JPH05501953A - 連続的な高密度の細胞培養システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 連続的な高密度の細胞培養システム 本発明は、細胞の培養方法及びその装置に関するものである。

従来、細胞は、ガラス又はプラスチックのローラ容器及びフラスコに取り付けて 増殖させていた。この方法は、高密度の細胞の培養又は連続的な細胞の培養には 不適であり、大量の媒地及びスペースを必要とする。更に、この方法は労働集約 的である。

高密度の増殖状態を実現するため、積み重ねたプレート構造で、その積み重ねた プレートの表面が細胞の接種及び増殖用の大きい表面積を提供する各種の試みが 為されている。これら各種の試みに拘わらず、従来技術の細胞培養装置は全て、 過度の量の媒地を必要とすること、全ての細胞増殖面に対し栄養を連続的に流動 させることが出来ないこと、労働集約的な監視及び増殖する細胞の保護が必要と されること、及び連続的に機能させることが出来ないことといった幾つかの欠点 本発明の一つの目的は、システム内に保持した栄饗媒地の量に比して細胞を高密 度に増殖させることの出来る細胞培養装置を提供することである。

本発明の別の目的は、媒地流を均等に受け入れる複数の増殖チャンバを備える細 胞培養組立体を提供することである。

本発明の別の目的は、栄養媒地を自動的かつ連続的に追加し、及び細胞により形 成された生成物及び廃物を含む使用済みの媒地を除去することを許容する細胞培 養組立体を提供することである。

本発明の別の目的は、細胞の環境条件を連続的に監視し、所望の状態から逸脱し た場合、自動的に補正し又は警報を発する細胞培養組立体及びシステムを提供す ることである。

本発明の別の目的は、細胞にとって望ましい恒成分培養槽的環境を促進すると共 に、生化学的物質、ワクチンウィルス及び薬剤のような細胞生成物に対する最適 な収量及び採取機能を促進する連続的フローシステムを提供することである。

本発明は、小さい容積内で高密度の細胞を増殖させる極めて大きい表面積を画成 する一列の増殖チャンバを備える連続的な細胞培養装置を提供するものである。

この装置は、増殖チャンバを通じて所定の方向への流動を許容し、その流動が連 続的で各チャンバ内の全ての増殖面に達することが出来るようにする構造及び構 成とする。各チャンバに増殖チャンバの各々への流体の流れ及び配分を制御する 働きをする流体絞りポートを提供することにより、各チャンバ内での十分な流れ を実現することが出来る。

該細胞培養装置は、複数の積み重ねたプレートの間のスペースにより画成される 一列の細胞増殖チャンバを備えることが望ましい。入口導管は、流体絞りポート を介して細胞増殖チャンバに流体連通するマニホルドに対する栄養媒地源を提供 する。流体絞りポートの最狭小領域の合計断面積は、入口導管の断面積より小さ く、これにより各流体絞りポートの圧力低下及び各増殖チャンバを通る流体の十 分な流れを確保する。

流体絞りポート及び増殖チャンバは、流体媒地が最小の乱流にて全ての増殖面に 配分されかつ連続的に所定の方向に流動するのを促進し得る構造及び構成にする ことが望ましい。これは、略四角の箱である増殖チャンバに対してその箱の対向 コーナ部に入口絞りポート及び出口絞りポートを提供することにより実現するこ とが出来る。これら流体絞りポートは、狭小な中間領域を備えることが出来、コ ーナ部は、流体の配分及び乱流無しの流れを促進し得るように湾曲面を備えるこ とが出来る。プレートの対向面の間にはリブを設け、流体流を構造的に支持し、 更に、その流れる方向を決めることが出来る。

このように、本発明は、細胞培養用の閉鎖滅菌システムを提供し、人間が細胞及 びその生成物に露呈されるのを防止しかつ細胞が外部環境により汚染されるのを 防止するものである。増殖状態は、自動的に感知し、その感知状態に応答して栄 養を追加し、細胞生成物を除去することが出来る。該装置は、経済的に製造する ことが出来、又大量生産が可能である。

