JPH05310791A - プレクトレウリス・トリスチスの殺虫毒 - Google Patents
プレクトレウリス・トリスチスの殺虫毒Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 「原始狩猟グモ」プレクトレウリス・トリス
チスから単離した新規殺虫毒プレクトキシン類を昆虫防
除の目的に使用する。 【構成】 プレクトレウリス・トリスチスからプレクト
キシン類を抽出・単離し、そのポリペプチドを配列決定
する。ウイルスプロモーター、特にバキュロウイルスプ
ロモーターを含むベクターを、プレクトキシン・ポリペ
プチドを暗号化しているＤＮＡ配列へ挿入して遺伝子組
立て物を遺伝子工学的に作成する。これらの組立て物
は、昆虫へ感染させると強力な殺虫活性を示す。特に強
力なプレクトキシンはＰｌｔ−VIである。
チスから単離した新規殺虫毒プレクトキシン類を昆虫防
除の目的に使用する。 【構成】 プレクトレウリス・トリスチスからプレクト
キシン類を抽出・単離し、そのポリペプチドを配列決定
する。ウイルスプロモーター、特にバキュロウイルスプ
ロモーターを含むベクターを、プレクトキシン・ポリペ
プチドを暗号化しているＤＮＡ配列へ挿入して遺伝子組
立て物を遺伝子工学的に作成する。これらの組立て物
は、昆虫へ感染させると強力な殺虫活性を示す。特に強
力なプレクトキシンはＰｌｔ−VIである。
Description
【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】この発明は、「原始狩猟グモ」(P
rimitive Hunting Spider)、プレクトレウリス・トリス
チス(Plectreurystristis)から得られた殺虫毒プレクト
キシン類、その核酸配列およびアミノ酸配列、プレクト
キシン遺伝子を含んでいるベクター、遺伝子を含んでい
るウイルス、およびこれらのプレクトキシン類の昆虫防
除の用途に関するものである。 【０００２】 【従来の技術および発明が解決しようとする課題】近
年、蛛形（シュケイ）動物、特にクモ類およびサソリ類
の毒が、医薬および農業のようなさまざまな分野で使用
される生物学的活性物質の可能性ある供給源として研究
されてきた。そのような研究の例を挙げればヨーロッパ
特許出願公開第２０８５２３Ａ２号、グルタメート・ア
ンタゴニスツ・アイソレーティッド・フロム・ニュー・
ワールド・スパイダーズ・アージオープ・トリファシア
タ・アンド・アラニアス・ジェンマ（Ｇｌｕｔａｍａｔ
ｅ ＡｎｔａｇｏｎｉｓｔｓＩｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏ
ｍ Ｎｅｗ Ｗｏｒｌｄ Ｓｐｉｄｅｒｓ Ａｒｇｉｏ
ｐｅ ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａ ａｎｄ Ａｒａｎｅｏ
ｕｓ ｇｅｍｍａ）、ヨーロッパ特許出願公開第１５６
５４０号、グルタメート・レセプター・インヒビター・
オブテインド・フロム・ネフィラ・クラバータ（Ｇｌｕ
ｔａｍａｔｅ ＲｅｃｅｐｔｏｒＩｎｈｉｂｉｔｏｒ
ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａ
ｖａｔａ）、グリシンら、１９８６年、「イオン・チャ
ネル・ブロッカー・フロム・ザ・ベノム・オブ・アージ
オープ・ロバータ(Ion Channel Blocker from the Veno
m ofArgiope lobata)」、ビオオルガニチェスカイア・
ヒミーア(Bioorg. Khim.)、１２巻（８）、１１２１〜
１１２４頁、アシャーウッドら、１９８４年、「グルタ
メート・チャネル・ブロッケード・バイ・ベノムズ・オ
ブ・アージオープ・トリファシアタ・アンド・アラニア
ス・ジェンマ(Glutamate Channel Blockade by Venoms
of Argiope trifasciata andAraneous gemma)」、ジャ
ーナル・オブ・フィジオロジー（パリ）（J. Physiol.
(Paris)）、７９巻、２４１〜２４５頁、アラマキら、
１９８６年、「グルタメート・ポテンシャル・サプレッ
サー・フロム・ネフィラ・クレイバータ・アンド・ネフ
ィラ・マキュァラータ(GlatamatePotential Suppressor
from Nephila clavata and Nephila maculata)」、プ
ロシーディングズ・オブ・ザ・ジャパン・アカデミー(P
roc. Japan Acad.)、６２巻、シリーズＢ、３５９〜３
６２頁、アシャーウッドら、１９８５年、「アンタゴニ
ズム・オブ・グルタメート・レセプター・チャネル・コ
ンプレックシズ・バイ・スパイダー・ベノム・ポリペプ
タイズ(Antagonism of Glutamate Receptor Channel Co
mplexes by Spider Venom Polypeptides)」、ニューロ
トキシコロジー(Neurotoxicology)、６巻（２）、２３
９〜２５０頁、アダムズら、１９８６年、「シナプティ
ック・トキシンズ・フロム・アジェレノプシス・アプテ
ラ(Synaptic Toxins from Agelenopsis aptera)」、イ
ンセクト・ニューロフィジオロジー(Insect Neurophysi
ology)、ボルコベックら編、ヒューマナ・プレス社(Hum
ana Press)、クリフトン(Clifton)、ＮＪ、３９７〜４
０８頁等がある。しかしこれまで単離された有効主成分
は、通常医薬および農業的な用途に適しない複合ポリペ
プチドであるか、または商業的な対象となるには活性水
準があまりに低すぎた。 【０００３】 【課題を解決するための手段】「原始狩猟グモ」、プレ
クトレウリス・トリスチスの毒から単離したある種のポ
リペプチド、またはプレクトレウリス・トリスチスの毒
から単離したこれらのポリペプチドと実質上の配列相同
性を示すポリペプチドを組立てると、予想外な低濃度
で、昆虫、特に鱗翅目に対して毒性を示し、即ち麻痺お
よび／または致死性であることが判明した。これらのポ
リペプチド類を「プレクトキシン(plectoxin)」と命名
した。したがってこの発明は、昆虫に対して毒性を示
し、付随するクモのポリペプチドを含有しないプレクト
キシン類に関するものである。これらのポリペプチド類
はプレクトレウリス・トリスチスの毒から単離し得、ま
たはプレクトレウリス・トリスチスの毒から単離したポ
リペプチド類と実質上の配列相同性を示し得る。 【０００４】 【図面の説明】図１はバイダック(Vydac)Ｃ18カラム
（５μm、０.４６×１５cm）を使用して、０.１％ＴＦ
Ａ（一定）中、アセトニトリル０−６０％の直線濃度勾
配で６０分間、溶出速度１.５ml／分、ＵＶ（２２０n
m）検出を用いたＬＣによる毒液成分の分析的分離を示
した図である。図２はＬＣ［図１と同一条件、ただしア
クアポア(Aquapore)ＯＤＳカラム（１×２２cm）、溶出
速度４.５ml／分］によって分離した毒液成分、および
ヘリオチス・バレッサンス(Heliothis virescens)の幼
虫における対応する生物検定の結果を示す。実線はＵＶ
吸収を表し、殺幼虫活性のヒストグラム（画分を幼虫へ
注射）を矩形の柱で示す。図３、４、５および６は各種
のプラスミドの組立てを示す。 【０００５】 【定義】本明細書および請求の範囲を通じて、以下の定
義を用いる。付随するクモのポリペプチドとは、プレク
トレウリス・トリスチスの毒に天然に存在する殺虫毒ポ
リペプチド類をいう。相同なポリペプチド類とは、シス
テイン残基数およびその位置がこの発明のＰｌｔの１つ
のと同一で、残りのアミノ酸配列が実質上相同であり、
それによって昆虫毒性を示すポリペプチド類をいう。相
同な核酸配列とは、緊縮ハイブリダイゼーション条件下
で対照配列へハイブリッド形成する配列をいう。緊縮ハ
イブリダイゼーション条件とは、４×緩衝化食塩水（Ｓ
ＳＰＥ緩衝液）中、６５℃の標準的な態様でハイブリダ
イゼーションを実施したのち、生成した真のハイブリッ
ドに影響を与えない０.２×ＳＳＰＥで５２℃で単に洗
浄を行う条件をいう。 【０００６】プレクトレウリス・トリスチスの天然毒の
分析によって、殺虫活性を有する約５０種の異なったポ
リペプチド類の存在を明らかにした。これらをＰｌｔ−
Ｉ〜Ｐｌｔ−Ｌと命名した。優れた活性を示すものをさ
らに特性決定し、そのアミノ酸配列を決定した。したが
ってこの発明の１態様は、付随するクモのポリペプチド
類を含有しておらず、下記のアミノ酸配列（配列番号
１、式Ａ） 【化５】 （式中、ＡＡ1はＡｌａまたはＧｌｕ、ＡＡ2はＶａｌま
たはＬｅｕ、ＡＡ5はＩｌｅまたはＧｌｎ、ＡＡ8はＧｌ
ｎまたはＶａｌ、ＡＡ9はＧｌｕまたはＡｓｐ、ＡＡ10
はＴｈｒまたはＴｙｒ、ＡＡ12はＡｓｎまたはＡｒｇ、
ＡＡ14はＡｓｎまたはＬｙｓ、ＡＡ15はＬｅｕまたはＶ
ａｌ、ＡＡ16はＰｒｏまたはＧｌｕ、ＡＡ 19はＡｓｎま
たはＡｓｐ、ＡＡ20はＧｌｕ、Ｇｌｙ、またはＡｓｐ、
ＡＡ24はＣｙｓまたはＴｙｒである）を含んでいるポリ
ペプチド、または式Ａの配列を含み、さらにＡＡ24の後
に下記の追加的なアミノ酸（配列番号２、式Ｂ） 【化６】 （式中、ＡＡ39はＬｙｓまたはＡｒｇ、ＡＡ40はＡｌ
ａ、Ｍｅｔ、またはＩｌｅ、ＡＡ42はＡｓｎまたはＳｅ
ｒである）を含んでいるポリペプチド、または式Ｂの配
列を含み、さらにＡＡ42の後に追加的なＧｌｕを含んで
いる（式Ｃ）ポリペプチド、または式Ｃの配列を含み、
さらに４３位のＧｌｕの後に下記の追加的なアミノ酸配
列（式Ｄ） −Ｃｙｓ−ＡＡ45 （Ｄ） （ここでＡＡ45はＧｌｕまたはＧｌｙである）を含んで
いるポリペプチド、または式Ｄの配列を含み、さらにＡ
Ａ45の後にＳｅｒを含んでいる（式Ｅ）ポリペプチド、
または下記のアミノ酸配列（配列番号３） 【化７】 を含んでいる式Ｆのポリペプチド、または下記のアミノ
酸配列（配列番号４） 【化８】 を含んでいる式Ｇのポリペプチド、または式Ａ〜Ｇの任
意のポリペプチドと相同であるペプチドを含んでいるポ
リペプチドに関する。好ましいポリペプチドは、式Ｅ'
（ここで、ＡＡ1はＡｌａ、ＡＡ2はＶａｌ、ＡＡ5はＩ
ｌｅ、ＡＡ8はＧｌｎ、ＡＡ9はＧｌｕ、ＡＡ10はＴｈ
ｒ、ＡＡ12はＡｓｎ、ＡＡ14はＡｓｎまたはＬｙｓ、Ａ
Ａ15はＬｅｕ、ＡＡ16はＰｒｏ、ＡＡ19はＡｓｎまたは
Ａｓｐ、ＡＡ20はＧｌｕまたはＧｌｙ、ＡＡ24はＣｙ
ｓ、ＡＡ39はＬｙｓまたはＡｒｇ、ＡＡ40はＡｌａまた
はＭｅｔ、ＡＡ42はＡｓｎまたはＳｅｒ、ＡＡ45はＧｌ
ｕまたはＧｌｙである）のポリペプチドである。上記の
式から判るように、この発明のプレクトキシン類は比較
的小分子である（分子量約５０００ダルトン）。最も強
力なプレクトキシンは１０個のハーフ・システイン残基
を有し、恐らく密に詰まった比較的疎水性のトキシンを
作り出す５カ所の相互連結ジスルフィド結合を有してい
る。少なくとも３種のプレクトキシンのカルボキシル末
端は酸性であるから、これはプレクトキシンの全般的な
特徴であるようである。 【０００７】この発明の好ましいポリペプチド類は、次
のものである。 Ｐｌｔ−VI：これはこの発明の特に好ましいポリペプチ
ドであって、式Ｅ（ここで、ＡＡ1はＡｌａ、ＡＡ2はＶ
ａｌ、ＡＡ5はＩｌｅ、ＡＡ8はＧｌｎ、ＡＡ9はＧｌ
ｕ、ＡＡ10はＴｈｒ、ＡＡ12はＡｓｎ、ＡＡ14はＡｓ
ｎ、ＡＡ15はＬｅｕ、ＡＡ16はＰｒｏ、ＡＡ19はＡｓ
ｎ、ＡＡ20はＧｌｕ、ＡＡ24はＣｙｓ、ＡＡ39はＬｙ
ｓ、ＡＡ40はＡｌａ、ＡＡ42はＡｓｎ、ＡＡ45はＧｌｕ
である）で示されるペプチドであることからなる。 Ｐｌｔ−Ｖ：式Ｅ（ここで、ＡＡ1はＡｌａ、ＡＡ2はＶ
ａｌ、ＡＡ5はＩｌｅ、ＡＡ8はＧｌｎ、ＡＡ9はＧｌ
ｕ、ＡＡ10はＴｈｒ、ＡＡ12はＡｓｎ、ＡＡ14はＡｓ
ｎ、ＡＡ15はＬｅｕ、ＡＡ16はＰｒｏ、ＡＡ19はＡｓ
ｎ、ＡＡ20はＧｌｕ、ＡＡ24はＣｙｓ、ＡＡ39はＬｙ
ｓ、ＡＡ40はＡｌａ、ＡＡ42はＡｓｎ、ＡＡ45はＧｌｕ
である）で示されるペプチドである。Ｐｌｔ−VIおよび
Ｐｌｔ−Ｖは、天然Ｐｌｔ−ＶおよびＰｌｔ−VIの還元
的アルキル化によって、クロマトグラフィー的に分離で
きる誘導体を生産する点で異なっており、理論に結びつ
けようとする意図はないが、Ｃ末端で、ある種の翻訳後
修飾がこれら２つのプレクトキシン間の構造上の相違の
原因となっているようである。 Ｐｌｔ−VIII：式Ｅ（ここで、ＡＡ1はＡｌａ、ＡＡ2は
Ｖａｌ、ＡＡ5はＩｌｅ、ＡＡ8はＧｌｎ、ＡＡ9はＧｌ
ｕ、ＡＡ10はＴｈｒ、ＡＡ12はＡｓｎ、ＡＡ14はＬｙ
ｓ、ＡＡ15はＬｅｕ、ＡＡ16はＰｒｏ、ＡＡ19はＡｓ
ｐ、ＡＡ20はＧｌｙ、ＡＡ24はＣｙｓ、ＡＡ39はＬｙ
ｓ、ＡＡ40はＭｅｔ、ＡＡ42はＳｅｒ、ＡＡ45はＧｌｙ
である）で示されるペプチド。 Ｐｌｔ−XI：式Ｅ（ここで、ＡＡ1はＧｌｕ、ＡＡ2はＶ
ａｌ、ＡＡ5はＩｌｅ、ＡＡ8はＧｌｎ、ＡＡ9はＧｌ
ｕ、ＡＡ10はＴｙｒ、ＡＡ12はＡｒｇ、ＡＡ14はＡｓ
ｎ、ＡＡ15はＬｅｕ、ＡＡ16はＰｒｏ、ＡＡ19はＡｓ
ｐ、ＡＡ20はＡｓｐ、ＡＡ24はＣｙｓ、ＡＡ39はＡｒ
ｇ、ＡＡ40はＩｌｅ、ＡＡ42はＳｅｒ、ＡＡ45はＧｌｙ
である）で示されるペプチド。 Ｐｌｔ−XII：式Ｄ（ここで、ＡＡ1はＡｌａ、ＡＡ2は
Ｖａｌ、ＡＡ5はＩｌｅ、ＡＡ8はＧｌｎ、ＡＡ9はＧｌ
ｕ、ＡＡ10はＴｈｒ、ＡＡ12はＡｓｎ、ＡＡ14はＡｓ
ｎ、ＡＡ15はＬｅｕ、ＡＡ16はＰｒｏ、ＡＡ19はＡｓ
ｎ、ＡＡ20はＧｌｕ、ＡＡ24はＣｙｓ、ＡＡ39はＬｙ
ｓ、ＡＡ40はＡｌａ、ＡＡ42はＡｓｎ、ＡＡ45はＧｌｕ
である）で示されるペプチド。 Ｐｌｔ−XIII：式Ａ（ここで、ＡＡ1はＡｌａ、ＡＡ2は
Ｌｅｕ、ＡＡ5はＧｌｎ、ＡＡ8はＶａｌ、ＡＡ9はＡｓ
ｐ、ＡＡ10はＴｙｒ、ＡＡ12はＡｓｎ、ＡＡ14はＡｓ
ｎ、ＡＡ15はＶａｌ、ＡＡ16はＧｌｕ、ＡＡ19はＡｓ
ｎ、ＡＡ20はＧｌｕ、ＡＡ24はＴｙｒである）で示され
るペプチド。 Ｐｌｔ−XIV：式Ｅ（ここで、ＡＡ1はＡｌａ、ＡＡ2は
Ｖａｌ、ＡＡ5はＩｌｅ、ＡＡ8はＧｌｎ、ＡＡ9はＧｌ
ｕ、ＡＡ10はＴｈｒ、ＡＡ12はＡｓｎ、ＡＡ14はＬｙ
ｓ、ＡＡ15はＬｅｕ、ＡＡ16はＰｒｏ、ＡＡ19はＡｓ
ｐ、ＡＡ20はＧｌｙ、ＡＡ24はＣｙｓ、ＡＡ39はＬｙ
ｓ、ＡＡ40はＡｌａ、ＡＡ42はＳｅｒ、ＡＡ45はＧｌｕ
である）で示されるペプチド。 【０００８】これらのポリペプチドのアミノ酸組成、お
よび正確なアミノ酸配列を決定するため、精製したプレ
クトキシン類を還元し、カルボキシメチル化（［3
Ｈ］ＲＣＭ）した。ついで個々の［3
Ｈ］ＲＣＭポリペプチド画分を、種々の酵素を使用して
タンパク分解的に消化し、生成した断片を通常の手技を
用いる配列分析、アミノ酸組成分析、およびＣＯＯＨ−
末端特性分析に掛けた。ハーフ・システイン残基を含ん
でいる位置は、カルボキシメチル部分の3
Ｈをカウントすることによって確かめた。合成ペプチド
断片とＣ末端断片を比較することによって測定した結果
、Ｐｌｔ−Ｖ、Ｐｌｔ−VI、およびＰｌｔ−ＸのＣ末端
は遊離酸であった。種々のＰｌｔ（天然、ＲＣＭ、およ
びＲＣＡＭ）のアミノ酸組成、および酵素断片の組成は
実施例で説明する。この発明に含まれる種々のポリペプ
チドの配列をまとめて表１に示す。好ましいポリペプチ
ド間の相同性は明白である。 【０００９】 【表１】 【００１０】この発明の好ましいポリペプチドは著しい
相同性、特にシステイン残基数およびその位置の保守に
関して著しい相同性を有している。３次構造の形成にお
けるその役割から考え、殺虫活性を有するこれらのポリ
ペプチド鎖におけるシステインの数および位置は特に重
要であると信じられる。上記のプレクトキシン類は、 何
れも殺虫毒性、即ち麻痺および／または致死性を示し、
これらのプレクトキシン類のポリペプチド配列中の僅か
な置換は、この活性に対して悪影響を及ばさないと信じ
られるので、システイン数およびその位置が同じで、残
りのアミノ酸配列が実質上相同であるポリペプチド配列
は、同様に殺虫毒性を示すことが期待できる。そのよう
な相同なポリペプチドもまたこの発明の範囲に包含され
る。 【００１１】この発明のポリペプチドは種々の手法によ
り作成され得る。例えば実施例に示したような精製手法
を用いて、プレクトレウリス・トリスチスの天然毒から
これらを単離し得る。別法としてこれらのポリペプチド
類のアミノ酸配列の知識に基づき、通常のタンパク質合
成技術を用いる合成的な組立て手法を採用し得る。この
発明のポリペプチドの生産に都合よく用い得る一層進ん
