジン ＭＭｅｔ、メチオニン Ｆ　Ｐｈｅ、フェニルアラニン Ｐ　Ｐｒｏ、プロリン Ｓ　Ｓｅｒ、セリン ＷＴｒｐ、）リブトファン を有する最小フィブロネクチン結合ペプチドに関する。

浸出液（旧「ｃｏ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍ　＋　）中へ接種することにより培 養を開始した。３７℃で一夜インキュベーション後、細菌を遠心分離により収集 し、アジ化ナトリウムを０．０２％（重量／体積）含有するリン酸緩衝化生理的 食塩水（ｐＨ７，４）中に懸濁し、細胞計数を光学密度に関係づける標準曲線に 対する関係より１０２０細胞／　ｍｌの値の懸濁液に調整した。次いで細胞を８ ８℃で２０分間加熱殺菌し、等分し、−２０℃で冷凍貯蔵した。

リガンドの調製およびヨー素化 ヒトフィブロネクチンをニューヨーク血液センターから購入し、または同所から 得た古くなった血しょうからＥｎｇｖａｌｌおよびＲｏｕｓｌａｈｔＬ　（１９ ７７、Ｉｎｔ、　Ｊ、　ＣａｎｃｅｒＲｃｓ、　２０　：　１〜５）により記述 されたように精製した。

フィブロネクチンの２９−ｋＤａＮ−末端ドメインの精製のために、ヒトフィブ ロネクチンを２５ｍＭ１リス−ＨＣ１（ｐＨ７，６）　、５０ｍＭ塩化ナトリウ ム、２．５ｍＭ塩化カルシウム、および０．５ｍ　Ｍエチレンジアミン四酢酸（ ＥＤＴＡ）からなる緩衝液に１１１ｇ　／　ｍｌに希釈した。

各ｌｌｌ１ｇのフィブロネクチンに対し５μｇのサーモリシン（Ｃａｌｂｉｏｃ ｈｃｖ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ）を添加してプロテアーゼ消化を開始し、 続いてエンドオーバーエンドミキシング（ｅｎｄ　ｏｖｅｒ　ｅｎｄ　１ｘｉｎ ｇ）により室温で２時間インキュベーションした。反応を５ｍＭまでＥＤＴＡを 添加して停止した。次いで消化物をセファロースＣＬ　−４Ｂ　（ＰｈａｒＩＩ ａｃｉａ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）に結合させられたＺＺ−ＦＲ融 融合タンパ資質らなるアフィニティゲルマトリックスを通過させ、次にリン酸緩 衝化生理的食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）中の４〜１グアニジン塩酸塩で溶離して単離し た。溶離液を次いてＰＢＳに対して広く透析した。フィブロネクチンまたは２９ ｋＤａフラグメントのヨー素化はＨｕｎｔｅｒのクロラミンＴ実験の観察記録（ １９８７）によって行った。

フィブロネクチン結合の検定 合成ペプチドを、先に記述された（　Ｓｊｇｎａｓ等、１９８９）ように正確に 、　■＝標識フィブロネクチン、または標識Ｎ−末端２９ｋＤａフラグメントの 結合に対してＳ、ａｕｒｅｕｓ８３２５−４の細胞と競争する能力を測定するこ とによりフィブロネクチン結合活性について分析した。必要とされた場合、この 検定はＺＺ−ＦＲセファロース（０，３ｍｇ／ｍ＋の膨潤ゲルの共役定量）４０ １によって細菌懸濁液を置換することにより変更した。この場合には、バックグ ラウンド放射能を、未変性セファロースをアフィニティマトリックスの代わりに 使用する検定によって測定した。細菌またはＺＺ−ＦＲセファロースに結合した 放射標識リガンドをＬＫＢガンマ−計数管で定量した（Ｔｕｒｋｕ、　Ｆｉｎｌ ａｎｄ）。

ペプチドの合成および精製 ５１６−３６を除いてすべてのペプチドを先に述べた（　Ｓｊｇｎａｓ等、１９ ８９）ようにアラバマ大学のバーミンガム癌センターの中心施設における＾ｐＨ ｊｅｄ　Ｂｌｏｓｙｓｔｅｍｓ自動ペプチド合成機によって合成した。ペプチド ３１６−３６はＦ−ｉｏｃ合成手順を使用してＶｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ 。