図面の簡単な説明 第１図は、本発明の細胞培養容器の右上方からの斜視図、第２図は、第１図の線 ａ−ａに沿った斜視図的な断面図、第３図は、第１図の細胞培養容器を形成する のに使用される単一の培養プレートの上方からの斜視図、 第４図は、第３図のプレートのコーナ部の拡大図、第５図は、包み込んだ培養チ ャンバの表面及び端部を示すために装置のケーシングの近接側を切欠いた、本発 明の細胞培養容器の円筒状の実施例の斜視図、第６図は、第５図のら旋状増殖チ ャンバの端面断面図、第７図は、連続的な細胞培養組立体における本発明の細胞 培養容器の概略図、第８図は、第１図の培養容器を形成するのに使用されるプレ ートの間のスペースの高さ及び形状を画成するガスケットを備えるプレート組立 体の一実施例の分解正面図である。

図面の簡単な説明 好適な実施例の細胞培養装置は、容器内に包み込まれた一列の増殖チャンバを備 えている。該増殖チャンバは、細胞が増殖するための大きい表面積を提供する。

外観図（第１図）において、容器１０は、四角の成形頂部１２及び底部１３を備 える略四角の箱であり、端縁に沿って垂直成形側壁１４が密封され、増殖チャン バを収容する流体密の機構を提供する。入口導管１６及び出口導管１８が頂部１ ２の対角状の対向コーナ部から伸長する。入口導管１６は容器１０の内側スペー スに対する流体アクセス口を提供し、出口導管１８は容器１０の内側スペースか らの流体排出口を提供する。出口導管１８は、図示するように頂部からではなく 、基部１３を通って伸長するようにしてもよい。

第２図を参照すると、入口導管１６は、コーナ部にて容器１０の内側スペースを 通って横方向に伸長する入口マニホルド２０と軸方向に整合しかつ流体連通して いる。入口絞りポート２２は、マニホルド２０と容器１０内に配置された複数の 細胞増殖チャンバ２４とを流体連通させ、該チャンバ２４の上方及び下方伸長程 度は一列の積み重ねたプレート２６により画成される。出口マニホルド２８が出 口導管１８と流体連通状態で入口マニホルド２０に対向する容器のニーす部に設 けられている。増殖チャンバ２４の各々は、出口流体絞りポート２３を介して出 口マニホルド２８と流体連通している。好適な実施例における入口及び出口マニ ホルド機構は、相互に鏡像であり、故に、その流動特性は、流体媒地が入口端か ら出口端に、又はその逆に出口端から入口端に流動するかどうかを問わず同一で ある。

絞りポート２２．２３及び導管１６．１８の相対的寸法は、本発明の重要な一部 を形成する。各チャンバが連続的でかつ制御された流体媒地流を受け入れるのを 確実にするため、各チャンバ内の流れを制御する流れ絞りポートにて圧力低下を 生じさせることが必要である。これを実現するためには、流れを制御する絞りポ ートの寸法は、これら絞りポートの最挟小部分の合計断面積が入口導管の断面積 に等しく又は望ましくはそれ以下であるように選択する。これら合計断面積は又 、出口導管の断面積に等しく又はそれ以下であることが望ましい。これら条件が ある場合、特別な増殖チャンバの配置位置が特に望ましいことはなく、全ての増 殖チャンバは、主としてそのチャンバ内の流れを制御する流体絞りポートの特別 な寸法に基づいて流体媒地を受け入れる。これら流体絞りポートは、均一な寸法 とし、各増殖チャンバが等しい流量の流体媒地を受け入れ得るようにすることが 望ましい。

図示した実施例において、増殖チャンバ入口端及び出口端の双方に、流れ絞りポ ートが設けられている。これら入口及び出口絞りポートの小さい方が、それが入 口端又は８口端にあるかに関係なく、特定の増殖チャンバを通る流れを制御する 。このように、各チャンバに対する入口及び出口絞りポートの小さい方の合計断 面積が導管の断面積より小さいことを要する。一対の入口及び出口絞りポートが 均一な寸法であり、その最挟小部分の断面積が等しい場合、上述の合計断面積を 計算するとき、一方の断面積のみを計算に含める。

