JPH054080B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はＮ−アセチルノイラミン酸の酵素的定
量方法に関するものである。 生体内にはＮ−アセチルノイラミン酸の糖複合
体であるシアル酸が様々な形で存在する。このシ
アル酸は糖蛋白や樹脂質の重要な成分であり、臨
床検査の分野において急性および慢性炎症、シヨ
ク、外傷、心筋梗塞、糖尿病、肝疾患、各種癌等
で変動することが見い出されており、シアル酸測
定が診断に重要な役割を示めしている。 このシアル酸測定には化学法であるEhrlich法、
オルシノール法、レゾルシノール法、過ヨウ素酸
レゾシノール法、チオバルビツール酸法等が知ら
れているが、特異性に問題があつたり、中には強
酸を使用しなければならないもの、加熱操作を必
要とする等、操作が繁雑であるという欠点があつ
た。 酵素的測定法としてシアル酸をノイラミニダー
ゼでＮ−アセチルノイラミン酸を遊離させ、ノイ
ラミン酸アルドラーゼによりピルビン酸を生成
し、このピルビン酸を乳酸デヒドロゲナーゼ
（LDH）、NADH系で反応させ定量する方法、ピ
ルビン酸にピルビン酸オキシダーゼを作用させ生
ずる過酸化水素を定量する方法があるが、これら
の測定法は内因性ピルビン酸の影響を受けるとい
う欠点がある。 本発明者らは操作が簡単で、しかも内因性ピル
ビン酸の影響を受けない正確性の高いＮ−アセチ
ルノイラミン酸測定法を種々鋭意検討したとこ
ろ、試料にノイラミン酸アルドラーゼ、アシルグ
ルコサミン−２−エピメラーゼ（以下AG−エピ
メラーゼと略す）、Ｎ−アセチルヘキソサミンオ
キシダーゼ（以下NAHODと略す）の酵素を作
用させることにより、上記の目的が達成されるこ
とを見い出し本発明に到達した。 すなわち本発明はＮ−アセチルノイラミン酸の
試料にノイラミン酸アルドラーゼ、アシルグルコ
サミン−２−エピメラーゼ（AG−エピメラー
ゼ）およびＮ−アセチルヘキソサミンオキシダー
ゼ（NAHOD）を作用させて生成する過酸化水
素又はＮ−アセチルグルコサミン酸又は消費され
る酵素を測定することを特徴とするＮ−アセチル
ノイラミン酸の酵素的定量方法である。 本発明の測定原理は下記に示す通りである。 (A) 酵素反応 Ｎ−アセチルノイラミン酸ノイラミン酸アルドラーゼ ―――――――――――――→ Ｎ−アセチルマンノサミン＋ピルビン酸 Ｎ−アセチルマンノサミンAG−エピメターゼ ――――――――――→ Ｎ−アセチルグルコサミン Ｎ−アセチルグルコサミン＋O₂＋H₂ONAHOD ―――――――→ Ｎ−アセチルグルコサミン酸＋H₂O₂ すなわちＮ−アセチルノイラミン酸をノイラミ
ン酸アルドラーゼによつてＮ−アセチルマンノサ
ミンとピルビン酸に分解し、生じたＮ−アセチル
マンノサミンにAG−エピメラーゼを作用させ、
Ｎ−アセチルグルコサミンを生成せしめる。この
Ｎ−アセチルグルコサミンに酸素と水の共存下、
NAHODを作用させることにより、Ｎ−アセチ
ルグルコサミン酸と過酸化水素を生じさせる。測
定方法はこの時生じる過酸化水素もしくはＮ−ア
セチルグルコサミン酸もしくは消費される酸素の
いずれかを測定することを特徴としている。 本発明に用いるノイラミン酸アルドラーゼとし
てはエシユリシア・コリ、クロストリデイウム
属、ラツトの肝、脳等から精製されるものがあ
り、いずれの起源によるものでも良いが、特に微
生物由来のものが好ましい。 本発明に用いるAG−エピメラーゼもいかなる
起源のものでも良いが、例えばゴーシユ、ロイゼ
マンによる「ジヤーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー」第24巻第４号第153頁に記載
されているブタの腎臓から精製したAG−エピメ
がある。このAG−エピメラーゼの反応を促進さ
せるためにはATPを添加しても良い。 本発明に用いるNAHODもいかなる起源のも
のでも良いが、例えば堀内による日本農芸化学会
昭和58年度大会講演要旨集第173頁に記載されて
いるシユードモナス属由来のNAHODがある。
必要があれば、このNAHODの反応を促進させ
るためにアノマーの変換を促進するムタロターゼ
を添加してもよい。 さらにノイラミニダーゼを作用させシアル酸を
測定する場合に使用するノイラミニダーゼは、い
かなる起源のものでも良いが、クロストリジウム
属、アルスロバクター属、コリネバクテリウム
属、ストレプトコツカス属等に属する微生物から
産生するものがある。 本発明で試料とは血清や血しよう、さらにはシ
アル酸を含む試料にノイラミニダーゼを作用させ
生成したＮ−アセチルノイラミン酸を含むものを
いう。 本発明で生成される過酸化水素の定量はいかな
る方法を用いても良いが、例えばペルオキシダー
ゼ、あるいはカタラーゼにより酵素法によつて比
色定量する方法、直接電極による定量方法などが
ある。 ペルオキシダーゼを用いる方法としては、色原
体として４−アミノアンチピリンとフエノールま
