JPH05501359A - 付着分子発現に関与するフコシルトランスフェラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ・　発　に　するフコシルトランスフェラーゼａ訓３υ［ｉ 本発明は、細胞付着の生物学に関し、特に表面リガンドの発現に関与する分子に 関する。この表面リガンドは、特に付着分子であるＥＬＡＭＩへの白血球の結合 に関わる糖タンパクの発現のＣＤＸである。

炎症とは、特徴として、特に、血管の内壁への白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ（ｗ ｈｉｔｅ　ｂｌｏｏｄ　ｃｅｌｌ））の付着および周りの組織への白血球の浸潤 を包含する（　Ｈａｒｌａｎ、　１９８５）。通常の炎症において、浸潤してい る白血球は、侵入する生物あるいは死細胞を食菌し、そして組織修復の役割を果 たす。しかし、病的な炎症では、浸潤している白血球は深刻な損傷、そしてしば しば致命的な損傷の原因となり得る（Ｈｏｕｇｈおよび５ｏｋｏｌｏｆＶ、　１ ９１１５；Ｒｏｓｓ、１９８６；）Ｉａｒｌａｎ、　１９８７およびＭａｌｅｃ ｈおよびＧａ１ｌｉｎ、　＋９８７）　ｏ　白血球の付着は多くの炎症に関する 病理学の重要な段階（ｋｅｙ　５ｔｅｐ）であると認識して、研究者らは最近、 内皮細胞表面に白血球が結合するメカニズムに注目している。

細胞の付着は、リセブターおよびリガンドとして作用する内皮細胞および白血球 の両方における細胞表面の分子によって、媒介される（　Ｆｅａｒ　ｔａｎら、 　１９８７　ＨＤａｎａら、　１９８６　、およびＢｅｖｉｌａｃｑｕａら、　 １９１］７ａ）。リンパ球の結合を媒介する内皮細胞表面上の分子は、内皮細胞 −白血球付着分子（ＥＬＡＭＳ）と呼ばれることもある（　Ｂｅｖｉｌａｃｑｕ ａら、１９８７ｂ）。あるＥＬＡＭ、４寺（こＥＬＡＭＩは、インビボの炎症を 起こした血管壁へのＰＭＮ付看付着要な媒介物質であると考えられる。ＥＬＡＭ Ｉは、１１６ｋＤの細胞表面種タンパクである。インビトロで増殖させたＨＵＶ ＥＣｓ　（ヒト済静脈内皮細胞）においては、ＥＬＡＭＩは炎症サイトカインＩ Ｌ−１およびＴＮＦに応じて迅速に合成される（　Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａら、　 １９８７ｂ；Ｃｏｔｒａｎら。

１９８６、およびＣ０ｔｒａｎおよびＰｏｂｅｒ、　１９８８）。

ＥＬＡＭＩを発現している細胞への白血球の付着によって、ＥＬＡＭ１リガンド が白血球上に存在することが示唆される。我々は、ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０２３ ５７　（ここで参考として援用されている）において、内皮細胞への白血球の付 着に関連している分子（ＭＩＣＡ）（これは、おそらく、唯一のＥＬＡＭＩリガ ンド（または、あるＥＬＡＭＩリガンド）である）の単離について報告した。Ｈ Ｌ−６０１１１胞から単離され、モしてＣＤＸと名付けられた分子は、１５０ｋ Ｄの糖タンパクである。我々は、ＨＬ−６０の全細胞でマウスを免疫することに よってＣＤＩに対して生じたモノクローナル抗体である５ＧＢ３Ｂ４を用いて、 ＣＤＩを単離した。５Ｇ８３Ｂ４は、ＥＬＡＭＩ発現細胞へのＰＭＮおよびＨＬ −６０細胞の結合を阻害する。さらに、ＣＤＸはＥＬＡＭｌに付着することが知 られている白血球細胞の型に存在し、そして、ＥＬＡＭＩに付着しない白血球細 胞型および他の細胞型には存在しない。このように、ＣＤＩは、ＥＬＡＭＩ−媒 介される白血球−内皮細胞の付着において重要な役割を果たす、ある種の白血球 で発現する分子である。

炎症におけるそれらの役割に加えて、ＥＬＡＭは、腫瘍の浸入、転移およびウィ ルス感染を含む、細胞−細胞間の認識を包含する病理学的な状態の広範囲にわた って、重要な役割を果たし得るということを、多くの実験が証明している（　Ｈ ａｒｌａｎ、　１９８５；＊ａｌｌｆｓおよびＨａｒｌａｎ、　１９８６　；Ｂ ｅｖｉ　Ｉａｃｑｕａら、ｌ９８７ａ；およびＣｏｔｒａｎおよびＰｏｂｅｒ、 　１９８８）。

このように、ＣＤｘおよびＥＬＡＭＩは、炎症および、おそら（は他の病状にお いて、重要な役割を果たす。それらの発現に直接的にまたは間接的に寄与する分 子の単離は、炎症中の細胞の付着を妨げること、または他の病理学的状態におい てＥＬＡＭｌおよびＣＤＸの関与を制限することを目的とする治療法の開発にお いて重要な工程である。

及豆立！１ 本発明は、Ｃ０５ＳＣＨＯおよびＲ１，１を包含するいくつかの細胞系に、抗− ＣＤＸ　（α−ＣＤＸ）抗体によって認識される表面糖タンパクを発現させ、そ してＥＬＡＭＩに結合させる分子をコードするＤＮＡ配列を提供する。本発明は 、特に、クローン７．２およびクローン１、およびタンパク７．２およびタンパ クｌをそれぞれ提供する。これらのタンパクは、１．３−フコシルトランスフェ ラーゼであると考えられる。

本発明はまた、糖タンパクであるＰｓｅｕｄｏ−ＸおよびＰｓｅｕｄｏ−Ｘ２を 提供する。これらのタンパクは、それぞれｃｏｓ細胞およびＣＨＯ細胞をＥＬＡ ＭＩと結合させ、モしてα−ＣＤＸ抗体によって認識されるようにする。

区道ρＪＪす１哩 図１には、タンパク７．２をコードするｃＤＮＡの配列、およびｐＳＱ２１９お よびＣＤＸ　ｐＣＤＭ８ＣＤ−ン７．２から誘導されたタンパク７．２の推測さ れるアミノ酸配列を示す。このヌクレオチドには１〜２１７５の番号が付けられ ている。本願において、我々は、この図のコーディングＤＮＡ配列をクローン７ ．２に対するＤＮＡ配列と呼ぶ。我々はまた、この図に描かれているアミノ酸配 列を含むポリペプチドをタンパク７．２と呼ぶ。

図２には、クローンエから誘導されるタンパクエをコードするｃＤＮＡの配列が 描かれている。本願において、我々は、この図のコーディングＤＮＡ配列をクロ ーン１に対するＤＮＡ配列と呼ぶ。

我々はまた、この図に描かれているアミノ酸配列を含むポリ良豆ユ１鼠工凰皿 この詳細な記載にしたがって、以下の定義が適用される二発現制御配列−−他の ＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列。

作動可能に連結されるｍ−発現制御配列がＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御お よび調節するとき、このＤＮＡ配列は発現制御配列に作動可能に連結される。こ の「作動可能に連結される」というに用語には、発現されるＤＮＡ配列の前に適 切な開始信号（例えば、ＡＴＧ）を有すること、および発現制御配列の制御下の このＤＮＡ配列の発現およびこのＤＮＡ配列によってコードされる所望の生成物 の製造を可能にする正しい読み枠を維持すること、が包含される。組換えＤＮＡ 分子中に挿入しよとする遺伝子が適切な開始信号を含有しないなら、このような 開始信号を遺伝子の前に挿入させ得る。