ｇｉｅｓ　（Ｔｕｃｓｏｎ・ＡＺ）により合成した。ペプチドは分取スケールＣ １Ｓカラム（Ｖｙｄａｃ　２１８ＴＰ５１０　；ＴｈｅＳｅｐａｒａｔｉｏｎ　 Ｇｒｏｕｐ、　Ｈｅ５ｐａｒｉａ、　ＣＡ）を使用する逆相ＨＰＬＣおよびＬＫ Ｂ　ＨＰＬＣ装置により粗製製品から精製した。精製に使用した緩衝液は、０． １１％（体積／体積）リン酸、０．２８９６　（体積／体積）トリエチルアミン 、および０．２５ミリモルＥＤＴＡからなるＴＥＡＰ／ＥＤＴＡ（ｐＨ５，５） であった。溶離緩衝液はアセトニトリル中の１５％のＴＥＡＰ／ＥＤＴＡであっ た。

トリエチルアミンはＰｉｅｒｃｅ　（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉ　Ｌ　）から、一方 ＨＰＬＣ級リン酸およびアセトニリルはＦｉｓｈｅｒ　（Ｐｉｔｔｓｔ＋ｕｒｇ ｈ、　Ｐ　Ａ　）から購入した。逆相クロマトグラフィ後、適切なフラクション を５０ミリモル重炭酸アンモニウムに対して広範囲に透析して凍結乾燥した。そ の結果生じる製品の純度を、溶離緩衝液として水中の０，１％（体積／体積）ト リフルオロ酢酸（Ｐｉｅｒｃｅ　；　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ。

ＩＬ）、および６０％アセトニトリル中の０．１％（体積／体積）ＴＦＡからな る緩衝液を使用する分析的０１８カラム上の逆相クロマトグラフィー（Ｖｙｄａ ｃ　２１８ＴＰ　５４６　；　Ｔｈｅ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｇｒｏｕｐ、　 Ｈｅ５ｐｅｒｉａ、　ＣＡ　）により検査した。この緩衝系で溶離するペプチド をロータリーエバポレーションにより乾燥し、Ｎ−末端配列分析またはアミノ酸 組成分析に付した。

ペプチド配列決定は、バーミンガムのアラバマ大学のタンパク質化学中心施設の Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ■ペプチド配列決定装置、モデル４７０Ａに よって行った。アミノ配分析は＾ｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ　Ｕｎｉｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＣｈｅＬＩｊｓｔｒｙ　Ｃｏｒｅにより行っ た。

合成ペプチドのタンパク質加水分解的消化り一（トシルアミド−２−フェニル） −エチル−クロロメチル−ケトン（Ｔ　Ｐ　ＣＫ）処理したトリプシン（コード ＴＲＴＰＣＫ）およびキモトリプシン（コードＣＤ５）をＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏ ｎ　（Ｆｒｅｅｈｏｌｄ、　Ｎ　Ｊ　）から得た。大豆トリプシン阻害剤および ＴＰＣＫを５１ｇｌ１ａ　（Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ。

ＭＯ）から購入し、エンドプロテナーゼＧｌｕ−ｃ（Ｖ８プロテアーゼ）をＢｏ ｅｒｈｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｎから購入し、リジンエンドペプチターゼＣ （Ｌ、ＥＣ）をＣａ１ｂｉｏｃｈｅｓ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）から得た。

トリプシンおよびキモトリプシンの両方の消化のために、ペプチドＤ３を０，１ モル重炭酸アンモニウム中に２ｍｇ／Ｉに溶解し、酵素対基質の比率１：２’０ ０のプロテアーゼによって３７℃で２４時間処理した。トリプシンを大豆トリプ シン阻害剤およびフェニルメチルスルホニルフルオリドの、それぞれ２０　ｇ　 ／　ｍｌおよび１ミリモルまでの添加により失活させた。キモトリプシンについ ては、ＴＰＣＫおよびＰＭＳ　Ｆをそれぞれ０．３ｎｇ／ｍｌおよび１ミリモル の濃度を得るために添加した。

エンドプロテナーゼＧｌｕ−ｃ消化に関して、酵素対基質の比率は１：１００で あり、ペプチドはリン酸緩衝化生理的食塩水中に２　ｍｇ　／　ｍｌてあった。

室温で２４時間インキュベーション後、消化をＰＭＳＦを１ミリモルまで添加し て停止した。ＬＥＣ消化に関して、ペプチドをＰＢＳに２　ｍｇ　／　ｎｎｌ溶 解し、それにｍｌ当り１単位のプロテアーゼを添加した。消化を３７℃で４０時 間継続させ、開裂生成物がＨＰＬＣにより分離されたとき停止した。

各消化に関して、ＴＥＡＰ／ＥＤＴＡ緩衝液系を使用する逆相ＨＰＬＣをタンパ ク質加水分解の進行をモニターし、開裂生成物を精製するために使用した。組成 分析またはＮ−末端配列決定のために必要な試料をさらにＴＦＡ緩衝液系を使用 してクロマトグラフにかけた。