プレート２８は増殖チャンバを形成し得るよう積み重ねられる。これらプレート は、１ｍｍ以上離間することが望ましい。これらプレートは、相互により近接し て配置することが出来るが、間隔が１ｍｍ以下である場合、プレートの間に気泡 が取り込まれ、媒地の均一な流れを妨害する傾向となる。プレート表面は粗面に し、波状、渦巻き状又はその他の不規則な形状とし、その表面積を増大させ、又 、所定のプレート上で増殖させ得る細胞数を増すことが可能である。不規則にし た場合、プレートの間の１ｍｍの間隔は、その不規則な表面の対面する頂点間の 間隔寸法であるようにする。又、プレート表面は、細胞の増殖を促進させ得るよ うに各種の異なる方法にて表面処理することが出来る。典型的な処理には、カル ボニル基処理、コラーゲン処理、線維腫処理又はフィーダ細胞層が含まれる。

好適な実施例によるプレートは、オクラホマ州７４００４、バートレスビルのフ ィリップス・ケミカル・カンパニー（Ｐｈｉｌｌｊｐｓ　Ｃｈｅｍｉｃａ）　Ｃ ｏ、　、　）から版売されているポリスチレン及びブタジェンのに樹脂、ブロッ ク共重合体にて成形した。適当なプレート材料には、スチレン系材料又はポリメ チルペンテンのような材料が含まれる。しかし、該プレートは、十分に堅牢で、 無毒、生物適合性があり、その他細胞の培養に適したものであれば実質的に任意 の材料にて形成することが可能である。

好適な実施例のプレートは、流れの配分及び製造を容易にする新規な構造を備え ている。プレート２６の各々は、外周壁３２に接する上面３０を備えている（第 ３図）。壁３２の内向き面３４は、プレートの上面３０と共に、増殖チャンバ２ ４の側壁及び床を画成する。プレート２６を組み立てた装置内に積み重ねたとき 、壁３２の頂端縁３５は隣接するプレートの下面３６に係合しかつ密封し、増殖 チャンバを画成し、該チャンバの天井部分は、隣接するプレートの下面３６によ り画成される。積み重ねたプレートの係合配置を容易にするため、壁３２の頂端 縁３５には、隣接するプレートの底面の係合リッジ３７を受け入れる溝３３が形 成される。これら係合するリッジ３７及び溝３３は、積み重ねたプレートと整合 する。　各プレート２６の４つのコーナ部３８．４０は、外周壁３２の高さに等 しい厚さになるまで中実に充填する。充填したコーナ部は、組み立てた構造体に 支持力を付与する。該充填したコーナ部は、以下に更に詳細に説明するように、 流体の乱流及び「デッド箇所」を更に軽減する。

各プレート２６は、対角状に対向した充填コーナ部４０に穴を有している。組み 立てた状態において、積み重ねたプレート２６の穴４２．４４は、軸方向に整合 され、それぞれ、入口マニホルド２０及び出口マニホルド２８を形成する。通路 ４８が各穴４２．４４から充填したコーナ部４０を通って各プレート２６の側壁 及び床により画成された内側スペースに伸長する。これら組み立てた状態におけ る通路は、マニホルド２０．２８と増殖チャンバ２４との間の流体アクセス口を 形成する流体絞りポート２２．２３を形成する。これら通路の各々は、プレート ２６の上面３０の一部により画成された床と、コーナ部４０の一部として一体に 形成され、外周りツノ３２と等しい高さを有する側壁４９とを備えている。対向 するプレート２６の平坦な底面を積み重ね、通路４８の開放した上端を密封する ときに、流体絞りポート２２．２３が形成される。