標準的なハイブリダイゼーションの条件−一　ハイブリダイゼーションおよび洗 浄の両方に対して５ｘｓｓｃおよび６５°Ｃに実質的に等しい塩および温度条件 。標準的なハイブリダイゼーションの条件下において、本発明のＤＮＡ配列は、 異なる種百来の相同性のある配列を含む、十分な相同性を有する他のＤＮＡ配列 にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの条件の緊縮性は、ハイブリダ イゼーションに必要な相同性の程度における因子であることが判っている。

ＤＮＡ配列−一本発明のＤＮＡ配列とは、組換えＤＮＡ技術を用いて、調製ある いは単離されたＤＮＡ配列をいう。これらのＤＮＡ配列には、ｃＤＮＡ、天然ゲ ノムから単離されたＤＮＡ配列、および合成りＮＡ配列が包含される。請求項の 範囲において用いられているこの用語は、自然界に存在するような天然のＤＮＡ 配列を包含することを意図しない。

本発明の組換えＤＮＡ分子の発現には、宿主細胞によって生じるポリペプチドの 翻訳後修飾を包含し得る。例えば、哺乳類細胞において、発現には以下のものが 包含され得る：特に、ポリペプチドのグリコジル化、リピデーンヨン（ｌ１ｐｉ ｄａｔｉｏｎ）またはリン酸化、あるいはシグナル配列を開裂させて「成熟」タ ンパクを生じること。従って、本明細書で用いられるように、「タンパク」とい う用語は、全長のポリペプチドおよびそれらの修飾体または誘導体を含み、例え ば、このようなポリペプチドの糖付加型、成熟タンパク、シグナルペプチドを保 持しているポリペプチド、匹敵する生物学的活性を有する先端切断ポリペプチド などがある。

本発明の分子は、ある白血球上における糖タンパクであるＣＤＩの発現に関与し ている。ＣＤＸは、約１５０ｋＤの単一の、拡がったバンドとして、５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥ上に現れる。９０ｋＤのタンパクバンドは、時折、ＨＬ−６０細胞由来の 結合されたタンパクにおいて見られ、そして、好中球由来のタンパクにおいて常 に見られる。

我々は、この９０ｋＤのバンドがＣＤＩ分解生成物を示すと考えている。高分子 量のバンド（すなわち、約１７０ｋＤ）もまた、時折、見られた。これらは非特 異的バンドであり得る。＋５０ｋＤのＣＤＸをＮ−グリカナーゼ（Ｎ−ｇｌｙｃ ａｎａｓｅ）で処理した場合、この分子量は約７０ｋＤに減少した。１５０ｋＤ のバンドをＮ−グリカナーゼおよび０−グリカナーゼで処理した場合、分子量は それ以上は減少しなかった。さらに、ＨＬ−６０細胞をシアリダーゼで処理した 場合、それらはＥＬＡＭＩに結合する能力を失う。これらの結果は、ＣＤＸはか なり密にグリコジル化されたタンパクであり、そしてこのグリコジル化はＣＤＸ −ＥＬＡＭＩの相互作用において重要な役割を果たすことを示す。

我々は、ＣＤｘポリペプチドをグリコジル化し、そしてＣＤＸポリペプチドにＥ ＬＡＭＩを結合する能力を与える、１．３−フコシルトランスフェラーゼをコー ドすると考えられている、２つのＤＮＡ配列、クローン７．２およびクローンｌ を単離した。１，３−フコシルトランスフェラーゼは、ゴルジ体および小胞体に おいて作用し、１．３グリコシド結合によって適切な受容体炭水化物にフコシル 部分を結合する、非常に特異的な酵素である。これらの配列の遺伝子構造は、他 の周知のグリコノルトランスフェラーゼの遺伝子構造と一致している。さらに、 クローン７．２でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞は、フコシルトランスフエ ラーゼ活性を発現する。

数種の１．３−フコシルトランスフェラーゼが当業者に知られている（Ｐａｕｌ ｓｏｎおよびＣｏ１１ｅｙ、　１９８９およびＫｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌ 。

ら、１９９０）。同様の活性を有するこれらのタンパクは、それら自身同士、ま たは他のグリコジルトランスフェラーゼの間においてわずかに配列の相同性があ るのみである（ＰａｕｌｓｏｎおよびＣｏｌ　ｌｅｙ、　１９８９およびＫｕｋ ｏｖｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏら、　１９９０）。従って、我々は、これらのＤＮ Ａ配列が本発明のＤＮＡ配列とキロ同性を宵するとは考えていない。しかし、他 の種は、ここで開示されているＤＮＡ配列と充分な配列相同性を共有する相同性 の遺伝子を含むと考えられる。標準的な／％イブリダイゼーシコン条件下で、プ ローブとして本発明のＤＮＡ配列を用いて、これらの相同性の遺伝子を単離し得 る。本発明は、特に、このような配列を熟考し、そして包含している。

ＣＯＳ　７細胞をこれら２つのクローンのいずれかでトランスフェクトした場合 、それらはＣＤＩを発現する細胞のように挙動した。すなわち、ＥＬＡＭＩが結 合し、モしてα−ＣＤＸモノクローナルである５Ｇ８３ＢＪによって認識される 、表面糖タンパクを生じ得るという点でＥＬＡＭＩに対して「可視的」になった 。α−ＣＤＸモノクローナルを用いることにより、我々がＰｓｅｕｄｏ−Ｘと名 付けた、トランスフェクトされたＣＯ８細胞由来の１３０ｋＤの糖タンパクのイ ムノブレンビテーションを行った。同様に、クローン７．２でトランスフェクト されたＣＨＯ細胞もまた、ＥＬＡＭＩおよびα−ＣＤＸに対して可視的になった 。それらは、我々がＰｓｅｕｄｏ−Ｘ２と名付けた１４０ｋＤ糖タンパクを発現 する。

Ｐｓｅｕｄｏ−ＸおよびＰｓｅｕｄｏ−Ｘ２の両者ともＣＤＸではないｏ　Ｐｓ ｅｕｄ。

−Ｘは、約１３０ｋＤの分子量を有し、そして、Ｐｓｅｕｄｏ−Ｘ２は１４０ｋ Ｄの分子量を有する。ＣＤＸは１５０ｋＤの分子量を有する。Ｎ−グリカナーゼ あるいはフッ化水素酸く全ての炭化水素を除去する）で処理した場合、Ｐｓｅｕ ｄｏ−Ｘは１１０ｋＤに変化する。Ｐｓｅｕｄｏ−Ｘ２は約１２０ｋＤに変化す る。ＣＤＩは約７０ｋＤに変化する。４ＳｋＤにも５９ｋＤにも移動しないので 、タンパク７．２およびタンパク１の予想される分子量は。Ｐｓｅｕｄｏ−Ｘお よびＣＤＸはまた異なるｖ８およびキモトリプシン消化パターンを有する。

我々は、以下のようにクローン７．２およびクローンｌを単離した：　ＣＤＸを 発現する、ヒト細胞系、ＨＬ−６０のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを創製 した。以下に記載するように、ＣＤＸを発現しないヒト細胞系（この場合ＨｅＬ ａ細胞）でサブトラクションテクニックを用いることによって、このライブラリ ーを弾化した。このことにより、約２１００クローンを含有するサブトラクショ ンされたライブラリーを生じた。多くの方法でアッセイされた、サブトラクシコ ンされたライブラリーで、サルの腎臓の細胞系であるＣＯＳ　７をトランスフェ クトした。