合成ペプチドの化学修飾 リシンのアミノ側鎖のジヒドロキシプロピル化−還元は＾ｃｈａｒｙａの方法（ １９８４：Ｊ、　Ｃｈｒｏｍ、　２９７　：　３７〜３８）の変形であった。ペ プチドをＰＢＳに溶解しく　２．５ｍｇ／ｍｌ）　、続いてＤＬ−グリセルアル デヒドおよび水素化シアノホウ素ナトリウム（Ｓｊｇｍａ、　ＳＬ、　Ｌｏｕｔ ｓ。

ＭＯ）を、それぞれ０．１および１．０モルの最終濃度まで添加した。反応を室 温で１時間行ない、５０ミリモル重炭酸ナトリウムに対して透析して停止した。

リジン側鎖残基の誘導体化の程度はアミノ酸分析により測定した。

グルタミン酸残基およびアスパラギン酸残基のカルボキシル化側鎖を１−エチル −３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）媒介縮合 によりグリシンメチルエステルに転換した（ＬｕｎｇｂｌａｄおよびＮｏｙｅｓ 、　１９８５　；タンパク質修飾のための化学薬剤、第２巻）。ペプチドを２回 蒸留した水に２　ｍｇ　／　ｍｌに溶解し、グリセリンメチルエステル（Ｓｉｇ ｌＩａ）中に１モルに溶解した。ｐＨを　０．１モルＨＣＩにより　４．３に調 整し、ＥＤＣらに　１．５時間後ｐＨを４．３に調整して室温で３時間混合した 。反応をＰＢＳに対して透析して停止した。誘導体化の程度を非誘導体化ペプチ ドと比較してグリシンモル比の増大により測定した。誘導体化はグリシンメチル エステルの代わりにエタノールアミンを使用して行ない、対照実験はＥＤＣだけ をペプチドと混合して行った。

チロシン残基のフェニル側鎖を、１００ミリモルのトリス−ＨＣｌ、１５０ミリ モルＮａＣＩ　（ｐＨ８，０）に溶解した１　ｍｇ　／　ｍｌペプチドの各ｍｌ にテトラニトロメタン（ＴＮＭ　；　Ｓｉｇｍａ）　１０　ｔｔ　１を添加して 酸化し、室温で１時間混合し、続いてトリス／ＮａＣ１緩衝液（ｐＨ８，０）に 対して透析してＴＮＭを除去した。

３種のＤ−反復のアミン酸配列を図１に示す。ＤｌとＤ２反復は僅かに３８残基 の５だけが相違する高度の同族（８７％同族）を示すが、一方Ｄ３はＤ２と５０ ％より小さい同族を示す。しかしながら、先に言及したように（Ｓｉｇｎａｓ等 、１９８９）、ペプチドは２　ｇ　／　ｍｌの濃度結合の５０％阻害に影響した が、一方Ｄ２およびＤｌに対してはそれぞれ９０ｇおよび２３０　ｇ　／　ｍｌ の濃度が同程度の阻害を与えるために必要であった。それゆえ、本発明者等はそ れ以上のキャラクタリゼーションのためにペプチドＤ３を選んだ。

化学修飾 表１はペプチドＤ３とその誘導体化生成物のアミノ酸組成分析からのデータから 成り立つ。リジン側鎖残基のジヒドロキシプロピル化は定量的に完全でＤ３に比 べてリジン含有量の９８％より大きい減小を示した。この実験方法の使用によっ て普通に起こる小さな副反応は、フェニルアラニン含有量の僅かな減少により注 目されるように、その遊離Ｎ　Ｈ２基による位置１におけるフェニルアラニンの 誘導体化であった。アスパラギン酸およびグルタミン酸残基のグリシンメチルエ ステルへの転換モまた、１０００当り５４から２９３へのグリシン含有量の変化 により注目されるように定量的に完全であった。これは、Ｄ３中の２個のグリシ ン残基、およびアスパラギン酸／グルタミン酸残基の完全な化学修飾により加え られた９個の追加残基に対して予期された値である。チロシンのＴＮＭ媒介酸化 もまた好結果でチロシン含有量の９５％減少を示した。

第２図は未修飾Ｄ３の阻害活性と比べた化学的に修飾したペプチドの阻害活性を 示す。リシンおよびチロシンの修飾はＤ３の活性をほんの部分的に減らすだけで あるが、アスパラギン酸／グルタミン酸残基の修飾は活性の完全な損失を生じた 。この結果は、カルボキシル側鎖におけるグリシンメチルエステルまたはエタノ ールアミン縮今について観察された。対照として、ＥＤＣ処理はりシンおよびチ ロシン修飾によって観察された活性の損失と類似ｌ−だ活性のほんの小さな損失 を示すだけてあった。