好適な実施例における流体絞りポートの特定の形状は、狭小部分５０のような狭 小な内側部分を備えている。この場合、この流れ絞りポート２２の径は、増殖チ ャンバ２４に向けて方向に連続的にかつ実質的に増大する。かかる配置により、 増殖チャンバに入る媒地は外方に広がり、増殖チャンバのスペース内で放射状パ ターンにて均一に分散され、増殖面全体に対する栄養の供給及び流体の均一な流 れを促進する。又、この構成は、特に、絞りボート２２付近における乱流を軽減 するものである。図示した実施例において、流れ絞りポートの径は直線的に増大 している。しかし、第２又は第３のベンチュリ管として形成されたポートは、速 度を連続的にかつ漸進的に変化させ、これにより、乱流無しの流れを更に促進す る。　乱流無しの所定の方向への流動パターンは、充填したコーナ部３８及び流 れ案内リブ４６により一層促進される。このコーナ部は、充填されていない場合 、流れ方向に対し、垂直な壁を提供し、かかる壁の結果、増殖チャンバ内には、 乱流及び連続的でかつ所定の方向への新たな媒地流が供給されない「デッド箇所 」が生じ、これにより、細胞が死滅する可能性がある。充填したコーナ部は、流 れを出口ポートの方向に連続的に誘導する作用をする湾曲面を提供する。リブ４ ６は２つの機能を果たす。これらリブは、真空力により装置から排液する場合で さえ、プレートを適正な間隔に維持しつつ、各プレートに構造的支持力を提供し 、又、流れを出口ボートに向けた方向に連続的に誘導し得るように位置決めする ことが出来る。

該装置を組み立てるため、プレートは、プレートの外周壁及びコーナ部を対向す るプレートの底面に密封し得るような方法にて積み重ねかつ相互に固着すること を要する。現在、これら各プレートは、超音波溶接により隣接するプレートに溶 接している。しかし、最終製品が十分な強度を備え、培養した細胞に無害である 限り、溶剤溶接、ＲＦ溶接、ボッティング、糊又はガスケットのような任意の製 造方法が採用可能である。

作用時、最初に、装置に細胞を接種する。次に、次のように接種した細胞に流体 媒地を供給する。流体媒地は、入口導管１６を介して入口マニホルド２０内に導 入する。次に、流体媒地は、各種の流れ絞りポート２２を通じて関係する増殖チ ャンバ２４内に入る。流れ絞りポート及び増殖チャンバの全体的な構造のため、 流れは、増殖チャンバ２４の全表面に連続的にかつ完全に分配され、流体媒地は 、常に、出口の流れ絞りポート２３の方向に動く。次に、媒地は出口の流れ絞り ポート２３を通って出口マニホルド２８内に入り、出口導管１８を通って装置か ら出る。

該装置の別の実施例は、長手方向に方向決めした一列の培養チャンバを保持する 円筒状ケーシングを備えている。第５図に図示するように、円筒状ケーシング５ ６は、円筒状培養チャンバ５７を包み込みかつその外面に密封される。ケーシン グ５６は、各端部にて、入口端プレート５８及び出口端プレート５９という２つ の円形の端プレートに密封され、これら端プレートの各々は、培養チャンバ５７ の両端から僅かに離間されている。培養チャンバ５７の入口端プレート５８と入 口端との間の間隔は、入口マニホルド６０を画成する。培養チャンバ５７の出口 端プレート５９と出口端との間の間隔は、出口マニホルド６２を画成する。流体 は、入口端プレート５８に流体流動可能に取り付けられかつ該プレート５８から 軸方向に伸長する入口導管６４を介して入口マニホルド６０に入る。流体は、出 口端プレート５９に流体流動可能に取り付けられかつ該プレート５９から軸方向 に伸長する出口導管６６を介して出口マニホルド６２から出る。

培養チャンバ５７の長手方向伸長の増殖チャネルは、長手方向に方向決めした複 数の突出リッジ７４を備えて形成された矩形の可撓性シート７２を圧延して形成 される。該シートを突出リッジ７４に対して平行な側から圧延すると、シート７ ２は、ら旋形の円筒体の形状となる（第６図）。突出リッジ７４は、圧延したシ ート７２の重ね合わせ部分と共に、長手方向チャネル列７６を画成し、リッジ７ ９の高さが各チャネル７６の高さを画成する。チャネル７６の開放端は、栓又は キャップをし、各チャネル７６に対する流体のアクセスを制限する絞りポート２ ２を提供する。

この実施例の作用は、上述のものと同様である。最初に、装置に細胞を接種し、 この細胞がチャネル７６の表面に付着するようにする。次に、流体媒地を入口導 管６４を介して入口マニホルド６０内に導入する。次に、流体露地は、入口絞り ポート２２を介してマニホルドから長手方向に伸長する増殖チャンバ７６内に進 む。該流体露地は、増殖チャネル７６の長さに沿って連続的に進み、出口絞りポ ート（図示せず）を通り、出口マニホルド６２及び出口導管６６を介して装置か ら出る。