我々は、トランスフェクトした細胞をα−ＣＤＸモノクローナル抗体（Ｍｏａｂ ｓ）と共にインキュベートし、抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭでコートされたプレ ート上でそれらをバンニングした（Ｗｙｓｏｃｋｉおよび５ａｔｏ、　１９７８ ）。プレートに結合する細胞は、α−ＣＤＸ　Ｍｏａｂｓによって認識される分 子を発現するものである。

このように、我々は、２．　ＬｋｂのＤＮＡ挿入物でトランスフェクトされた付 着細胞を同定した。我々は、シーフェンスベクター中にこの配列の一部をサブク ローンし、そしてそれをｐｓＱ２１９と名付けた。ｐＣＤＭ８ＣＤ−ンにおける ＤＮＡ挿入物をクローン７゜２と名付けた。さらに、ハイブリダイゼーションに よって２．９ｋｂの挿入物を単離し、そしてそれをクローン１と名付けた。これ ら２つのクローンは、タンパク７．２およびタンパクｌをそれぞれコードする。

本発明の他の特徴は、ここで開示されるＤＮＡ配列の発現である。当業者によ（ 知られているように、ＤＮＡ配列は、適切な発現ベクター中で、発現制御配列に 作動可能に連結し、そしてその発現ベクターを用い、適切な単細胞宿主を形質転 換することによって発現し得る。

このような本発明のＤＮＡ配列の発現制御配列への作動可能な連結には、このＤ ＮＡ配列の正しい読み取り枠のｈ流に、開始コドンであるＡＴＧを提供すること が包含される。このことは、開始コドンがまだ、このＤＮＡ配列またはこの発現 ベクターの一部でない場合に行われる。

広範囲の宿主／発現ベクターの組み合せか、本発明のＤＮＡ配列を発現するのに 用いられ得る。有用な発現ベクターは、例えば、染色体、非染色体および合成り ＮＡ配列のセグメントから成り得る。適当なベクターとしては、ＳＶ４０の誘導 体および周知の細菌のプラスミド、例えば、大腸菌のプラスミドｃａｌ　Ｅｌ、 ｐｃＲｌ、　ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体、ＲＰ４のようなプ ラスミド；ファージＤＮＡ、例えば、λファージの多数の誘導体、例えば、ＮＭ ９８９、および他のファージＤＮＡ、例えば、Ｍ１３および繊維状（Ｆｔｌａｍ ｅｒ＋ｔｏｕｓ）一本鎖ファージＤＮＡ：２ｕプラスミドあるいはその誘導体の ような酵母プラスミド；真核細胞において有用なベクター、例えば、昆虫あるい は哺乳類細胞において有用なベクター；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み 合せ由来のベクター、例えば、ファージＤＮＡあるいは池の発現制御配列を用い るために修飾されたプラスミド；などが挙げられる。

広範囲の発現制御配列−一それに作動可能に連結されるＤＮＡ配列の発現を制御 する配列−一　は、いずれも本発明のＤＮＡ配列を発現するためにこれらのベク ターにおいて用いられ得る。このような有用な発現制御配列としては、例えば、 ５ｖ４０あるいはアデノウィルスの初期および後期のプロモーター、Ｉａｃ系、 Ω上系、工あるいは１系、λファージの主要オペレーターおよびプロモーター領 域、ｆｄココ−タン、ｆりの制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼあるい は他の解糖系酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター（例えば 、Ｐｈｏｎ）、酵母α−接合因子のプロモーター、および原核細胞あるいは真核 細胞あるいはそれらのウィルスの発現を制御する周知の他のプロモーター、およ びそれらの種々の組み合せが挙げられる。

広範囲の単細胞宿主細胞はまた、本発明のＤＮＡ配列を発現するのに有用である 。これらの宿主としては、よく知られた真核および原核宿主、例えば、大腸菌、 シュードモナス、バチルス、ストレプトマイシス、酵母のような菌類、および動 物細胞、例えば、Ｃ００％Ｒ１，１、Ｂ４およびＬ−Ｍ細胞、アフリカングリー ンモンキーの腎細胞（例えば、ＣＯＳ　１、ＣＯＳ　７、Ｂ５Ｃｌ、Ｂ５Ｃ４０ 、およびＢＭＴＩＯ）、昆虫細胞（例えば、Ｓ「９）、および組織培養における ヒト細胞および植物細胞が包含され得る。

すべてのベクター、発現制御配列、および宿主が、本発明のＤＮＡを発現するた めに同等にうまく機能するわけではないということが理解される。同様に全ての 宿主はいずれも同じ発現系と同等にうまく機能されるわけではない。しかし、当 業者は、本発明の範囲からはずれることなく、所望の発現を成し遂げるのに過度 の実験をせずに、適当なベクター、発現制御配列、および宿主を選択し得る。例 えば、ベクターを選択する際には、宿主のことが考慮されなければならない。な ぜなら、このベクターはその中で機能しなければならないからである。このベク ターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、および抗生物質マーカーのよう な、ベクターによってフードされるいずれの他のタンパクの発現もまた、考慮さ れる。

適切な発現制御配列を選択する際には、通常柱々の因子が考慮される。これらに は、例えば、この系の相対的な強さ、その制御能力、および発現される特定のＤ ＮＡ配列あるいは遺伝子との適合性（特に潜在的な二次構造に関して）が包含さ れる。適切な単細胞宿主は、例えば、選択されたベクターとのそれらの適合性、 それらの分泌の特性、正しくタンパクを折りたたむそれらの能力、およびそれら の培養条件、および発現されるＤＮＡ配列によってコードされる生成物の宿主に 対する毒性、および発現生成物の精製の容易さを考慮することによって選択され る。

本発明のＤＮＡ配列の発現は、異なる宿主においては異なる効果を有し得るとい うこともまた認められる。例えば、ＣＯ３細胞中で発現するクローン７．２は、 ＥＬＡＭＩ結合表面分子の出現を導く一方、例えば、原核宿主細胞におけるクロ ーン７．２の発現は同様の効果を有さない。なぜなら、原核生物は、タンパク７ ゜２の生物学的機能性のために必要であり得る内部の細胞構造（ゴルジ体）が欠 如しているからである。一方、クローン７．２発現生成物を完全な状態で単離お よび精製するために、タンパク７．２が細胞生化学における機能（例えば、グリ コジルトランスフェラーゼの触媒性の役割）を有さない宿主細胞が好ましいとさ れ得る。当業者は、特定の目的のために、適切な宿主細胞および発現メカニズム を選択し得ル。

このような因子および他の因子を考慮すること（こより、当業者は、培養または 大規模の動物細胞の培養（こお（Ａて、本発明のＤＮＡ配列を発現する種々のベ クター／発現■制御配ｙ１１／宿主の組み合せを構築し得る。