だ技術として、発現すると、この発明のポリペプチドを
暗号化しているＤＮＡ配列を通常の手法によって組み立
てる方法を含む。ついでそのようなＤＮＡ配列を好適な
ベクターへ単独に、または対象となるポリペプチドを暗
号化しているＤＮＡ配列の発現を制御し得、または例え
ば融合タンパク質のように、その機能がプレクトキシン
ＤＮＡ発現生産物の活性を増強し、あるいは拡大する結
果をもたらし得る他の相同または非相同なＤＮＡ配列と
組合わせて挿入し得る。好適に採用し得るベクターは、
そのような目的への用途が通常の当業者の共通知識であ
るプラスミド、ファージ、およびウイルスである。その
ようなプレクトキシンＤＮＡを含んだベクターを発現し
得る細胞としては、例えばエシェリキア・コリ(E. col
i)およびバシラス種(Bacillus spp.)のような原核細
胞、または酵母細胞または昆虫細胞のような真核細胞等
が挙げられる。 【００１２】発現生産物を単離し、精製し、製剤化する
加工処理が必要でない有毒な生産物として、プレクトキ
シン・ポリペプチドを直接的に生産する好ましい方法
は、昆虫に特異的なウイルス（バキュロウイルス(bacul
ovirus)）をベクターとして使用する方法である。所望
のポリペプチド・プレクトキシンを暗号化している遺伝
子をバキュロウイルスＤＮＡへ挿入し、バキュロウイル
スプロモーターの制御下に置く。組換え体ハイブリッド
・バキュロウイルスＤＮＡを昆虫に摂取させたの ち、昆
虫の体内でウイルスを増殖し、昆虫に対する殺虫効果を
促進するのに十分な量でプレクトキシンを発現（生産）
する。またそのような組換え技術によって修飾したバキ
ュロウイルスＤＮＡを、クモのプレクトキシン生産遺伝
子の細胞内導入、特に昆虫細胞への導入のためのベクタ
ーとして使用し、プレクトキシン生産に一層好ましい系
を提供することもできる。多数のバキュロウイルスがベ
クターとして使用するのに好適であり、それらはオート
グラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)、
ヘリオチス・バレッサンス(Heliothis virescence)、お
よびボンビクス・モリ(Bombyx mori)からの核多角体病
ウイルスのように当業界既知である。好適な技術は、例
えばヨーロッパ特許出願第０１７５８５２号および米国
特許第４７４５０５１号に報告されており、説明のため
これらをともに本明細書に包含させた。 【００１３】したがってこの発明のもう１つの特徴は、
式Ａ〜Ｅで示されるポリペプチドを暗号化した核酸を含
んでいる核酸配列（ＲＮＡおよびＤＮＡ）、およびこれ
らと相同な核酸である核酸配列を含む。またこの発明の
核酸配列は、目的のポリペプチド生産物を発現しない配
列、例えばシグナル配列、終結配列等のような配列を包
含する。したがってこの発明のもう１つの特徴は、各種
のプレクトキシン類、特にＰｌｔ−VIのクローニングお
よび遺伝子工学を包含する。 【００１４】２５匹の頭胸部（約１ｇ）から出発し、実
施例３で詳細に報告した方法を用いてポリ（Ａ）＋ｍＲ
ＮＡ約８μgを得た。成熟Ｐｌｔ−VIペプチドの逆トラ
ンスレーションによって得られたヌクレオチド配列の２
つの領域に対応する縮重オリゴヌクレオチド・プライマ
ーを合成し、プレクトレウリス・トリスチスｍＲＮＡか
らＰＣＲ増幅するのに使用した。約１３０bpの大きさと
予測されるＤＮＡ断片をＰＣＲ反応で生産した。ＤＮＡ
断片をゲル精製し、ｐＴＺ１８Ｒへクローニングし、４
種のクローンを配列決定した。これらのクローンの１つ
は成熟Ｐｌｔ−VIプレクトキシンのアミノ酸配列の一部
に一致する読み枠を含んでいた。増幅した配列内からの
領域に一致するように設計した非縮重プライマーを32Ｐ
で末端標 識し、プレクトレウリス・トリスチス頭胸部の
ｍＲＮＡから作成したλＺＡＰIIｃＤＮＡライブラリー
のスクリーニングに使用した。約１×１０6プラークの
ライブラリー・スクリーニングで７３個の陽性プラーク
を検出した。ｐブルースクリプト(pBluescript)ＳＫ−
プラスミドを含んでいるｃＤＮＡをλＺＡＰIIクローン
からプラーク精製し、イン・ビボ切断したのち、９個の
クローンのｃＤＮＡ挿入体のＤＮＡ配列分析を行った。
予想される完全鎖長のｃＤＮＡのサイズを測定するた
め、プライマー伸長反応をプレクトレウリス・トリスチ
ス頭胸部のｍＲＮＡで実施した。２個の主バンドおよび
数個の副バンド（主バンドよりも約２０〜３０塩基大き
い）を検出した。最大ｃＤＮＡクローン、ｐＳＣＩ２６
３の分析の結果、主プライマー伸長生産物のサイズに基
づいて、予想された完全鎖長のｃＤＮＡよりもＮ末端で
数塩基長いことが判明し、それが副バンドによって示さ
れた位置の１つで始まるｍＲＮＡから誘導されたもので
あり得ることが示唆された。８２残基のアミノ酸配列が
推定される２４６ヌクレオチドの長いオープン・リーデ
ィングフレームがｃＤＮＡ配列内で見いだされた。プレ
クトキシンＰｌｔ−VIの成熟形と決定されたアミノ酸配
列はこのオープン・リーディングフレーム内に存在し、
３４位のアミノ酸で始まり、７９位で終わる。恐らくカ
ルボキシペプチダーゼ−Ｂ様の酵素によるプロセッシン
グによって成熟形から除かれる３個のＣ末端アルギニン
がこのあとに続く。最初の２０アミノ酸は共通シグナル
配列に合致する。シグナル配列を切断すると、単一のア
ルギニンで終わる１３個のアミノ酸からなるプロ領域が
遊離され、エンドヌクレアーゼによってプロセッシング
されて成熟ペプチドを遊離したのに相違ないと推測され
る。 【００１５】残り８個のｃＤＮＡクローンは完全鎖長よ
りはるかに短かった。９個のクローンは、すべて３'末
端の近くに推定ポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡ
Ａ）を含んでいた。９個のクローンのうちの６個では、
ポリ（Ａ）＋尾部はポリアデニル化シグナルの開始点か
ら２０ヌクレオチド下流に位置しており、残りの３個の
クローンでは、ポリ（Ａ）＋尾部はさらに追加的な３〜
２１塩基下流に位置している。９個のクローンのうちの
７個は成熟Ｐｌｔ−VI（表１０）（配列番号５）の完 全
鎖長に対応する区画を有する読み枠を含んでいる。これ
らの７個のクローンでは、３個のアルギニン・コドンが
成熟タンパク質のカルボキシ末端のあとに続いている。
表１０で下線で示したＡＴＧは、（ａ）これがほぼ完全
な鎖長のｃＤＮＡに存在する最初のメチオニン・コドン
であり、（ｂ）このメチオニンのコドンが、コザックに
よって測定されたリボソーム開始部位の共通配列［コザ
ック、１９８９年、ジャーナル・オブ・セル・バイオロ
ジー(J. Cell Bio.)、１０８巻、２２９〜２４１頁］と
一致する配列ＡＡＣＧＡＴＧＡに存在し、（ｃ）このメ
チオニン・コドンの２１bp上流で始まるＰｌｔ−VIオー
プン・リーディングフレームを有する枠に翻訳停止配列
（ＴＧＡ）があることから、翻訳開始は、まさしくこの
ＡＴＧで起こると考えられる。即ち、Ｐｌｔ−VIタンパ
ク質は、３３Ｎ−末端アミノ酸および３Ｃ−末端アミノ
酸がプロセッシングされて除かれ、表９に示した成熟形
を生じるプレプロタンパク質として合成されたものと推
定される。Ｎ末端の追加的な３３アミノ酸は、２０位で
アラニンのあとに続き、３３位の単一アルギニン以下で
切断される１３アミノ酸のプロ配列を遊離する切断部位
を伴なう推定シグナル配列［フォン・ハイジン、Ｇ、１
９８６年、ニュークレイック・アシッズ・リサーチ(Nuc
l. Acids Res.)、１４巻、４６８３〜４６９０頁］を含
んでいる。したがって一般にプレクトキシン類、特にＰ
ｌｔ-VIのプレプロタンパク質およびプロタンパク質形
は、これらを暗号化している核酸配列と同様にこの発明
のもう１つの特徴である。クローンｐＳＣＩ２６５はＰ
ｌｔ−XIについて測定した４６アミノ酸配列に対応する
区画を伴う読み枠を有する。クローンｐＳＣＩ２７２
は、ＡＡ47でグルタミンがリシンに変わった以外、Ｐｌ
ｔ−VIIIと同じである区画を伴う読み枠を有する。これ
らのクローンは、Ｐｌｔ−VI ｃＤＮＡで見られた３個
のＣ末端アルギニンと比べて、ともに２個のＣ末端アル
ギニン・コドンだけを有する。 【００１６】多くの異なった昆虫への注射によってＰｌ
ｔ−VIプレクトキシンが誘発する極めて高水準の麻痺活
性から、プレプロＰｌｔ−VIプレクトキシンを暗号化し
ているｃＤＮＡを昆虫バキュロウイルスでクローン化し
得る。昆虫で発現すると、野生型バキュロウイルスで感
染後に起こるより一層急速な摂食停止が見られる。昆虫
バキュロウイルスには、昆虫間のウイルス蔓延に関与す
る閉鎖型ウイルスと、感染した昆虫の体内で細胞から細
胞へのウイルスの蔓延に関与する非閉鎖型、即ち出芽し
たウイルスとの２つの形がある。経口による昆虫の感染
には、普通ウイルスの閉塞型が必要である。したがって
この発明のもう１つの特徴は、閉鎖体の形成が損なわれ
ないような遺伝子座で挿入したこの発明のプレクトキシ
ン、またはプレ・プレクトキシン、またはプレプロ・プ
レクトキシンを暗号化した遺伝子を含んでいる組換え体
ウイルスである。そのような遺伝子座の１つはｐ１０座
である。プレクトレウリス・トリスチスの毒から単離し
たポリペプチド、またはこれと実質上相同性を示すポリ
ペプチドは殺虫剤として有用である。特にこれらは、鱗
翅目の昆虫、例えばヘリオチス・バレッサンス、オート
グラファ・カリフォルニカ、およびヨトウムシ属(genus
Spodoptera)の昆虫に対して有用な殺虫剤である。精製
したプレクトキシン、およびプレクトキシンを生産する
ように形質転換したウイルスをともに、タバコ・ホーン
ウオーム(tobaco hornworm)［マンヅカ・セクスタ(Mand
uca sexta)］、タバコ・バッドウオーム(tobaco budwar
m)（ヘリオチス・バレッサンス）、およびビート・アー
ミーウオーム(beat armyworm)［スポドプテラ・エクシ
グア(Spodoptera exigua)］等の幼虫に対する生物活性
を検定した。毒性は試験幼虫の麻痺および／または死を
生じるポリペプチドの活性により検討した。 【００１７】この発明はまたプレクトレウリス・トリス
チスから単離したポリペプチド類、およびこれと実質上
の配列相同性を示すポリペプチド類の殺虫剤としての用
途を提供する。殺虫剤として使用するには、この発明の
ポリペプチドを生産する組換え体ウイルスを昆虫防除製
剤で標準的に用いられる助剤、希釈剤、変性剤、または
調節剤のような好適な担体物質と調合し得る。製剤は溶
液、乳剤、分散剤、粉末、粉剤、顆粒剤等の形であり得
る。プレクトキシンが昆虫の表皮を直接透過して活性に
影響を与える恐れのある消化酵素を避けるように、ＤＭ
ＳＯのような表面活性剤を製剤へ加えるのが都合よい。
これらの組成物を、昆虫または昆虫の繁殖地域へ標的昆
虫を防除するのに好適な量で都合よく適用する。本明細
書で用いる「防除」の語は、麻痺、致死、または摂食停
止を起こすことを意味する。この発明の組成物の投与量
は、防除すべき害虫、および気象条件等を含む多くの要
素によって変わり得るが、一般に０.５〜１００kg／ヘ
クタール、好ましくは１０〜５０kg／ヘクタールの範囲
である。 【００１８】 【実施例】以下に実施例を挙げてこの発明を詳細に説明
する。実施例は発明を説明するためのものであって、発
明の範囲を制限する目的のものではない。 実施例１ クモの毒の精製 プレクトレウリス・トリスチスの毒はスパイダー・ファ
ーム(Spider Pharm)［ブラックキャニオン・シティー(B
lack Canyon City)、ＡＺ］から入手する。天然毒（１
注入当たり約２００μl）を、下記の条件［パーキン・
エルマー(PerkinElmer)４１０型バイオソルベント液送
システム、５ml注入ループ、ヒューレット・パッカード
(Hewlett Packard)１０４０Ｍ型ダイオード・アレー検
出器（２２０nmおよび２８０nm）、アクアポアーＯＤＳ
カラム（２２×１cm）（ブラウンリー・ラボラトリーズ
(Brownlee Labs)、サンタ・クララ(Santa Clara)、Ｃ
Ａ）、流速４.５ml／分、０.１％トリフルオロ酢酸（一
定）中、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）、０％ＭｅＣＮ
（５分間）、ついでＭｅＣＮ直線濃度勾配０−６０％
（５５分間）］を用いた逆相液体クロマトグラフィー
（ＬＣ）によって分別する。数回の操作から類似の画分
を合わせ、一部ずつを生物検定のために採取する。個々
の画分のアリコート１５μgをウシ血清アルブミン含有
１.５mlのポリプロピレンチューブ中に加え、迅速Ｖａ
ｃ濃縮器（サバント(Savant)）で蒸発乾固する。生理食
塩水（３５μl）を加え、３μlアリコートをヘリオチス
・バレッサンスの幼虫へ注射して生物活性を測定する。
生物活性に基づいて、一定のＵＶ活性ゾーンをさらに逆
相液体クロマトグラフィーによって精製し、生物検定の
ために選び出す。即ち、Ｐｌｔ−Ｖ、Ｐｌｔ−VI、およ
びＰｌｔ−VIIIをバイダック・カラム（０.４６×１５c
m、３００オングストローム、Ｃ4またはＣ18(セパレー
ションズ・グループ(Separations Group)、ヘスペリア
(Hesperia)、ＣＡ）、０.１％ＴＦＡ（一定）中で、Ｍ
ｅＣＮまたは１−プロパノールの何れかの直線濃度勾配
を用いてさらに精製する。Ｐｌｔ−ＶはさらにＣ4カラ
ムで２０％ＭｅＣＮ（５分間）、勾配２０−４５％Ｍｅ
ＣＮ（１.５ml／分、６０分間）、１５％ １−プロパノ
ール（５分間）、勾配２０−４５％ＭｅＣＮ（１.５ml
／分、６０分間）、１５％ １−プロパノール（５分
間）、１５−４０％ １−プロパノール（０.８ml／分、
６０分間）により精製する。Ｐｌｔ−VIはさらにＣ4カ
ラムで、３０％ＭｅＣＮ（５分間）、３０−５０％Ｍｅ
ＣＮ（１.５ml／分、６０分間）、２０％ １−プロパノ
ール（５分間）、２０−４５％ １−プロパノール（０.
８ml／分、６０分間）により精製する。Ｐｌｔ−VIIIは
さらにＣ18カラムで２５％ＭｅＣＮ（５分間）、２５−
５５％ＭｅＣＮ（１.５ml／分、５５分間）により精製
する。その他のプレクトキシン類も同様にして精製す
る。 【００１９】［分析］ 精製したＰｌｔ−Ｖ、Ｐｌｔ−
VI、およびＰｌｔ−VIIIを還元し、以下のようにアルキ
ル化する。プレクトキシン１〜５ナノモルを６Ｍ塩酸グ
アニジン（０.５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.５）３００
μlに溶解する。アルゴン大気下に、ペプチドをジチオ
トレイトール（ＤＴＴ）０.８マイクロモルで３７℃で
４時間還元する。トリチウム化したヨード酢酸または非
放射能標識ヨードアセトアミド２.３マイクロモルの何
れかをこれに添加し、室温で１０分間静置する。さらに
非放射能標識ヨード酢酸（またはヨードアセトアミド）
２.７マイクロモルを追加する。さらに１０分経過後、
ＤＴＴ ４.１マイクロモルを追加し、３７℃で１時間、
繰り返し還元を行う。最後にヨード酢酸またはヨードア
セトアミド１３.５マイクロモルを追加してアルキル化
を完結させる。還元し、カルボキシメチル（ＲＣＭ）化
およびカルボキシアミドメチル（ＲＣＡＭ）化したペプ
チドをバイダックＣ18カラムで、０.１％ＴＦＡ中、Ｍ
ｅＣＭ濃度勾配［２５％ＭｅＣＮ（５分間）、２５−５
５％ＭｅＣＮ（５５分間）］を使用するＬＣにより精製
する。得られた結果を表２に示す。 【００２０】 【表２】 【００２１】誘導体化したペプチド（ＲＣＭおよびＲＣ
ＡＭ）を酵素で切断し、構造の帰属に役立ち得る断片を
生産する。標準的なペプチド１〜２ナノモルのＬＣ溶媒
溶液を１.５mlのポリプロピレンチューブへ加える。１
００〜１５０μlに濃縮したのち、０.１Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ
3（ｐＨ８）３００μlを添加する。試料を約３００μl
に濃縮する。個々の酵素について、それぞれ下記の条件
［トリプシン（０.５μg）、ＲＣＭペプチド、３７℃、
４時間：サーモリシン（０.２５μg）、ＲＣＭペプチ
ド、ＣａＣｌ2中、５mM、３７℃、４時間：エンドペプ
チダーゼＧｌｕ−Ｃ（１μg）、ＲＣＡＭペプチド、Ｅ
ＤＴＡ中、１mM、室温、２０時間］を用いる。試料を１
％ＴＦＡで酸性とし、ついで約２００μlに濃縮したの
ち、バイダックＣ18カラムを使用するＬＣ分析を行う
［０.１％ＴＦＡ（一定）中、ＭｅＣＮ、０％ＭｅＣＮ
（５分間）、ＭｅＣＮ勾配０−６０％（８０分）、０.
