JPH05331193A - 非ａ非ｂ型肝炎ウイルスに対する抗体と免疫化学的に反応するペプチド - Google Patents
非ａ非ｂ型肝炎ウイルスに対する抗体と免疫化学的に反応するペプチドInfo
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- JPH05331193A JPH05331193A JP4043083A JP4308392A JPH05331193A JP H05331193 A JPH05331193 A JP H05331193A JP 4043083 A JP4043083 A JP 4043083A JP 4308392 A JP4308392 A JP 4308392A JP H05331193 A JPH05331193 A JP H05331193A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
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- C12N2770/24011—Flaviviridae
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス（ＮＡＮＢＨ−ウイル
ス）に対する抗体と免疫科学的に反応するペプチド更
に、試験用液におけるＮＡＮＢＨあるいは抗ＮＡＮＢＨ
の検出に関する方法、及び、当該検出法を適用する際に
使用される免疫化学的試薬及びテスト用キットの提供。 【構成】表７において示されるアミノ酸配列を有するペ
プチド及びＮＡＮＢＨ抗体と免疫化学的に反応するその
フラグメント及び主要成分として当該ペプチドを含有す
るポリペプチド、並びにその機能上の誘導体。表１また
は表５において示されるアミノ酸配列を有するドデカペ
プチド及びＮＡＮＢＨ抗体と免疫化学的に反応するその
フラグメント及び主要成分として当該ペプチドを含有す
るポリペプチド、並びにその機能上の誘導体およびこれ
らを含有する免疫化学的試薬。
ス）に対する抗体と免疫科学的に反応するペプチド更
に、試験用液におけるＮＡＮＢＨあるいは抗ＮＡＮＢＨ
の検出に関する方法、及び、当該検出法を適用する際に
使用される免疫化学的試薬及びテスト用キットの提供。 【構成】表７において示されるアミノ酸配列を有するペ
プチド及びＮＡＮＢＨ抗体と免疫化学的に反応するその
フラグメント及び主要成分として当該ペプチドを含有す
るポリペプチド、並びにその機能上の誘導体。表１また
は表５において示されるアミノ酸配列を有するドデカペ
プチド及びＮＡＮＢＨ抗体と免疫化学的に反応するその
フラグメント及び主要成分として当該ペプチドを含有す
るポリペプチド、並びにその機能上の誘導体およびこれ
らを含有する免疫化学的試薬。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
ス（ＮＡＮＢＨ−ウイルス）に対する抗体と免疫化学的
に反応するペプチドに関する。
ス（ＮＡＮＢＨ−ウイルス）に対する抗体と免疫化学的
に反応するペプチドに関する。
【０００２】本発明は更に、試験用液におけるＮＡＮＢ
Ｈあるいは抗ＮＡＮＢＨの検出に関する方法、及び、当
該検出法を適用する際に使用される免疫化学的試薬及び
テスト用キットに関する。
Ｈあるいは抗ＮＡＮＢＨの検出に関する方法、及び、当
該検出法を適用する際に使用される免疫化学的試薬及び
テスト用キットに関する。
【０００３】
【従来の技術】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による引き
起こされる可能性も、又そうでない可能性も考えられて
いる非Ａ非Ｂ型肝炎は、伝染性疾患あるいはウイルス起
因性として示される疾患の一種である。これは、サイト
メガロウイルス（ＣＭＶ）あるいはエプスタイン−バー
ルウイルス（ＥＢＶ）により引き起こされる肝炎のみな
らず、例えばＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウ
イルス（ＨＢＡ）及びデルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）等
の既知の肝炎ウイルスに起因するものを含む他のウイル
ス関連性肝疾患とは区別され得る。ＮＡＮＢＨは最初輸
血患者において同定された。ヒトからチンパンジーへの
伝染、及び、チンパンジーにおける連続的継代により、
ＮＡＮＢＨは伝染性因子に起因するものであるという証
拠が得られた。
起こされる可能性も、又そうでない可能性も考えられて
いる非Ａ非Ｂ型肝炎は、伝染性疾患あるいはウイルス起
因性として示される疾患の一種である。これは、サイト
メガロウイルス（ＣＭＶ）あるいはエプスタイン−バー
ルウイルス（ＥＢＶ）により引き起こされる肝炎のみな
らず、例えばＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウ
イルス（ＨＢＡ）及びデルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）等
の既知の肝炎ウイルスに起因するものを含む他のウイル
ス関連性肝疾患とは区別され得る。ＮＡＮＢＨは最初輸
血患者において同定された。ヒトからチンパンジーへの
伝染、及び、チンパンジーにおける連続的継代により、
ＮＡＮＢＨは伝染性因子に起因するものであるという証
拠が得られた。
【０００４】疫学的証拠によりおそらく３種類、つまり
水で伝染する疫学タイプ、血液あるいは注射針関連のタ
イプ及び散在的に起こる（市中感染性）タイプ、のＮＡ
ＮＢＨが存在するであろうということが示唆される。し
かしながら、ＮＡＮＢＨの原因であると思われる因子の
数は未明である。
水で伝染する疫学タイプ、血液あるいは注射針関連のタ
イプ及び散在的に起こる（市中感染性）タイプ、のＮＡ
ＮＢＨが存在するであろうということが示唆される。し
かしながら、ＮＡＮＢＨの原因であると思われる因子の
数は未明である。
【０００５】ＮＡＮＢＨの臨床診断法及び同定法は主と
して他のウイルスマーカーの排除により行われてきた。
ＮＡＮＢＨ抗原及び抗体とみなされるものの検出に使用
される方法としては、アガロースゲル拡散、逆方向免疫
電気泳動、免疫螢光顕微鏡、免疫電子顕微鏡、ラジオイ
ムノアッセイ及び酵素結合免疫吸着アッセイがある。し
かしながら、ＮＡＮＢＨに関する診断テストとして使用
するには、感度、特異性及び再現性が充分なものがこれ
らのアッセイのうちには存在しないことが証明されてい
る。
して他のウイルスマーカーの排除により行われてきた。
ＮＡＮＢＨ抗原及び抗体とみなされるものの検出に使用
される方法としては、アガロースゲル拡散、逆方向免疫