１つの宿主系における発現後のタン／　ＸＨり７２およびタン、４り１の単離お よび精製に、数種の戦略力ｆ有効である。ある方法ζよ、細菌細胞においてタン ノくりを発現すること、この細胞を溶解すること、および従来の手段によってこ のタンｔ４りを精製することを包含する。あるいは、ある者（ま、細胞力）ら分 泌させるようにＤＮＡ配列を操作し得る。例えＩｆ、　Ｃｏ１１ｅｙら（１９８ ９）＋よ、シアリルトランスフェラーゼに対するＤＮＡ配Ｗｌｌ上（こヒトグー インターフェロンの開裂し得るシグナルベプチト′を１！作するこ記１１１てい る。Ｌａｒｓｅｎら（１９９０）は、フコシルトランスフェラーゼの遺伝子のア ミノ末端にタン７＜りＡ（こ対するＤＮＡ配り１］を融合し、そして分泌された 融合タンノくりとしてそれを発現させた。これらの構築物において、あるもの（ よ、アミ／末女嵩の近くに存在するこれらのタンｌ＜りの膜質５ｍ領ｌ或をＩＶ 意除去し得る。分泌の後、このタン、（りは培地力）ら精製される。同様の戦略 が細菌に対して有効である。

科学者らは、ますます有機合成における触媒としての酵素の価値を認めつつある （Ｗａｎｇ、　１９８９）。本発口月の１．３−フコシルトランスフェラーゼは インビトロ（こお１する炭７に化物の酵素的合成に有用である。本発明の１．３ −フコシルトランスフェラーゼは、特に、１．３グリコシド結合によって、適切 な受容体にフコースの連結を触媒するのに有用である。我々は、実施例Ｉにおい て、この触媒の適切な条件のｌセットを記載しており、それはフコシルトランス フェラーゼ活性のためのアッセイに関する。当業者は、本明細書に記載されてい る１、３フフシルトランスフエラーゼを好都合に使用し得る他の適切な条件を認 識する。

現在、ＣＤＩの炭水化物部分がＥＬＡＭＩ媒介細胞媒介細胞付方重要であること は、明らかである。ＣＤＸ５Ｐｓｅｕｄｏ−Ｘ、　あるいはＰｓｅｕｄｏ−Ｘ２ の炭水化物部分を含有する分子、あるいはその部分のフコース含有部分は、εＬ ＡＭＩリガンドとして機能するのに重要であり得る。このような分子はＥＬＡＭ Ｉ媒介細胞付着の阻害を導（治療を包含する方法において有用であり得る。

本発明はまた、合成有機化学物質（ｃｈｅｍｉｃａｌ’ｓ）、天然培養生成物、 ペプチドなどを包含する、本明細書に記載の１．３−フコシルトランスフェラー ゼの活性を阻害する小分子に向けられる。これらの小分子は、ＥＬＡＭＩ媒介細 胞付着を阻害することを目的とする治療において有用であり得る。このような分 子を同定るために、ある者は阻害剤の候補、フコース受ｇ　体および１．３−フ コシルトランスフェラーゼとを、共に接触させることにより、試験混合物を調製 する。このフコース受容体は、好ましくは、ＬａｃＮＡｃあるいは２゛−フコシ ルラクトースである。

この１．３−フコシルトランスフェラーゼは、好ましくは、クローン７．２ある いはクローン１で形質転換された細胞由来の抽出物から誘導される。次いで、実 施例■に記載されているように、１．３−フコンルトランスフェラーゼの活性に ついて試験混合物を７ノセイする。

本発明をよく理解し得るために、我々は、以下の実施例を示す。これらの実施例 は例示を目的とするものであり、いがなる方法によっても、本発明の範囲を限定 すると解釈すべき艷ｌ豆旦 我々は、ＣＤＸ発現細胞の２つの型、すなわちＨＬ−６０細胞およびＵ９３７細 胞由来の２つのｃＤＮＡライブラリーをｐｃＤＭＢベクター中に構築した。これ らの細胞からｍＲＮＡを単離し、そしてそれを当業者によく知られている方法を 用いてｃＤＮＡに逆転写した（ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ、　１９８３ ）。標準的な方法を用いて、以下の配列を有するＮｏｔｌ−ＢｓｔＸＩリンカ− ／アダプターに二本鎖ｃＤＮＡを連結させた。： ５’　ＧＣＧ　ＧＣＣＧＣＴ　ＴＴＡ　ＧＡＧ　ＣＡＣＡ　３’３°ＣＧＣＣＧ Ｇ　ＣＧＡ　ＡＡＴ　ＣＴＣ５’次いで、４．２ｎ＋１の５〜２０％の酢酸カリ ウム勾配、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｌμｇ／ｍ　１のエチジウムブロマイドにおいて 、Ｂｒ１ａｎ　５ｅｅｄのプロトコールに従って、ＢＥＣＫＭＡＮ　５Ｗ６００ −　ター　Ｔ　２２°ｃで３時間、５０゜００ＯｒｐｍでｃＤＮＡをサイズ選択 した（　Ｍａｎｉａｔ　ｉｓ、　１９８２．　ｐ、　２７８もまた参照のこと） 。５００塩基対より大きいｃＤＮＡ断片をプールし、次いで、ベクター、ｐＣＤ Ｍ８を調製した（Ｂｒｉａｎ　５ｅｅｄからの寄贈）。

このプラスミドをＢｓｔＸＩで分解した。４００塩基対のスタッファ−断片（ｓ ｔｕｆｆｅｒ　ｆｒａｇｍｅｎｔ）を除去するために、この混合物を酢酸カリウ ム勾配上で、上記のように遠心分離し、そして、大きい断片を単離した。さらに 、アガロースゲル電気泳動法によって、この断片を精製し、次いで、このベクタ ーにｃＤＮＡを連結した。

次いで、まず１μｇのＨＬ−６０ポリＡ＋　ｍＲＮＡから３２ｐ標識されたＣＤ ＮＡプローブを創製して、次いで、ＣＤＸを発現しないＨｅＬａ細胞由来のポリ Ａ＋　ｍＲＮＡ　３０μｇとハイブリダイズさせることによってこのプローブか ら非ＣＤＸ関連のｃＤＮＡ配列をサブトラクションし、強化したｃＤＮＡライブ ラリーを調製した（　Ｄａｖｉｓ、　１９８６を参照のこと）。サブトラクショ ンされたプローブを用いてｐＣＤＭ８　ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング し、そしてこのように大腸菌ＭＣ１０６１Ｐ３中にＨＬ−６０細胞由来の強化さ れたサブライブラリーを創製した。２２個の９６−ウェルプレートにおいて、約 ２１００個のクローンを増殖させた。Ｕ９３７の強化されたサブライブラリーを 同様の方法で調製し、そして、１４００個のクローンを得た。

スフェロプラスト融合によるＣＯＳ　？細胞のトランスフェク／ヨンのために、 ＨＬ−６０の強化されたライブラリーからのコロニーを２２個のプールに分けた （Ｓａｎｄｒｉ−Ｇｏｌｄｉｎら、１９８１）　ｏ　５ｅｅｄおよびＡｒｕｆｆ ｏ（１９８７＞の方法に従って、ハイブリドーマ５ＧＣ２ＥＳ由来のα−ＣＤＸ モノク°ローナル抗体（５Ｇ８３Ｂ４に対する機能と同様の抗体）でバンニング することにより、ＥＬＡＭＩ結合活性についてトランスフェクトされたＣＯＳ　 ７細胞をアッセイした（Ａｒｕｆｆｏおよび５ｅｅｄ、　１９８７およびＷｙｓ ｏｃｋｉおよび５ａｔｏ、　１９７８も参照のこと）。プール＃７をアッセイし てポジティブとなり、２．１ｋｂのｃＤＮＡ挿入物とともに２つのクローンを得 た。この２つのクローンを、クローン７．１および７．２と名付けた。

ＣＤＸ　ｐＣＤＭ８のクローン７．２から、およびシーフェンスベクターである ｐＮＮｌ　１中にサブクローンされた７、２挿入物の一部から、マキサム・ギル バート法（ＭａｘｉｍおよびＧ１１ｂｅｒｔ、　１９８０）によって、クローン ７．２のＤＮＡ配列を得た。この後者のプラスミドをｐｓＱ２１９と名付けた。