それゆえ活性の観察された損失は、特にカルボキシル側鎖の修飾によるものであ る。

Ｄ３のトリプシン、キモトリプシンおよびエンドプロテアーゼＧｌｕ−ｃ消化物 の逆相ＨＰＬＣは、ペプチド基質がより小さな生成物に完全に転換することを確 認した。Ｄ３およびそのトリプシン消化物の代表的逆相プロフィルをその後に精 製されたフラグメントの同一性と共−ＨＦＮまたは　ｌ−２９ｋＤａＮ＝末端フ ラグメントの結合に対する試験のために適切なプロテアーゼ阻害剤の存在下に、 初期検定を粗製消化物について行った（第４図）。第３図において証明されたよ うに、完全なトリプシン消化物、生成する非フラクション化開裂生成物は生物学 的活性に少ししか損失を示ざながったが、キモトリプシン消化は阻害物活性を全 く示さながった。この結果はリガンドとして　Ｉ　２９ｋＤａを使用して阻害剤 活性を示すエンドプロテアーゼＧｌｕ−ｃ消化物についてより明瞭さを欠き、　 Ｉ−ＨＦＮについては全くなかった。これは、Ｎ−末端トメインがタンパク質加 水分解的開裂により分離されるときのコンホメーションの変化によるものかもし れない。

第１図は逆相ＨＰＬＣにより粗製消化物から精製されたいくつかの開裂生成物の アミノ酸配列を示す。トリプシン消化物から精製された主要な開裂生成物は３７ アミノ酸Ｄ３の残基１５−３６（Ｔ１５−３６）を構成し、生物学的活性はこの ペプチドにより保持された（第５図）。このペプチドのりシンエンドペプチダー ゼ−〇によるそれ以上の消化は、依然阻害剤活性を示すＴＬ　１７−３６を生成 するＮ−末端ジペプチドの除去を生じる。エンドプロテアーゼＧｌｕ−ｃによる Ｔ　１．５−３６の開裂はＣ−末端へキサペプチドの除去および活性の付随する 損失を生じた。Ｄ３のエンドプロテアーゼＧｌｕ−ｃおよびキモトリプシン消化 物から単離されたペプチドの配列もまた第１図に示す。これらのペプチドのどれ も阻害剤活性を持たなかった（第５図）。

７１、５−３６がＤ３の生物学的活性と類似した生物学的活性を示したので、こ の配列を有するいくつかの合成ペプチドが組立てられ（第２図）、生物学的活性 について試験された（第６図）。Ｔ１５−３６よりＮ−末端においてより短かい １種の残基、ペプチド５１６−３６は、Ｄ３に対し３ナノモル／　ｍｌに比べて １０ナノモル／　ｍｌの濃度においてフィブロネクチン結合の５０％阻害を示し た。ペプチドＴＬ１７−３６が生物学的活性を保持することを知って、本発明者 等はフィブロネクチン結合におけるＣ−末端アミノ酸のかかわりについて試験す るためにペプチド５１７−３３を組立てた。それは著るしく減少してはいるが一 貫して観察される生物活性を有し、１００ナノモル／ｍｌの濃度においてフィブ ロネクチン結合の５０％阻害を顕現させることが見出された。このペプチドの寸 法をＮ末端からさらに減少させ５２０−３３を作ることは、活性の完全に近い損 失を生しる。しかしながら、５２０−３６を生成するＣ−末端から３２０−３３ を膨張させることは、Ｓ１’７−３３の活性に匹敵する活性のレベルを有するペ プチドを生じ、２００ナノモル／ｍｌにおいて５０９６阻害を示した。ペプチド ５２１−３６は依然ペプチドの量に直接的に比例する阻害活性を示したが、５２ ０−３６より約１０借手さい効果しかなかった。それゆえ、本発明者等は、活性 に対し必須であるが単独では結合を阻害するには充分でないコアペプチド、５２ ０−３３までＤ３のフィブロネクチン結合領域を減少させた。Ｎ−末端に対する 配列ＰＳＹまたはＣ−末端に対するＬＰＫの添加は類似の生物学的活性を持つペ プチドを生じた。これらのペプチドの寸法をこれ以上減少させると、活性の大き な減小をもたらす。