電気泳動、免疫螢光顕微鏡、免疫電子顕微鏡、ラジオイ
ムノアッセイ及び酵素結合免疫吸着アッセイがある。し
かしながら、ＮＡＮＢＨに関する診断テストとして使用
するには、感度、特異性及び再現性が充分なものがこれ
らのアッセイのうちには存在しないことが証明されてい
る。
【０００６】しかしながら、ＮＡＮＢＨ感染の様々な段
階における確実な診断法を可能とするための特異的かつ
感度の良い方法の開発にあたり、このタイプの免疫的優
性なウイルスのエピトープを同定することは非常に重要
である。
階における確実な診断法を可能とするための特異的かつ
感度の良い方法の開発にあたり、このタイプの免疫的優
性なウイルスのエピトープを同定することは非常に重要
である。
【０００７】表１から表６において示されるようなアミ
ノ酸配列及び12のアミノ酸を有し、ＮＡＮＢＨ抗体と顕
著に免疫化学的に反応する６つのペプチドが現在までに
発見されている。これらの配列は表７において述べられ
ているアミノ酸配列を包含する。
ノ酸配列及び12のアミノ酸を有し、ＮＡＮＢＨ抗体と顕
著に免疫化学的に反応する６つのペプチドが現在までに
発見されている。これらの配列は表７において述べられ
ているアミノ酸配列を包含する。
【０００８】（表１） Arg-Arg-Gly-Pro-Arg-Leu-Gly-Val-Arg-Ala-Thr-Arg （表２） Arg-Gly-Pro-Arg-Leu-Gly-Val-Arg-Ala-Thr-Arg-Lys （表３） Gly-Pro-Arg-Leu-Gly-Val-Arg-Ala-Thr-Arg-Lys-Thr （表４） Pro-Arg-Leu-Gly-Val-Arg-Ala-Thr-Arg-Lys-Thr-Ser （表５） Arg-Leu-Gly-Val-Arg-Ala-Thr-Arg-Lys-Thr-Ser-Glu （表６） Leu-Gly-Val-Arg-Ala-Thr-Arg-Lys-Thr-Ser-Glu-Arg （表７） Arg-Arg-Gly-Pro-Arg-Leu-Gly-Val-Arg-Ala-Thr-Arg-Ly
s-Thr-Ser-Glu-Arg 本発明は、ＮＡＮＢＨ抗体とやはり免疫化学的に反応す
る当該ペプチドのフラグメント及び主要成分として当該
ペプチドを含有するポリペプチド、並びにその機能上の
誘導体をも含む。
s-Thr-Ser-Glu-Arg 本発明は、ＮＡＮＢＨ抗体とやはり免疫化学的に反応す
る当該ペプチドのフラグメント及び主要成分として当該
ペプチドを含有するポリペプチド、並びにその機能上の
誘導体をも含む。
【０００９】表１及び表５によるアミノ酸配列のドデカ
ペプチドは、それぞれ本発明によるペプチドとして好適
である。
ペプチドは、それぞれ本発明によるペプチドとして好適
である。
【００１０】本発明は、本発明によるペプチドのうち少
なくとも一つを含有する試薬である免疫化学的試薬にも
係わる。
なくとも一つを含有する試薬である免疫化学的試薬にも
係わる。
【００１１】本発明は、本発明によるペプチドのうちの
一種類以上のものを使用することによる、試験用液中の
ＮＡＮＢＨに対する抗体の検出方法をも包含する。
一種類以上のものを使用することによる、試験用液中の
ＮＡＮＢＨに対する抗体の検出方法をも包含する。
【００１２】本発明は、本発明によるペプチドのうち一
種類以上のものを使用する試験用液中のＮＡＮＢＨの検
出方法にも関する。
種類以上のものを使用する試験用液中のＮＡＮＢＨの検
出方法にも関する。
【００１３】最後に、本発明は、イムノアッセイを行う
ために使用されるテスト用キットに関するものであり、
このテスト用キットは本発明による免疫化学的試薬の少
なくとも一種類を含有する。
ために使用されるテスト用キットに関するものであり、
このテスト用キットは本発明による免疫化学的試薬の少
なくとも一種類を含有する。
【００１４】その上、例えば、米国特許4,683,202 及び
欧州特許329,822 にそれぞれ記載のあるポリメラーゼ鎖
反応（ＰＣＲ）あるいは核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳ
ＢＡ）のような核酸増幅技術によりＮＡＮＢＨのＤＮＡ
あるいはＲＮＡを検出するテストの基礎として、本発明
によるアミノ酸配列をコードする新しいヌクレオチド配
列あるいはその一部、いわゆるプライマー、を使用する
ことも本発明の範囲に含まれる。
欧州特許329,822 にそれぞれ記載のあるポリメラーゼ鎖
反応（ＰＣＲ）あるいは核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳ
ＢＡ）のような核酸増幅技術によりＮＡＮＢＨのＤＮＡ
あるいはＲＮＡを検出するテストの基礎として、本発明
によるアミノ酸配列をコードする新しいヌクレオチド配
列あるいはその一部、いわゆるプライマー、を使用する
ことも本発明の範囲に含まれる。
【００１５】本発明の一部は、上述の増幅及び検出法を
行うためのテスト用増幅キットを包含する。
行うためのテスト用増幅キットを包含する。
【００１６】更に、本発明によるペプチドあるいはフラ
グメントはＮＡＮＢ肝炎疾患の予防あるいは治療におけ
る適切な医薬投与形態に於いて使用可能である。活性成
分として前述のペプチドあるいはフラグメントを使用し
てかように取得されるワクチンは、当該技術分野の当業
者により調製可能である。
グメントはＮＡＮＢ肝炎疾患の予防あるいは治療におけ
る適切な医薬投与形態に於いて使用可能である。活性成
分として前述のペプチドあるいはフラグメントを使用し
てかように取得されるワクチンは、当該技術分野の当業
者により調製可能である。
【００１７】上述のペプチドは、特に試験用液中のＮＡ
ＮＢＨあるいはＮＡＮＢＨ抗体の存在を決定するための
診断法における使用に適する。
ＮＢＨあるいはＮＡＮＢＨ抗体の存在を決定するための
診断法における使用に適する。
【００１８】上述のペプチドに加え、これらのペプチド
の機能上の誘導体も、本発明によるペプチドの一部とみ
なされる。機能上の誘導体とは、以下のものを含む。
の機能上の誘導体も、本発明によるペプチドの一部とみ
なされる。機能上の誘導体とは、以下のものを含む。
【００１９】(a) ペプチドの酸付加塩、(b) ペプチド
のアミド及び、特にＣ末端誘導アミド、(c) エステル
及び、特にＣ末端誘導エステル、及び(d) 修飾された
Ｎ−アシル誘導体、特異的に修飾されたＮ末端アシル誘
導体、及び、特に、修飾されたＮ−アセチル誘導体。
のアミド及び、特にＣ末端誘導アミド、(c) エステル
及び、特にＣ末端誘導エステル、及び(d) 修飾された
Ｎ−アシル誘導体、特異的に修飾されたＮ末端アシル誘
導体、及び、特に、修飾されたＮ−アセチル誘導体。
【００２０】天然のＮＡＮＢＨと比較すると、本発明に