たはその誘導体、４−アミノアンチピリンとアニ
リンまたはその誘導体、３−メチル−２−ベンゾ
チアゾリノンヒドラゾンとアニリンまたはその誘
導体などを用いる方法がある。フエノール誘導体
としては、ｐ−クロロフエノール、２，４−ジク
ロロフエノール、ｐ−プロモフエノール、ｏ−ク
ロロフエノール、ｍ−クロロフエノール、２，６
−ジクロロフエノール、２，３−ジクロロフエノ
ールなどがある。またアニリン誘導体としては
Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルア
ニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン、
Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル
−Ｎ−（３−メチルフエニル）−N′−アセチルエ
チレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロ
キシエチル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ
−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−
トルイジン（以下EHSPTと略す）、Ｎ−エチル
−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エ
チル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシ
アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−
３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニ
リン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−ア
ニシジン等がある。 カタラーゼを用いる方法としては、過酸化水素
とメタノールにカタラーゼを作用させ、生成した
ホルムアルデヒドをアンモニアの存在下、アセチ
ルアセトンと縮合させ、412nｍの吸光度を測定
する方法がある。この方法は検体ブランクをとる
ことにより正確な濃度測定が行なえる。 酸素の消費量から定量する方法としては酸素電
極を用いて定量する方法がある。 又、本発明では過酸化水素の発色を妨害する検
体中のアスコルピン酸をアスコルビン酸オキシダ
ーゼ（以下ASOと略記する）を作用させること
により除去することもできる。この場合、ASO
は他の酵素反応に先だつて作用させても、また他
の酵素反応と共役させて同時に作用させて除去し
てもよい。ASOは微生物又は植物由来のものが
あるが、好ましくはカボチヤ、キユウリ由来のも
のがある。 本発明による試薬はPH３〜10に緩衝した組成物
であり、本発明による試薬を用いＮ−アセチルノ
イラミン酸を測定する場合の反応温度は約４〜50
℃である。 本発明によるＮ−アセチルノイラミン酸測定用
組成物はノイラミン酸アルドラーゼ、AG−エピ
メラーゼ、NAHODの酵素類、生成される過酸
化水素またはＮ−アセチルグルコサミン酸又は消
費される酸素を定量するための酵素類または試薬
類を適当に組み合わせることにより成る。この試
薬類、酵素類は液剤、固型剤もしくは凍結乾燥剤
とし、必要に応じて使用前に緩衝液を添加して測
定用試薬とする。 測定方法は試料にまずノイラミン酸アルドラー
ゼ、AG−エピメラーゼを作用させ、Ｎ−アセチ
ルノイラミン酸をＮ−アセチルマンノサミンに、
さらにＮ−アセチルグルコサミンとする。次に
NAHODおよび生成される過酸化水素を測定す
る試薬を作用させることにより過酸化水素を測定
する。本発明では測定方法は１試薬系でも２試薬
系でも良く、さらには何試薬系で測定しても良
い。 本発明では、試料にノイラミン酸アルドラー
ゼ、AG−エピメラーゼおよびNAHODを作用さ
せることにより、操作が簡単で、しかも内因性ピ
ルビン酸の影響を受けない正確性の高いＮ−アセ
チルノイラミン酸定量が可能となり、シアル酸の
臨床検査の診断分野においてもきわめて有意義で
ある。 次に本発明を実施例により説明する。 実施例 １ 溶液中のＮ−アセチルノイラミン酸の濃度を下
記試薬を用い、下記方式により定量した。 １ 試薬 ノイラミン酸アルドラーゼ 40単位 AG−エピメラーゼ 300μ NAHOD ４単位 ４−AA 0.5mg EHSPT ２mg ATP 60.53mg 0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0） 全量10ml ２ 測定方法 試料20μを試験管にとり、これに上記試薬
３mlを添加し、37℃20分間反応させた後、波長
550nｍで吸光度測定した。この試料のＮ−ア
セチルノイラミン酸の濃度は既知濃度のＮ−ア
セチルノイラミン酸と比較することにより求め