５ml／分］。プレクトキシン（天然、ＲＣＭ、およびＲ
ＣＡＭ）、および断片をパルス液相タンパク質シーケン
サー（アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosyst
ems)４７７Ａ型、フェニルチオヒダントイン分析装置１
２０Ａ型とオン・ラインでつなぐ）を使用して配列決定
する。液体シンチレーションカウンター（パッカード４
４３０型）によりアルキル化したハーフ・システイン残
基の3Ｈを定量するため、個々のＰＴＨアミノ酸を採取
する。またペプチドを真空蒸気によって加水分解（６Ｍ
ＨＣｌ／１％フェノール、１１０℃、２０時間）し
て、アミノ酸分析を行う。フェニルチオカルバモイル誘
導体へ変換したのち、ＬＣによりアミノ酸を分析する
（ウルトラスフェアＯＤＳカラム、０.４６×１５cm、
アルテックス(Altex)）。Ｐｌｔ−ＶおよびＰｌｔ−VI
のカルボキシル末端の分析のため、ヘプタペプチド（ア
トネッセス(ATNECES)−ＮＨ2およびアトネッセス−Ｏ
Ｈ、配列番号１１）を合成する。粗製ペプチドを還元
し、カルボキシメチル化し（前記と同様）、ＬＣにより
精製する。ペプチドの配列決定は、Ｐｌｔ−ＶおよびＰ
ｌｔ−VIからの対応するトリプシン分解断片とＬＣによ
り比較したこれらの構造を確認する。その結果を以下の
表３〜６ａに示す。 【００２２】 【表３】 【００２３】 【表４】 【００２４】 【表５】 【００２５】 【表６】 【００２６】 【表７】 【００２７】 【表８】 【００２８】実施例２ 種々のプレクトキシン類の生物活性 毒液から単離した種々のプレクトキシン類を３種の異な
った昆虫の幼虫へ注射する。その結果を下表に示す。Ｌ
Ｄ50は処理した幼虫の５０％を２４時間で致死させる投
与量である。ＥＤ50は幼虫の５０％を１時間で麻痺させ
るのに有効であった量である。★印を付した値は、異な
ったミルキング・ロットからの試料で重複分析した値を
表す。 【００２９】 【表９】 【００３０】実施例３ ｍＲＮＡの単離 生きたプレクトレウリス・トリスチスのクモ（スパイダ
ー・ファーム、ブラックキャニオン・シティー、ＡＺ）
を液体窒素中で手速く凍結し、脚および腹部を頭胸部か
ら離断する。２５匹分の頭胸部（１ｇ）を、ポリトロン
(Polytron)ホモジナイザーでＲＮＡ抽出緩衝液（４Ｍグ
アニジン・イソチオシアナート、５０mMクエン酸ナトリ
ウム(ｐＨ７.０)、０.１Ｍ ２−メルカプトエタノー
ル）２０ml中で１分間ホモジナイズする。ホモジナイズ
したのち、引き続き１０％ザルコシル(Sarkosyl)１mlを
添加する。ホモジネートをソルボール(Sorvall)ＨＢ−
４ローターで４℃、８０００rpmで１０分間遠心し、上
清を清浄な試験管へデカントして、不溶性の破片を除去
する。この操作を２回繰り返し、ついで透明な溶解液
へ、１Ｍ酢酸０.０２５容量（０.５ml）および１００％
エタノール０.７５容量（１５ml）を混合し、これを−
２０℃で１夜貯蔵する。ＨＢ−４ローターを使用して４
℃、１００００rpmで１０分間遠心後、上清を棄て、ペ
レットをファーストトラック(FastTrack)（インビトロ
ジェン社(Invitrogen Corp.)）溶解緩衝液１５mlに再浮
遊する。ついで製造業者（インビトロジェン社）によっ
て提供されたファーストトラックｍＲＮＡ単離キットに
関するプロトコールにしたがい、ポリＡ＋頭胸部ｍＲＮ
Ａ約８μgを単離する。 【００３１】実施例４ ＰＣＲ増幅 実施例３で単離したｍＲＮＡ（０.５μg）から、下記の
配列（配列番号１２） 【化９】 を有する縮重３０量体オリゴヌクレオチドプライマーで
始動させたＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（ギブコ・ベセスダ・
リサーチ・ラボラトリーズ(GIBCO-Bethesda Research L
aboratories)を使用して１本鎖ｃＤＮＡを合成する。こ
のプライマーは最初の１１ヌクレオチドにＮｏｔＩ配列
を含み、そのあとにＰｌｔ−VIプレクトキシン・アミノ
酸配列の逆トランスレーションによって誘導された配列
と相補的な１９ヌクレオチドが続く。ｃＤＮＡ合成のあ
と、反応を９０℃で５分間加熱し、室温に冷却し、エタ
ノール沈殿する。ｃＤＮＡ反応生産物を、前記のプライ
マーおよび下記の配列（配列番号１３） 【化１０】 を有する別の縮重プライマーそれぞれ２μMずつを使用
し、ＰＣＲのジーンＡＭｐ試薬［パーキン・エルマー・
シータス・インスツルメンツ(Perkin-Elmer Cetus Inst
ruments)］により、１００μl反応で増幅する。この第
２のプライマーも最初の１１ヌクレオチドにＮｏｔｌＩ
部位を含み、それに続いてＰｌｔ−VIプレクトキシンの
アミノ酸配列の逆トランスレーション生産物の一部に対
応する配列を含んでいる。ＰＣＲ条件は、９４℃で１分
間、３７℃で２分間、３分間で温度を徐々に７２℃へ上
昇させ、７２℃で３分間、１サイクル当たり７２℃セグ
メントの１０秒間伸長を３０サイクル、ついで７２℃セ
グメントの最終サイクル伸長を１０分間実施する。約１
３０bpの予想サイズを有するＤＮＡ断片が生産される。
これらをゲル精製し、ｐＴＺ１８Ｒ（バイオ・ラド・ラ
ボラトリーズ(BIO-RAD Laboratories)）へクローニング
し、４種のクローンを配列決定する。これらのクローン
のうちの１つは成熟Ｐｌｔ−VIのアミノ酸配列に一致す
る読み枠を含んでいる。 【００３２】 【表１０】 【００３３】実施例５ ｃＤＮＡ合成およびクローニング λファージλＺＡＰIIシステム（ストラタジーン社(Str
atagene Corp)）を、プレクトレウリス・トリスチスの
頭胸部ｍＲＮＡ３.５μgから出発するｃＤＮＡの合成お
よびクローニングに使用する。オリゴヌクレオチド 【化１１】 （配列番号１６）の５'末端を、ポリヌクレオチドキナ
ーゼを使用する32Ｐで末端標識し［サンブルックら、１
９８９年、モレキュラー・クローニング・ア・ラボラト
リー・マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory M
anual)、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー・プレス(Cold Spring HarborLaboratory Pr
ess)、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ］、プラ
ーク・ハイブリダイゼーション（サンブルックら、前
掲）によるプレクトレウリス・トリスチス頭胸部ｃＤＮ
Ａライブラリー・スクリーニングのプローブとして使用
する。約１×１０6プラークのライブラリー・スクリー
ニングで、７３個の陽性プラークを検出する。 【００３４】ＤＮＡ配列決定および配列分析 λＺＡＰIIインストラクション・マニュアルに記載され
ているイン・ビボ操作法を用いて、９個のクローンのｃ
ＤＮＡ挿入体を含んでいる２本鎖ｐブルースクリプトＳ
Ｋ-（ストラタジーン）プラスミドＤＮＡをλＺＡＰII
ｃＤＮＡクローンから作成する。製造業者の指示にした
がい、Ｍ１３およびＭ１３逆プライマーおよびファーマ
シアＬＫＢ(Parmacia LKB)T7ＤＮＡシークエンシング・
キットを使用して、ｃＤＮＡ挿入体を両方向から配列決
定し、これらを表１０−１１に示す。ヌクレオチド配列
および推定されるタンパク質配列をインテリジェネティ
ックス(IntelliGenetics)・コンピュータープログラム
により分析する。 【００３５】 【表１１】 【表１２】 【００３６】 【表１３】 【００３７】プライマー伸長 完全鎖長ｃＤＮＡの予想されるサイズを決定するため、
プライマー伸長反応をプレクトレウリス・トリスチス頭
胸部のｍＲＮＡで実施する。Ｐｌｔ−VI ｍＲＮＡの転
写開始部位を、Ｐｌｔ−VI ｍＲＮＡの一部と相補的で
ある下記の３１量体オリゴヌクレオチド（配列番号１
７） 【化１２】 を使用するプライマー伸長分析によって確かめる。Ｔ４
ポリヌクレオチドキナーゼでオリゴヌクレオチドを５'
−末端標識する（サンブルックら、前掲）。プライマー
・アニーリングおよびプライマー伸長反応は、参考のた
め本明細書に包含させたＧ.Ｗ.ブリッサードおよびＧ.
Ｆ.ローマンの報告［１９８９年、ビロロジー(Virolog
y)、１７０巻、５３７〜５５５頁］にしたがい、ただし
１０mMトリス（ｐＨ８.０）およびプレクトレウリス・
トリスチス頭胸部のｍＲＮＡ２.５μgを含んで伸長反応
を実施する。プライマー伸長反応生産物のサイズは、Ｍ
１３−２０プライマーを使用し、ｐブルースクリプトII
ＳＫ+（ストラタジーン）から生産した配列決定用の連
鎖との比較により決定する。２つの主バンド、および主
バンドより約２０〜３０bp大きい数個の副バンドを検出
する。最長のｃＤＮＡクローンｐＳＣＩ２６３の分析か
ら、これは、主プライマーの伸長反応生産物のサイズに
基づいて推定した完全鎖長のｃＤＮＡより、Ｎ末端で数
塩基長いことが判明し、副バンドによって示される位置
の１つで始まるｍＲＮＡに由来するものであり得ること
が示唆される。残りの８個のｃＤＮＡは完全鎖長よりも
はるかに短かった。９個のクローンは、すべて３'末端
の近くに推定ポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）
［プラウドフットおよびブラウンリー、１９７６年、ネ
ーチャー(Nature)、２６３巻、２１１〜２１４頁］を含
んでいる。９個のクローンのうちの６個では、ポリ（Ａ
＋）尾部はポリアデニルシグナルの開始位置から２０bp
下流に位置し、３個のクローンでは、ポリ（Ａ＋）尾部
はさらに追加的な３〜２１塩基下流に位置している。 【００３８】実施例６ バキュロウイルスの組立て Ｐｌｔ−VI ｃＤＮＡを含む転移ベクターに基づくＡｃ
ＮＰＶｐ１０遺伝子の組立て 参考のため図３、４、５および６を示す。ＥｃｏＲＩお
よびＸｈｏＩで切断することにより、クローンｐＳＣＩ
２６６のｃＤＮＡ挿入体を取り出す。ゲル濾過後、４種
類のすべてのｄＮＴＰの存在で、エシェリキア・コリＤ
ＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片で処理することによ
り、１本鎖ＤＮＡ末端を修復する。完全なｐ１０オープ
ン・リーディングフレームの代わりになるポリリンカー
を有するプラスミドｐＡＣＪＪ２［ジャスト・ファルク
博士(Dr. Just Valk)、デパートメント・オブ・ビロロ
ジー(Dept. of Virology)、アグリカルチュラル・ユニ
バーシティー(Agricultural Univ.)、ウォゲニンゲン(W
ageningen)、オランダから入手］をＢａｍＨＩで切断
し、その末端を修復し、ウシの腸ホスファターゼでホス
ファターゼ処理し、ついでｐＳＣＩ２６６からのｃＤＮ
Ａとライゲーションして、ｐＳＣＩ１８３を作成する。
プラスミドｐＳＣＩ１８４の組立ては、ｃＤＮＡ挿入体
がｐＳＣＩ２７０に由来していることを除いて、上記の
ｐＳＣＩ１８３と類似している。ハイブリッドｐ１０−
キャプシド多面体プロモーターから下流を挿入したクロ
ーンｐＳＣＩ２６６からのｃＤＮＡを含んでいるプラス
ミドｐＳＣＩ１８５は、下記のようにして組立てる。Ｅ
ｃｏＲＶおよびＢｇｌIIで切断することにより、ｐＣａ
ｐｐｏｌｈ［チームおよびミラー、１９９０年、ジーン
(Gene)、９１巻、８７〜９４頁］からハイブリッド−キ
ャプシド多面体プロモーターを含んでいる断片を取り出
す。ＢｇｌII切断した粘着末端を修復し、この断片を、
ＢａｍＨＩで切断し、修復し、ホスファターゼ処理した
ｐＡｃＪＪ２へクローニングし、ｐＳＣＩ１８１を作成
する。ついでｐＳＣＩ１８１をＳｍａＩで切断し、ホス
ファターゼ処理し、前記と同様にこれをｐＳＣＩ２６６
からのｃＤＮＡ断片とライゲーションして、ｐＳＣＩ１
８５を作成する。ハイブリッド−キャプシド多面体プロ
モーターから下流のクローンｐＳＣＩ２６６からのｃＤ
ＮＡを含んだプラスミドｐＳＣＩ１９８は、下記のよう
にして組立てる。ＡｃＮＰＶ断片ＥｃｏＲＩ−Ｐおよび
ＥｃｏＲＩ−ＸをｐＴＺ１８Ｒへ別々にサブクローニン
グして、それぞれｐＳＣＩ２０６およびｐＳＣＩ２５０
を作成する。ｐＳＣＩ２０６をＥｃｏＲＩで部分的に切
断し、その末端をクレノー反応によって修復し、ついで
再ライゲーションしてｐＳＣＩ１７６を作成する。Ｅｃ
ｏＲＩ−Ｘ断片を、ついでｐＳＣＩ２５０からｐＳＣＩ
１７６へクローニングして、ｐＳＣＩ１７７を作成す
る。ついでｐＳＣＩ１７７をＨｉｎｄIIIで部分的に切
断し、その末端をクレノー反応によって修復し、ついで
再ライゲーションして、ｐＳＣＩ１７８を作成する。下
記の配列（配列番号３６） 【化１３】 を有するプライマーを使用するｐＳＣＩ１７７のイン・
ビトロ変異によって、ｐ１０ ＡＴＡＡＧ転写開始部位
の代わりに、ＥｃｏＲＶ部位を導入し、生じたプラスミ
ドをｐＳＣＩ１８６と命名する。ついでｐＳＣＩ１８６
をＥｃｏＲＶおよびＢｇｌIIで切断し、ホスファターゼ
処理し、ついでｐＣａｐＰｏｌｈｃａｔ（チームおよび
ミラー、前掲）からのハイブリッド−キャプシド多面体
プロモーターを含むＥｃｏＲＶ−ＢｇｌII断片へライゲ
ーションして、ｐＳＣＩ１８７を作成する。ｐＳＣＩ１
８７をＢｇｌIIで切断し、その末端を修復し、ホスファ
ターゼ処理し、ついでｐＳＣＩ２６６（上記）からのｃ
ＤＮＡ断片へライゲーションして、ｐＳＣＩ１９８を作
成する。 【００３９】実施例７ 生物検定 遺伝子工学的に組み立てたプレクトキシンを含有するバ
キュロウイルスを、参考のため本明細書に包含させたス
チュアートらの方法（スチュアートら、１９９１年、ネ
ーチャー、３５２巻、８５頁）にしたがって生物検定し
た。簡単に説明すると、ＬＤ50を測定するには、第２虫
令のヘリオチス・バレッサンス幼虫５０匹（約０.６〜
０.７mg）を、微量滴定プレート中で小型の人工固形食
餌により各ウイルス・ストックの５倍希釈液を摂取させ
る。ウイルスの最大投与量は致死が９０％以上生じるよ
うに選び、最小投与量は致死が約１０％生じるように選
ぶ。これらの量は、遺伝子操作を加えないＡｃＮＰＶで
は、幼虫１匹当たり約１２０、６０、３０、１５、およ
び７.５多面体である。投与量を２４時間で消費した幼
虫を人工食餌の個々の容器へ移し、毎日これを測定す
る。死骸を取り出し、スライドへ塗り付け、死因を確か
める。プロビット分析を用いてデータを解析し、ＬＤ50
値を決定する。生存時間（ＳＴ50）を測定するには下記
の方法を用いる。成虫を産卵用の濾紙を加えたケージで
飼育する。卵が載っている濾紙を表面滅菌し、プラスチ
ック容器内に保存する。孵化後、生まれ立ての幼虫を３
〜６時間絶食させたのち、各ウイルス浮遊液（１ml当た
り多面体２×１０6）の小滴を摂取させる。浮遊液を５
％青色食用色素で着色すると、摂取を可視化することが
できる。ウイルスの小滴をペトリ皿に同心円輪状に配置
する。幼虫を輪の中心に置くと、幼虫は小滴を通って移
動し、皿の縁へ這い上る前に少量の液体を摂取する。摂
取後、幼虫を人工食餌を加えた個々の容器で２３℃で維
持する。２４時間後、処置によって死亡した幼虫を取り
出す。その後、間隔をおいて頻回に幼虫をチェックす
る。死亡した幼虫を取り出し、外観および顕微鏡検査に
よって死因を診断する。ＳＴ50計算はビスタット(Vista
t)プログラムによって実施する。プレクトキシン遺伝子
を保有しているウイルスで感染した幼虫は、一層低いＳ
Ｔ50値を示す。 【００４０】 【化１４】 【化１５】 【化１６】 【化１７】 【化１８】 【化１９】 【化２０】 【化２１】 【化２２】 【化２３】 【化２４】 【化２５】 【化２６】 【化２７】 【化２８】 【化２９】 【化３０】 【化３１】 【化３２】 【化３３】 【化３４】 【化３５】 【化３６】 【化３７】 【化３８】 【化３９】 【化４０】 【化４１】 【化４２】 【化４３】 【化４４】 【化４５】 【化４６】 【化４７】 【化４８】 【化４９】 【００４１】 【配列表】 【００４２】配列番号：１ 配列の長さ：２４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ フラグメント型：Ｎ末端 配列の特徴 特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ 存在位置：１．．２４ 他の情報：ｌａｂｅｌ＝ＸＡＡ 注＝“ＡＡ１＝ＡまたはＥ；ＡＡ２＝ＶまたはＬ；ＡＡ
５＝ＩまたはＱ；ＡＡ８＝ＱまたはＶ；ＡＡ９＝Ｅまた
はＤ；ＡＡ１０＝ＴまたはＹ；ＡＡ１２＝ＮまたはＲ；
ＡＡ１４＝ＮまたはＫ；ＡＡ１５＝ＬまたはＶ；ＡＡ１
６＝ＰまたはＥ；ＡＡ１９＝ＮまたはＤ； 配列 Xaa Xaa Lys Cys Xaa Gly Trp Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Gly Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Cys Cys Xaa Xaa Cys Val Met Xaa 20 【００４３】配列番号：２ 配列の長さ：１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ フラグメント型：中間部 配列の特徴 特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ 存在位置：１５．．１８ 他の情報：ｌａｂｅｌ＝ＸＡＡ 注＝“ＡＡ３９＝ＫまたはＲ；ＡＡ４０＝Ａ，Ｍまたは
Ｉ；ＡＡ４２＝ＮまたはＳ” 配列 Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn Cys Arg Cys Asn His Pro Xaa Xaa 1 5 10 15 Thr Xaa 【００４４】配列番号：３ 配列の長さ：４６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 Cys Ala Lys His Ser Glu Thr Cys Lys Asn Gly Asn Cys Cys Thr Cys 1 5 10 15 Thr Gln Tyr Arg Gly Lys Asp Glu Pro Met Ala Cys Arg Arg Gly Thr 20 25 30 His Gly Gln Arg Cys Gln Cys Val Met Lys Ile Met Lys His 35 40 45 【００４５】配列番号：４ 配列の長さ：４９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 Gly Cys Lys Glu Phe Leu Val Lys Cys Asp Ser Asn Ser Glu Cys Cys 1 5 10 15 Lys Thr Ala Ile Val Lys Gly Lys Lys Lys Gln Leu Ser Cys Leu Cys 20 25 30 Gly Ala Trp Gly Ala Gly Cys Ser Cys Ser Phe Arg Cys Gly Asn Arg 35 40 45 Cys 【００４６】配列番号：５ 配列の長さ：４６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 Ala Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Asn Leu Pro 1 5 10 15 Cys Cys Asn Glu Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn 20 25 30 Cys Arg Cys Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser 35 40 45 【００４７】配列番号：６ 配列の長さ：４６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 Ala Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Lys Leu Pro 1 5 10 15 Cys Cys Asp Gly Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn 20 25 30 Cys Arg Cys Asn His Pro Lys Met Thr Ser Glu Cys Gly Ser 35 40 45 【００４８】配列番号：７ 配列の長さ：４６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 Glu Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Tyr Cys Arg Gly Asn Leu Pro 1 5 10 15 Cys Cys Asp Asp Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn 20 25 30 Cys Arg Cys Asn His Pro Arg Ile Thr Ser Glu Cys Gly Ser 35 40 45 【００４９】配列番号：８ 配列の長さ：４５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 Ala Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Asn Leu Pro 1 5 10 15 Cys Cys Asn Glu Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn 20 25 30 Cys Arg Cys Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu 35 40 45 【００５０】配列番号：９ 配列の長さ：２４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 Ala Leu Lys Cys Gln Gly Trp Val Asp Tyr Cys Asn Gly Asn Val Glu 1 5 10 15 Cys Cys Asn Glu Cys Val Met Tyr 20 【００５１】配列番号：１０ 配列の長さ：４６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 Ala Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Lys Leu Pro 1 5 10 15 Cys Cys Asp Gly Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn 20 25 30 Cys Arg Cys Asn His Pro Lys Ala Thr Ser Glu Cys Gly Ser 35 40 45 【００５２】配列番号：１１ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ フラグメント型：中間部 【００５３】配列番号：１２ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 GATGCGGCCG CTCRCAYTCR TTNGTNGCYT TNGG 【００５４】配列番号：１３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 GATGCGGCCG CGTNAARTGU ATHGGNTGGC 【００５５】配列番号：１４ 配列の長さ：１３８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） ハイポセティカル：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 配列 CGNGTNAART GYATHGGNTG GCARGARACN TGYAAYGGNA AYYTNCCNTG YTGYAAYGAR 60 TGYGTNATGT GYGARTGYAA YATHATGGGN CARAAYTGYM GNTGYAAYCA YCCNAARGCN 120 ACNAAYGART GYGARWSN 138 【００５５】配列番号：１５ 配列の長さ：１３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 GTTAAGTGTA TTGGTTGGCA GGAAACATGC AACGGCAACT TGCCCTGCTG CAATGAGTGC 60 GTCATGTGCG AATGCAACAT TATGGGTCAA AACTGCAGAT GCAACCATCC CGAAAGCGAC 120 CAATGAATGT GA 132 【００５６】配列番号：１６ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 GGATGGTTGC ATCTGCAG 18 【００５７】配列番号：１７ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 GTGCAAACGA CCAATGCACA GACAAGGGCG G 【００５８】配列番号：１８ 配列の長さ：３４５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：４０．．２８８ 配列 GTTTTTGTAG TGAAGCACTG AGAAGCCTGT AGCAGAACC ATG AAG CAT TTG ATC 54 Met Lys His Leu Ile 1 5 TTT TCA TCC GCC CTT GTC TGT GCA TTG GTC GTT TGC ACA TTT GCT GAA 102 Phe Ser Ser Ala Leu Val Cys Ala Leu Val Val Cys Thr Phe Ala Glu 10 15 20 GAG CAA GTG AAC GTG CCC TTT CTT CCT GAC GAA AGA GCA GTA AAA TGT 150 Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu Arg Ala Val Lys Cys 25 30 35 ATC GGG TGG CAG GAA ACA TGC AAC GGC AAC TTG CCC TGC TGC AAT GAG 198 Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Asn Leu Pro Cys Cys Asn Glu 40 45 50 TGC GTC ATG TGC GAA TGC AAC ATT ATG GGT CAA AAC TGC AGA TGC AAC 246 Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn Cys Arg Cys Asn 55 60 65 CAT CCC AAA GCA ACT AAC GAA TGC GAG TCA AGA AGG CGT TGAAACAGCA 295 His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser Arg Arg Arg 70 75 80 AAGAAATTAT CTGTATGATT TTTGGATTGA ATAAACGGGA GTAGATATGA 345 【００５９】配列番号：１９ 配列の長さ：８２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Lys His Leu Ile Phe Ser Ser Ala Leu Val Cys Ala Leu Val Val 1 5 10 15 Cys Thr Phe Ala Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu 20 25 30 Arg Ala Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Asn Leu 35 40 45 Pro Cys Cys Asn Glu Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln 50 55 60 Asn Cys Arg Cys Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser Arg 65 70 75 80 Arg Arg 【００６０】配列番号：２０ 配列の長さ：３２６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：６．．