よるペプチドは安全な非感染性材料であるという貴重な
長所を有する。その上、本ペプチドはＮＡＮＢＨ抗体に
対して特に高い親和性を有し、このことにより当該ペプ
チドは診断テスト法における使用に非常に適するものと
なっている。
よるペプチドは安全な非感染性材料であるという貴重な
長所を有する。その上、本ペプチドはＮＡＮＢＨ抗体に
対して特に高い親和性を有し、このことにより当該ペプ
チドは診断テスト法における使用に非常に適するものと
なっている。
【００２１】本発明によるペプチドは、ペプチド合成用
の既知の有機化学法の１つを用いるか組換えＤＮＡの技
術を利用するかにより調製される。この後者の方法は、
宿主としての適切な微小生物において問題となっている
ペプチドのうち１種類以上のものをコードしているポリ
ヌクレオチド配列を有する組換えポリヌクレオチドを発
現させる方法による所望ペプチドの調製を含む。
の既知の有機化学法の１つを用いるか組換えＤＮＡの技
術を利用するかにより調製される。この後者の方法は、
宿主としての適切な微小生物において問題となっている
ペプチドのうち１種類以上のものをコードしているポリ
ヌクレオチド配列を有する組換えポリヌクレオチドを発
現させる方法による所望ペプチドの調製を含む。
【００２２】ペプチド合成用の有機化学法は、均一相内
あるいはいわゆる固相のいずれかを利用しての縮合反応
による必要なアミノ酸のカップリングを含むものとみな
される。
あるいはいわゆる固相のいずれかを利用しての縮合反応
による必要なアミノ酸のカップリングを含むものとみな
される。
【００２３】縮合反応は以下のごとく行うことが可能で
ある。
ある。
【００２４】(a) 縮合試薬存在下における、保護基の
うちのひとつは（誘導化された）固体支持体である可能
性も存在する、未修飾のカルボキシル基及び保護されて
いる他の反応基を有する化合物（アミノ酸、ペプチド）
と未修飾のアミノ基及び保護された反応基を有する化合
物（アミノ酸、ペプチド）との縮合、(b) 保護基のう
ちのひとつは（誘導化された）固体支持体である可能性
も存在する、活性化されたカルボキシル基及び未修飾で
あるかあるいは保護されている他の反応基を有する化合
物（アミノ酸、ペプチド）と未修飾のアミノ基及び未修
飾であるかあるいは保護されている他の反応基を有する
化合物（アミノ酸、ペプチド）との縮合。
うちのひとつは（誘導化された）固体支持体である可能
性も存在する、未修飾のカルボキシル基及び保護されて
いる他の反応基を有する化合物（アミノ酸、ペプチド）
と未修飾のアミノ基及び保護された反応基を有する化合
物（アミノ酸、ペプチド）との縮合、(b) 保護基のう
ちのひとつは（誘導化された）固体支持体である可能性
も存在する、活性化されたカルボキシル基及び未修飾で
あるかあるいは保護されている他の反応基を有する化合
物（アミノ酸、ペプチド）と未修飾のアミノ基及び未修
飾であるかあるいは保護されている他の反応基を有する
化合物（アミノ酸、ペプチド）との縮合。
【００２５】中でも、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミ
ド、Ｎ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール、ｐ−ニトロ
フェニル、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オ
キソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＯＤｈｂｔ）あ
るいはペンターフルオロフェニル（ＯＰｆｐ）エステル
のような酸性ハロゲン化物、アジド、無水物、イミダゾ
ール化あるいは活性化エステルへカルボキシル基を変換
することによりカルボキシル基の活性化を行うことが可
能である。
ド、Ｎ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール、ｐ−ニトロ
フェニル、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オ
キソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＯＤｈｂｔ）あ
るいはペンターフルオロフェニル（ＯＰｆｐ）エステル
のような酸性ハロゲン化物、アジド、無水物、イミダゾ
ール化あるいは活性化エステルへカルボキシル基を変換
することによりカルボキシル基の活性化を行うことが可
能である。
【００２６】上述の縮合反応に関して最も一般的な方法
は、Peptide Analysis, Synthesis,Biologyの１巻から
３巻(Gross, E.及びMeienhofer, J.編集）1979年、1980
年、1981年(Academic Press, Inc.)において記載のある
ような、カルボジイミド法、ＢＯＰ法［ベンゾトリアゾ
リロオキシトリス（ジメチル−アミノ）フォスフォニウ
ム ヘキサフルオロリン酸］、ＴＢＴＵ法［２−（１Ｈ
−ベンゾトリアゾール−１−イル）１，１，３，３−テ
トラメチルウロニウム テトラフルオロホウ酸、アジド
法、混合無水物法及び活性化エステルを用いる方法であ
る。
は、Peptide Analysis, Synthesis,Biologyの１巻から
３巻(Gross, E.及びMeienhofer, J.編集）1979年、1980
年、1981年(Academic Press, Inc.)において記載のある
ような、カルボジイミド法、ＢＯＰ法［ベンゾトリアゾ
リロオキシトリス（ジメチル−アミノ）フォスフォニウ
ム ヘキサフルオロリン酸］、ＴＢＴＵ法［２−（１Ｈ
−ベンゾトリアゾール−１−イル）１，１，３，３−テ
トラメチルウロニウム テトラフルオロホウ酸、アジド
法、混合無水物法及び活性化エステルを用いる方法であ
る。
【００２７】特に適切な固相とは、例えば、Wang（1974
年）J. Am. Chem. Soc. 95巻、1328により記載の、ｐ−
アルコキシベンジルアルコール樹脂（４−ヒドロキシ−
メチル−、フェノキシ−メチル−共重合スチレン−１％
ジビニルベンゼン樹脂）及び同様に機能する共重合樹脂
でAtherton（1989年）J. Chem. Soc., Chem. Comm. 115
1 により記載されている、不活性マクロポラス珪藻土の
鋳型で支持されているＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミ
ド、アクリロイルサルコシンメチルエステル及びビス
アクリロイルエチレンジアミンである。合成後、ペプチ
ドを緩和な条件下でこの固相より切り放すことが可能で
ある。他の適切な支持体としては、Geysen, P. N. A.