この得られたＤＮＡ配列を図１に示す。

我々は、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ、、６１１　 Ｐ、ＨａｍｍｏｎｄｓＦｅｒｒｙ　Ｒｄ、、Ｌｉｎｔｈｉｅｕｍ、Ｍｄ、　２１ ０９０（ＵＳＡ）に１９９０年４月２６日にブタヘスト条約に基づいて、プラス ミドＣＤＸ　ｐＣＤＭ８ＣＤ−ン７．２を含有する培養物を寄託した。この寄託 は以下のように示される。　： ＣＤＸ　ｐＣＤＭ８　／　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１Ｐ３寄託番号ＩＶＩ−１ ０２４２ 我々はまた、１（Ｌ−６０細胞由来のｍＲＮＡを７−ザンブロソトで解析し、そ れをクローン７．２でプローブした。クローン７．２は、３つの１ＲＮＡの種類 、すなわち、５．　Ｏｋｂおよび２．４ｋｂにおける２つの顕著なバンド、およ び３．０ｋｂにおける他のバンドに）＼イブリダイズした。クローン７．２であ る２’、１ｋｂのｃＤＮＡは、３．Ｏｋｂおよび６．０ｋｂの種類由来の全長ｃ ＤＮＡとなるのに充分な大きさではない。従って、これらのメツセージに対する ＤＮＡ配列を同定するために、クローン７．２から誘導されたオリゴヌクレオチ ドで、Ｕ９３７およびＩ（Ｌ−６０細胞の両方に由来する強化されたｃＤＮＡサ ブライブラリーをプローブした。ＨＬ−６０ライブラリーから数種の長い挿入物 を単離し、ＣＯＳ　７細胞中にその挿入物をトランスフェクトし、そして、ＥＬ ＡＭＩおよびα−ＣＤＸに結合するクローンを選択した。このようにして、３． ０ｋｂのメツセージから生じ得る２、　９ｋｂの挿入物を同定した。我々はそれ をＣＤＸクローンｌと呼んだ。

マキサム・ギルバート法によって、ＣＤｘクローン１のＤＮＡ配列を決定した。

この得られたＤＮＡ配列を図２に示す。

我々は、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ、、６１１　 Ｐ、ＨａｍｍｏｎｄｓＦｅｒｒｙ　Ｒｄ、、Ｌｉｎｔｈｉｃｕｍ、Ｍｄ、　２１ ０９０（ＵＳＡ）に１９９０年１０月１１日にブタヘスト条約に基づいて、プラ スミドＣＤＸクローンｌを含有スる培養物を寄託した。この寄託は以下のように 示される。：ＣＤＸ　ａｌｏｎｅ　１　ｐＣＤＭ８　／　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１ ０６１Ｐ３寄託番号ＩＶＹ−１０２５５ 我々は、ＣＯＳ　？およびＣＨＯ細胞中にクローン７．２およびクローン１をト ランスフェクトした。トランスフエフシランの４８時間後、これらの細胞は、Ｆ Ａ　ＣＳによってアッセイされたように、細胞表面上に糖タンパクを発現し、こ れに蛍光標識したα−ＣＤＩ抗体が結合した。これらの細胞表面タンパクは、１ ２５Ｉで標識され得、そしてα−ＣＤＸ　Ｍｏａｂｓと共に、免疫沈降した。Ｃ Ｏ３７細胞から単離したタンパクをＰｓｅｕｄｏ−Ｘと名付け、そしてＣＩＩＯ 細胞から単離したタンパクをＰｓｅｕｄｏ−Ｘ２と名付けた。ＳＤＳポリアクリ ルアミドゲルにおいて、Ｐｓｅｕｄｏ−ＸおよびＰｓｅｕｄｏ−Ｘ２はそれぞれ 、約１３０ｋＤおよび１４０ｋＤであった。

このトランスフェクトされたＣＯ３細胞はまた、組換え可溶性ＥＬＡＭＩ　（ｒ ｓＥＬＡＭｌ）でコートしたセファロースビーズのまわりにロゼツトを形成し； そしてこのロゼ、ティノブはカチオン依存性であり、ＢＢＩＩ　（抗ＥＬＡＭＩ 抗体）およびα−ＣＤＸの両方によって阻害された。ｐＣＤＭ８のみ（挿入クロ ーンなし）でトランスフェクトされたＣＯ３細胞およびＣＨＯ細胞は、ｒｓＥＬ ＡＭｌビーズにロゼツトしなかった。さらに、クローン７２でトランスフェクト されたＣＯ３細胞およびＣＨＯ細胞は、ウシ血清アルブミンでコートされたビー ズにロゼツトしなかった。

さらに、ＤＮＡ配列分析および酵素アッセイによってクローン７．２およびクロ ーン１を特徴付けた。クローンｌは、　（図２の１７４位〜１７６３位のヌクレ オチドによってフードされた）５３０個のアミノ酸のポリペプチドをコードする 。クローン７．２は、　（図１の６６位〜１２８０位のヌクレオチドによってフ ードされた）４０５個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。ＵＷＧＣＧ配列 分析配列分析ソフトウェーバ（ＵＷＧＣＧ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉ ｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｐａｃｋａｇｅ）　（バージョン６、１．１９８９年８ 月）を用いて、他のタンパクとのホモロジー検索のためのプログラムＦＡＳＴＡ を使って、我々は、ＮＢＲＦタンパクのデータベースを検索したくリリース２３ 、１９８９年１２月）。また、ＧｅｎＢａｎｋ　（リリース６３．１９９０年３ 月）およびＥＭＢＬ　（リリース１９．１９８９年５月）をＴＦＡ　ＳＴＡを用 いて検索した。これらの検索において、１型単純ヘルペスウイルス、デング熱ウ ィルス、黄熱病および他のフラビウィルス類を包含するある種のウィルス性の外 被タンパクに対して、短い領域（例えば、約２３個のアミノ酸）でホモロジーが あることを発見した。一般に、周知のタンパクに対するホモロジーは低く、そし て我々は、このポリペプチドは新規であると結論つけた。

クローン７．２のヌクレオチド９位からヌクレオチド２１６２位までのヌクレオ チド配列の一部（図１）は、クローンｌのヌクレオチド４９２位からヌクレオチ ド２６４５位の配列の一部（図２）と等しい。タンパク７．２の最初のメチオニ ンは、タンパク１の１２６位のアミノ酸であるメチオニンに相当する。このホモ ロジーに対する１つの説明は、２つの挿入物は同じＤＮＡセグメント由来の異な る転写物を表すということである。

