JPH0534953B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 《産業上の利用分野》 本発明は例えば、リンパ球、骨髄細胞、更には
精子、受精卵等の生体細胞の凍結方法に関する。

《従来の技術》 生体細胞を長期保存の目的のために凍結するに
あたつて、その生存率を高くすることは最も重要
な事柄である。

凍結細胞の生存率は、細胞の冷却速度に大きく
影響されるものであり、その関係は第２図に示す
通りである。

図示の如く、細胞の生存率向上に際し、有利な
冷却速度には２領域あり、その１つは１℃〜数
℃／毎分の緩速冷却域Ａであり、他の１つは
10000℃／毎分以上の極めて急速な冷却速度、す
なわち、超急速冷却域Ｂである。

又、生体細胞を凍結するにあたつては、細胞液
の塩濃縮、脱水、細胞内氷結晶形成等がどの程度
行なわれるかによつて適正冷却速度、非適正冷却
速度が定まるのであるが、特に毎分10000℃以上
の超急速冷却域Ｂにおいては、細胞内水分が非晶
質（所謂ガラスの様な状態）として凍結するか、
あるいは、氷晶ができても極めて微細であるの
で、細胞が凍害を受けないとされている。

ところが従来、生体細胞を凍結する方法として
は、ストロー管等のチユーブ状収納管に、細胞を
凍害防止剤を含む緩衝液と共に収納し、これを液
化窒素等の低温液化ガス、あるいは冷凍機を用い
て冷却し、凍結を行うことが実施されており、従
つてその冷却域は、前記緩速冷却域Ａである。

上述従来方法においては、凍結の直接の対象で
ある細胞が、これに比べて極めて大量の緩衝液の
中に浮遊した状態で存在するため、収納管の周囲
環境をいかに急速凍結の条件下においてやつて
も、細胞を取り囲む緩衝液が細胞の冷却に対して
は極めて大きな抵抗となるため、細胞の冷却速度
を前記超急速冷却域Ｂまで上げることはできず、
結局緩速冷却域Ａに依存するしかなかつた。

その結果、上記従来方法では次のような諸問題
点が指摘される。

(イ) 緩速冷却域Ａにおいて、高い生存率とするこ
とができるが、これはあくまで凍害防止剤を加
えた条件下での成績であるから、従来方法によ
るときは、凍害防止剤の添加が不可欠となつて
くるだけでなく、又、細胞の種類によつては、
20％程度の非実用的な生存率しか得られない。

(ロ) 上記凍害防止剤を加える際、急激に所定の濃
度にすると、細胞への悪影響が非常に大きくな
るため、４〜５回に分けて階段的に濃度を上げ
ていかねばならず、この作業は甚だ面倒で時間
がかかり、このような労力をかけても、多少の
悪影響から、のがれることはできない。

(ハ) さらに、生体細胞への悪影響を防ぐため、細
胞の解凍時には、凍害防止剤を洗浄、除去する
作業が必要となり、更に、この際、細胞の流失
によるロスが生じる。

(ニ) 毎分１℃から数℃という比較的狭い領域で冷
却しなければならないため、冷却速度の制御は
厳格に行う必要があり、プログラムコントロー
ラー等、高度な制御装置を必要とする上、凍結
時間が２〜３時間と長くなる。

(ホ) 凍害防止剤の添加等の前処理に時間を要する
上、凍結時間も長く、細胞の凍結までの時間が
総体的に長くかかるため、細胞の活性が低下し
易い。

《発明が解決しようとする問題点》 本発明は、上記の問題点を解消しようとしたも
ので、断熱したチヤンバー内に液体ヘリウム蒸気
を供給する一方、生体細胞を培養液と共にキヤピ
ラリーチユーブ（毛細管）を介して同チヤンバー
に供給し、当該チヤンバー内に微細な培養液滴に
包まれた状態で供与させることにより凍結し、こ
れにより生体細胞を高能率で、しかも高い生存率
が得られ、しかも簡便な操作によつて凍結処理が
できるようにすることを目的としている。

《問題点を解決するための手段》 即ち本発明は断熱したチヤンバー内に液体ヘリ
ウム蒸気を供給し、当該チヤンバー内を所定温度
以下に保持する一方、生体細胞を培養液と共にキ
ヤピラリーチユーブを介して同チヤンバー内へ送
出して、当該チヤンバー内に、当該生体細胞の可
及的最小数を一単位として培養液により包被した
ものを、供与することにより、凍結させるように
したことを特徴とする生体細胞の凍結方法を提供
しようとするものである。