本発明の一つの特徴によれば、本発明の細胞増殖装置は、第７図に概略図で示す ように組立体８０の一部として提供される。組立体８０は、連続的な作用可能で あるような構造及び構成とする。組立体８０は、本発明の培養容器１０を流体リ ザーバ８２に接続する閉ループシステムである。リザーバ８２の出口ボート８４ は、流体供給導管８８を介して培養容器１０の入口ポート８６に接続される。

培養容器１０の出口端９０は、流体戻り導管９４を介してリザーバ８２の入口ポ ート９２に流体連通ずる。ポンプ９６が流体供給導管８８に沿って配置されてお り、流体露地をリザーバから培養容器１０を通じて連続的に送出する。栄養供給 管９８がポンプ９６と容器１０との間で流体供給導管８８に流体流動可能に接続 されており、このため、栄養を流体供給導管８８に付与することが出来る。栄養 を流体供給導管８８に送出するポンプ１００が設けられている。又、リザーバ８ ２には、培養容器の下流の流体を望ましくは連続的に除去する吸引ポンプ１０４ に接続した生成物吸引導管１０２が設けられている。最後に、組立体には、流体 供給導管８８及び流体吸引導管９４にプローブ１０６が設けられる。これらプロ ーブ１０６は、露地の状態を感知する手段を提供する。これらプローブは、制御 装置１ｉｆ１０８に接続することが出来る一方、該制御装置１０８は、各種のポ ンプに接続し、露地の状態に基づいて栄養の導入及びリザーバからの生成物の吸 引を制御する。随意的選択として、培養露地に酸素を連続的に再供給する酸素交 換手段１１０を設けることも可能である。栄養供給ポンプ１００及び生成物吸引 ポンプ１０４は、連続的にかつ等速度にて作動させ、再供給露地が連続的に導入 され、生成物がシステムから連続的に吸引され、その送出速度が制御手段により 設定されるようにすることが望ましい。

上述のように、流れ絞りポートは、均一な寸法にする必要はない。各チャンバを 通る流れを均一にすることが望ましい場合、一般的に、流れ絞りポートは等しい 径にすることが必要である。しかし、当業者には、流れ絞りポートの寸法のみな らず、増殖チャンバの特定の寸法いかんによっても流量が決まることが理解され よう。このように、流れ絞りポート及び増殖チャンバの相対的寸法は、共に、特 定の流量を維持する一方、変化させることも可能である。

好適な実施例において、増殖チャンバ当たり一対の絞りポートのみについて説明 した。勿論、入口側又は出口側に多くの流れ絞り手段を備えることが可能である 。本発明者は、現在、製造が容易であり、乱流が少なく、通常、流れ絞りポート の極く付近の箇所で見られる細胞の増殖不足を軽減する結果が得られる点で１つ の入口及び出口絞りポートを設けることが望ましいと考える。

更に、当業者には、流れ絞りポートを入口側にのみ設けることも可能であること が理解されよう。細胞を培養容器から除去する従来の方法は、狭小な出口を閉塞 させる虞れのある細胞塊を生じる傾向があるため、かかる構造の容器は、細胞を 容器から取り出す必要がある適用例に望ましいものである。又、絞りポートを出 口側にのみ設けることも可能である。しかし、現在、流れ絞りポートを入口側及 び出口側に設けることが望ましい。

流れ絞りポートの合計断面積は、出口導管の断面積以下とし又はこれに等しくす ることが更に望ましい。さもなければ、出口導管は背圧を受け、その結果、流動 が１又は２以上の培養チャンバを通って、優先的に行われることになろう。