前述のように、これらのクローンはＣＤＸ％　Ｐｓｅｕｄｏ−ＸあるいはＰｓｅ ｕｄｏ−Ｘ２をコードしない。それらがコードするポリペプチドは正しい大きさ ではない。むしろ、証拠が強（以下の結論を支持する。即ち、クローン７．２と クローンｌは、１．３−フコシルトランスフェラーゼをフードし、この酵素が池 のタンパク、例えば、ＣＤＸ、　Ｐｓｅｕｄｏ−ＸあるいはＰｓｅｕｄｏ−Ｘ２ を（ＥＬＡＭＩあるいはα−ＣＤＸによって認識されるかＥＬＡＭＩあるいはα −ＣＤＸに結合することによって）、′見えるＥＬＡＭＩあるいはα−ＣＤＸと するようにグリコジル化する。第一番目にクローン１とクローン７．２のＤＮＡ 配列は周知のグリコジルトランスフェラーゼのＤＮＡ配列が有するいくつかの構 造的特徴を共有する。例えば、周知のグリコジルトランスフェラーゼをコードす る遺伝子は連続的なメチオニン開始部位を通常有しており、１つより多いｍＲＮ Ａ転写物を生産することができる。すでに述べたように、クローン７２にハイブ リダイズする３個のｍＲＮＡ転写物を同定し、クローン１は転写開始シグナルと して作用する２つのコドンを含んでいることを確認した。さらに、周知のグリコ ジルトランスフェラーゼのように、これらのクローンは多くのＳＰＩエンハンサ 一部位を有する。これらの部位の塩基配列はＧＧＧＣＧＧあるいはＣＣＧＣＣＣ である。クローン１はこのような部位を５個有する。さらに、周知のグリコジル トランスフェラーゼと同様にクローン７．２とクローン１は、グアニン（Ｇ）お よびシトシン（Ｃ）リッチである。例えばクローンｌは遺伝子の５°領域では７ ５％ＧＣリンチであり、遺伝子の３°領域では６０％ＧＣリッチである。また、 グリコジルトランスフェラーゼは典型的なりラスＩ＋膜蛋白で、膜にかかる（　 ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ）　ドメインはアミノ末端の付近にあり、 細胞外部分はカルボキシ末端付近にある。クローン１とクローン７．２はアミノ 末端付近に疎水性の領域を有するポリペプチドをコードする。

グリコジルトランスフェラーゼは４０ｋＤから６０ｋＤの間の分子量を有する傾 向にあり、クローン１は約５９ｋＤのポリペプチドをコードし、クローン７．２ は約４６ｋＤのポリペプチドをコードして０る。最後に、周知のグリコジルトラ ンスフェラーゼは通常ｌから３個のＮ−グリコジル化部位を有し、クローン１お よびクローン７．２は共にそのような部位を２箇所有している。

第二に、クローン７．２でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞からの抽出物につい て行った酵素のアッセイでは、トランスフェクトされていない細胞では発現しな いフコシルトランスフェラーゼが存在することが示された。このアッセイでは、 放射能ラベルされたフコースをアクセプター分子に結合させる酵素の能力をテス トした。そのアッセイは以下のように行った。

１０μｍの酵素、８μｌのカクテルと２μｌの１０倍濃度のアクセプターを含有 するアッセイサンプルをｇ製した。クローノア、２でトランスフェクトされた約 １５０万個のＣＨＯ細胞を単離し、そして１５０μｍの冷却した１％トリトンＸ −１ｏｏ水溶液中で１５秒間超音波処理してこの細胞を溶解し酵素を調製した。

カクテルは７５μＭ　ｌ’ｃ−ＧＤＰフフース、　１００ｍＭ　ＡＴＰ、５００ ｍＭ　Ｌ−フコース、ＬＭ　ＭｎＣｌ２、およびＩＭ力コジレート（ｃａｃｏｄ ｙｌａｔｅ）　ｐｔ（６，２を含有していた。１０倍濃度のアクセプターは種々 の２００ｍＭ　ＬａｃＮＡｃＳＬａｃ−Ｎ−ビオースもしくはラクトース、２５ ０ｍＭ　フェニル−β−Ｄ−ガラクトシドまたは５０ｍＭ　２’−フコシルラク トースを含有していた。このアッセイサンプルを１時間、３７℃でインキュベー トし、２０μｌのエタノールを加えて反応を停止させた。

５６０μｌの水を加えて希釈し、エッベンドルフ遠心器で高速で５分間遠心分離 した。

ダウエックス（ＤＯＷＥＸ）　Ｉ　！　２−４００　カラム（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、製）を調製し、変換されたものから未変換の１ＡＣフコー ス−〇ＤＰを分離した。このマトリックスを大きなカラムにかけて、１０倍容量 のＩＮ　ＮａＯＨで洗浄し、５倍容量の水、次に１０倍容量の５％濃度のギ酸で 洗浄した。この洗浄サイクルを繰り返した。この材料を用いて、０．４ｍｌの小 さなカラムを作った。この小さなカラムを１０倍容量の水で洗浄して用いた。

２００μｌのサンプルを小さなカラムにのせ、溶出液を集め、２ｍｌの水で洗浄 し、溶出液中に稟めた。この溶出液の放射能活性をンンチレーションカウンティ ングして決定した。

このアッセイの結果により、誘導された酵素が１．３−フコンルトランスフェラ ーゼであることが示された（表１参照）。

酵素はフコースをＬａｃＮＡｃ、　２−フコシルラクトース及びラクトース等に 結合させ、これらのアクセプターは遊離の３゛ヒドロキシルを有するＧｌｃＮＡ ｃあるいはグルコース部分を有している。

フコースは、そのＧｌｃＮＡｃ部分が遊離の３°ヒドロキシルを有していない、 ＬａｃＮビオースには結合しなかった。ネガティブコントロールアクセプターで あるフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドにも結合しなかった。トランスフェクトし なかった細胞からのコントロールサンプルにおいてはフラクトースのこれらアク セプターへの結合はほんの意味のない程度を示したにすぎない。

表１−フコシル化効率 従って、遺伝的および酵素的な両方の証拠からクローン７゜２とクローン１は１ ．３−フコンルトランスフエラーゼをコードすることが示される。

本明細書においては本発明の多数の実施態様について記載しているが、当業者で あれば本発明の方法を改変し、本発明のプロセスや組成物を利用する他の態様を 提９％できることは明白である。従って、本発明の範囲は、実施例として提示さ れている特別な実施態様ではなく、ここに添付した請求の範囲によって定められ なければならないことは自明である。