S. 81巻、3998(1984)及びP.N.A.S.82巻、178, 1985 年
により記載されている誘導化した架橋型ポリスチレン、
ポリエチレンあるいはポリプロピレンの棒が挙げられ
る。
年）J. Am. Chem. Soc. 95巻、1328により記載の、ｐ−
アルコキシベンジルアルコール樹脂（４−ヒドロキシ−
メチル−、フェノキシ−メチル−共重合スチレン−１％
ジビニルベンゼン樹脂）及び同様に機能する共重合樹脂
でAtherton（1989年）J. Chem. Soc., Chem. Comm. 115
1 により記載されている、不活性マクロポラス珪藻土の
鋳型で支持されているＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミ
ド、アクリロイルサルコシンメチルエステル及びビス
アクリロイルエチレンジアミンである。合成後、ペプチ
ドを緩和な条件下でこの固相より切り放すことが可能で
ある。他の適切な支持体としては、Geysen, P. N. A.
S. 81巻、3998(1984)及びP.N.A.S.82巻、178, 1985 年
により記載されている誘導化した架橋型ポリスチレン、
ポリエチレンあるいはポリプロピレンの棒が挙げられ
る。
【００２８】所望するアミノ酸配列の合成後、溶液中あ
るいは固相支持体上においてのいずれかで、例えばトリ
フルオロ酢酸を利用したり、あるいは緩和な還元によ
り、別の例としては水素とパラジウムのような触媒を用
いたり、例えばピペリジンあるいは水酸化物イオン等の
塩基で処理したり、氷酢酸中のＨＢｒを用いたりと、特
別な基の性質いかんによる様々な従来法により保護基を
解離することが可能である。
るいは固相支持体上においてのいずれかで、例えばトリ
フルオロ酢酸を利用したり、あるいは緩和な還元によ
り、別の例としては水素とパラジウムのような触媒を用
いたり、例えばピペリジンあるいは水酸化物イオン等の
塩基で処理したり、氷酢酸中のＨＢｒを用いたりと、特
別な基の性質いかんによる様々な従来法により保護基を
解離することが可能である。
【００２９】これは、解離可能な固相支持体上でペプチ
ドを合成する場合には、リンカーのタイプいかんによ
り、例えば、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンス
ルホン酸あるいはトリフルオロ酢酸に溶解しているメタ
ンスルホン酸を使用することで実行可能となり、又、低
級アルコール、好ましくはメタノールかエタノールを使
用することではエステル転移が実行可能となり、いずれ
の場合においてもペプチドの低級アルキルエステルが直
接形成される。
ドを合成する場合には、リンカーのタイプいかんによ
り、例えば、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンス
ルホン酸あるいはトリフルオロ酢酸に溶解しているメタ
ンスルホン酸を使用することで実行可能となり、又、低
級アルコール、好ましくはメタノールかエタノールを使
用することではエステル転移が実行可能となり、いずれ
の場合においてもペプチドの低級アルキルエステルが直
接形成される。
【００３０】上述のように縮合反応に関与してないと思
われる反応基は、酸、塩基あるいは還元による加水分解
により非常に簡単に除去可能である基により効果的に保
護されている。つまり、カルボキシル基は、例えば、メ
タノール、エタノール、第三ブタノール、ベンジルアル
コールあるいはｐ−イトロベンジルアルコール及び固体
支持体に結合されたアミンでのエステル化により効果的
に保護され得る。
われる反応基は、酸、塩基あるいは還元による加水分解
により非常に簡単に除去可能である基により効果的に保
護されている。つまり、カルボキシル基は、例えば、メ
タノール、エタノール、第三ブタノール、ベンジルアル
コールあるいはｐ−イトロベンジルアルコール及び固体
支持体に結合されたアミンでのエステル化により効果的
に保護され得る。
【００３１】アミノ基を効果的に保護し得る基とは、エ
トキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブ
トキシカルボニル、９−フルオレニル−メトキシカルボ
ニル（Ｆｍｏｃ）あるいはｐ−メトキシ−ベンジルオキ
シカルボニル基か、あるいは、ｐ−トルエン−スルホニ
ル、ペンタメチルベンゼンスルホニル（Ｐｍｓ）、４−
メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル
（Ｍｔｒ）あるいは１，２，５，７，８−ペンタメチル
クロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）基のようなスルホ
ン酸から誘導される酸性基であるが、例えばベンジル及
びトリフェニルメチルのような置換化あるいは非置換化
アリールあるいはアラルキル基、あるいはオルソーニト
ロフェニル−スルフェニル及び２−ベンゾイル−１−メ
チルビニルのような基のように他の基も又使用可能であ
る。
トキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブ
トキシカルボニル、９−フルオレニル−メトキシカルボ
ニル（Ｆｍｏｃ）あるいはｐ−メトキシ−ベンジルオキ
シカルボニル基か、あるいは、ｐ−トルエン−スルホニ
ル、ペンタメチルベンゼンスルホニル（Ｐｍｓ）、４−
メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル
（Ｍｔｒ）あるいは１，２，５，７，８−ペンタメチル
クロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）基のようなスルホ
ン酸から誘導される酸性基であるが、例えばベンジル及
びトリフェニルメチルのような置換化あるいは非置換化
アリールあるいはアラルキル基、あるいはオルソーニト
ロフェニル−スルフェニル及び２−ベンゾイル−１−メ
チルビニルのような基のように他の基も又使用可能であ
る。
【００３２】可能な保護基のより広範な説明は、The Pe
ptides, Analysis, Synthesis, Biologyの１巻から９巻
(Gross, Udenfriend及びMeienhofer編集）、1979年まか
ら1987年(Academic Press, Inc.)において見出される。
ptides, Analysis, Synthesis, Biologyの１巻から９巻
(Gross, Udenfriend及びMeienhofer編集）、1979年まか
ら1987年(Academic Press, Inc.)において見出される。
【００３３】「固相」を使用しての、本発明による上述
のペプチドの調製は、例えば、J. Amer. Chem. Soc. 85
巻、2149（1963年）及びInt. J. Peptide Protein Res.
35巻、161-214(1990年）に記載してある。調製される
アミノ酸のカップリングは通常カルボキシル末端側より
始める。この方法のためには反応基が存在するかあるい
はかような基が導入され得る固相が必要である。例え
ば、反応性クロロメチル基を有するベンジン及びジビニ
ルベンジンの共重合体、あるいは、ヒドロキシメチルあ
るいはアミンの機能で反応性になっている他種の適当な
重合性固相等がこれにあてはまる。
のペプチドの調製は、例えば、J. Amer. Chem. Soc. 85
巻、2149（1963年）及びInt. J. Peptide Protein Res.