フィブロネクチンに対する細菌の付着は、創傷組織および血液凝塊をコロニー化 することを細菌に可能ならしめるヴイルレシス因子として提案された（　Ｒｙｄ ｅｎ等、１関する魅力的な標的である。このゴールを達成することに対するいく つかの進歩が、Ｔｒｅｐｏｎｅｎ＋ａ　ｐａｌｌａｄｉｕｍ　（Ｔｈｏｍａｓ等 、１．９８５．　Ｊ、　ＥＸＩ）、　Ｍｅｄ、、１４−２５）およびＴｒｙｐａ ｎｏｓｏ覆ａ　ＣｒＵ２１によるフィブロネクチン結合の研究によって以前に報 告された。真核生物の細胞のフィブロネクチンコートした基質に対する付着を阻 害するモノクに対するフィブロネクチンの結合を妨害する。結合はまた真核生物 のフィブロネクチンインテグリン受容体によって認識されるフィブロネクチンの 細胞結合ドメイン内のアミノ酸配列であるペプチドＲＧＤＳによっても阻害され た（Ｔｈｏｍａｓ　ｅｔ　ａｌ、１９８５Ｄ　；Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１６ ２：１７１５−１７１９．０ｕａｉｓｓｌ　ｅｔ　ａｌ　、１９８６）。

この同じペプチドはまた培養されたヒト細胞に対するスピロヘータの付着を妨害 した。しかしながら、ＲＧＤＳペプチドはまたフィブロネクチンの役割を無効に することを考慮しなければならない。第二に、これらの微生物はフィブロネクチ ンの細胞結合ドメインに対する特異性において通常ではない。

上記研究方法は、合成ペプチドの使用によって分子レベルにおいてフィブロネク チンとＳ、ａｕｒｅｕｓ受容体の間の相互作用を特徴ずけることにあった。

Ｄ３ペプチドの化学修飾からの結果は、グルタミン酸残基およびアスパラギン酸 残基がフィブロネクチンに対する結合のために不可欠であることを示す。これら は、Ｆ　ＥＥＤＴまたはＤＦＥＥＤＴのモチーフがＳ、ａｕｒｅｕｓＦＮ−受容 体の３種のＤ−反復のおのおのに現れるので、特別に関心を引くものである。事 実、Ｄ３においてこのる遺伝子から得られた配列データは、反復のおのおのにお いてＤＦＴＥＤＴ　（遺伝子Ｉ）またはＥＶＥＤＴ　（遺伝子■）モチーフを含 有する３種の反復配列を示す。エンドプロテアーゼＧｌｕ−ｃを使用する開裂に よる活性の損失はＦＥＥＤＴモチーフの分裂に帰することができ酸性アミノ酸残 基のかかわり合いを示すさらなる徴候である。

Ｄ３トリプシン消化生成物Ｔ１５−３６、および合成ペプチド５１６−３６によ り示された活性は、ＦＥＥＤＴモチーフを含有するＣ−末端ハーフのペプチドに Ｄ３のフィブロネクチン結合決定基を有効に局在化した。配列ＩＥＥＤＴがまた Ｄ３（残基８−１２）のＮ−末端の近くに現れ、反復Ｄ１およびＤ２が同し位置 にＦＥＥＤＴを含有することは興味あることである。Ｄ３中に２回繰返されたこ のモチーフの存在は、ＤＩおよびＤ２に比べてその実質的に高い生物学的活性を 説明することができる。

ペプチド５１６−３６内のフィブロネクチン結合決定基をさらに局在化する試み は、生物学的活性の実質的な損失を生しる。本発明者等は、ペプチド５２０−３ ３がフィブロネクチンに対する接触および結合を確立するアミノ酸残基を含有す ることを信じる。このペプチドそれ自身は本質的に活性を全く示さない。しかし ながら、トリペプチドＲ３ＹのＮ−末端（Ｓ１７−３３）に対する添加またはＬ ＰＫのＣ−末端（２０−３６）に対する添加は、活性の劇的な回収を生しる。こ のコアペプチドが両側にフランキング配列を有するならば、Ｄ３に直接に匹敵す る活性のレベルを有するペプチドＳ　１６−３６よりもＮ−末端において１残基 分短いものであろう。本発明者等の化学修飾実験は、チロシンちりシンもどちら もフィブロネクチンとの接触を伴わないことを示した。本発明者等は、側面配列 トリペプチドである。ＰＳＹおよびＬＰＫはフィブロネクチンとの接触を伴わな いがＬペプチドが適切なそして安定なコンホーメーションを作るために必要とさ れることを提言する。本発明者等は５２０−３６のＮ−末端から１個のアミノ酸 を失うことは、活性の１０倍以上の減小をもたらしたことに気づいた。