（以下余白） 弘■１」ビＬ（献 Ａｒｕｆｆｏ、　Ａ、　、およびＢ、５ｅｅｄ、　ｒ非常に能率的なＣＯ３細胞 発現系によるＣＤ２８　ｃＤＮＡの分子クローニングＪ　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ阻、８４．ｐｐ、８５７３−７７（１９８７） Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ、Ｍ、Ｐ、、ら、「白血球付着の内皮依存メカニズム：イ ンターロイキン−１および腫瘍壊死因子による調節」、に叫和ｃ　ｔｅ　Ｅｍｊ 　ｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ｓｅ　ｕｅｌａｅ（Ｓ、Ｋａｒｇｅｒ　Ａ− Ｇ、、５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ、　１９８７ａ）、　ｐｐ、　７９−９３）Ｂｅ ｖｉｌａｃｑｕａ、Ｍ、Ｐ、　、ら、「誘導性内皮−白血球付着分子の同定」、 　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　８４．　ｐｐ、 　９２３８−４２　（１９８７ｂ）Ｂｅｖｉ　１ａｃｑｕａ、　Ｍ、　Ｐ、　、 ら、［内皮白血球付着分子１：補体調節タンパクおよびレクチンに関する好中球 に対する誘導性リセブタＪ　、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４３．　Ｉ）り、　１１ ６０−５（１９８９）Ｃｏｔｒａｎ、　Ｒ，Ｓ、　、ら、「インビボにおけるヒ ト内皮活性化抗原の誘導および検知」、ム■Ｌ熟虹、１６４．ｐｐ、６６１−６ ６（１９８６）Ｃｏｌ　ｌｅｙ、　Ｋ、　Ｊ、　、ら、「シグナルペプチドでの Ｎｌ２−末端シグナルアンカーの置換によるゴルジ体シアリルトランスフェラー ゼの分泌タンパクへの変換Ｊ　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｓｅｔ、　、　２６４． 　ｐｐ、　１７６１９−２２（１９８Ｃｏｔｒａｎ、　Ｒ，Ｓ、　、およびＪ、 Ｓ、Ｐｏｂｅｒ、　ｒ内皮活性化：炎症におけるその役割および免疫反応におけ るその役割Ｊ　、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃ虹り影且匝江、　Ｓ　ｉ　ｍ　ｉ 　ｏ　ｎ　ｅ　ｓ　ｃ　ｕおよび５１ｍ１ｏｎｅｓｃｕ！ｉ、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐ ｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８８）、　ｐｐ、　３３５−４７Ｄａｎａ、　Ｎ、　、 ら、ｒＭｏ１表面糖タシバク：構造、機能および臨床上の重要性」、ｂ匹加呂ユ ｈ旦東氏ｍ上（社）工ｌ虹工、　５．　ｐｐ、　３７１−８３（１９８６）Ｄａ ｖｉｓ、Ｍ、　Ｍ、　、　ｒサブトラクティブｃＤＮＡハイブリダイゼーション およびＴ細胞リセブター遺伝子」、■組匝■−Ｌ■匹旦胚旺〔１ｍｍｕｎｏｌｏ 　Ｉｎ　Ｆｏｕｒ　Ｖｏｌｕｍｅｓ、第４版、Ｂｌａｃｋｖｅｌｌ　５ｃｉｅｎ ｔｉｆｉｃＰｕｂｌ　１ｃａｔｉｏｎｓ、　０ｘｆｏｒｄ、　Ｅｎｇｌ　ａｎｄ （１９８６）、　ｐｐ、　７６、１−７６、１３Ｇｕｂｌｅｒ、　Ｕ、およびＨ ｏｆｆｍａｎ、Ｂ、　Ｊ、　、　ｒ　ｃＤＮＡライブラリーを生じる簡単でかつ 非常に効果的な方法」、箪、　２５．　ｐｐ、　２６３−６９　（１９８３）Ｈ ａｒｌａｎ、　Ｊ、Ｍ、、［白血球−内皮相互作用Ｊ　、Ｂｌｏｏｄ、６５．ｐ ｐ、５１３−２５Ｈａｒｌａｎ、　Ｊ、Ｍｌ、「好中球媒介血管損傷Ｊ　、Ａｃ ｔａ　Ｍｅｄ、５ｃａｎｄ、　Ｓｕ１工、７１５．　Ｉ）Ｉ）、　１２３−２９ （１９８７）Ｈａｒｌａｎ、　Ｊ、Ｍ、、ら、「好中球移出における好中球膜タ ンパクの役割Ｊ　、Ｌｅｕｋｏｃ　ｔｅ　Ｅｍｉ　ｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｔ ｓ　Ｓｅ　ｕｅｌａｅ、Ｈ，Ｍｏｖａｔ編、（Ｓ、　Ｋａｒｇｅｒ　ＡＧ、　Ｂ ａ５ｅｌ、　５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ、　１９８７）、　ｐｐ、　９４９４−１ Ｏ４Ｈｏｕ、　Ａおよびり、５ｏｋｏｌｏｆｆ、　ｒ病理学」、第４車、Ｒｈｅ ｕｍａｔｏｉｄ　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、　Ｐ、　Ｄ、　Ｕｓｔｉｎｇｅｒ、　Ｎ 、　Ｊ、　Ｚｕｇｉｆｌｅｒ、およびＥｈｒｌｉｃｈ、　Ｇ、　Ｅ、　。

編、　（Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ、　Ｐｈｆｌａｄｅｌｐｈｉａ、　１９８５）、 　ｐｐ、　４９−６９Ｋｕｋｏｗｓｋ４９−６９Ｋｕｋｏ、　Ｊ、　Ｆ、　、ら 、「クローン化されたヒトｃＤＮＡでマウス発育段階−特異的胚抗原（Ｍｏｕｓ ｅ　Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｅｍｂｒｙ。

ｎｉｃ　Ａｎｔｉｇｅｎ）およびルイス血液型ａ　（１，３／１．４）フコシル トランスフェラーゼの発現を決定するＪ　、Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏ 　ｍｅ■、生、ｐｐ、　１２８８−１３０３（１９９０）Ｌａｒｓｅｎ、　Ｒ， Ｄ、　、ら、［ヒトＧＰＤ−Ｌ−７コースの分子クローニング、配列決定、およ び発現：Ｈ血液型抗原を形成し得るβ−Ｄ−ガラクトシド２−α−Ｌ−フフシル トランスフェラーゼｃＤＮＡＪ　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ、　８７．　ｐｐ、　６６７４−６６７８　（１９９０）Ｍａｌｅｃｈ 、　Ｈ，Ｌ、およびＧａ１ｌｉｎ、Ｊ、１．、　ｒヒト疾病における好中球」、 Ｌ阻ＬＬ■虹、　３１７．　ｐｐ、　６８７−９４（１９８７）Ｍａｎｉａｔｉ ｓ、　Ｔ、　、ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ、　１９ ８２） Ｍａｘａｍ、　Ａ、およびＷ、Ｇ１１ｂｅｒｔ、　ｒ塩基−特異的化学開裂によ る末端標識されたＤＮＡの配列決定Ｊ　、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏ ｌ、、６５．ｐｐ、４９Ｐａｕｌｓｏｎ、　Ｊ、　Ｃ，、およびに、Ｊ、Ｃｏ１ １ｅｙ、　ｒグリコジルトランスフェラーゼ：細胞型−特異的グリコシル化の構 造、局在、および調節Ｊ　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　２６４．　 ｐｐ、　１７６１５−１７６１８　（１９８９）Ｒｏｓｓ、Ｒ，、「アテローム 硬化症の病因−最新版」、Ｌ堕ｌユ、　Ｍｅｄ、　３１４．　ｐｐ、　４８８− ５００　（１９８６）Ｓａｎｄｒｉ−Ｇｏｌｄｉｎ、Ｒ，Ｍ、、ら、［プロトプ ラスト融合による哺乳類細胞に対するクローン化されたＩ型単純ヘルペスウィル ス配列の高頻度転移Ｊ　、Ｍｏ１ｅｃ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、１．ｐ ｐ、７４３−５２（１９８１）Ｓｅｅｄ、Ｂ、、　ｒＬＦＡ−３ｃＤＮＡはリセ プターＣＤ２に類似のリン脂質連結膜タンパクをコードするＪ　、　Ｎａｔｕｒ ｅ、　３２９．　ｐｐ、　８４０−４２（１９８７＞５ｅｅｄ、　Ｂ、およびＡ 、Ａｒｕｆｆｏ、　ｒ迅速な免疫選択法による、ＣＤ２抗原、Ｔ細胞赤血球リセ ブターの分子クローニングＪ　、　’Ｐｒｏｃ、ＮａｔｌＡｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ、　８４．　ｐｐ、　３３６５−６９（１９８７）Ｗａｌｌｉｓ、　Ｗ 、　Ｊ、　、およびＪ、Ｍ、Ｈａｒｌａｎ、　「炎症および免疫反応における内 皮のエフェクター機能Ｊ　Ｐａｔｈｏｌ、　１ｍｍｕｎｏ　ａｔｈｏｌ、　Ｒｅ ｓ、、５゜ｐｐ、７７３−１Ｏ３（１９８６ ）Ｗａｎ、　Ｃ，−Ｈ，、ｒ　宵機合成における酵素的な触媒Ｊ　、５ｃｉｅｎ ｃｅ、２４東、ｐｐ、１−１４５〜１１５２（１９８９）Ｗｙｓｏｃｋｉ、　Ｌ 、　Ｊ、およびＶ、Ｌ、５ａｔｏ、　ｒ白血球のためのパンニング。