35巻、161-214(1990年）に記載してある。調製される
アミノ酸のカップリングは通常カルボキシル末端側より
始める。この方法のためには反応基が存在するかあるい
はかような基が導入され得る固相が必要である。例え
ば、反応性クロロメチル基を有するベンジン及びジビニ
ルベンジンの共重合体、あるいは、ヒドロキシメチルあ
るいはアミンの機能で反応性になっている他種の適当な
重合性固相等がこれにあてはまる。
【００３４】既に上述してあるように、本発明によるペ
プチドは、同様に組換えＤＮＡ技術により調整すること
ができる。特に反復配列（タンデム）としてペプチドが
取り込まれる場合、あるいは、ペプチドが（より大き
い）蛋白質あるいはポリペプチドの必須成分として調製
され得る場合にこの技術は重要である。そのため、この
タイプのペプチドの調製も同様に本発明の範囲に含まれ
る。この目的のため、組換えＤＮＡの成分としてポリヌ
クレオチドを使用するが、これは本発明によるペプチド
をコードするものであり、更には、天然のＮＡＮＢＨゲ
ノム中においては上述のポリヌクレオチド配列に隣接す
るポリヌクレオチドセグメントを実質的に含まないもの
である。
プチドは、同様に組換えＤＮＡ技術により調整すること
ができる。特に反復配列（タンデム）としてペプチドが
取り込まれる場合、あるいは、ペプチドが（より大き
い）蛋白質あるいはポリペプチドの必須成分として調製
され得る場合にこの技術は重要である。そのため、この
タイプのペプチドの調製も同様に本発明の範囲に含まれ
る。この目的のため、組換えＤＮＡの成分としてポリヌ
クレオチドを使用するが、これは本発明によるペプチド
をコードするものであり、更には、天然のＮＡＮＢＨゲ
ノム中においては上述のポリヌクレオチド配列に隣接す
るポリヌクレオチドセグメントを実質的に含まないもの
である。
【００３５】本発明によるペプチドをコードしているこ
のタイプのポリヌクレオチド及びこのポリヌクレオチド
を取り込んでいる組換えＤＮＡも同様に本発明の範囲に
含まれる。
のタイプのポリヌクレオチド及びこのポリヌクレオチド
を取り込んでいる組換えＤＮＡも同様に本発明の範囲に
含まれる。
【００３６】これを特に特許請求の範囲に加えなくと
も、本発明によるペプチド中の一種類以上のアミノ酸が
他のアミノ酸に置換され得ることは自明である。
も、本発明によるペプチド中の一種類以上のアミノ酸が
他のアミノ酸に置換され得ることは自明である。
【００３７】上述のごとく調製されたペプチドあるいは
フラグメントは、ポリクローナル及びモノクローナルの
両方の抗体を作成するのに用いる。本発明によるペプチ
ドに対するモノクローナル抗体は、当業者により簡単に
作成され得る。
フラグメントは、ポリクローナル及びモノクローナルの
両方の抗体を作成するのに用いる。本発明によるペプチ
ドに対するモノクローナル抗体は、当業者により簡単に
作成され得る。
【００３８】ハイブリドーマによるモノクローナル抗体
の作成は、広く知られている。細胞融合により不死化し
た抗体産生細胞株が作成可能である一方、腫瘍転移性Ｄ
ＮＡでのＢリンパ球の直接的形質転換や、あるいはエプ
スタイン−バールウイルスでのトランスフェクションな
どの他の技術が有効である。
の作成は、広く知られている。細胞融合により不死化し
た抗体産生細胞株が作成可能である一方、腫瘍転移性Ｄ
ＮＡでのＢリンパ球の直接的形質転換や、あるいはエプ
スタイン−バールウイルスでのトランスフェクションな
どの他の技術が有効である。
【００３９】本発明によるペプチドに対するモノクロー
ナル及びポリクローナルの両方の抗体は、診断法に非常
に適するものであるが、中和作用のある抗体は受動免疫
の治療に非常に有効である。特にモノクローナル抗体は
抗イディオタイプ抗体を誘導することに用いることが可
能と思われる。抗イディオタイプ抗体の誘導技術は当該
技術分野においては有名なものである。
ナル及びポリクローナルの両方の抗体は、診断法に非常
に適するものであるが、中和作用のある抗体は受動免疫
の治療に非常に有効である。特にモノクローナル抗体は
抗イディオタイプ抗体を誘導することに用いることが可
能と思われる。抗イディオタイプ抗体の誘導技術は当該
技術分野においては有名なものである。
【００４０】当該抗イディオタイプ抗体は、非Ａ非Ｂ型
肝炎の予防あるいは治療並びにＮＡＮＢＨ抗原の重要な
エピトープ領域の解明にとっても有効である。
肝炎の予防あるいは治療並びにＮＡＮＢＨ抗原の重要な
エピトープ領域の解明にとっても有効である。
【００４１】本発明による「免疫化学的試薬」は、通
常、本発明による一種類以上ペプチド及び適切な支持体
あるいはラベル化物質で構成されている。
常、本発明による一種類以上ペプチド及び適切な支持体
あるいはラベル化物質で構成されている。
【００４２】使用可能な支持体としては、例をあげる
と、微小テストウェルあるいは分光度計の吸収管の内
壁、試験管あるいは毛細管、膜、フィルター、テスト用
細片あるいは、ラテックス粒子、赤血球、染色用膠質溶
液、あるいは、膠質性(sol) 粒子としての金属性膠質溶
液あるいは金属性化合物、ＢＳＡやＫＬＨなどの担体蛋
白質を例とする粒子表面等である。
と、微小テストウェルあるいは分光度計の吸収管の内
壁、試験管あるいは毛細管、膜、フィルター、テスト用
細片あるいは、ラテックス粒子、赤血球、染色用膠質溶
液、あるいは、膠質性(sol) 粒子としての金属性膠質溶
液あるいは金属性化合物、ＢＳＡやＫＬＨなどの担体蛋
白質を例とする粒子表面等である。
【００４３】使用可能なラベル化物質とは、特に、ラジ
オ活性アイソトープ、螢光性化合物、酵素、膠質性粒子
としては染色用膠質溶液、金属性膠質溶液あるいは金属
性化合物である。
オ活性アイソトープ、螢光性化合物、酵素、膠質性粒子
としては染色用膠質溶液、金属性膠質溶液あるいは金属
性化合物である。
【００４４】試験用液中のＮＡＮＢＨに対する抗体の検
出方法においては、本発明による免疫化学的試薬を試験
用液に接触させる。その後、ペプチドと試験用液中の抗
体の間に形成される免疫複合体の存在が検出され、この
検出により試験用液中のＮＡＮＢＨ抗体の存在が明らか
になり、定量的に測定されることが可能となる。