２５４ 配列 GAACC ATG AAG CAT TTG ATC TTT TCA TCC GCC CTT GTC TGT GCA TTG 47 Met Lys His Leu Ile Phe Ser Ser Ala Leu Val Cys Ala Leu 1 5 10 GTC GTT TGC ACA TTT GCT GAA GAG CAA GTG AAC GTG CCC TTT CTT CCT 95 Val Val Cys Thr Phe Ala Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro 15 20 25 30 GAC GAA AGA GCA GTA AAA TGT ATC GGG TGG CAG GAA ACA TGC AAC GGC 143 Asp Glu Arg Ala Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly 35 40 45 AAC TTG CCC TGC TGC AAT GAG TGC GTC ATG TGC GAA TGC AAC ATT ATG 191 Asn Leu Pro Cys Cys Asn Glu Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met 50 55 60 GGT CAA AAC TGC AGA TGC AAC CAT CCC AAA GCA ACT AAC GAA TGC GAG 239 Gly Gln Asn Cys Arg Cys Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu 65 70 75 TCA AGA AGG CGT TGAAACAGCA AAGAAATTAT CTGTATGATT TTTGGATTGA 291 Ser Arg Arg Arg 80 ATAAACGGGA GTAGATATGA CTCTGTTCGT CTGTT 326 【００６１】配列番号：２１ 配列の長さ：８２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Lys His Leu Ile Phe Ser Ser Ala Leu Val Cys Ala Leu Val Val 1 5 10 15 Cys Thr Phe Ala Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu 20 25 30 Arg Ala Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Asn Leu 35 40 45 Pro Cys Cys Asn Glu Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln 50 55 60 Asn Cys Arg Cys Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser Arg 65 70 75 80 Arg Arg 【００６２】配列番号：２２ 配列の長さ：３０８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．２４６ 配列 AAG CAT TTG ATC TTT TCA TCC GCC CTT GTC TGT GCA TTG GTC GTT TGC 48 Lys His Leu Ile Phe Ser Ser Ala Leu Val Cys Ala Leu Val Val Cys 1 5 10 15 ACA TTT GCT GAA GAG CAA GTG AAC GTG CCC TTT CTT CCT GAC GAA AGA 96 Thr Phe Ala Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu Arg 20 25 30 GCA GTA AAA TGT ATC GGG TGG CAG GAA ACA TGC AAC GGC AAC TTG CCC 144 Ala Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Asn Leu Pro 35 40 45 TGC TGC AAT GAG TGC GTC ATG TGC GAA TGC AAC ATT ATG GGT CAA AAC 192 Cys Cys Asn Glu Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn 50 55 60 TGC AGA TGC AAC CAT CCC AAA GCA ACT AAC GAA TGC GAG TCA AGA AGG 240 Cys Arg Cys Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser Arg Arg 65 70 75 80 CGT TGAAACAGCA AAGAAATTAT CTGTATGATT TTTGGATTGA ATAAACGGGA 293 Arg GTAGATATGA ATCTG 308 【００６３】配列番号：２３ 配列の長さ：８１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Lys His Leu Ile Phe Ser Ser Ala Leu Val Cys Ala Leu Val Val Cys 1 5 10 15 Thr Phe Ala Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu Arg 20 25 30 Ala Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Asn Leu Pro 35 40 45 Cys Cys Asn Glu Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn 50 55 60 Cys Arg Cys Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser Arg Arg 65 70 75 80 Arg 【００６４】配列番号：２４ 配列の長さ：３０６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．２４９ 配列 ATG AAG CAT TTG ATC TTA GCA TCC GCC CTT GTC TGT GCA TTG GTC GTT 48 Met Lys His Leu Ile Leu Ala Ser Ala Leu Val Cys Ala Leu Val Val 1 5 10 15 TGC ACA TTT GCT GAA GAG CAA GTG AAC GTG CCC TTT CTT CCT GAC GAA 96 Cys Thr Phe Ala Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu 20 25 30 AGA GCA GTA AAA TGT ATC GGG TGG CAG GAA ACA TGC AAC GGC AAC TTG 144 Arg Ala Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Asn Leu 35 40 45 CCC TGC TGC AAT GAG TGC GTC ATG TGC GAA TGC AAC ATT ATG GGT CAA 192 Pro Cys Cys Asn Glu Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln 50 55 60 AAC TGC AGA TGC AAC CAT CCC AAA GCA ACT AAC GAA TGC GAG TCA AGA 240 Asn Cys Arg Cys Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser Arg 65 70 75 80 AGG CGT TGAAACAGCA AAGAAATTAT CTGTATGATT TTTGGATTGA ATAAACGGGA 296 Arg Arg GTAGATATGA 306 【００６５】配列番号：２５ 配列の長さ：８２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Lys His Leu Ile Leu Ala Ser Ala Leu Val Cys Ala Leu Val Val 1 5 10 15 Cys Thr Phe Ala Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu 20 25 30 Arg Ala Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Asn Leu 35 40 45 Pro Cys Cys Asn Glu Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln 50 55 60 Asn Cys Arg Cys Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser Arg 65 70 75 80 Arg Arg 【００６６】配列番号：２６ 配列の長さ：３０２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：３．．２４５ 配列 AG CAT TTG ATC TTA GCA TCC GCC CTT ATC TGT GCA TTG GTC GTT TGC 47 His Leu Ile Leu Ala Ser Ala Leu Ile Cys Ala Leu Val Val Cys 1 5 10 15 ACA TCT GCT GAA GAG CAA GTG AAC GTG CCC TTT CTT CCT GAC GAA AGA 95 Thr Ser Ala Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu Arg 20 25 30 GCA GTA AAA TGT ATC GGG TGG CAG GAA ACA TGC AAC GGC AAC TTG CCC 143 Ala Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Asn Leu Pro 35 40 45 TGC TGC AAT GAG TGC GTC ATG TGC GAA TGC AAC ATT ATG GGT CAA AAC 191 Cys Cys Asn Glu Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn 50 55 60 TGC AGA TGC AAC CAT CCC AAA GCA ACT AAC GAA TGC GAG TCA AGA AGG 239 Cys Arg Cys Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser Arg Arg 65 70 75 CGT TGAAACAGCA AAGAAATTAT CTGTATGATT TTTGGATTGA ATAAACGGGA 292 Arg 80 GTAGATATGA 302 【００６７】配列番号：２７ 配列の長さ：８０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 His Leu Ile Leu Ala Ser Ala Leu Ile Cys Ala Leu Val Val Cys Thr 1 5 10 15 Ser Ala Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu Arg Ala 20 25 30 Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Asn Leu Pro Cys 35 40 45 Cys Asn Glu Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn Cys 50 55 60 Arg Cys Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser Arg Arg Arg 65 70 75 80 【００６８】配列番号：２８ 配列の長さ：３１２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：７．．２５５ 配列 AGAACC ATG AAG CAT TTG ATC TTA GCA TCC GCC CTT ATC TGT GCA TTG 48 Met Lys His Leu Ile Leu Ala Ser Ala Leu Ile Cys Ala Leu 1 5 10 GTC GTT TGC ACA TCT GCT GAA GAG CAA GTG AAC GTG CCC TTT CTT CCT 96 Val Val Cys Thr Ser Ala Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro 15 20 25 30 GAC GAA AGA GCA GTA AAA TGT ATG GGG TGG CAG GAA ACA TGC AAC GGC 144 Asp Glu Arg Ala Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly 35 40 45 AAC TTG CCC TGC TGC AAT GAG TGC GTC ATG TGC GAA TGC AAC ATT ATG 192 Asn Leu Pro Cys Cys Asn Glu Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met 50 55 60 GGT CAA AAC TGC AGA TGC AAC CAT CCC AAA GCA ACT AAC GAA TGC GAG 240 Gly Gln Asn Cys Arg Cys Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu 65 70 75 TCA AGA AGG CGT TGAAACAGCA AAGAAATTAT CTGTATGATT TTTGGATTGA 290 Ser Arg Arg Arg 80 ATAAACGGGA GTAGATATGA 312 【００６９】配列番号：２９ 配列の長さ：８２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Lys His Leu Ile Leu Ala Ser Ala Leu Ile Cys Ala Leu Val Val 1 5 10 15 Cys Thr Ser Ala Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu 20 25 30 Arg Ala Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Asn Leu 35 40 45 Pro Cys Cys Asn Glu Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln 50 55 60 Asn Cys Arg Cys Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser Arg 65 70 75 80 Arg Arg 【００７０】配列番号：３０ 配列の長さ：３０８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：２．．２３５ 配列 C TTA GCA TCC GCC CTT ATC TGT GCA TTG GTC GTT TGC ACA TCT GCT 46 Leu Ala Ser Ala Leu Ile Cys Ala Leu Val Val Cys Thr Ser Ala 1 5 10 15 GAA GAG CAA GTG AAC GTG CCC TTT CTT CCT GAC GAA AGA GCA GTA AAA 94 Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu Arg Ala Val Lys 20 25 30 TGT ATC GGG TGG CAG GAA ACA TGC AAC GGC AAC TTG CCC TGC TGC AAT 142 Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Asn Leu Pro Cys Cys Asn 35 40 45 GAG TGC GTC ATG TGC GAA TGC AAC ATT ATG GGT CAA AAC TGC AGA TGC 190 Glu Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn Cys Arg Cys 50 55 60 AAC CAT CCC AAA GCA ACT AAC GAA TGC GAG TCA AGA AGG CGT TGAAACAGCA 242 Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser Arg Arg Arg 65 70 75 AAGAAATTAT CTGTATGATT TTTGGATTGA ATAAACGGGA GTAGATATGA CTCTGTTCGT 302 CTGTTA 308 【００７１】配列番号：３１ 配列の長さ：７７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Leu Ala Ser Ala Leu Ile Cys Ala Leu Val Val Cys Thr Ser Ala Glu 1 5 10 15 Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu Arg Ala Val Lys Cys 20 25 30 Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Asn Leu Pro Cys Cys Asn Glu 35 40 45 Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn Cys Arg Cys Asn 50 55 60 His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser Arg Arg Arg 65 70 75 【００７２】配列番号：３２ 配列の長さ：３１４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：３．．２４２ 配列 AG CAT TTG ATC TTA GCA TCC GCC CTT ATC TGT GCA TTG GTC GTT TGC 47 His Leu Ile Leu Ala Ser Ala Leu Ile Cys Ala Leu Val Val Cys 1 5 10 15 ACA TTT GCT GAA GAG CAA GTG AAC GTG CCC TTT CTT CCT GAC GAA AGA 95 Thr Phe Ala Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu Arg 20 25 30 GAA GTA AAA TGT ATT GGG TGG CAG GAA TAT TGC CGC GGC AAC TTG CCC 143 Glu Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Tyr Cys Arg Gly Asn Leu Pro 35 40 45 TGC TGC GAT GAC TGC GTC ATG TGC GAA TGC AAC AAT ATG GGG CAA AAC 191 Cys Cys Asp Asp Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Asn Met Gly Gln Asn 50 55 60 TGC AGA TGC AAC CAC CCC AGA ATA ACT TCC GAG TGC GGG TCA AGG CGT 239 Cys Arg Cys Asn His Pro Arg Ile Thr Ser Glu Cys Gly Ser Arg Arg 65 70 75 TGAAACAGCA AAGAAATTAT CTGTATGATT TTTGGATTGA ATAAACTGGA ATAGATATGA 299 CTCTGTTCGT CTGTT 314 【００７３】配列番号：３３ 配列の長さ：７９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 His Leu Ile Leu Ala Ser Ala Leu Ile Cys Ala Leu Val Val Cys Thr 1 5 10 15 Phe Ala Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu Arg Glu 20 25 30 Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Tyr Cys Arg Gly Asn Leu Pro Cys 35 40 45 Cys Asp Asp Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Asn Met Gly Gln Asn Cys 50 55 60 Arg Cys Asn His Pro Arg Ile Thr Ser Glu Cys Gly Ser Arg Arg 65 70 75 【００７４】配列番号：３４ 配列の長さ：２５９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．１８６ 配列 GAA GAG CAA GTG AAC GTG CCC TTT CTT CCT GAC GAA AGA GCA GTA AAA 48 Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu Arg Ala Val Lys 1 5 10 15 TGT ATC GGG TGG CAG GAA ACA TGC AAC GGC CAG CTC CCC TGC TGC GAT 96 Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Gln Leu Pro Cys Cys Asp 20 25 30 GGC TGC GTC ATG TGC GAA TGC AAC ATT ATG GGG CAA AAC TGC AGA TGC 144 Gly Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn Cys Arg Cys 35 40 45 AAC CAC CCC AAA GCA ACT AAC GAA TGC GAG TCA AGG CGT TGAAACAGCA 193 Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser Arg Arg 50 55 60 AAGAAATTAT CTGTATGATT TTTTGGATTG AATAAACGGG AGTAGATATG ACTCTGTTCG 253 TCTGTT 259 【００７５】配列番号：３５ 配列の長さ：６１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu Arg Ala Val Lys 1 5 10 15 Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Gln Leu Pro Cys Cys Asp 20 25 30 Gly Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn Cys Arg Cys 35 40 45 Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser Arg Arg 50 55 60 【００７６】配列番号：３６ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 CAATATATTA ATAGTTAAGA TATCAATTAT TATCAAATC
３９
rimitive Hunting Spider)、プレクトレウリス・トリス
チス(Plectreurystristis)から得られた殺虫毒プレクト
キシン類、その核酸配列およびアミノ酸配列、プレクト
キシン遺伝子を含んでいるベクター、遺伝子を含んでい
るウイルス、およびこれらのプレクトキシン類の昆虫防
除の用途に関するものである。 【０００２】 【従来の技術および発明が解決しようとする課題】近
年、蛛形（シュケイ）動物、特にクモ類およびサソリ類
の毒が、医薬および農業のようなさまざまな分野で使用
される生物学的活性物質の可能性ある供給源として研究
されてきた。そのような研究の例を挙げればヨーロッパ
特許出願公開第２０８５２３Ａ２号、グルタメート・ア
ンタゴニスツ・アイソレーティッド・フロム・ニュー・
ワールド・スパイダーズ・アージオープ・トリファシア
タ・アンド・アラニアス・ジェンマ（Ｇｌｕｔａｍａｔ
ｅ ＡｎｔａｇｏｎｉｓｔｓＩｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏ
ｍ Ｎｅｗ Ｗｏｒｌｄ Ｓｐｉｄｅｒｓ Ａｒｇｉｏ
ｐｅ ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａ ａｎｄ Ａｒａｎｅｏ
ｕｓ ｇｅｍｍａ）、ヨーロッパ特許出願公開第１５６
５４０号、グルタメート・レセプター・インヒビター・
オブテインド・フロム・ネフィラ・クラバータ（Ｇｌｕ
ｔａｍａｔｅ ＲｅｃｅｐｔｏｒＩｎｈｉｂｉｔｏｒ
ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａ
ｖａｔａ）、グリシンら、１９８６年、「イオン・チャ
ネル・ブロッカー・フロム・ザ・ベノム・オブ・アージ
オープ・ロバータ(Ion Channel Blocker from the Veno
m ofArgiope lobata)」、ビオオルガニチェスカイア・
ヒミーア(Bioorg. Khim.)、１２巻（８）、１１２１〜
１１２４頁、アシャーウッドら、１９８４年、「グルタ
メート・チャネル・ブロッケード・バイ・ベノムズ・オ
ブ・アージオープ・トリファシアタ・アンド・アラニア
ス・ジェンマ(Glutamate Channel Blockade by Venoms
of Argiope trifasciata andAraneous gemma)」、ジャ
ーナル・オブ・フィジオロジー（パリ）（J. Physiol.