別の実施例において、第１図乃至第４図に示したものと同様の細胞培養容器は、 増殖チャンバ（第８図）の側壁及び絞りポートを形成するガスケット挟持する一 連の平坦なプレートにて形成することが出来る。この実施例において、プレート １２６は、略平坦な上面及び下面を備えている。交差穴１２８が各プレートの一 対の対向するコーナ部の各々に配置されている。ガスケット１３０は、プレート １２６の外周に対応する寸法及び形状の外周を備えている。ガスケット１３０の 内面１３２は中空スペースを画成する。一対のプレート１２６がガスケット１３ ０を挟持するとき、プレート１２６の対向面は増殖チャンバの上方及び下方伸長 程度を画成する一方、ガスケットの内壁１３２は、増殖チャンバの側壁を形成す る。

ガスケットのコーナ部１３４は充填する。一対の対向コーナ部の各々は、貫通し て伸長するガスケット穴１３６を有し、これらガスケット穴１３６は、プレート １２６の対向するコーナ部の穴１２８と対応する寸法及び形状をしている。通路 １３８がガスケット穴１３６からコーナ部を通ってガスケット１３０の内向き壁 １３２により画成される内側スペースまで内方に伸長する。一対のプレート１２ ６がガスケット１３０を挟持するとき、プレート１２６の穴１２８、及びガスケ ット穴１３６は、整合してマニホルドを形成する。通路１３８は、積み重ねたプ レートにより上方及び下方伸長箇所にて閉塞され、絞りポートを形成する。

かかる積み重ねたプレート及びガスケットの組立体は、クランプのような圧縮力 により相互に保持することが出来る。本発明のこの特別な実施例は、細胞の増殖 後、プレートを相互に分離させ得るという利点を備えている。これにより、細胞 の単一層、即ち、「外皮」はプレート表面から剥離することが可能となり、その 他、プレート表面上の細胞に対するアクセスが容易となる。

この実施例に使用される細胞培養組立体は、第１図に示すものと略同−の構造と した（プローブ及び酸素交換手段を除いて）。

この組立体に使用される細胞培養容器は次の特性を備えるものとした。１０枚の プレートを積み重ね、超音波溶接により相互に固着した。底部プレートが容器の 底部を形成するようにした。入口及び出口導管取り付は箇所を備える頂部プレー トを最上方プレートに密封し、最上方増殖チャンバが形成されるようにした。

この頂部プレートは、積み重ねたプレートの４つの全ての側部をポツティング成 形することにより適所にクランプしかつ固着した。各プレートは、厚さが約１． ５ｍｍとし、プレートの各々が、コーナ部を充填した約１ｍｍの高さの壁を備え ようにした。積み重ねたとき、プレートは高さ約１ｍｍ、及び長さ、幅２２ｍｍ の増殖チャンバを形成した。その最挟小部分の絞りポートは、高さ１ｍｍｘ幅２ ｍｍであり、約２ｍｍ２の断面積を画成した。円筒状の入口導管は、直径約５ｍ ｍであり、約４９ｍｍ２の断面積を画成するようにした。このように、入口導管 の断面積（４９ｍｍりは、絞りポートの最挟小部分の合計断面積（２０ｍｍ”） を上廻る結果となった。

この実施例に使用した細胞は、マレーランド州、ロックビルのアメリカン・タイ プ慟カルチャー畢コレクンＨン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ 　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）からＡＴＣＣＮｏ、ＣＣＬ−８１として入手されるベ ロ（ＶＥＩｉＯ）細胞とした。このベロ細胞は、ローラボトル（マサチューセッ ツ州、ケンブリッジのコースタ・コーポレーション（Ｃｏｓｔａｒ　Ｃｏｒｐｏ ｒａｔｉｏｎ）の９００ｃｍ”）内で増殖させ、密度５．　Ｏｘ　１０’の細胞 とした。この細胞は、次に無菌状態でトリプンン処理し、細胞をボトル表面から 除去し、次に、細胞は、１５ｍ１のＭＥＭ　にューヨーク州、グランドアイラン ドのキフコ（Ｇｊｂｃｏ）　）及び５ｍｌのＦＢＳ　（ミズリー州、セントルイ スの）ニータル・ボビン・セラム、ングｖ　（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅ ｒｕｍ、Ｓｉｇｍａ）　）内で再度懸濁させた。