本発明の結果と組合されて、Ｄ３およびＺＺ−ＦＲ融合タンパク質の以前の研究 　（Ｓｔｇｎａｓ等、１９８９）は、３種の直列のＤ−反復の連続性が中断され るとき活性の劇的な低下が起こるが、Ｄ３が５１７−３６まで減少されるとき活 性の変化は全く無関係であることを示す。Ｓｌ　７−３６の寸法のそれ以上の減 小は、直列の反復の物理的な分離によって観察された損失に匹敵する活性の損失 をもたらす。それゆえ、個々の反復の２次的構造はフィブロネクチンに対する親 和性の一つのレベルを提供し、３種の反復の３次組織はより高いオーダーにおけ る親和性を生しる。仮説的なそして依然未探査であるが、３次レベルの組織、お よびフィブロネクチンに対する親和性のそれ以上の増大は、Ｓ、ａｕｒｅｕｓ８ ３２５−４の細胞表面におけるフィブロネクチン受容体の第４次組織によって達 成されるかもしれない。

表１．ペプチドＤ３およびその誘導体化生成物のアミノ酸組成１．０００当りの アミノ酸残基 ＊ Ａ　ｓ　ｘ　２１７．７（１８９，２）　２２Ｂ、８　１５５．９　１５７．１ 木 Ｇ　１　ｘ　１５Ｇ、３（ｌｆｔ２．２）　１９３．４　１３１ｔ、４　１７４ ．９Ｓｅｒ　５１．４（５４，１）　５ｇ、７　４４．７　５７．７＊ Ｇ　１　ｙ　５４．６　（５４，１）　６２．７　２９２．７　８４．６Ｈｉ　 ｓ　５７．４　（５４，１）　６５．８　４３．５　４８．６Ａｒｇ　−−−− Ｔｈ　ｒ　８２．７　（８１，１）　９５．３　７Ｂ、９　１００．６Ａｌａ　 −−−− Ｐ　ｒ　ｏ　５４．５　（５４，１）　ｔ３３．５　４９．９　６０．４＊ Ｔ　ｙ　ｒ　１８．２　（２７，０）　２３．４　１０．５　０．９Ｖ　ａ　１ 　５１．Ｂ　（５４，１）　６１４　３９．３　５７．１１１　ｅ　２９．３　 （５４，１）　３３．８　２Ｂ、８　３１．８Ｌ　ｅ　ｎ　３０．６　（２７， ０）　３３．５　２２．２　３２．８Ｐ　ｈ　ｅ　７０．２　（８１，１）　５ ５．０　５７．６　７２．１化学修飾に対して標的とされたかまたは化学修飾に より影響されたアミノ酸を星印により示す。カッコ内の数値は、Ｄ３の既知の比 較に基づいて予測された数値を示す。

１）リジンのジヒドロキンプロピル化還元２）アスパラギン酸残基およびグルタ ミン酸残基のグリシンメチルエステルへの転換 ３）チロシンのテトラニトロメタン酸化本発明のフィブロネクチン結合タンパク 質は免疫法に使用することができ、好ましくは感応する大きな抗原を創り出すた めに融合タンパク質と結合して、ペプチドは宿主哺乳動物に免疫反応をもたらす 投与量にて注射される。したがって、フィブロネクチン結合ペプチドはブドウ球 菌感染によりもたらされる乳腺炎に対する反鍔動物のワクチン接種に使用できる 。

さらに、フィブロネクチン結合ペプチドは、懸濁液の状態でフィブロネクチン結 合ペプチドを使用して創傷治療により開放外皮ふ創傷における感染を阻止するた めに使用できる。したがって、フィブロネクチン結合ペプチドは創傷の治療のた めに、たとえばタンパク質受容体を阻止するために、または免疫化（ワクチン接 種）のために使用できる。後者の場合には、宿主のからだは、そのようなフィブ ロネクチン結合ペプチドを含む細菌菌株の侵入に対して保護することができる特 殊な抗体を生成する。このようにして抗体は損傷された組織に対する細菌菌株の 密着を阻止する。

組織損傷のコロニー化の例は： ａ）損傷が機械的な外傷、化学的な損傷および／または熱的な損傷によりもたら された、皮ふおよび結合組織の創傷のコロニー化。

ｂ）口腔におけるような、または乳腺、尿道もしくは膣におけるような、粘膜上 の創傷のコロニー化；Ｃ）上皮および内皮に関連して最小組織損傷（微小外傷） により露出された（乳腺炎、心弁障害、膜交換外科手術）、結合組織タンパク質 のコロニー化である。

本発明のＦＮＢＰ、即わちペプチドを、人間を含む哨乳動物における免疫化（ワ クチン接種）の目的に使用するときは、ペプチドは、場合によっては薬学的に許 容し得る分散剤を添加しながら、無菌の、等張生理的食塩水溶液に分散する。い ろいろな型のアジュバントを組織内における解放を持続するためにさらに使用す ることができ、かくして身体の免疫系に対し長時間ペプチドをさらすことができ る。