(Paris)）、７９巻、２４１〜２４５頁、アラマキら、
１９８６年、「グルタメート・ポテンシャル・サプレッ
サー・フロム・ネフィラ・クレイバータ・アンド・ネフ
ィラ・マキュァラータ(GlatamatePotential Suppressor
from Nephila clavata and Nephila maculata)」、プ
ロシーディングズ・オブ・ザ・ジャパン・アカデミー(P
roc. Japan Acad.)、６２巻、シリーズＢ、３５９〜３
６２頁、アシャーウッドら、１９８５年、「アンタゴニ
ズム・オブ・グルタメート・レセプター・チャネル・コ
ンプレックシズ・バイ・スパイダー・ベノム・ポリペプ
タイズ(Antagonism of Glutamate Receptor Channel Co
mplexes by Spider Venom Polypeptides)」、ニューロ
トキシコロジー(Neurotoxicology)、６巻（２）、２３
９〜２５０頁、アダムズら、１９８６年、「シナプティ
ック・トキシンズ・フロム・アジェレノプシス・アプテ
ラ(Synaptic Toxins from Agelenopsis aptera)」、イ
ンセクト・ニューロフィジオロジー(Insect Neurophysi
ology)、ボルコベックら編、ヒューマナ・プレス社(Hum
ana Press)、クリフトン(Clifton)、ＮＪ、３９７〜４
０８頁等がある。しかしこれまで単離された有効主成分
は、通常医薬および農業的な用途に適しない複合ポリペ
プチドであるか、または商業的な対象となるには活性水
準があまりに低すぎた。 【０００３】 【課題を解決するための手段】「原始狩猟グモ」、プレ
クトレウリス・トリスチスの毒から単離したある種のポ
リペプチド、またはプレクトレウリス・トリスチスの毒
から単離したこれらのポリペプチドと実質上の配列相同
性を示すポリペプチドを組立てると、予想外な低濃度
で、昆虫、特に鱗翅目に対して毒性を示し、即ち麻痺お
よび／または致死性であることが判明した。これらのポ
リペプチド類を「プレクトキシン(plectoxin)」と命名
した。したがってこの発明は、昆虫に対して毒性を示
し、付随するクモのポリペプチドを含有しないプレクト
キシン類に関するものである。これらのポリペプチド類
はプレクトレウリス・トリスチスの毒から単離し得、ま
たはプレクトレウリス・トリスチスの毒から単離したポ
リペプチド類と実質上の配列相同性を示し得る。 【０００４】 【図面の説明】図１はバイダック(Vydac)Ｃ18カラム
（５μm、０.４６×１５cm）を使用して、０.１％ＴＦ
Ａ（一定）中、アセトニトリル０−６０％の直線濃度勾
配で６０分間、溶出速度１.５ml／分、ＵＶ（２２０n
m）検出を用いたＬＣによる毒液成分の分析的分離を示
した図である。図２はＬＣ［図１と同一条件、ただしア
クアポア(Aquapore)ＯＤＳカラム（１×２２cm）、溶出
速度４.５ml／分］によって分離した毒液成分、および
ヘリオチス・バレッサンス(Heliothis virescens)の幼
虫における対応する生物検定の結果を示す。実線はＵＶ
吸収を表し、殺幼虫活性のヒストグラム（画分を幼虫へ
注射）を矩形の柱で示す。図３、４、５および６は各種
のプラスミドの組立てを示す。 【０００５】 【定義】本明細書および請求の範囲を通じて、以下の定
義を用いる。付随するクモのポリペプチドとは、プレク
トレウリス・トリスチスの毒に天然に存在する殺虫毒ポ
リペプチド類をいう。相同なポリペプチド類とは、シス
テイン残基数およびその位置がこの発明のＰｌｔの１つ
のと同一で、残りのアミノ酸配列が実質上相同であり、
それによって昆虫毒性を示すポリペプチド類をいう。相
同な核酸配列とは、緊縮ハイブリダイゼーション条件下
で対照配列へハイブリッド形成する配列をいう。緊縮ハ
イブリダイゼーション条件とは、４×緩衝化食塩水（Ｓ
ＳＰＥ緩衝液）中、６５℃の標準的な態様でハイブリダ
イゼーションを実施したのち、生成した真のハイブリッ
ドに影響を与えない０.２×ＳＳＰＥで５２℃で単に洗
浄を行う条件をいう。 【０００６】プレクトレウリス・トリスチスの天然毒の
分析によって、殺虫活性を有する約５０種の異なったポ
リペプチド類の存在を明らかにした。これらをＰｌｔ−
Ｉ〜Ｐｌｔ−Ｌと命名した。優れた活性を示すものをさ
らに特性決定し、そのアミノ酸配列を決定した。したが
ってこの発明の１態様は、付随するクモのポリペプチド
類を含有しておらず、下記のアミノ酸配列（配列番号
１、式Ａ） 【化５】 （式中、ＡＡ1はＡｌａまたはＧｌｕ、ＡＡ2はＶａｌま
たはＬｅｕ、ＡＡ5はＩｌｅまたはＧｌｎ、ＡＡ8はＧｌ
ｎまたはＶａｌ、ＡＡ9はＧｌｕまたはＡｓｐ、ＡＡ10
はＴｈｒまたはＴｙｒ、ＡＡ12はＡｓｎまたはＡｒｇ、
ＡＡ14はＡｓｎまたはＬｙｓ、ＡＡ15はＬｅｕまたはＶ
ａｌ、ＡＡ16はＰｒｏまたはＧｌｕ、ＡＡ 19はＡｓｎま
たはＡｓｐ、ＡＡ20はＧｌｕ、Ｇｌｙ、またはＡｓｐ、
ＡＡ24はＣｙｓまたはＴｙｒである）を含んでいるポリ
ペプチド、または式Ａの配列を含み、さらにＡＡ24の後
に下記の追加的なアミノ酸（配列番号２、式Ｂ） 【化６】 （式中、ＡＡ39はＬｙｓまたはＡｒｇ、ＡＡ40はＡｌ
ａ、Ｍｅｔ、またはＩｌｅ、ＡＡ42はＡｓｎまたはＳｅ
ｒである）を含んでいるポリペプチド、または式Ｂの配
列を含み、さらにＡＡ42の後に追加的なＧｌｕを含んで
いる（式Ｃ）ポリペプチド、または式Ｃの配列を含み、
さらに４３位のＧｌｕの後に下記の追加的なアミノ酸配
列（式Ｄ） −Ｃｙｓ−ＡＡ45 （Ｄ） （ここでＡＡ45はＧｌｕまたはＧｌｙである）を含んで
いるポリペプチド、または式Ｄの配列を含み、さらにＡ
Ａ45の後にＳｅｒを含んでいる（式Ｅ）ポリペプチド、
または下記のアミノ酸配列（配列番号３） 【化７】 を含んでいる式Ｆのポリペプチド、または下記のアミノ
酸配列（配列番号４） 【化８】 を含んでいる式Ｇのポリペプチド、または式Ａ〜Ｇの任
意のポリペプチドと相同であるペプチドを含んでいるポ
リペプチドに関する。好ましいポリペプチドは、式Ｅ'
（ここで、ＡＡ1はＡｌａ、ＡＡ2はＶａｌ、ＡＡ5はＩ
ｌｅ、ＡＡ8はＧｌｎ、ＡＡ9はＧｌｕ、ＡＡ10はＴｈ
ｒ、ＡＡ12はＡｓｎ、ＡＡ14はＡｓｎまたはＬｙｓ、Ａ
Ａ15はＬｅｕ、ＡＡ16はＰｒｏ、ＡＡ19はＡｓｎまたは
Ａｓｐ、ＡＡ20はＧｌｕまたはＧｌｙ、ＡＡ24はＣｙ
ｓ、ＡＡ39はＬｙｓまたはＡｒｇ、ＡＡ40はＡｌａまた
はＭｅｔ、ＡＡ42はＡｓｎまたはＳｅｒ、ＡＡ45はＧｌ
ｕまたはＧｌｙである）のポリペプチドである。上記の
式から判るように、この発明のプレクトキシン類は比較
的小分子である（分子量約５０００ダルトン）。最も強
力なプレクトキシンは１０個のハーフ・システイン残基
を有し、恐らく密に詰まった比較的疎水性のトキシンを
作り出す５カ所の相互連結ジスルフィド結合を有してい
る。少なくとも３種のプレクトキシンのカルボキシル末
端は酸性であるから、これはプレクトキシンの全般的な
特徴であるようである。 【０００７】この発明の好ましいポリペプチド類は、次
のものである。 Ｐｌｔ−VI：これはこの発明の特に好ましいポリペプチ
ドであって、式Ｅ（ここで、ＡＡ1はＡｌａ、ＡＡ2はＶ
ａｌ、ＡＡ5はＩｌｅ、ＡＡ8はＧｌｎ、ＡＡ9はＧｌ
ｕ、ＡＡ10はＴｈｒ、ＡＡ12はＡｓｎ、ＡＡ14はＡｓ
ｎ、ＡＡ15はＬｅｕ、ＡＡ16はＰｒｏ、ＡＡ19はＡｓ
ｎ、ＡＡ20はＧｌｕ、ＡＡ24はＣｙｓ、ＡＡ39はＬｙ
ｓ、ＡＡ40はＡｌａ、ＡＡ42はＡｓｎ、ＡＡ45はＧｌｕ
である）で示されるペプチドであることからなる。 Ｐｌｔ−Ｖ：式Ｅ（ここで、ＡＡ1はＡｌａ、ＡＡ2はＶ
ａｌ、ＡＡ5はＩｌｅ、ＡＡ8はＧｌｎ、ＡＡ9はＧｌ
ｕ、ＡＡ10はＴｈｒ、ＡＡ12はＡｓｎ、ＡＡ14はＡｓ
ｎ、ＡＡ15はＬｅｕ、ＡＡ16はＰｒｏ、ＡＡ19はＡｓ
ｎ、ＡＡ20はＧｌｕ、ＡＡ24はＣｙｓ、ＡＡ39はＬｙ
ｓ、ＡＡ40はＡｌａ、ＡＡ42はＡｓｎ、ＡＡ45はＧｌｕ
である）で示されるペプチドである。Ｐｌｔ−VIおよび
Ｐｌｔ−Ｖは、天然Ｐｌｔ−ＶおよびＰｌｔ−VIの還元
的アルキル化によって、クロマトグラフィー的に分離で
きる誘導体を生産する点で異なっており、理論に結びつ
けようとする意図はないが、Ｃ末端で、ある種の翻訳後
修飾がこれら２つのプレクトキシン間の構造上の相違の
原因となっているようである。 Ｐｌｔ−VIII：式Ｅ（ここで、ＡＡ1はＡｌａ、ＡＡ2は
Ｖａｌ、ＡＡ5はＩｌｅ、ＡＡ8はＧｌｎ、ＡＡ9はＧｌ
ｕ、ＡＡ10はＴｈｒ、ＡＡ12はＡｓｎ、ＡＡ14はＬｙ
ｓ、ＡＡ15はＬｅｕ、ＡＡ16はＰｒｏ、ＡＡ19はＡｓ
ｐ、ＡＡ20はＧｌｙ、ＡＡ24はＣｙｓ、ＡＡ39はＬｙ
ｓ、ＡＡ40はＭｅｔ、ＡＡ42はＳｅｒ、ＡＡ45はＧｌｙ
である）で示されるペプチド。 Ｐｌｔ−XI：式Ｅ（ここで、ＡＡ1はＧｌｕ、ＡＡ2はＶ
ａｌ、ＡＡ5はＩｌｅ、ＡＡ8はＧｌｎ、ＡＡ9はＧｌ
ｕ、ＡＡ10はＴｙｒ、ＡＡ12はＡｒｇ、ＡＡ14はＡｓ
ｎ、ＡＡ15はＬｅｕ、ＡＡ16はＰｒｏ、ＡＡ19はＡｓ
ｐ、ＡＡ20はＡｓｐ、ＡＡ24はＣｙｓ、ＡＡ39はＡｒ
ｇ、ＡＡ40はＩｌｅ、ＡＡ42はＳｅｒ、ＡＡ45はＧｌｙ
である）で示されるペプチド。 Ｐｌｔ−XII：式Ｄ（ここで、ＡＡ1はＡｌａ、ＡＡ2は
Ｖａｌ、ＡＡ5はＩｌｅ、ＡＡ8はＧｌｎ、ＡＡ9はＧｌ
ｕ、ＡＡ10はＴｈｒ、ＡＡ12はＡｓｎ、ＡＡ14はＡｓ
ｎ、ＡＡ15はＬｅｕ、ＡＡ16はＰｒｏ、ＡＡ19はＡｓ
ｎ、ＡＡ20はＧｌｕ、ＡＡ24はＣｙｓ、ＡＡ39はＬｙ
ｓ、ＡＡ40はＡｌａ、ＡＡ42はＡｓｎ、ＡＡ45はＧｌｕ
である）で示されるペプチド。 Ｐｌｔ−XIII：式Ａ（ここで、ＡＡ1はＡｌａ、ＡＡ2は
Ｌｅｕ、ＡＡ5はＧｌｎ、ＡＡ8はＶａｌ、ＡＡ9はＡｓ
ｐ、ＡＡ10はＴｙｒ、ＡＡ12はＡｓｎ、ＡＡ14はＡｓ
ｎ、ＡＡ15はＶａｌ、ＡＡ16はＧｌｕ、ＡＡ19はＡｓ
ｎ、ＡＡ20はＧｌｕ、ＡＡ24はＴｙｒである）で示され
るペプチド。 Ｐｌｔ−XIV：式Ｅ（ここで、ＡＡ1はＡｌａ、ＡＡ2は
Ｖａｌ、ＡＡ5はＩｌｅ、ＡＡ8はＧｌｎ、ＡＡ9はＧｌ
ｕ、ＡＡ10はＴｈｒ、ＡＡ12はＡｓｎ、ＡＡ14はＬｙ
ｓ、ＡＡ15はＬｅｕ、ＡＡ16はＰｒｏ、ＡＡ19はＡｓ
ｐ、ＡＡ20はＧｌｙ、ＡＡ24はＣｙｓ、ＡＡ39はＬｙ
ｓ、ＡＡ40はＡｌａ、ＡＡ42はＳｅｒ、ＡＡ45はＧｌｕ
である）で示されるペプチド。 【０００８】これらのポリペプチドのアミノ酸組成、お
よび正確なアミノ酸配列を決定するため、精製したプレ
クトキシン類を還元し、カルボキシメチル化（［3
Ｈ］ＲＣＭ）した。ついで個々の［3
Ｈ］ＲＣＭポリペプチド画分を、種々の酵素を使用して
タンパク分解的に消化し、生成した断片を通常の手技を
用いる配列分析、アミノ酸組成分析、およびＣＯＯＨ−
末端特性分析に掛けた。ハーフ・システイン残基を含ん
でいる位置は、カルボキシメチル部分の3
Ｈをカウントすることによって確かめた。合成ペプチド
断片とＣ末端断片を比較することによって測定した結果
、Ｐｌｔ−Ｖ、Ｐｌｔ−VI、およびＰｌｔ−ＸのＣ末端
は遊離酸であった。種々のＰｌｔ（天然、ＲＣＭ、およ
びＲＣＡＭ）のアミノ酸組成、および酵素断片の組成は
実施例で説明する。この発明に含まれる種々のポリペプ
チドの配列をまとめて表１に示す。好ましいポリペプチ
ド間の相同性は明白である。 【０００９】 【表１】 【００１０】この発明の好ましいポリペプチドは著しい
相同性、特にシステイン残基数およびその位置の保守に
関して著しい相同性を有している。３次構造の形成にお
けるその役割から考え、殺虫活性を有するこれらのポリ
ペプチド鎖におけるシステインの数および位置は特に重
要であると信じられる。上記のプレクトキシン類は、 何
れも殺虫毒性、即ち麻痺および／または致死性を示し、
これらのプレクトキシン類のポリペプチド配列中の僅か
な置換は、この活性に対して悪影響を及ばさないと信じ
られるので、システイン数およびその位置が同じで、残
りのアミノ酸配列が実質上相同であるポリペプチド配列
は、同様に殺虫毒性を示すことが期待できる。そのよう
な相同なポリペプチドもまたこの発明の範囲に包含され
る。 【００１１】この発明のポリペプチドは種々の手法によ
り作成され得る。例えば実施例に示したような精製手法
を用いて、プレクトレウリス・トリスチスの天然毒から
これらを単離し得る。別法としてこれらのポリペプチド
類のアミノ酸配列の知識に基づき、通常のタンパク質合
成技術を用いる合成的な組立て手法を採用し得る。この
発明のポリペプチドの生産に都合よく用い得る一層進ん
だ技術として、発現すると、この発明のポリペプチドを
暗号化しているＤＮＡ配列を通常の手法によって組み立
てる方法を含む。ついでそのようなＤＮＡ配列を好適な
ベクターへ単独に、または対象となるポリペプチドを暗
号化しているＤＮＡ配列の発現を制御し得、または例え
ば融合タンパク質のように、その機能がプレクトキシン
ＤＮＡ発現生産物の活性を増強し、あるいは拡大する結
果をもたらし得る他の相同または非相同なＤＮＡ配列と
組合わせて挿入し得る。好適に採用し得るベクターは、
そのような目的への用途が通常の当業者の共通知識であ
るプラスミド、ファージ、およびウイルスである。その
ようなプレクトキシンＤＮＡを含んだベクターを発現し
得る細胞としては、例えばエシェリキア・コリ(E. col
i)およびバシラス種(Bacillus spp.)のような原核細
胞、または酵母細胞または昆虫細胞のような真核細胞等
が挙げられる。 【００１２】発現生産物を単離し、精製し、製剤化する
加工処理が必要でない有毒な生産物として、プレクトキ
シン・ポリペプチドを直接的に生産する好ましい方法
は、昆虫に特異的なウイルス（バキュロウイルス(bacul
ovirus)）をベクターとして使用する方法である。所望
のポリペプチド・プレクトキシンを暗号化している遺伝
子をバキュロウイルスＤＮＡへ挿入し、バキュロウイル
スプロモーターの制御下に置く。組換え体ハイブリッド
・バキュロウイルスＤＮＡを昆虫に摂取させたの ち、昆
虫の体内でウイルスを増殖し、昆虫に対する殺虫効果を
促進するのに十分な量でプレクトキシンを発現（生産）
する。またそのような組換え技術によって修飾したバキ
ュロウイルスＤＮＡを、クモのプレクトキシン生産遺伝
子の細胞内導入、特に昆虫細胞への導入のためのベクタ
ーとして使用し、プレクトキシン生産に一層好ましい系
を提供することもできる。多数のバキュロウイルスがベ
クターとして使用するのに好適であり、それらはオート
グラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)、