《作 用》 真空等により断熱したチヤンバー内は液体ヘリ
ウム蒸気によつて極低温、望ましくは、20゜K（−
253℃）以下の雰囲気となり、そこに凍結すべき
生体細胞が通過する程度の内径（例えば、リンパ
球、骨髄細胞の場合は50〜150μ、牛の受精卵の
場合は100〜150μ）をもつた微細管、すなわち所
謂キヤピラリーチユーブ等を通して培養液と共に
当該生体細胞が供給され、かくして上記低温雰囲
気内に、微細な培養液滴に包まれた状態の生体細
胞、即ち、凍結する単位が殆ど１個の生体細胞、
もしくは数戸の細胞そのものに近い最小容積、最
小熱容量となつた状態のものが滴下等の手段にて
供与されるから、当該細胞を毎分10000℃以上の
超急速冷却域、即ち第２図のＢ領域で冷却を行な
い得ることとなり、瞬時の凍結が実現される。

《実施例》 以下本発明の実施例を第１図に基づいて、詳述
する。

真空手段等により断熱が施されたチヤンバー１
内に液体ヘリウム蒸気Ｈを噴射管２より噴射供給
し、該チヤンバー１内を望ましくは、20゜K（−
235℃）以下に予冷した後、その温度もしくは、
その温度以下を保持するように、液体ヘリウム蒸
気を供給し続ける。

一方、細胞の大きさに応じた内径を有するガラ
ス等のキヤピラリーチユーブ３を介して、培養液
４に生体細胞ａが分散した状態で、これを保存し
ている細胞収納容器５から、ポンプＰにより当該
細胞を培養液４と共に上記チヤンバー１内に供給
し、上記キヤピラリーチユーブ３の開口端より培
養液４に包まれた状態の生体細胞ｂを当該チヤン
バー１内に滴下等の手段で供与する。

凍結する単位は、細胞１個、もしくは数個程度
の最小単位となつているから、その熱容量、体積
は極めて微小で、当該生体細胞ｂの冷却に対する
抵抗は、極めて零に近く、一方極めて熱容量が大
きく、かつ極低温であるヘリウム蒸気の雰囲気に
曝されることとなるから、当該生体細胞ｂは毎分
10000℃以上の超急速で冷却され、瞬時に凍結し
て落下し、これによりチヤンバー１内の下部にあ
つて、少なくとも生成される凍結微細粒よりも小
さいメツシユを有する回収容器６内にパウダー状
に堆積する。

所定量の上記凍結処理が終つたら液体ヘリウム
蒸気の供給を停止し、フランジ７，８にあつてボ
ルト止め等にて接続させてあるチヤンバー１を、
上部１ａと下部１ｂに分離し、上記回収容器６を
取り出し、この凍結細胞９を図示しない保存用容
器に移し、液体窒素等の低温液化ガスに浸漬し、
保存する。

尚、供与された上記液体ヘリウム蒸気は、凍結
処理中にあつて、チヤンバー１の下部に設けられ
ている排気管１０から大気中に排出するようにす
るのがよい。

《発明の効果》 以上説明したように本発明によれば、生体細胞
を毎分10000℃以上の超急速で冷却、凍結するよ
うにしたから、細胞の種類により多少のばらつき
はあるが、凍害防止剤を用いずに従来法よりも相
対的に高い生存率が得られ、又、凍害防止剤を添
加しないので、これに伴う面倒な作業と時間を省
略でき、また解凍時の洗浄工程も不要となり、か
つ凍害防止使用に係る前記時間が不要である上、
凍結そのものが極めて短時間で行えるため、凍結
前における生体細胞の活性低下を最少限におさえ
ることができ、又従来法より高い細胞密度で凍結
処理することとなるので、小さい装置を用いて大
量の処理を行え、しかも保存スペースが小さくて
済み、更に超急速冷却においては、温度が低けれ
ば低い程良く適正冷却域の巾が広いので、冷却速
度制御が容易であるといつた幾多の優れた利点が
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係る生体細胞の凍結方法を実
施する場合に用いられる凍結装置の一例を示した
略示図、第２図は、生体細胞の生存率と冷却速度
との関係を示したグラフである。 １……チヤンバー、３……キヤピラリーチユー
ブ、４……生体細胞、Ｈ……液体ヘリウム蒸気。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 断熱したチヤンバー内に液体ヘリウム蒸気を
   供給し、当該チヤンバー内を所定温度以下に保持
   する一方、生体細胞を培養液と共にキヤピラリー
   チユーブを介して同チヤンバー内へ送出して、当
   該チヤンバー内に、当該生体細胞の可及的最小数
   を一単位として培養液により包被したものを、供
   与することにより、凍結させるようにしたことを
   特徴とする生体細胞の凍結方法。