出方法においては、本発明による免疫化学的試薬を試験
用液に接触させる。その後、ペプチドと試験用液中の抗
体の間に形成される免疫複合体の存在が検出され、この
検出により試験用液中のＮＡＮＢＨ抗体の存在が明らか
になり、定量的に測定されることが可能となる。
【００４５】この免疫化学的試薬の性質及び更には特異
性いかんにより、使用する免疫化学的反応は、いわゆる
サンドウィッチ反応、凝集反応、競合反応あるいは阻害
反応となる。
性いかんにより、使用する免疫化学的反応は、いわゆる
サンドウィッチ反応、凝集反応、競合反応あるいは阻害
反応となる。
【００４６】試験用液中のＮＡＮＢＨの検出には、本発
明による免疫化学的試薬を試験用液及び抗ＮＡＮＢＨに
接触させ、その後、形成される免疫複合体の存在が検出
され、これにより試験用液中のＮＡＮＢＨの存在を決定
することが可能となる。
明による免疫化学的試薬を試験用液及び抗ＮＡＮＢＨに
接触させ、その後、形成される免疫複合体の存在が検出
され、これにより試験用液中のＮＡＮＢＨの存在を決定
することが可能となる。
【００４７】試験用液中のＮＡＮＢＨの検出に関して特
に適した方法は、固相に結合されたＮＡＮＢＨに対する
抗体に向けてペプチドと抗原が競合するという、ラベル
化物質を伴う本発明によるペプチドとＮＡＮＢＨ抗原
（試験用液中に存在）との間の競合反応に基づくもので
ある。
に適した方法は、固相に結合されたＮＡＮＢＨに対する
抗体に向けてペプチドと抗原が競合するという、ラベル
化物質を伴う本発明によるペプチドとＮＡＮＢＨ抗原
（試験用液中に存在）との間の競合反応に基づくもので
ある。
【００４８】本発明によるテスト用キットはその主要成
分として上述の免疫化学的試薬を含有する。ＮＡＮＢＨ
抗体の検出のためにサンドウィッチ反応を用いる場合、
テスト用キットは、例えば、微小テスト用ウェルの内壁
などの様な固相にコートされている本発明によるペプチ
ド及びラベル化された本発明によるペプチドあるいはラ
ベル化された抗体のいずれかを含むと思われる。
分として上述の免疫化学的試薬を含有する。ＮＡＮＢＨ
抗体の検出のためにサンドウィッチ反応を用いる場合、
テスト用キットは、例えば、微小テスト用ウェルの内壁
などの様な固相にコートされている本発明によるペプチ
ド及びラベル化された本発明によるペプチドあるいはラ
ベル化された抗体のいずれかを含むと思われる。
【００４９】ＮＡＮＢＨ抗体の検出に競合反応を用いる
場合、テスト用キットは、固相にコートされている本発
明によるペプチド及びＮＡＮＢＨに対するラベル化抗
体、好ましくは当該ペプチドに対するモノクローナル抗
体を含むと思われる。
場合、テスト用キットは、固相にコートされている本発
明によるペプチド及びＮＡＮＢＨに対するラベル化抗
体、好ましくは当該ペプチドに対するモノクローナル抗
体を含むと思われる。
【００５０】凝集反応においては、テスト用キットは、
粒子あるいは膠質性物質にコートされた本発明によるペ
プチドから成る免疫化学的試薬を含む。
粒子あるいは膠質性物質にコートされた本発明によるペ
プチドから成る免疫化学的試薬を含む。
【００５１】ＮＡＮＢＨ抗原の検出用のキットは、例え
ば、ラベル化された本発明によるペプチド及び固体の支
持体にコートされているＮＡＮＢＨに対する抗体を含
む。
ば、ラベル化された本発明によるペプチド及び固体の支
持体にコートされているＮＡＮＢＨに対する抗体を含
む。
【００５２】実施例１ 表１から表６に示される配列を有するドデカペプチドは
段階的な固相ペプチド合成により調製される。この合成
は、Milligen／Biosearch 9050自動ペプチド合成機かLa
bortec SP640半自動ペプチド合成機を用い、マクロポラ
ス珪藻土あるいはｐ−ベンジルオキシベンジルアルコー
ル樹脂（Wang-resin； 0.6−0.7mmoles/g ，Bachem AG
，スイス）を支持体とする共重合（ジメチルアクリル
アミド−ビスアクリロイルエチレンジアミン−アクリロ
イルサルコシンメチルエステル）の機能化されたポリマ
−及びＮα−Ｆｍｏｃ保護された（Ｆｍｏｃ，９−フル
オレニル−メチルオキシ−カルボニル）アミノ酸を使用
して行った。
段階的な固相ペプチド合成により調製される。この合成
は、Milligen／Biosearch 9050自動ペプチド合成機かLa
bortec SP640半自動ペプチド合成機を用い、マクロポラ
ス珪藻土あるいはｐ−ベンジルオキシベンジルアルコー
ル樹脂（Wang-resin； 0.6−0.7mmoles/g ，Bachem AG
，スイス）を支持体とする共重合（ジメチルアクリル
アミド−ビスアクリロイルエチレンジアミン−アクリロ
イルサルコシンメチルエステル）の機能化されたポリマ
−及びＮα−Ｆｍｏｃ保護された（Ｆｍｏｃ，９−フル
オレニル−メチルオキシ−カルボニル）アミノ酸を使用
して行った。
【００５３】例えば表１のペプチドの合成は、ＤＣＣ
（ジシクロヘキシル−カルボジイミド，１等量）、ＨＯ
Ｂｔ（１−ヒドロキシベンゾ−トリアゾール，２等量）
及びＤＭＦ−ジクロロメタン（容量比１：１）に溶かし
たＤＭＡＰ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−ピリジン，１等
量）を用い、４℃下18時間でのＦｍｏｃ−−Ａｒｇ（Ｐ
ｍｃ）−ＯＨの樹脂へのカップリングで始めた。樹脂上
での未反応アルコールの機能は、その後、ベンゾイルク
ロライド−ピリジンを２時間使用するベンゾイル化によ
り遮断した。
（ジシクロヘキシル−カルボジイミド，１等量）、ＨＯ
Ｂｔ（１−ヒドロキシベンゾ−トリアゾール，２等量）
及びＤＭＦ−ジクロロメタン（容量比１：１）に溶かし
たＤＭＡＰ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−ピリジン，１等
量）を用い、４℃下18時間でのＦｍｏｃ−−Ａｒｇ（Ｐ
ｍｃ）−ＯＨの樹脂へのカップリングで始めた。樹脂上
での未反応アルコールの機能は、その後、ベンゾイルク
ロライド−ピリジンを２時間使用するベンゾイル化によ
り遮断した。