組立体には、１．２５０ｍ　ｌの流体露地（５％ＦＢＳ内にＭＥＭ）を充填し、 次に、容器は、同日に、流体供給導管内に配置した滅菌隔壁を通じて細胞を注入 することにより細胞を装填する一方、流体露地は、ポンプにより容器内に導入し た。この装填は、容器がその通常の作用位置（入口導管が底部にあり、出口導管 が頂部にあって、その側部が垂直方向に立ち上がった状態）にあるときに行った 。この位置において、容器に入る全ての泡は上昇し、容器から出る。細胞を流体 露地流内に徐々に注入する間にポンプを連続的に作動させ、そのポンプ及び細胞 の注入は、露地を注入箇所から容器の出口ポートまで動かすのに必要な時間の約 ９０％が経過する時点で停止させた。この細胞の装填方法は、注入時ｌ二均−に 希釈し、容器の全ての増殖チャンバにて細胞を均一に処理するものである。次に 、この容器は、その底面が接触する状態に４時間置き、細胞がその面に付着する ようにした。

次に、容器をその頂部面が水平位置となるように配置し、細胞がその面に付着す るのを許容する点を除いて、上述の装填方法を反復した。

容器に細胞を接種し、細胞が付着するのを許容した後、ポンプ８８を始動させ、 ２４時間中、７５ｍ１／分の速度で連続的に作動させた。２日目に開始し、次の ２４時間中、作動させることにより、更なる流体露地がシステム内に導入され、 その全容積は１．７５０ｍ　ｌとなった。更に、２日目、ポンプ速度は、７５ｍ １／分から１５０ｍＩ／分に増速させた。次に、３日目、ポンプは３００ｍ　１ 　／分の速度まで増速し、その速度で５日目まで連続的に作動させた。ポンプの ５日目の作動時、５％の炭酸ガスをリザーバ内の流体媒地表面上を循環させた（ 約２５ｍ　ｌ　／分）。増殖の５日目、容器は組立体から外し、塩水で洗滌した 。その後、グルタルアルデヒド（塩水中）を容器内に導入し、細胞を固定した。

次に、細胞はライト（ｆｒｉｇｈｔ）染料にて着色した。着色後、着色した細胞 を検査するため、容器を切断して開放させた。プレート表面は細胞の均一な層で 完全に被覆されていた。

５日間の増殖期間中、グルコースの消費量を監視した。グルコースの消費量は、 次の通りであった。

５日間の増殖期間中、グルコース消費量の変化に対応して速度を増速しで、新た な露地を栄養供給導管を通じて導入した。対応する量の使用済み露地をリザーバ 内のオーバーフロー導管を介して除去した。システムの容量はＩ、　７５０ｍ　 ｌであるため、この１以上の増加分はオーバーフローする結果となった。故に、 システムを一旦完全に充填したならば、新たな流体露地を添加することにより、 対応する等しい量の使用済み媒体が流体リザーバから除去される結果となった。

グルコースは注射器を隔壁内に挿入し、少量の流体露地標本を除去することで監 視した。次に、この標本のグルコース値を細胞培養組立体から離れた箇所にて試 験した。更に、本明細書に記載したように、組立体には、グルコース等を連続的 に監視するためのオンライン型プローブを設けることも可能である。

上述の実施例の各種の変形例及び応用例が本発明の範囲内で可能であることを理 解すべきである。上記説明に含め又は添付図面に示した全ての事項は、単に一例 にしか過ぎず、限定的な意味を有するものと解釈されるべきではない。