免疫化を得るために適する投与量は体重驕当りおよび免疫化の注射当り、ペプチ ド０．５〜５μｇである。耐久性の免疫化を得るためには、ワクチン接種は１〜 ３週間の間隔を持つ１回より多い連続した機会で、好ましくは３回の機会にて行 われるべきである。

本発明のペプチドを、局部の、局所の投与のために使用するとき、タンパク質を 濃度２５〜２５０μｇ　／　ｍｌに等張生理的食塩水溶液に分散する。次いで創 傷表面の完全な湿潤を得るためたけの量によって創傷を治療する。

平均的な創傷に対しては、したがって僅か２．３ｍｌの溶液をこの方法で使用す る。このペプチド溶液を使用する治療の後で、創傷を等張生理的食塩水または別 の適当な創（１４治療溶液で適当に洗浄する。

さらに、本発明の最小フィブロネクチン結合部位ペプチドおよびフィブロネクチ ン結合ペプチドは、ブドウ球菌菌株によりもたらされる細菌性感染を診断するた めに使用でき、それにより本発明のフィブロネクチン結合ペプチドは、抗体を含 有する血しょうが通過できてＦＮＢＰと反応し、したがって免疫化される、小さ なラテックスすなわち５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（商標）ビーズのような、固体担体 上に固定化される。次いて凝集を既知の方法により測定する。

さらに、ペプチドはＥＬ　Ｉ　ＳＡ試験（酵素結合免疫吸着剤検定：　Ｅ　Ｅｎ ｇｖａｌｌ、　Ｍｅｄ、　Ｂｊｏｌ、　５５．　１９３　（１９７７））に使用 できる。これによりポリスチレンミクロタイター板のウェル（Ｗｅｌｌ）はＦＮ ＢＰによってコートされ、４℃で一夜インキユベートされる。次いて板をＴｗｅ ｅｎ２０を０．０５％含有するＰＢＳを使用して徹底的に洗浄し、乾燥する。患 者の血しょうの連続した希釈をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で行ない、ウェルへ添加し 、３０℃で１．５時間インキュベートした。酵素と複合した抗ヒト−ＩｇＧ。

または酵素と複合した抗ウシ−１ｇＧをそれぞれすすいだ後、セイヨウワサビペ ルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼをウェルに添加し、３０℃で１ ．５時間インキュベートした。次いてＩｇＧがそれらに結合し、そしてすすいだ 後、酵素基質を添加したが、アルカリ性ホスファターゼの場合にはｐ−ニトロホ スフェートを、またはペルオキシダーゼを使用した場合にはオルトフェニレンジ アミン基質（ＯＰ　Ｄ）をそれぞれ添加した。このようにして次にウェルを含む 板を００５５％ＯＰＤ、および０００５％Ｈ２０□を含有するクエン酸緩衝液を 使用してすすぎ、３０℃で１０分間インキュベートした。各ウェルに４Ｎ　ＨＳ ｏ４溶液を添加して酵素反応を停止させた。色の発現を分光光度計を使用して測 定した。

使用された酵素基質の型に依存して蛍光測定もまた使用できる。

ブドウ球菌感染を診断するための別の方法は、ペプチド配列に基づ＜　ＤＮＡ遺 伝子プローブ法を使用することによる。それによれば、天然または合成りＮＡ配 列を、上述のようなポリスチレン板のごとき固体担体に、たとえば、表面に、乳 腺炎を診断する場合には乳を添加することにより付着させる。場合によっては標 識酵素法的に、または放射性同位元素により、ＤＮＡ遺伝子プローブは次いでＤ ＮＡ配列を含む固体表面板に添加され、それによりＤＮＡ遺伝子プローブは出現 する配列に付着する。

次いで酵素または放射性同位元素は既知の方法により容品に測定することができ る。

全部位を構成する直列の反復アミノ酸配列。反復のおのおのに対応する合成ペプ チドをＤｌ、Ｄ２およびＤ３と命名した。Ｄ３の配列の下にＤ３ペプチドのいく つかのタンパク質加水分解開裂生成物、およびＤ３のフィブロネクチン結合決定 基をさらに明らかにするために使用されたより小さい合成ペプチドの組成を説明 する。１つまたは２つの文字が前にある２つの数字は、個々のペプチドを同定す るために使用する。数字はＤ３の３７個のアミノ酸配列内の各ペプチドのＮ−お よびＣ−末端残基の位置に当てはまる。文字Ｖ１ＣおよびＴは、ペプチドＤ３の それぞれエンドプロテアーゼＧｌｕ−ｃ、トリプシン、またはキモトリプシン消 化物から単離された開裂生成物を示す。ペプチドＴ　１．５−３６はＴ　Ｌ　］ 、　７−３６を生成するりシンエンドペプチダーゼ−Ｃ１またはＴＶＩ５−３０ を生成するエンドプロテアーゼＧｌｕ−ｃによる第二の消化に付した。文字Ｓは 化学合成によって生成されたペプチドを示すために使用する。