【００５４】結果として得られるＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐ
ｍｃ）樹脂（0.38mmol/g）を、Ｆｍｏｃ基を除去する目
的で連続的に３回、ＤＭＦに溶かした20％ピペリジンで
６分間づつ処理した。その後、アミノ酸配列に従い、Ｆ
ｍｏｃ−アミノ酸の連続的なカップリング段階によりＨ
−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）樹脂上で保護基のついたドデカペプ
チドを調製した。次に示す様な側鎖保護基を使用した。
Ａｒｇには−Ｐｍｃ（２，２，５，７，８−ペンタメチ
ルクロマン−６−スルホニル−），Ｔｈｒには−ｔＢｕ
（３級ブチル−）。
ｍｃ）樹脂（0.38mmol/g）を、Ｆｍｏｃ基を除去する目
的で連続的に３回、ＤＭＦに溶かした20％ピペリジンで
６分間づつ処理した。その後、アミノ酸配列に従い、Ｆ
ｍｏｃ−アミノ酸の連続的なカップリング段階によりＨ
−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）樹脂上で保護基のついたドデカペプ
チドを調製した。次に示す様な側鎖保護基を使用した。
Ａｒｇには−Ｐｍｃ（２，２，５，７，８−ペンタメチ
ルクロマン−６−スルホニル−），Ｔｈｒには−ｔＢｕ
（３級ブチル−）。
【００５５】１グラム樹脂あたりにＦｍｏｃ−アミノ
酸、ＢＯＰ（＝ベンゾトリアゾリルオキシ−トリス（ジ
メチルアミノ）−フォスフォニウムヘキサフルオロリン
酸），ＨＯＢｔの各３等量及び 4.5等量のＮ−メチルモ
ルフォリンを12mlから15mlのＤＭＦに溶かしたものを使
用して45分間づつ各カップリング段階を行い、次にＤＭ
Ｆとエタノールでの洗浄を３回行った（１回につき１分
間）。カップリング反応が完結したことは、Kaiser（An
al. Biochem. 34 巻，595-598 ，1970年）のニンヒドリ
ンテストによりモニターした。Ａｌａ10，Ａｒｇ9 ，Ｖ
ａｌ8 ，Ｌｅｕ6，Ａｒｇ5 及びＰｒｏ3 のカップリン
グ反応の後ごとに陽性のニンヒドリン反応が観察され
た。どの場合においても、１等量の対応するＦｍｏｃ−
アミノ酸，ＢＯＰ，ＨＯＢｔ及びＮ−メチルモルフォリ
ンを用い30分間、カップリング反応を一回繰り返した。
残存する未反応アミノ基のいづれのものをも、無水酢酸
−ＤＭＦ（容量比5:95）を用いた10分間のアセチル化に
より遮断し、ＤＭＦとメタノール（各１分間）で別々に
洗浄した。
酸、ＢＯＰ（＝ベンゾトリアゾリルオキシ−トリス（ジ
メチルアミノ）−フォスフォニウムヘキサフルオロリン
酸），ＨＯＢｔの各３等量及び 4.5等量のＮ−メチルモ
ルフォリンを12mlから15mlのＤＭＦに溶かしたものを使
用して45分間づつ各カップリング段階を行い、次にＤＭ
Ｆとエタノールでの洗浄を３回行った（１回につき１分
間）。カップリング反応が完結したことは、Kaiser（An
al. Biochem. 34 巻，595-598 ，1970年）のニンヒドリ
ンテストによりモニターした。Ａｌａ10，Ａｒｇ9 ，Ｖ
ａｌ8 ，Ｌｅｕ6，Ａｒｇ5 及びＰｒｏ3 のカップリン
グ反応の後ごとに陽性のニンヒドリン反応が観察され
た。どの場合においても、１等量の対応するＦｍｏｃ−
アミノ酸，ＢＯＰ，ＨＯＢｔ及びＮ−メチルモルフォリ
ンを用い30分間、カップリング反応を一回繰り返した。
残存する未反応アミノ基のいづれのものをも、無水酢酸
−ＤＭＦ（容量比5:95）を用いた10分間のアセチル化に
より遮断し、ＤＭＦとメタノール（各１分間）で別々に
洗浄した。
【００５６】各合成サイクルの後、Ｎα−Ｆｍｏｃ保護
基を上述のＤＭＦに溶かした25％ピペリジンで処理する
ことにより除去した。
基を上述のＤＭＦに溶かした25％ピペリジンで処理する
ことにより除去した。
【００５７】合成終了後、結果として得られる完全に保
護されているドデカペプチド樹脂を、樹脂からペプチド
を解離すると同時に全ての保護基を除去することを行う
目的で、室温下で18時間、トリフルオロ酢酸−水−フェ
ノール−チアニゾール−エタンジチオール（容量比82:
5:5:5:2.5) の混合物中で処理した。反応液をジエチル
エーテルに加えて沈殿を起こさせ、粗精製ペプチドを分
離した。ドデカペプチドはpH 2.1の 0.1Ｍリン酸バッフ
ァーに溶かしたアセトニトリルの濃度勾配液を用いたＣ
18−シリカでのＨＰＬＣにより精製した。
護されているドデカペプチド樹脂を、樹脂からペプチド
を解離すると同時に全ての保護基を除去することを行う
目的で、室温下で18時間、トリフルオロ酢酸−水−フェ
ノール−チアニゾール−エタンジチオール（容量比82:
5:5:5:2.5) の混合物中で処理した。反応液をジエチル
エーテルに加えて沈殿を起こさせ、粗精製ペプチドを分
離した。ドデカペプチドはpH 2.1の 0.1Ｍリン酸バッフ
ァーに溶かしたアセトニトリルの濃度勾配液を用いたＣ
18−シリカでのＨＰＬＣにより精製した。
【００５８】実施例２ 表２から表６によるドデカペプチドを対応する方法にお
いて調製した。
いて調製した。
【００５９】実施例３ 表１から表６に示されるアミノ酸配列を有するドデカペ
プチドを別々に、 100mMリン酸バッファーpH 8.0に対し
て 7.5μg/mlとなる様に溶解した。リン酸バッファーpH
5.0に溶かした 0.2％グルタールアルデヒドを各穴あた
り 135μl として用い、室温下の振盪条件で４時間、微
小アッセイ用プレートを前処理した。その後プレートを
空にし、上述のペプチド溶液の 135μl の各分注を各穴
に加えた。37℃下で３時間かけて微小アッセイ用プレー
トにペプチドを結合させた。プレートを凍結し、−20℃
下で一晩保存した。
プチドを別々に、 100mMリン酸バッファーpH 8.0に対し
て 7.5μg/mlとなる様に溶解した。リン酸バッファーpH
5.0に溶かした 0.2％グルタールアルデヒドを各穴あた
り 135μl として用い、室温下の振盪条件で４時間、微
小アッセイ用プレートを前処理した。その後プレートを
空にし、上述のペプチド溶液の 135μl の各分注を各穴
に加えた。37℃下で３時間かけて微小アッセイ用プレー