ＦＩＧ、　Ｉ ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、　５ ＦＩＧ、　６ 国際調査報告

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．組織培養装置にして、 複数の細胞増殖チャンバであって、その内面が細胞の増殖に適するようにした細 胞増殖チャンバと、 前記チャンバに対する流体源を提供する入口導管と、流体を前記チャンバから排 出する出口導管と、前記導管の少なくとも１つと前記増殖チャンバの各々とを流 体連通させる流体絞り手段とを備え、前記流体絞り手段の最狭小部分の合計断面 積が入口導管の断面積に等しく又はそれ以下であるようにしたことを特徴とする 組織培養装置。
2. ２．請求の範囲第１項に記載の組織培養装置にして、前記細胞増殖チャンバが複 数の積み重ねたプレートの間の間隔により画成されることを特徴とする組織培養 装置。
3. ３．請求の範囲第２項に記載の組織培養装置にして、前記流体絞りポート及び前 記ブレードが、前記チャンバの入口端から出口端まで流体を連続的にかつ所定の 方向に向けて乱流無しに流動させ得る構造及び構成であることを特徴とする組織 培養装置。
4. ４．請求の範囲第２項に記載の組織培養装置にして、前記プレートが少なくとも １ｍｍだけ離間されることを特徴とする組織培養装置。
5. ５．請求の範囲第２項に記載の組織培養装置にして、前記プレートが略四角であ り、前記流体絞り手段が、プレートの一対の対向するコーナ部に流体絞りポート を備えることを特徴とする組織培養装置。
6. ６．請求の範囲第２項に記載の組織培養装置にして、前記プレートを分離させる 支持リブを更に備えることを特徴とする組織培養装置。
7. ７．同様のプレートと共に積み重ねられ、複数の組織培養チャンバを画成する組 織培養プレートにして、 成形した矩形のプラットフォームであって、略平坦な上面及び下面を有するプラ ットフォームとを備え、前記面の少なくとも一方が外周リッジを備え、前記プレ ートが一対の対角状に対向するーナ部を備え、前記コーナ部が外周リッジの高さ まで充填され、 更に、前記充填した各コーナ部に設けられた穴であって、プラットフォームによ り画成された面に対し垂直な軸線を有する穴と、前記穴とリッジ及びプラットフ ォームによる画成される内側スペースとを連通させる第２の通路とを備えること を特徴とする組織培養プレート。
8. ８．請求の範囲第７項に記載の組織培養プレートにして、前記プレートが該プレ ートの上面と一体の支持リブを更に備えることを特徴とする組織培養プレート。
9. ９．複数の増殖チャンバと、前記増殖チャンバに対する流体アクセス口を提供す る入口ポートとを備える組織培養装置にして、狭小な中間部分と、前記増殖チャ ンバの方向に増大する径とを有する入口ポートを更に備え、前記入口ポートを通 って増殖チャンバ内に流動する流体が広い角度の放射状パターンにて分散される ようにしたことを特徴とする組織培養装置。
10. １０．請求の範囲第２項に記載の組織培養装置にして、前記細胞増殖チャンバが ガスケットにより分離された複数の積み重ねたプレートの間の間隔により画成さ れることを特徴とする組織培養装置。
11. １１．請求の範囲第１０項に記載の組織培養装置にして、前記ガスケット及びプ レートが積み重ね列を形成し、前記プレートが前記積み重ね列から分離され得る ような構造及び構成であることを特徴とする組織培養装置。
12. １２．請求の範囲第１０項に記載の組織培養装置にして、前記プレート及びガス ケットを積み重ね列状に解放可能に固着する手段を更に備えることを特徴とする 組織培養装置。
13. １３．請求の範囲第１項に記載の組織培養装置にして、前記入口導管と前記複数 の細胞増殖チャンバとの間に配置された入口マニホルドを更に備え、前記流体絞 り手段が、前記入口マニホルドと前記細胞増殖チャンバの各々との間に配置され ることを特徴とする組織培養装置。
14. １４．請求の範囲第１３項に記載の組織培養装置にして、前記流体絞りポート及 び前記プレートが、前記チャンバの入口端から出口端まで流体を連続的にかつ所 定の方向に向けて乱流無しに流動させ得る構造及び構成であることを特徴とする 組織培養装置。
15. １５．請求の範囲第１３項に記載の組織培養装置にして、前記絞り手段が、狭小 な中間部分と、前記増殖チャンバの方向に増大する径とを有し、これにより、前 記入口ポートを通って増殖チャンバ内に流動する流体が広い角度の放射状パター ンにて分散されるようにしたことを特徴とする組織培養装置。
16. １６．請求の範囲第１項、第１３項、第１４項又は第１５項の何れかに記載の組 織培養装置にして、前記出口導管と前記細胞増殖チャンバとの間に配置された出 口マニホルドを更に備え、前記絞り手段が、前記出口マニホルドと前記増殖チャ ンバとの間に配置されることを特徴とする組織培養装置。