ヘリオチス・バレッサンス(Heliothis virescence)、お
よびボンビクス・モリ(Bombyx mori)からの核多角体病
ウイルスのように当業界既知である。好適な技術は、例
えばヨーロッパ特許出願第０１７５８５２号および米国
特許第４７４５０５１号に報告されており、説明のため
これらをともに本明細書に包含させた。 【００１３】したがってこの発明のもう１つの特徴は、
式Ａ〜Ｅで示されるポリペプチドを暗号化した核酸を含
んでいる核酸配列（ＲＮＡおよびＤＮＡ）、およびこれ
らと相同な核酸である核酸配列を含む。またこの発明の
核酸配列は、目的のポリペプチド生産物を発現しない配
列、例えばシグナル配列、終結配列等のような配列を包
含する。したがってこの発明のもう１つの特徴は、各種
のプレクトキシン類、特にＰｌｔ−VIのクローニングお
よび遺伝子工学を包含する。 【００１４】２５匹の頭胸部（約１ｇ）から出発し、実
施例３で詳細に報告した方法を用いてポリ（Ａ）＋ｍＲ
ＮＡ約８μgを得た。成熟Ｐｌｔ−VIペプチドの逆トラ
ンスレーションによって得られたヌクレオチド配列の２
つの領域に対応する縮重オリゴヌクレオチド・プライマ
ーを合成し、プレクトレウリス・トリスチスｍＲＮＡか
らＰＣＲ増幅するのに使用した。約１３０bpの大きさと
予測されるＤＮＡ断片をＰＣＲ反応で生産した。ＤＮＡ
断片をゲル精製し、ｐＴＺ１８Ｒへクローニングし、４
種のクローンを配列決定した。これらのクローンの１つ
は成熟Ｐｌｔ−VIプレクトキシンのアミノ酸配列の一部
に一致する読み枠を含んでいた。増幅した配列内からの
領域に一致するように設計した非縮重プライマーを32Ｐ
で末端標 識し、プレクトレウリス・トリスチス頭胸部の
ｍＲＮＡから作成したλＺＡＰIIｃＤＮＡライブラリー
のスクリーニングに使用した。約１×１０6プラークの
ライブラリー・スクリーニングで７３個の陽性プラーク
を検出した。ｐブルースクリプト(pBluescript)ＳＫ−
プラスミドを含んでいるｃＤＮＡをλＺＡＰIIクローン
からプラーク精製し、イン・ビボ切断したのち、９個の
クローンのｃＤＮＡ挿入体のＤＮＡ配列分析を行った。
予想される完全鎖長のｃＤＮＡのサイズを測定するた
め、プライマー伸長反応をプレクトレウリス・トリスチ
ス頭胸部のｍＲＮＡで実施した。２個の主バンドおよび
数個の副バンド（主バンドよりも約２０〜３０塩基大き
い）を検出した。最大ｃＤＮＡクローン、ｐＳＣＩ２６
３の分析の結果、主プライマー伸長生産物のサイズに基
づいて、予想された完全鎖長のｃＤＮＡよりもＮ末端で
数塩基長いことが判明し、それが副バンドによって示さ
れた位置の１つで始まるｍＲＮＡから誘導されたもので
あり得ることが示唆された。８２残基のアミノ酸配列が
推定される２４６ヌクレオチドの長いオープン・リーデ
ィングフレームがｃＤＮＡ配列内で見いだされた。プレ
クトキシンＰｌｔ−VIの成熟形と決定されたアミノ酸配
列はこのオープン・リーディングフレーム内に存在し、
３４位のアミノ酸で始まり、７９位で終わる。恐らくカ
ルボキシペプチダーゼ−Ｂ様の酵素によるプロセッシン
グによって成熟形から除かれる３個のＣ末端アルギニン
がこのあとに続く。最初の２０アミノ酸は共通シグナル
配列に合致する。シグナル配列を切断すると、単一のア
ルギニンで終わる１３個のアミノ酸からなるプロ領域が
遊離され、エンドヌクレアーゼによってプロセッシング
されて成熟ペプチドを遊離したのに相違ないと推測され
る。 【００１５】残り８個のｃＤＮＡクローンは完全鎖長よ
りはるかに短かった。９個のクローンは、すべて３'末
端の近くに推定ポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡ
Ａ）を含んでいた。９個のクローンのうちの６個では、
ポリ（Ａ）＋尾部はポリアデニル化シグナルの開始点か
ら２０ヌクレオチド下流に位置しており、残りの３個の
クローンでは、ポリ（Ａ）＋尾部はさらに追加的な３〜
２１塩基下流に位置している。９個のクローンのうちの
７個は成熟Ｐｌｔ−VI（表１０）（配列番号５）の完 全
鎖長に対応する区画を有する読み枠を含んでいる。これ
らの７個のクローンでは、３個のアルギニン・コドンが
成熟タンパク質のカルボキシ末端のあとに続いている。
表１０で下線で示したＡＴＧは、（ａ）これがほぼ完全
な鎖長のｃＤＮＡに存在する最初のメチオニン・コドン
であり、（ｂ）このメチオニンのコドンが、コザックに
よって測定されたリボソーム開始部位の共通配列［コザ
ック、１９８９年、ジャーナル・オブ・セル・バイオロ
ジー(J. Cell Bio.)、１０８巻、２２９〜２４１頁］と
一致する配列ＡＡＣＧＡＴＧＡに存在し、（ｃ）このメ
チオニン・コドンの２１bp上流で始まるＰｌｔ−VIオー
プン・リーディングフレームを有する枠に翻訳停止配列
（ＴＧＡ）があることから、翻訳開始は、まさしくこの
ＡＴＧで起こると考えられる。即ち、Ｐｌｔ−VIタンパ
ク質は、３３Ｎ−末端アミノ酸および３Ｃ−末端アミノ
酸がプロセッシングされて除かれ、表９に示した成熟形
を生じるプレプロタンパク質として合成されたものと推
定される。Ｎ末端の追加的な３３アミノ酸は、２０位で
アラニンのあとに続き、３３位の単一アルギニン以下で
切断される１３アミノ酸のプロ配列を遊離する切断部位
を伴なう推定シグナル配列［フォン・ハイジン、Ｇ、１
９８６年、ニュークレイック・アシッズ・リサーチ(Nuc
l. Acids Res.)、１４巻、４６８３〜４６９０頁］を含
んでいる。したがって一般にプレクトキシン類、特にＰ
ｌｔ-VIのプレプロタンパク質およびプロタンパク質形
は、これらを暗号化している核酸配列と同様にこの発明
のもう１つの特徴である。クローンｐＳＣＩ２６５はＰ
ｌｔ−XIについて測定した４６アミノ酸配列に対応する
区画を伴う読み枠を有する。クローンｐＳＣＩ２７２
は、ＡＡ47でグルタミンがリシンに変わった以外、Ｐｌ
ｔ−VIIIと同じである区画を伴う読み枠を有する。これ
らのクローンは、Ｐｌｔ−VI ｃＤＮＡで見られた３個
のＣ末端アルギニンと比べて、ともに２個のＣ末端アル
ギニン・コドンだけを有する。 【００１６】多くの異なった昆虫への注射によってＰｌ
ｔ−VIプレクトキシンが誘発する極めて高水準の麻痺活
性から、プレプロＰｌｔ−VIプレクトキシンを暗号化し
ているｃＤＮＡを昆虫バキュロウイルスでクローン化し
得る。昆虫で発現すると、野生型バキュロウイルスで感
染後に起こるより一層急速な摂食停止が見られる。昆虫
バキュロウイルスには、昆虫間のウイルス蔓延に関与す
る閉鎖型ウイルスと、感染した昆虫の体内で細胞から細
胞へのウイルスの蔓延に関与する非閉鎖型、即ち出芽し
たウイルスとの２つの形がある。経口による昆虫の感染
には、普通ウイルスの閉塞型が必要である。したがって
この発明のもう１つの特徴は、閉鎖体の形成が損なわれ
ないような遺伝子座で挿入したこの発明のプレクトキシ
ン、またはプレ・プレクトキシン、またはプレプロ・プ
レクトキシンを暗号化した遺伝子を含んでいる組換え体
ウイルスである。そのような遺伝子座の１つはｐ１０座
である。プレクトレウリス・トリスチスの毒から単離し
たポリペプチド、またはこれと実質上相同性を示すポリ
ペプチドは殺虫剤として有用である。特にこれらは、鱗
翅目の昆虫、例えばヘリオチス・バレッサンス、オート
グラファ・カリフォルニカ、およびヨトウムシ属(genus
Spodoptera)の昆虫に対して有用な殺虫剤である。精製
したプレクトキシン、およびプレクトキシンを生産する
ように形質転換したウイルスをともに、タバコ・ホーン
ウオーム(tobaco hornworm)［マンヅカ・セクスタ(Mand
uca sexta)］、タバコ・バッドウオーム(tobaco budwar
m)（ヘリオチス・バレッサンス）、およびビート・アー
ミーウオーム(beat armyworm)［スポドプテラ・エクシ
グア(Spodoptera exigua)］等の幼虫に対する生物活性
を検定した。毒性は試験幼虫の麻痺および／または死を
生じるポリペプチドの活性により検討した。 【００１７】この発明はまたプレクトレウリス・トリス
チスから単離したポリペプチド類、およびこれと実質上
の配列相同性を示すポリペプチド類の殺虫剤としての用
途を提供する。殺虫剤として使用するには、この発明の
ポリペプチドを生産する組換え体ウイルスを昆虫防除製
剤で標準的に用いられる助剤、希釈剤、変性剤、または
調節剤のような好適な担体物質と調合し得る。製剤は溶
液、乳剤、分散剤、粉末、粉剤、顆粒剤等の形であり得
る。プレクトキシンが昆虫の表皮を直接透過して活性に
影響を与える恐れのある消化酵素を避けるように、ＤＭ
ＳＯのような表面活性剤を製剤へ加えるのが都合よい。
これらの組成物を、昆虫または昆虫の繁殖地域へ標的昆
虫を防除するのに好適な量で都合よく適用する。本明細
書で用いる「防除」の語は、麻痺、致死、または摂食停
止を起こすことを意味する。この発明の組成物の投与量
は、防除すべき害虫、および気象条件等を含む多くの要
素によって変わり得るが、一般に０.５〜１００kg／ヘ
クタール、好ましくは１０〜５０kg／ヘクタールの範囲
である。 【００１８】 【実施例】以下に実施例を挙げてこの発明を詳細に説明
する。実施例は発明を説明するためのものであって、発
明の範囲を制限する目的のものではない。 実施例１ クモの毒の精製 プレクトレウリス・トリスチスの毒はスパイダー・ファ
ーム(Spider Pharm)［ブラックキャニオン・シティー(B
lack Canyon City)、ＡＺ］から入手する。天然毒（１
注入当たり約２００μl）を、下記の条件［パーキン・
エルマー(PerkinElmer)４１０型バイオソルベント液送
システム、５ml注入ループ、ヒューレット・パッカード
(Hewlett Packard)１０４０Ｍ型ダイオード・アレー検
出器（２２０nmおよび２８０nm）、アクアポアーＯＤＳ
カラム（２２×１cm）（ブラウンリー・ラボラトリーズ
(Brownlee Labs)、サンタ・クララ(Santa Clara)、Ｃ
Ａ）、流速４.５ml／分、０.１％トリフルオロ酢酸（一
定）中、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）、０％ＭｅＣＮ
（５分間）、ついでＭｅＣＮ直線濃度勾配０−６０％
（５５分間）］を用いた逆相液体クロマトグラフィー
（ＬＣ）によって分別する。数回の操作から類似の画分
を合わせ、一部ずつを生物検定のために採取する。個々
の画分のアリコート１５μgをウシ血清アルブミン含有
１.５mlのポリプロピレンチューブ中に加え、迅速Ｖａ
ｃ濃縮器（サバント(Savant)）で蒸発乾固する。生理食
塩水（３５μl）を加え、３μlアリコートをヘリオチス
・バレッサンスの幼虫へ注射して生物活性を測定する。
生物活性に基づいて、一定のＵＶ活性ゾーンをさらに逆
相液体クロマトグラフィーによって精製し、生物検定の
ために選び出す。即ち、Ｐｌｔ−Ｖ、Ｐｌｔ−VI、およ
びＰｌｔ−VIIIをバイダック・カラム（０.４６×１５c
m、３００オングストローム、Ｃ4またはＣ18(セパレー
ションズ・グループ(Separations Group)、ヘスペリア
(Hesperia)、ＣＡ）、０.１％ＴＦＡ（一定）中で、Ｍ
ｅＣＮまたは１−プロパノールの何れかの直線濃度勾配
を用いてさらに精製する。Ｐｌｔ−ＶはさらにＣ4カラ
ムで２０％ＭｅＣＮ（５分間）、勾配２０−４５％Ｍｅ
ＣＮ（１.５ml／分、６０分間）、１５％ １−プロパノ
ール（５分間）、勾配２０−４５％ＭｅＣＮ（１.５ml
／分、６０分間）、１５％ １−プロパノール（５分
間）、１５−４０％ １−プロパノール（０.８ml／分、
６０分間）により精製する。Ｐｌｔ−VIはさらにＣ4カ
ラムで、３０％ＭｅＣＮ（５分間）、３０−５０％Ｍｅ
ＣＮ（１.５ml／分、６０分間）、２０％ １−プロパノ
ール（５分間）、２０−４５％ １−プロパノール（０.
８ml／分、６０分間）により精製する。Ｐｌｔ−VIIIは
さらにＣ18カラムで２５％ＭｅＣＮ（５分間）、２５−
５５％ＭｅＣＮ（１.５ml／分、５５分間）により精製
する。その他のプレクトキシン類も同様にして精製す
る。 【００１９】［分析］ 精製したＰｌｔ−Ｖ、Ｐｌｔ−
VI、およびＰｌｔ−VIIIを還元し、以下のようにアルキ
ル化する。プレクトキシン１〜５ナノモルを６Ｍ塩酸グ
アニジン（０.５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.５）３００
μlに溶解する。アルゴン大気下に、ペプチドをジチオ
トレイトール（ＤＴＴ）０.８マイクロモルで３７℃で
４時間還元する。トリチウム化したヨード酢酸または非
放射能標識ヨードアセトアミド２.３マイクロモルの何
れかをこれに添加し、室温で１０分間静置する。さらに
非放射能標識ヨード酢酸（またはヨードアセトアミド）
２.７マイクロモルを追加する。さらに１０分経過後、
ＤＴＴ ４.１マイクロモルを追加し、３７℃で１時間、
繰り返し還元を行う。最後にヨード酢酸またはヨードア
セトアミド１３.５マイクロモルを追加してアルキル化
を完結させる。還元し、カルボキシメチル（ＲＣＭ）化
およびカルボキシアミドメチル（ＲＣＡＭ）化したペプ
チドをバイダックＣ18カラムで、０.１％ＴＦＡ中、Ｍ
ｅＣＭ濃度勾配［２５％ＭｅＣＮ（５分間）、２５−５
５％ＭｅＣＮ（５５分間）］を使用するＬＣにより精製
する。得られた結果を表２に示す。 【００２０】 【表２】 【００２１】誘導体化したペプチド（ＲＣＭおよびＲＣ
ＡＭ）を酵素で切断し、構造の帰属に役立ち得る断片を
生産する。標準的なペプチド１〜２ナノモルのＬＣ溶媒
溶液を１.５mlのポリプロピレンチューブへ加える。１
００〜１５０μlに濃縮したのち、０.１Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ
3（ｐＨ８）３００μlを添加する。試料を約３００μl
に濃縮する。個々の酵素について、それぞれ下記の条件
［トリプシン（０.５μg）、ＲＣＭペプチド、３７℃、
４時間：サーモリシン（０.２５μg）、ＲＣＭペプチ
ド、ＣａＣｌ2中、５mM、３７℃、４時間：エンドペプ
チダーゼＧｌｕ−Ｃ（１μg）、ＲＣＡＭペプチド、Ｅ
ＤＴＡ中、１mM、室温、２０時間］を用いる。試料を１
％ＴＦＡで酸性とし、ついで約２００μlに濃縮したの
ち、バイダックＣ18カラムを使用するＬＣ分析を行う
［０.１％ＴＦＡ（一定）中、ＭｅＣＮ、０％ＭｅＣＮ
（５分間）、ＭｅＣＮ勾配０−６０％（８０分）、０.