た。第１図に検量線を示す。 実施例 ２ 血清中のシアル酸量を下記試薬を用い、下記方
法により定量した。 本発明の効果を説明するため、次のように試験
を行なつた。血清中のシアル酸にノイラミニダー
ゼを作用させ、Ｎ−アセチルノイラミン酸にし、
本発明の定量方法によつて測定する方法をＡ法と
する。血清中のシアル酸をノイラミニダーゼでノ
イラミン酸にし、ノイラミン酸アルドラーゼによ
りピルビン酸を生成し、このピルビン酸にピルビ
ン酸オキシダーゼを作用させ、生ずる過酸化水素
を定量する方法をＢ法とする。Ａ、Ｂの方法で血
清中のシアル酸量を定量した。さらに同一の血清
中に存在するピルビン酸量をピルビン酸にピルビ
ン酸オキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水
素を測定する方法を用い定量した。 Ａ 法 １ 試薬 ノイラミニダーゼ（半井化学製） 10単位 ノイラミン酸アルドラーゼ（半井化学製）
40単位 AG−エピメラーゼ 0.3ml NAHOD １単位 ４−AA 0.5mg EHSPT ２mg ATP 60.53mg 0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0） 全量10ml ２ 測定方法 血清を20μ試験管に取り、上記試薬３mlを
添加し、37℃20分反応させた後、波長550nｍ
で吸光度測定した。血清中のシアン酸量は既知
濃度のシアル酸を比較することにより求めた。 Ｂ 法 スガワラ等による「クリニカ ヒミカ アク
タ」第108巻第493〜498頁に記載されている方法
で測定した。 １ 試薬 試薬Ｂ ノイラミニダーゼ（半井化学製） ２単位 ノイラミン酸アルドラーゼ（半井化学製）
10単位 ６ｍＭリン酸緩衝液（PH6.8） 全量10ml 試薬Ｂ 下記の試薬Ｂ− Ｂ−を容
量比５：２の割合に混合する。 Ｂ− ピリビン酸オキシダーゼ 100単位 TPP 14μmole FAD 0.36μmole ｐ−クロロフエノール 57μmole MgCl₂ 150μmole 20ｍＭリン酸緩衝液（PH7.4） 全量15ml Ｂ− POD 550単位 ４−AA 89μmole NaN₃ 1.55ｍmole ４ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0） 50ml 試薬Ｂ EDTA 50ｍmole Na₂HPO₄ 0.1mole クエン酸ナトリウム 0.1mole トリトンＸ−405 ３ｇ イオン交換水 全量１ ２ 測定方法 血清を50μ試験管にとり、これに試薬Ｂ
0.5mlを添加し、45℃30分間インキユベートし
た後、試薬Ｂ１mlを添加し、さらに15分間イ
ンキユベートし、試薬Ｂ3.5mlを添加し室温
で10分間放置した後、波長505nｍで吸光度を
測定した。血清中のシアル酸量は既知濃度のシ
アル酸と比較することによつて求めた。 ピルビン酸濃度測定 １ 試薬 試薬Ｃ 下記の試薬Ｃ− Ｃ−を容
量比５：２の割合に混合する。 試薬Ｃ− ノイラミニダーゼ（半井化学製） ２単位 ノイラミン酸アルドラーゼ（半井化学製）
10単位 ６ｍＭリン酸緩衝液（PH6.8） 全量10ml 試薬Ｃ− POD 550単位 ４−AA 89μmole NaN₃ 1.5ｍmole ４ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0） 50ml 試薬Ｃ EDTA 50ｍＭ NaN₂HPO₄ 0.1ｍmole クエン酸ナトリウム 0.1mole トリトンＸ−405 ３ｇ イオン交換水 全量１ｇ ２ 測定方法 血清を50μを試験管にとり、これに試薬Ｃ
１mlを添加し37℃15分間インキユベートした
後、試薬Ｃ3.5mlを添加し室温で10分間放置
した後、波長505nｍで吸光度を測定した。血
清中のピルビン酸濃度は既知濃度のピルビン酸
と比較することによつて求めた。 血清中のシアル酸濃度、ピルビン酸濃度の測定
値を第１表に示す。 第１表には血清中のピルビン酸量をシアル酸濃
度に換算した値も記載する。

【表】

【表】 第１表から明らかなように、従来法（Ｂ法）で
は血清中に存在するピルビン酸の影響を受け、シ
アル酸を過剰に定量するが、本発明ではピルビン
酸の影響を受けることなく、正確にシアル酸濃度
を定量することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１の検量線を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ Ｎ−アセチルノイラミン酸試料にノイラミン
   酸アルドラーゼ、アシルグルコサミン−２−エピ
   メラーゼおよびＮ−アセチルヘキソサミンオキシ
   ダーゼを作用させて、生成する過酸化水素又はＮ
   −アセチルグルコサミン酸又は消費される酸素を
   測定することを特徴とするＮ−アセチルノイラミ
   ン酸の酵素的定量方法。