トにペプチドを結合させた。プレートを凍結し、−20℃
下で一晩保存した。
【００６０】次にプレートを解凍し、中味を空け、 0.2
ＭトリスpH 7.4／ 0.2Ｍ ＮａＣｌに溶した0.05％Twee
n 20(R) 溶液を５分間用いて余分な結合部位を遮断し
た。その後、プレートを 0.2Ｍ Ｔｒｉｓ pH 7.4 ／
0.2Ｍ ＮａＣｌで一度、0.04ＭＴｒｉｓ pH 7.4 で二
度、各穴ごとに 250μl で洗浄した。非Ａ非Ｂ型肝炎に
特異的な抗体の決定に関しては、サンプル希釈液（リン
酸バッファー食塩水（ＰＢＳ）／20％正常ヤギ血清／１
％Triton X100 ）をピペット操作で穴に注入して（各穴
100μl ）血清サンプルを希釈し、37℃下で１時間イン
キュベートした。各穴をＰＢＳ／0.05％Tween 20(R) で
洗浄後、結合したヒト抗体をサンプル希釈液で希釈した
ペルオキシダーゼでラベルしたヤギ抗ヒトイムノグロブ
リンで検出した（各穴 100μl ，37℃下１時間）。プレ
ートをＰＢＳ／0.05％Tween 20(R)で４回洗浄した。ペ
ルオキシダーゼの基質としてＴＭＢ（各穴 100μl ）を
添加し、室温で30分間反応させた。各穴に 100μl の２
Ｍ Ｈ2 ＳＯ4 を添加することにより反応を停止させ
た。黄色度を Organo Teknika マイクロエリザ計測機に
おいて 450nmで測定した。
ＭトリスpH 7.4／ 0.2Ｍ ＮａＣｌに溶した0.05％Twee
n 20(R) 溶液を５分間用いて余分な結合部位を遮断し
た。その後、プレートを 0.2Ｍ Ｔｒｉｓ pH 7.4 ／
0.2Ｍ ＮａＣｌで一度、0.04ＭＴｒｉｓ pH 7.4 で二
度、各穴ごとに 250μl で洗浄した。非Ａ非Ｂ型肝炎に
特異的な抗体の決定に関しては、サンプル希釈液（リン
酸バッファー食塩水（ＰＢＳ）／20％正常ヤギ血清／１
％Triton X100 ）をピペット操作で穴に注入して（各穴
100μl ）血清サンプルを希釈し、37℃下で１時間イン
キュベートした。各穴をＰＢＳ／0.05％Tween 20(R) で
洗浄後、結合したヒト抗体をサンプル希釈液で希釈した
ペルオキシダーゼでラベルしたヤギ抗ヒトイムノグロブ
リンで検出した（各穴 100μl ，37℃下１時間）。プレ
ートをＰＢＳ／0.05％Tween 20(R)で４回洗浄した。ペ
ルオキシダーゼの基質としてＴＭＢ（各穴 100μl ）を
添加し、室温で30分間反応させた。各穴に 100μl の２
Ｍ Ｈ2 ＳＯ4 を添加することにより反応を停止させ
た。黄色度を Organo Teknika マイクロエリザ計測機に
おいて 450nmで測定した。
【００６１】20人の正常人の血清の平均吸光度は0.250
（標準偏差0.047 ）であるのに対し、非Ａ非Ｂ型肝炎の
患者からの血清を用いてみると、 0.6から 0.8にわたる
範囲の吸光度が測定された。対称として無関係なドデカ
ペプチドを用いてこの方法を再現した。テストした全て
の場合において（ｎ＝400 ）、正常人血清とＮＡＮＢＨ
患者からの血清サンプルにより得られる吸光度において
顕著な違いは観察されなかった。
（標準偏差0.047 ）であるのに対し、非Ａ非Ｂ型肝炎の
患者からの血清を用いてみると、 0.6から 0.8にわたる
範囲の吸光度が測定された。対称として無関係なドデカ
ペプチドを用いてこの方法を再現した。テストした全て
の場合において（ｎ＝400 ）、正常人血清とＮＡＮＢＨ
患者からの血清サンプルにより得られる吸光度において
顕著な違いは観察されなかった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/576 Ｚ 9015−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/00 Ｈ 9284−4Ｃ 39/29 9284−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 99:00
Claims (10)
- 【請求項１】 表７において示されるアミノ酸配列を有
するペプチド及びＮＡＮＢＨ抗体と免疫化学的に反応す
るそのフラグメント及び主要成分として当該ペプチドを
含有するポリペプチド、並びにその機能上の誘導体。 - 【請求項２】 表１において示されるアミノ酸配列を有
するドデカペプチド及びＮＡＮＢＨ抗体と免疫化学的に
反応するそのフラグメント及び主要成分として当該ペプ
チドを含有するポリペプチド、並びにその機能上の誘導
体。 - 【請求項３】 請求項２によるペプチドを含有する免疫
化学的試薬。 - 【請求項４】 表５において示されるアミノ酸配列を有
するドデカペプチド及びＮＡＮＢＨ抗体と免疫化学的に
反応するそのフラグメント及び主要成分として当該ペプ
チドを含有するペプチド、並びにその機能上の誘導体。 - 【請求項５】 請求項４によるペプチドを含有する免疫
化学的試薬。 - 【請求項６】 請求項３あるいは請求項５による免疫化
学的試薬を試験用液に接触させ、ペプチドと試験用液中
の抗体との間に形成される免疫複合体の存在が検出さ
れ、それが試験用液中のＮＡＮＢＨ抗体の存在に関する
測定となることを特徴とする、試験用液中のＮＡＮＢＨ
に対する抗体の検出方法。 - 【請求項７】 請求項３あるいは請求項５による免疫化
学的試薬を試験用液及び抗ＮＡＮＢＨに接触させ、その
後形成される免疫複合体の存在が検出され、これにより
試験用液中のＮＡＮＢＨの存在が決定されることを特徴
とする試験用液中のＮＡＮＢＨの検出方法。 - 【請求項８】 非Ａ非Ｂ型肝炎核酸配列の核酸増幅を行
いそれを検出する目的で請求項１によるアミノ酸配列を
コードする配列あるいはそのフラグメントをプライマー
として使用する試験用液中の当該非Ａ非Ｂ型肝炎核酸配
列の増幅及び検出方法。 - 【請求項９】 請求項６あるいは請求項７によるイムノ
アッセイにおいて使用されるテスト用キット。 - 【請求項１０】 請求項８による増幅及び検出法を行う
ためのテスト用増幅キット。
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