５ml／分］。プレクトキシン（天然、ＲＣＭ、およびＲ
ＣＡＭ）、および断片をパルス液相タンパク質シーケン
サー（アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosyst
ems)４７７Ａ型、フェニルチオヒダントイン分析装置１
２０Ａ型とオン・ラインでつなぐ）を使用して配列決定
する。液体シンチレーションカウンター（パッカード４
４３０型）によりアルキル化したハーフ・システイン残
基の3Ｈを定量するため、個々のＰＴＨアミノ酸を採取
する。またペプチドを真空蒸気によって加水分解（６Ｍ
ＨＣｌ／１％フェノール、１１０℃、２０時間）し
て、アミノ酸分析を行う。フェニルチオカルバモイル誘
導体へ変換したのち、ＬＣによりアミノ酸を分析する
（ウルトラスフェアＯＤＳカラム、０.４６×１５cm、
アルテックス(Altex)）。Ｐｌｔ−ＶおよびＰｌｔ−VI
のカルボキシル末端の分析のため、ヘプタペプチド（ア
トネッセス(ATNECES)−ＮＨ2およびアトネッセス−Ｏ
Ｈ、配列番号１１）を合成する。粗製ペプチドを還元
し、カルボキシメチル化し（前記と同様）、ＬＣにより
精製する。ペプチドの配列決定は、Ｐｌｔ−ＶおよびＰ
ｌｔ−VIからの対応するトリプシン分解断片とＬＣによ
り比較したこれらの構造を確認する。その結果を以下の
表３〜６ａに示す。 【００２２】 【表３】 【００２３】 【表４】 【００２４】 【表５】 【００２５】 【表６】 【００２６】 【表７】 【００２７】 【表８】 【００２８】実施例２ 種々のプレクトキシン類の生物活性 毒液から単離した種々のプレクトキシン類を３種の異な
った昆虫の幼虫へ注射する。その結果を下表に示す。Ｌ
Ｄ50は処理した幼虫の５０％を２４時間で致死させる投
与量である。ＥＤ50は幼虫の５０％を１時間で麻痺させ
るのに有効であった量である。★印を付した値は、異な
ったミルキング・ロットからの試料で重複分析した値を
表す。 【００２９】 【表９】 【００３０】実施例３ ｍＲＮＡの単離 生きたプレクトレウリス・トリスチスのクモ（スパイダ
ー・ファーム、ブラックキャニオン・シティー、ＡＺ）
を液体窒素中で手速く凍結し、脚および腹部を頭胸部か
ら離断する。２５匹分の頭胸部（１ｇ）を、ポリトロン
(Polytron)ホモジナイザーでＲＮＡ抽出緩衝液（４Ｍグ
アニジン・イソチオシアナート、５０mMクエン酸ナトリ
ウム(ｐＨ７.０)、０.１Ｍ ２−メルカプトエタノー
ル）２０ml中で１分間ホモジナイズする。ホモジナイズ
したのち、引き続き１０％ザルコシル(Sarkosyl)１mlを
添加する。ホモジネートをソルボール(Sorvall)ＨＢ−
４ローターで４℃、８０００rpmで１０分間遠心し、上
清を清浄な試験管へデカントして、不溶性の破片を除去
する。この操作を２回繰り返し、ついで透明な溶解液
へ、１Ｍ酢酸０.０２５容量（０.５ml）および１００％
エタノール０.７５容量（１５ml）を混合し、これを−
２０℃で１夜貯蔵する。ＨＢ−４ローターを使用して４
℃、１００００rpmで１０分間遠心後、上清を棄て、ペ
レットをファーストトラック(FastTrack)（インビトロ
ジェン社(Invitrogen Corp.)）溶解緩衝液１５mlに再浮
遊する。ついで製造業者（インビトロジェン社）によっ
て提供されたファーストトラックｍＲＮＡ単離キットに
関するプロトコールにしたがい、ポリＡ＋頭胸部ｍＲＮ
Ａ約８μgを単離する。 【００３１】実施例４ ＰＣＲ増幅 実施例３で単離したｍＲＮＡ（０.５μg）から、下記の
配列（配列番号１２） 【化９】 を有する縮重３０量体オリゴヌクレオチドプライマーで
始動させたＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（ギブコ・ベセスダ・
リサーチ・ラボラトリーズ(GIBCO-Bethesda Research L
aboratories)を使用して１本鎖ｃＤＮＡを合成する。こ
のプライマーは最初の１１ヌクレオチドにＮｏｔＩ配列
を含み、そのあとにＰｌｔ−VIプレクトキシン・アミノ
酸配列の逆トランスレーションによって誘導された配列
と相補的な１９ヌクレオチドが続く。ｃＤＮＡ合成のあ
と、反応を９０℃で５分間加熱し、室温に冷却し、エタ
ノール沈殿する。ｃＤＮＡ反応生産物を、前記のプライ
マーおよび下記の配列（配列番号１３） 【化１０】 を有する別の縮重プライマーそれぞれ２μMずつを使用
し、ＰＣＲのジーンＡＭｐ試薬［パーキン・エルマー・
シータス・インスツルメンツ(Perkin-Elmer Cetus Inst
ruments)］により、１００μl反応で増幅する。この第
２のプライマーも最初の１１ヌクレオチドにＮｏｔｌＩ
部位を含み、それに続いてＰｌｔ−VIプレクトキシンの
アミノ酸配列の逆トランスレーション生産物の一部に対
応する配列を含んでいる。ＰＣＲ条件は、９４℃で１分
間、３７℃で２分間、３分間で温度を徐々に７２℃へ上
昇させ、７２℃で３分間、１サイクル当たり７２℃セグ
メントの１０秒間伸長を３０サイクル、ついで７２℃セ
グメントの最終サイクル伸長を１０分間実施する。約１
３０bpの予想サイズを有するＤＮＡ断片が生産される。
これらをゲル精製し、ｐＴＺ１８Ｒ（バイオ・ラド・ラ
ボラトリーズ(BIO-RAD Laboratories)）へクローニング
し、４種のクローンを配列決定する。これらのクローン
のうちの１つは成熟Ｐｌｔ−VIのアミノ酸配列に一致す
る読み枠を含んでいる。 【００３２】 【表１０】 【００３３】実施例５ ｃＤＮＡ合成およびクローニング λファージλＺＡＰIIシステム（ストラタジーン社(Str
atagene Corp)）を、プレクトレウリス・トリスチスの
頭胸部ｍＲＮＡ３.５μgから出発するｃＤＮＡの合成お
よびクローニングに使用する。オリゴヌクレオチド 【化１１】 （配列番号１６）の５'末端を、ポリヌクレオチドキナ
ーゼを使用する32Ｐで末端標識し［サンブルックら、１
９８９年、モレキュラー・クローニング・ア・ラボラト
リー・マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory M
anual)、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー・プレス(Cold Spring HarborLaboratory Pr
ess)、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ］、プラ
ーク・ハイブリダイゼーション（サンブルックら、前
掲）によるプレクトレウリス・トリスチス頭胸部ｃＤＮ
Ａライブラリー・スクリーニングのプローブとして使用
する。約１×１０6プラークのライブラリー・スクリー
ニングで、７３個の陽性プラークを検出する。 【００３４】ＤＮＡ配列決定および配列分析 λＺＡＰIIインストラクション・マニュアルに記載され
ているイン・ビボ操作法を用いて、９個のクローンのｃ
ＤＮＡ挿入体を含んでいる２本鎖ｐブルースクリプトＳ
Ｋ-（ストラタジーン）プラスミドＤＮＡをλＺＡＰII
ｃＤＮＡクローンから作成する。製造業者の指示にした
がい、Ｍ１３およびＭ１３逆プライマーおよびファーマ
シアＬＫＢ(Parmacia LKB)T7ＤＮＡシークエンシング・
キットを使用して、ｃＤＮＡ挿入体を両方向から配列決
定し、これらを表１０−１１に示す。ヌクレオチド配列
および推定されるタンパク質配列をインテリジェネティ
ックス(IntelliGenetics)・コンピュータープログラム
により分析する。 【００３５】 【表１１】 【表１２】 【００３６】 【表１３】 【００３７】プライマー伸長 完全鎖長ｃＤＮＡの予想されるサイズを決定するため、
プライマー伸長反応をプレクトレウリス・トリスチス頭
胸部のｍＲＮＡで実施する。Ｐｌｔ−VI ｍＲＮＡの転
写開始部位を、Ｐｌｔ−VI ｍＲＮＡの一部と相補的で
ある下記の３１量体オリゴヌクレオチド（配列番号１
７） 【化１２】 を使用するプライマー伸長分析によって確かめる。Ｔ４
ポリヌクレオチドキナーゼでオリゴヌクレオチドを５'
−末端標識する（サンブルックら、前掲）。プライマー
・アニーリングおよびプライマー伸長反応は、参考のた
め本明細書に包含させたＧ.Ｗ.ブリッサードおよびＧ.
Ｆ.ローマンの報告［１９８９年、ビロロジー(Virolog
y)、１７０巻、５３７〜５５５頁］にしたがい、ただし
１０mMトリス（ｐＨ８.０）およびプレクトレウリス・
トリスチス頭胸部のｍＲＮＡ２.５μgを含んで伸長反応
を実施する。プライマー伸長反応生産物のサイズは、Ｍ
１３−２０プライマーを使用し、ｐブルースクリプトII
ＳＫ+（ストラタジーン）から生産した配列決定用の連
鎖との比較により決定する。２つの主バンド、および主
バンドより約２０〜３０bp大きい数個の副バンドを検出
する。最長のｃＤＮＡクローンｐＳＣＩ２６３の分析か
ら、これは、主プライマーの伸長反応生産物のサイズに
基づいて推定した完全鎖長のｃＤＮＡより、Ｎ末端で数
塩基長いことが判明し、副バンドによって示される位置
の１つで始まるｍＲＮＡに由来するものであり得ること
が示唆される。残りの８個のｃＤＮＡは完全鎖長よりも
はるかに短かった。９個のクローンは、すべて３'末端
の近くに推定ポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）
［プラウドフットおよびブラウンリー、１９７６年、ネ
ーチャー(Nature)、２６３巻、２１１〜２１４頁］を含
んでいる。９個のクローンのうちの６個では、ポリ（Ａ
＋）尾部はポリアデニルシグナルの開始位置から２０bp
下流に位置し、３個のクローンでは、ポリ（Ａ＋）尾部
はさらに追加的な３〜２１塩基下流に位置している。 【００３８】実施例６ バキュロウイルスの組立て Ｐｌｔ−VI ｃＤＮＡを含む転移ベクターに基づくＡｃ
ＮＰＶｐ１０遺伝子の組立て 参考のため図３、４、５および６を示す。ＥｃｏＲＩお
よびＸｈｏＩで切断することにより、クローンｐＳＣＩ
２６６のｃＤＮＡ挿入体を取り出す。ゲル濾過後、４種
類のすべてのｄＮＴＰの存在で、エシェリキア・コリＤ
ＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片で処理することによ
り、１本鎖ＤＮＡ末端を修復する。完全なｐ１０オープ
ン・リーディングフレームの代わりになるポリリンカー
を有するプラスミドｐＡＣＪＪ２［ジャスト・ファルク
博士(Dr. Just Valk)、デパートメント・オブ・ビロロ
ジー(Dept. of Virology)、アグリカルチュラル・ユニ
バーシティー(Agricultural Univ.)、ウォゲニンゲン(W
ageningen)、オランダから入手］をＢａｍＨＩで切断
し、その末端を修復し、ウシの腸ホスファターゼでホス
ファターゼ処理し、ついでｐＳＣＩ２６６からのｃＤＮ
Ａとライゲーションして、ｐＳＣＩ１８３を作成する。
プラスミドｐＳＣＩ１８４の組立ては、ｃＤＮＡ挿入体
がｐＳＣＩ２７０に由来していることを除いて、上記の
ｐＳＣＩ１８３と類似している。ハイブリッドｐ１０−
キャプシド多面体プロモーターから下流を挿入したクロ
ーンｐＳＣＩ２６６からのｃＤＮＡを含んでいるプラス
ミドｐＳＣＩ１８５は、下記のようにして組立てる。Ｅ
ｃｏＲＶおよびＢｇｌIIで切断することにより、ｐＣａ
ｐｐｏｌｈ［チームおよびミラー、１９９０年、ジーン
(Gene)、９１巻、８７〜９４頁］からハイブリッド−キ
ャプシド多面体プロモーターを含んでいる断片を取り出
す。ＢｇｌII切断した粘着末端を修復し、この断片を、
ＢａｍＨＩで切断し、修復し、ホスファターゼ処理した
ｐＡｃＪＪ２へクローニングし、ｐＳＣＩ１８１を作成
する。ついでｐＳＣＩ１８１をＳｍａＩで切断し、ホス
ファターゼ処理し、前記と同様にこれをｐＳＣＩ２６６
からのｃＤＮＡ断片とライゲーションして、ｐＳＣＩ１
８５を作成する。ハイブリッド−キャプシド多面体プロ
モーターから下流のクローンｐＳＣＩ２６６からのｃＤ
ＮＡを含んだプラスミドｐＳＣＩ１９８は、下記のよう
にして組立てる。ＡｃＮＰＶ断片ＥｃｏＲＩ−Ｐおよび
ＥｃｏＲＩ−ＸをｐＴＺ１８Ｒへ別々にサブクローニン
グして、それぞれｐＳＣＩ２０６およびｐＳＣＩ２５０
を作成する。ｐＳＣＩ２０６をＥｃｏＲＩで部分的に切
断し、その末端をクレノー反応によって修復し、ついで
再ライゲーションしてｐＳＣＩ１７６を作成する。Ｅｃ
ｏＲＩ−Ｘ断片を、ついでｐＳＣＩ２５０からｐＳＣＩ
１７６へクローニングして、ｐＳＣＩ１７７を作成す
る。ついでｐＳＣＩ１７７をＨｉｎｄIIIで部分的に切
断し、その末端をクレノー反応によって修復し、ついで
再ライゲーションして、ｐＳＣＩ１７８を作成する。下
記の配列（配列番号３６） 【化１３】 を有するプライマーを使用するｐＳＣＩ１７７のイン・
ビトロ変異によって、ｐ１０ ＡＴＡＡＧ転写開始部位
の代わりに、ＥｃｏＲＶ部位を導入し、生じたプラスミ
ドをｐＳＣＩ１８６と命名する。ついでｐＳＣＩ１８６
をＥｃｏＲＶおよびＢｇｌIIで切断し、ホスファターゼ
処理し、ついでｐＣａｐＰｏｌｈｃａｔ（チームおよび
ミラー、前掲）からのハイブリッド−キャプシド多面体
プロモーターを含むＥｃｏＲＶ−ＢｇｌII断片へライゲ
ーションして、ｐＳＣＩ１８７を作成する。ｐＳＣＩ１
８７をＢｇｌIIで切断し、その末端を修復し、ホスファ
ターゼ処理し、ついでｐＳＣＩ２６６（上記）からのｃ
ＤＮＡ断片へライゲーションして、ｐＳＣＩ１９８を作
成する。 【００３９】実施例７ 生物検定 遺伝子工学的に組み立てたプレクトキシンを含有するバ
キュロウイルスを、参考のため本明細書に包含させたス
チュアートらの方法（スチュアートら、１９９１年、ネ
ーチャー、３５２巻、８５頁）にしたがって生物検定し
た。簡単に説明すると、ＬＤ50を測定するには、第２虫
令のヘリオチス・バレッサンス幼虫５０匹（約０.６〜
０.７mg）を、微量滴定プレート中で小型の人工固形食
餌により各ウイルス・ストックの５倍希釈液を摂取させ
る。ウイルスの最大投与量は致死が９０％以上生じるよ
うに選び、最小投与量は致死が約１０％生じるように選
ぶ。これらの量は、遺伝子操作を加えないＡｃＮＰＶで
は、幼虫１匹当たり約１２０、６０、３０、１５、およ
び７.５多面体である。投与量を２４時間で消費した幼
虫を人工食餌の個々の容器へ移し、毎日これを測定す
る。死骸を取り出し、スライドへ塗り付け、死因を確か
める。プロビット分析を用いてデータを解析し、ＬＤ50
値を決定する。生存時間（ＳＴ50）を測定するには下記
の方法を用いる。成虫を産卵用の濾紙を加えたケージで
飼育する。卵が載っている濾紙を表面滅菌し、プラスチ
ック容器内に保存する。孵化後、生まれ立ての幼虫を３
〜６時間絶食させたのち、各ウイルス浮遊液（１ml当た
り多面体２×１０6）の小滴を摂取させる。浮遊液を５
％青色食用色素で着色すると、摂取を可視化することが
できる。ウイルスの小滴をペトリ皿に同心円輪状に配置
する。幼虫を輪の中心に置くと、幼虫は小滴を通って移
動し、皿の縁へ這い上る前に少量の液体を摂取する。摂
取後、幼虫を人工食餌を加えた個々の容器で２３℃で維
持する。２４時間後、処置によって死亡した幼虫を取り
出す。その後、間隔をおいて頻回に幼虫をチェックす
る。死亡した幼虫を取り出し、外観および顕微鏡検査に
よって死因を診断する。ＳＴ50計算はビスタット(Vista
t)プログラムによって実施する。プレクトキシン遺伝子
を保有しているウイルスで感染した幼虫は、一層低いＳ
Ｔ50値を示す。 【００４０】 【化１４】 【化１５】 【化１６】 【化１７】 【化１８】 【化１９】 【化２０】 【化２１】 【化２２】 【化２３】 【化２４】 【化２５】 【化２６】 【化２７】 【化２８】 【化２９】 【化３０】 【化３１】 【化３２】 【化３３】 【化３４】 【化３５】 【化３６】 【化３７】 【化３８】 【化３９】 【化４０】 【化４１】 【化４２】 【化４３】 【化４４】 【化４５】 【化４６】 【化４７】 【化４８】 【化４９】 【００４１】 【配列表】 【００４２】配列番号：１ 配列の長さ：２４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ フラグメント型：Ｎ末端 配列の特徴 特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ 存在位置：１．．２４ 他の情報：ｌａｂｅｌ＝ＸＡＡ 注＝“ＡＡ１＝ＡまたはＥ；ＡＡ２＝ＶまたはＬ；ＡＡ
５＝ＩまたはＱ；ＡＡ８＝ＱまたはＶ；ＡＡ９＝Ｅまた
はＤ；ＡＡ１０＝ＴまたはＹ；ＡＡ１２＝ＮまたはＲ；
ＡＡ１４＝ＮまたはＫ；ＡＡ１５＝ＬまたはＶ；ＡＡ１
６＝ＰまたはＥ；ＡＡ１９＝ＮまたはＤ； 配列 Xaa Xaa Lys Cys Xaa Gly Trp Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Gly Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Cys Cys Xaa Xaa Cys Val Met Xaa 20 【００４３】配列番号：２ 配列の長さ：１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ フラグメント型：中間部 配列の特徴 特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ 存在位置：１５．．１８ 他の情報：ｌａｂｅｌ＝ＸＡＡ 注＝“ＡＡ３９＝ＫまたはＲ；ＡＡ４０＝Ａ，Ｍまたは
Ｉ；ＡＡ４２＝ＮまたはＳ” 配列 Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn Cys Arg Cys Asn His Pro Xaa Xaa 1 5 10 15 Thr Xaa 【００４４】配列番号：３ 配列の長さ：４６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 Cys Ala Lys His Ser Glu Thr Cys Lys Asn Gly Asn Cys Cys Thr Cys 1 5 10 15 Thr Gln Tyr Arg Gly Lys Asp Glu Pro Met Ala Cys Arg Arg Gly Thr 20 25 30 His Gly Gln Arg Cys Gln Cys Val Met Lys Ile Met Lys His 35 40 45 【００４５】配列番号：４ 配列の長さ：４９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 Gly Cys Lys Glu Phe Leu Val Lys Cys Asp Ser Asn Ser Glu Cys Cys 1 5 10 15 Lys Thr Ala Ile Val Lys Gly Lys Lys Lys Gln Leu Ser Cys Leu Cys 20 25 30 Gly Ala Trp Gly Ala Gly Cys Ser Cys Ser Phe Arg Cys Gly Asn Arg 35 40 45 Cys 【００４６】配列番号：５ 配列の長さ：４６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 Ala Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Asn Leu Pro 1 5 10 15 Cys Cys Asn Glu Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn 20 25 30 Cys Arg Cys Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser 35 40 45 【００４７】配列番号：６ 配列の長さ：４６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 Ala Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Lys Leu Pro 1 5 10 15 Cys Cys Asp Gly Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn 20 25 30 Cys Arg Cys Asn His Pro Lys Met Thr Ser Glu Cys Gly Ser 35 40 45 【００４８】配列番号：７ 配列の長さ：４６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 Glu Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Tyr Cys Arg Gly Asn Leu Pro 1 5 10 15 Cys Cys Asp Asp Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn 20 25 30 Cys Arg Cys Asn His Pro Arg Ile Thr Ser Glu Cys Gly Ser 35 40 45 【００４９】配列番号：８ 配列の長さ：４５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 Ala Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Asn Leu Pro 1 5 10 15 Cys Cys Asn Glu Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn 20 25 30 Cys Arg Cys Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu 35 40 45 【００５０】配列番号：９ 配列の長さ：２４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 Ala Leu Lys Cys Gln Gly Trp Val Asp Tyr Cys Asn Gly Asn Val Glu 1 5 10 15 Cys Cys Asn Glu Cys Val Met Tyr 20 【００５１】配列番号：１０ 配列の長さ：４６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 Ala Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Lys Leu Pro 1 5 10 15 Cys Cys Asp Gly Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn 20 25 30 Cys Arg Cys Asn His Pro Lys Ala Thr Ser Glu Cys Gly Ser 35 40 45 【００５２】配列番号：１１ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ フラグメント型：中間部 【００５３】配列番号：１２ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 GATGCGGCCG CTCRCAYTCR TTNGTNGCYT TNGG 【００５４】配列番号：１３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 GATGCGGCCG CGTNAARTGU ATHGGNTGGC 【００５５】配列番号：１４ 配列の長さ：１３８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） ハイポセティカル：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 配列 CGNGTNAART GYATHGGNTG GCARGARACN TGYAAYGGNA AYYTNCCNTG YTGYAAYGAR 60 TGYGTNATGT GYGARTGYAA YATHATGGGN CARAAYTGYM GNTGYAAYCA YCCNAARGCN 120 ACNAAYGART GYGARWSN 138 【００５５】配列番号：１５ 配列の長さ：１３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 GTTAAGTGTA TTGGTTGGCA GGAAACATGC AACGGCAACT TGCCCTGCTG CAATGAGTGC 60 GTCATGTGCG AATGCAACAT TATGGGTCAA AACTGCAGAT GCAACCATCC CGAAAGCGAC 120 CAATGAATGT GA 132 【００５６】配列番号：１６ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 GGATGGTTGC ATCTGCAG 18 【００５７】配列番号：１７ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 GTGCAAACGA CCAATGCACA GACAAGGGCG G 【００５８】配列番号：１８ 配列の長さ：３４５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：４０．．