細胞選択の方法Ｊ　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７５．　 ｐｐ、２８４４−４８ＦＩＧ、　ＩＡ Ｆ　ＩＧ、旧 ＦＩＧ、　ＩＣ ＦＩＧ、２Ａ ＦＩＧ、２Ｂ ＦＩＧ、２Ｇ １７５１　ＣＴＧＧＴＴＣＧＡＧＣＧＧＴＧＡＡＧＣＣＧＣＧＣＴＣＣＣＣＴＧ ＧＡＡＧＣＧＡＣＣＣＡＧＧＧＧＡＧＧさ　１８００１８０１　ＣＡＡＧＴＴＧ ＴＣＡＧＣＴＴＴＴＴＧＡＴＣＣＴＣＴＡＣＴＧＴＧＣＡＴＣＴＣＣＴ÷ｃＡｃ τｃｃｃａｃＭ　１ａｓ。

１ａ５１　ＴＣＡＴＧＧＧＡＧＴＡＡＧＴＴＣＴＴＣλＡＡＣＡＣＣＣＡＴ÷Ｔ ＴＴＧＣＴＣＴｋＴＧＧＧｋｋＡＡｋｋｋ　１９００１９０１　ＣＧｋＴＴＴｋ ＣＣＡＡＴＴＡＡＴＡＴＴＡＣＴＣＡＧＣＡｃＡＧＡＯＡＴＯＧＧＯＧＣＣＣＧ ＧＴＴＴＣＣλ　１９５０１９５１　ＴＡＴＴＴＴＴＴＧＣＡＣＡＧＣＴｋＧＣ ＭＴＴＧＧＧＣｒ品ＣＴ？ＴＧＣＴＧ（÷ＧＡＴＧＣＧＣＡＴＣ２０００２００ １ｘＴＴ（、ｒＴ？ＡＣＧＧＧＴＣ入ＡＧｃＡＧｃＧＧＧＴＴＣＴＴ（ＣＴＣＡ ＣＣＴ？Ｇ÷ＡＡＣＣＡＣｉＴＧＣ＾　２０５゜ＦＩＧ、２Ｄ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の７第１項）平成３年１２月 ２６８１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）でなる群から 選択される、ＤＮＡ配列：（ａ）図１のヌクレオチド６６〜１２８０のＤＮＡ配 列；（ｂ）図１のヌクレオチド６９〜１２８０のＤＮＡ配列；（ｃ）図２のヌク レオチド１７２〜１７６１のＤＮＡ配列；（ｄ）図２のヌクレオチド１７５〜１ ７６１のＤＮＡ配列；（ｅ）標準的なハイブリダイゼーションの条件下で、上記 ＤＮＡ配列のいずれかにハイプリダイズするＤＮＡ配列、およびタンバク７．２ またはタンパク１の生物学的活性を有するＤＮＡ配列；および （ｆ）上記ＤＮＡ配列のいずれかによってコードされるアミノ酸配列を発現する ようにコードするＤＮＡ配列。 ２．以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）でなる群から 選択されるＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子： （ａ）図１のヌクレオチド６６〜１２８０のＤＮＡ配列；（ｂ）図１のヌクレオ チド６９〜１２８０のＤＮＡ配列；（ｃ）図２のヌクレオチド１７２〜１７６１ のＤＮＡ配列；（ｄ）図２のヌクレオチド１７５〜１７６１のＤＮＡ配列；（ｅ ）標準的なハイブリダイゼーションの条件下で、上記ＤＮＡ配列のいずれかにハ イプリダイズするＤＮＡ配列、およびタンパク７．２またはタンパク１の生物学 的活性を有するＤＮＡ配列；および （ｆ）上記ＤＮＡ配列のいずれかによってコードされるアミノ酸配列を発現する ようにコードするＤＮＡ配列。 ３．前記ＤＮＡ配列が発現制御配列に作動可能に連結されている、請求項２に記 載の組換えＤＮＡ分子。 ４．図１または図２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ 分子で形質転換された単細胞宿主。 ５．大腸菌、シュードモナス、バチルス、ストレプトマイシス、酵母、ＣＨＯ、 Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｍ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭ Ｔ１０、昆虫細胞、および組織培養における植物細胞おびヒト細胞、でなる群か ら選択される、請求項４に記載の単細胞宿主。 ６．単細胞宿主において請求項２に記載の組換えＤＮＡ分子を発現する方法によ って製造されるタンパク。 ７．ＥＬＡＭ１に結合する分子を製造するプロセスであって、真核宿主細胞にお いて図１あるいは図２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を発現する工程を 含む、プロセス。 ８．ＥＬＡＭ１に付着する分子を製造するプロセスであって、真核宿主細胞にお いて図１あるいは図２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を発現する工程を 含む、プロセス。 ９．α−ＣＤＸに結合し得るＰｓｅｕｄｏ−Ｘあるいはその断片。 １０．α−ＣＤＸに結合し得るＰｓｅｕｄｏ−Ｘ２あるいはその断片。 １１．タンパクまたはそのフコース含有部分の炭水化物部分を含むＥＬＡＭ１に 結合し得る分子であって、該タンパクがＣＤＸ、Ｐｓｅｕｄｏ−ＸまたはＰｓｅ ｕｄｏ−Ｘ２でなる群から選択される、分子。 １２．前記タンパクがＣＤＸである、請求項１１に記載の分子。 １３．白血球と内皮細胞とを含む系において、それらの間の付着を阻害する方法 であって、該系においてＥＬＡＭ１に結合し得る分子の効果的な量を導入する工 程を包含し、そして、該分子がタンパクまたはそのフコース含有部分の炭水化物 部分を含み、そして、該タンパクがＣＤＸ、Ｐｓｅｕｄｏ−ＸおよびＰｓｅｕｄ ｏ−Ｘ２でなる群から選択される、方法。 １４．前記タンパクがＣＤＸである、請求項１３に記載の方法。 １５．本明細書に記載されている１，３−フコシルトランスフェラーゼの活性を 阻害する小分子。 １６．本明細書に記載の１，３−フコシルトランスフェラーゼの活性を阻害する 小分子を同定する方法であって、（１）試験混合物を創製するために、阻害剤の 候補であるフコース受容体および１，３−フコシルトランスフェラーゼをともに 接触させる工程；および （２）該試験混合物の１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性をアッセイする 工程； を包含する、方法。 １７．前記フコース受容体がＬａｃＮＡｃである、請求項１６に記載の方法。 １８．前記フコース受容体が２′−フコシルラクトースである、請求項１６に記 載の方法。 １９．前記１，３−フコシルトランスフェラーゼが、クローン７．２あるいはク ローン１で形質転換された細胞の抽出物に由来する、請求項１６に記載の方法。 ２０．有機化合物を合成する方法における１，３−フコシルトランスフェラーゼ の使用。 ２１．本明細書に記載されているように、１，３−フコシルトランスフェラーゼ が触媒する工程を包含する、フコースとフコース受容体との間の１，３グリコシ ド結合を製造する方法。 ２２．前記フコース受容体が炭水化物である、請求項２１に記載の方法。 ２３．タンパク７．２、タンパク１、タンパク７．２あるいは１の非ヒト類似体 およびこれらのタンパクのいずれかの生物学的活性断片。