を阻害するペプチドＤ３の能力に関する化学修飾の効果。

ペプチドの示された量を、ウシ血しょうアルブミン０．１％（重量／体積）、Ｔ ｖｅｅｎ８０　０．１％（体積／体積）、およびアジ化ナトリウム０．０２％（ 重量／体積）で補われたＰＢＸの０．５ｍｌの検定体積中の５×１０８個の細胞 および５Ｘ１０　ｃｐｍの　Ｉ−ＨＦＮと混合した。室温で６０分エンド・オー バー・エンド混合後、非結合フィブロネクチンをＴｗｅｅｎ８０を０．１％（体 積／体積）含有する水冷ＰＢ５３ｍｌを添加して希釈した。１，３５０×ｇで２ ０分間遠心分離後、上澄み液を吸引し、細菌沈殿物に関連する放射能をＬＫＢガ ンマ−計数管で定量した。

パネルＡ　非修飾Ｄ３　（−）　、およびチロシン（△−△）またはりシン（〇 −〇）によって修飾後の残基の阻害剤活性。

パネルＢ：非修飾Ｄ３（−）、およびグリシンメチルエステル（０−０）　、エ タノールアミン（△−△）によるカルボキシル側鎖残基の修飾後、またはＥＤＣ 試薬だけ（ローロ）の阻害剤活性。

第３図 トリプシンによる消化の前（パネルＡ）、および後（パネルＢ）のペプチドＤ３ の逆相ＨＰＬＣ０クロマトクラフィバＶ　ｙ　ｄ　ａ　ｃ　Ｃ，８分析的カラム および１ｍ１／分の移動率て溶離剤としてＴＦＡ緩衝化アセトニトリルを使用し て行った。ピーク上の数字はＤ３の配列内の開裂生成物の第一および最後の残基 を同定する。パネルＣはトリプシンだけの画像である。

第４図 トリプシン（Ａ、Ｄ）　、キモトリプシン（Ｂ、Ｅ）、またはエンドプロテアー ゼＧｌｕ−ｃ　（Ｃ，Ｆ）による１、２５ たは　Ｉ−ｋＤａフラグメントの結合を阻害するペプチドＤ３の活性に関する検 定。

を阻害する精製プロテアーゼ開裂生成物の能力に関する検定。ペプチドの不在に おける細胞により結合された１２５１−ＨＦＮを１００％とし、ペプチドの存在 における結合をこの値に比較して表わした。

の結合を阻害する合成ペプチドの能力に関する検定。検定条件は第２図の説明文 に記述した通りであった。ペプチドの配列は第１図に示しである。結果はペプチ ドの不在において細胞により結合されたフィブロネクチンに関する百分率として 表わしている。

ＬＩ　ａ＞ ｏｂ 冨３　ｒｆ５ １２５１−１−ＩＦＮ　”５１−２９　ｋＤａ笥仝囚 １．１ヲを芒５・；ち／＋／：’、７・セどに肘でり５ンく〉箪デ図 婢纜め２舌今邦種 手続補正書動式） 本発明ハ構造Ｒ’　−ＰＳＹＱＦＧＧＨＮＳＶＤＦＥＥＤＴ−Ｒ２（式中、Ｒ１ は水素またはＫまたはＤＫであり、Ｒ２はヒドロキシ、Ｌ、ＬＰ、またはＬＰＫ である）を有するフィブロネクチン結合ペプチドに関する。

６゜補正の対象 代表者名を記載した願晋δまひ安住状ＩよＩ−）ＵにてＶノ国際調査報告 一一峠い、（＾＃ｔｌｌｃｌ１ｍｓ昧ＰＣＴ／ＳＥ　９１１００５３４国際調査 報告 、ＰＣＴ／ＳＥ　９１１００５３４

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．構造Ｒｌ−ＰＳＹＱＦＧＧＨＮＳＶＤＦＥＥＤＴ−Ｒ２（式中、Ｒ１は水素 またはＫまたはＤＫであり、Ｒ２はヒドロキシ、Ｌ、ＬＰ、またはＬＰＫである ）を有するフィブロネクチン結合ペプチド。