２８８ 配列 GTTTTTGTAG TGAAGCACTG AGAAGCCTGT AGCAGAACC ATG AAG CAT TTG ATC 54 Met Lys His Leu Ile 1 5 TTT TCA TCC GCC CTT GTC TGT GCA TTG GTC GTT TGC ACA TTT GCT GAA 102 Phe Ser Ser Ala Leu Val Cys Ala Leu Val Val Cys Thr Phe Ala Glu 10 15 20 GAG CAA GTG AAC GTG CCC TTT CTT CCT GAC GAA AGA GCA GTA AAA TGT 150 Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu Arg Ala Val Lys Cys 25 30 35 ATC GGG TGG CAG GAA ACA TGC AAC GGC AAC TTG CCC TGC TGC AAT GAG 198 Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Asn Leu Pro Cys Cys Asn Glu 40 45 50 TGC GTC ATG TGC GAA TGC AAC ATT ATG GGT CAA AAC TGC AGA TGC AAC 246 Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn Cys Arg Cys Asn 55 60 65 CAT CCC AAA GCA ACT AAC GAA TGC GAG TCA AGA AGG CGT TGAAACAGCA 295 His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser Arg Arg Arg 70 75 80 AAGAAATTAT CTGTATGATT TTTGGATTGA ATAAACGGGA GTAGATATGA 345 【００５９】配列番号：１９ 配列の長さ：８２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Lys His Leu Ile Phe Ser Ser Ala Leu Val Cys Ala Leu Val Val 1 5 10 15 Cys Thr Phe Ala Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu 20 25 30 Arg Ala Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Asn Leu 35 40 45 Pro Cys Cys Asn Glu Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln 50 55 60 Asn Cys Arg Cys Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser Arg 65 70 75 80 Arg Arg 【００６０】配列番号：２０ 配列の長さ：３２６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：６．．２５４ 配列 GAACC ATG AAG CAT TTG ATC TTT TCA TCC GCC CTT GTC TGT GCA TTG 47 Met Lys His Leu Ile Phe Ser Ser Ala Leu Val Cys Ala Leu 1 5 10 GTC GTT TGC ACA TTT GCT GAA GAG CAA GTG AAC GTG CCC TTT CTT CCT 95 Val Val Cys Thr Phe Ala Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro 15 20 25 30 GAC GAA AGA GCA GTA AAA TGT ATC GGG TGG CAG GAA ACA TGC AAC GGC 143 Asp Glu Arg Ala Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly 35 40 45 AAC TTG CCC TGC TGC AAT GAG TGC GTC ATG TGC GAA TGC AAC ATT ATG 191 Asn Leu Pro Cys Cys Asn Glu Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met 50 55 60 GGT CAA AAC TGC AGA TGC AAC CAT CCC AAA GCA ACT AAC GAA TGC GAG 239 Gly Gln Asn Cys Arg Cys Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu 65 70 75 TCA AGA AGG CGT TGAAACAGCA AAGAAATTAT CTGTATGATT TTTGGATTGA 291 Ser Arg Arg Arg 80 ATAAACGGGA GTAGATATGA CTCTGTTCGT CTGTT 326 【００６１】配列番号：２１ 配列の長さ：８２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Lys His Leu Ile Phe Ser Ser Ala Leu Val Cys Ala Leu Val Val 1 5 10 15 Cys Thr Phe Ala Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu 20 25 30 Arg Ala Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Asn Leu 35 40 45 Pro Cys Cys Asn Glu Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln 50 55 60 Asn Cys Arg Cys Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser Arg 65 70 75 80 Arg Arg 【００６２】配列番号：２２ 配列の長さ：３０８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．２４６ 配列 AAG CAT TTG ATC TTT TCA TCC GCC CTT GTC TGT GCA TTG GTC GTT TGC 48 Lys His Leu Ile Phe Ser Ser Ala Leu Val Cys Ala Leu Val Val Cys 1 5 10 15 ACA TTT GCT GAA GAG CAA GTG AAC GTG CCC TTT CTT CCT GAC GAA AGA 96 Thr Phe Ala Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu Arg 20 25 30 GCA GTA AAA TGT ATC GGG TGG CAG GAA ACA TGC AAC GGC AAC TTG CCC 144 Ala Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Asn Leu Pro 35 40 45 TGC TGC AAT GAG TGC GTC ATG TGC GAA TGC AAC ATT ATG GGT CAA AAC 192 Cys Cys Asn Glu Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn 50 55 60 TGC AGA TGC AAC CAT CCC AAA GCA ACT AAC GAA TGC GAG TCA AGA AGG 240 Cys Arg Cys Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser Arg Arg 65 70 75 80 CGT TGAAACAGCA AAGAAATTAT CTGTATGATT TTTGGATTGA ATAAACGGGA 293 Arg GTAGATATGA ATCTG 308 【００６３】配列番号：２３ 配列の長さ：８１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Lys His Leu Ile Phe Ser Ser Ala Leu Val Cys Ala Leu Val Val Cys 1 5 10 15 Thr Phe Ala Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu Arg 20 25 30 Ala Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Asn Leu Pro 35 40 45 Cys Cys Asn Glu Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn 50 55 60 Cys Arg Cys Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser Arg Arg 65 70 75 80 Arg 【００６４】配列番号：２４ 配列の長さ：３０６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．２４９ 配列 ATG AAG CAT TTG ATC TTA GCA TCC GCC CTT GTC TGT GCA TTG GTC GTT 48 Met Lys His Leu Ile Leu Ala Ser Ala Leu Val Cys Ala Leu Val Val 1 5 10 15 TGC ACA TTT GCT GAA GAG CAA GTG AAC GTG CCC TTT CTT CCT GAC GAA 96 Cys Thr Phe Ala Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu 20 25 30 AGA GCA GTA AAA TGT ATC GGG TGG CAG GAA ACA TGC AAC GGC AAC TTG 144 Arg Ala Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Asn Leu 35 40 45 CCC TGC TGC AAT GAG TGC GTC ATG TGC GAA TGC AAC ATT ATG GGT CAA 192 Pro Cys Cys Asn Glu Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln 50 55 60 AAC TGC AGA TGC AAC CAT CCC AAA GCA ACT AAC GAA TGC GAG TCA AGA 240 Asn Cys Arg Cys Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser Arg 65 70 75 80 AGG CGT TGAAACAGCA AAGAAATTAT CTGTATGATT TTTGGATTGA ATAAACGGGA 296 Arg Arg GTAGATATGA 306 【００６５】配列番号：２５ 配列の長さ：８２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Lys His Leu Ile Leu Ala Ser Ala Leu Val Cys Ala Leu Val Val 1 5 10 15 Cys Thr Phe Ala Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu 20 25 30 Arg Ala Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Asn Leu 35 40 45 Pro Cys Cys Asn Glu Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln 50 55 60 Asn Cys Arg Cys Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser Arg 65 70 75 80 Arg Arg 【００６６】配列番号：２６ 配列の長さ：３０２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：３．．２４５ 配列 AG CAT TTG ATC TTA GCA TCC GCC CTT ATC TGT GCA TTG GTC GTT TGC 47 His Leu Ile Leu Ala Ser Ala Leu Ile Cys Ala Leu Val Val Cys 1 5 10 15 ACA TCT GCT GAA GAG CAA GTG AAC GTG CCC TTT CTT CCT GAC GAA AGA 95 Thr Ser Ala Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu Arg 20 25 30 GCA GTA AAA TGT ATC GGG TGG CAG GAA ACA TGC AAC GGC AAC TTG CCC 143 Ala Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Asn Leu Pro 35 40 45 TGC TGC AAT GAG TGC GTC ATG TGC GAA TGC AAC ATT ATG GGT CAA AAC 191 Cys Cys Asn Glu Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn 50 55 60 TGC AGA TGC AAC CAT CCC AAA GCA ACT AAC GAA TGC GAG TCA AGA AGG 239 Cys Arg Cys Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser Arg Arg 65 70 75 CGT TGAAACAGCA AAGAAATTAT CTGTATGATT TTTGGATTGA ATAAACGGGA 292 Arg 80 GTAGATATGA 302 【００６７】配列番号：２７ 配列の長さ：８０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 His Leu Ile Leu Ala Ser Ala Leu Ile Cys Ala Leu Val Val Cys Thr 1 5 10 15 Ser Ala Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu Arg Ala 20 25 30 Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Asn Leu Pro Cys 35 40 45 Cys Asn Glu Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn Cys 50 55 60 Arg Cys Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser Arg Arg Arg 65 70 75 80 【００６８】配列番号：２８ 配列の長さ：３１２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：７．．２５５ 配列 AGAACC ATG AAG CAT TTG ATC TTA GCA TCC GCC CTT ATC TGT GCA TTG 48 Met Lys His Leu Ile Leu Ala Ser Ala Leu Ile Cys Ala Leu 1 5 10 GTC GTT TGC ACA TCT GCT GAA GAG CAA GTG AAC GTG CCC TTT CTT CCT 96 Val Val Cys Thr Ser Ala Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro 15 20 25 30 GAC GAA AGA GCA GTA AAA TGT ATG GGG TGG CAG GAA ACA TGC AAC GGC 144 Asp Glu Arg Ala Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly 35 40 45 AAC TTG CCC TGC TGC AAT GAG TGC GTC ATG TGC GAA TGC AAC ATT ATG 192 Asn Leu Pro Cys Cys Asn Glu Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met 50 55 60 GGT CAA AAC TGC AGA TGC AAC CAT CCC AAA GCA ACT AAC GAA TGC GAG 240 Gly Gln Asn Cys Arg Cys Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu 65 70 75 TCA AGA AGG CGT TGAAACAGCA AAGAAATTAT CTGTATGATT TTTGGATTGA 290 Ser Arg Arg Arg 80 ATAAACGGGA GTAGATATGA 312 【００６９】配列番号：２９ 配列の長さ：８２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Lys His Leu Ile Leu Ala Ser Ala Leu Ile Cys Ala Leu Val Val 1 5 10 15 Cys Thr Ser Ala Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu 20 25 30 Arg Ala Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Asn Leu 35 40 45 Pro Cys Cys Asn Glu Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln 50 55 60 Asn Cys Arg Cys Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser Arg 65 70 75 80 Arg Arg 【００７０】配列番号：３０ 配列の長さ：３０８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：２．．２３５ 配列 C TTA GCA TCC GCC CTT ATC TGT GCA TTG GTC GTT TGC ACA TCT GCT 46 Leu Ala Ser Ala Leu Ile Cys Ala Leu Val Val Cys Thr Ser Ala 1 5 10 15 GAA GAG CAA GTG AAC GTG CCC TTT CTT CCT GAC GAA AGA GCA GTA AAA 94 Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu Arg Ala Val Lys 20 25 30 TGT ATC GGG TGG CAG GAA ACA TGC AAC GGC AAC TTG CCC TGC TGC AAT 142 Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Asn Leu Pro Cys Cys Asn 35 40 45 GAG TGC GTC ATG TGC GAA TGC AAC ATT ATG GGT CAA AAC TGC AGA TGC 190 Glu Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn Cys Arg Cys 50 55 60 AAC CAT CCC AAA GCA ACT AAC GAA TGC GAG TCA AGA AGG CGT TGAAACAGCA 242 Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser Arg Arg Arg 65 70 75 AAGAAATTAT CTGTATGATT TTTGGATTGA ATAAACGGGA GTAGATATGA CTCTGTTCGT 302 CTGTTA 308 【００７１】配列番号：３１ 配列の長さ：７７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Leu Ala Ser Ala Leu Ile Cys Ala Leu Val Val Cys Thr Ser Ala Glu 1 5 10 15 Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu Arg Ala Val Lys Cys 20 25 30 Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Asn Leu Pro Cys Cys Asn Glu 35 40 45 Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn Cys Arg Cys Asn 50 55 60 His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser Arg Arg Arg 65 70 75 【００７２】配列番号：３２ 配列の長さ：３１４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：３．．２４２ 配列 AG CAT TTG ATC TTA GCA TCC GCC CTT ATC TGT GCA TTG GTC GTT TGC 47 His Leu Ile Leu Ala Ser Ala Leu Ile Cys Ala Leu Val Val Cys 1 5 10 15 ACA TTT GCT GAA GAG CAA GTG AAC GTG CCC TTT CTT CCT GAC GAA AGA 95 Thr Phe Ala Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu Arg 20 25 30 GAA GTA AAA TGT ATT GGG TGG CAG GAA TAT TGC CGC GGC AAC TTG CCC 143 Glu Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Tyr Cys Arg Gly Asn Leu Pro 35 40 45 TGC TGC GAT GAC TGC GTC ATG TGC GAA TGC AAC AAT ATG GGG CAA AAC 191 Cys Cys Asp Asp Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Asn Met Gly Gln Asn 50 55 60 TGC AGA TGC AAC CAC CCC AGA ATA ACT TCC GAG TGC GGG TCA AGG CGT 239 Cys Arg Cys Asn His Pro Arg Ile Thr Ser Glu Cys Gly Ser Arg Arg 65 70 75 TGAAACAGCA AAGAAATTAT CTGTATGATT TTTGGATTGA ATAAACTGGA ATAGATATGA 299 CTCTGTTCGT CTGTT 314 【００７３】配列番号：３３ 配列の長さ：７９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 His Leu Ile Leu Ala Ser Ala Leu Ile Cys Ala Leu Val Val Cys Thr 1 5 10 15 Phe Ala Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu Arg Glu 20 25 30 Val Lys Cys Ile Gly Trp Gln Glu Tyr Cys Arg Gly Asn Leu Pro Cys 35 40 45 Cys Asp Asp Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Asn Met Gly Gln Asn Cys 50 55 60 Arg Cys Asn His Pro Arg Ile Thr Ser Glu Cys Gly Ser Arg Arg 65 70 75 【００７４】配列番号：３４ 配列の長さ：２５９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．１８６ 配列 GAA GAG CAA GTG AAC GTG CCC TTT CTT CCT GAC GAA AGA GCA GTA AAA 48 Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu Arg Ala Val Lys 1 5 10 15 TGT ATC GGG TGG CAG GAA ACA TGC AAC GGC CAG CTC CCC TGC TGC GAT 96 Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Gln Leu Pro Cys Cys Asp 20 25 30 GGC TGC GTC ATG TGC GAA TGC AAC ATT ATG GGG CAA AAC TGC AGA TGC 144 Gly Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn Cys Arg Cys 35 40 45 AAC CAC CCC AAA GCA ACT AAC GAA TGC GAG TCA AGG CGT TGAAACAGCA 193 Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser Arg Arg 50 55 60 AAGAAATTAT CTGTATGATT TTTTGGATTG AATAAACGGG AGTAGATATG ACTCTGTTCG 253 TCTGTT 259 【００７５】配列番号：３５ 配列の長さ：６１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Glu Glu Gln Val Asn Val Pro Phe Leu Pro Asp Glu Arg Ala Val Lys 1 5 10 15 Cys Ile Gly Trp Gln Glu Thr Cys Asn Gly Gln Leu Pro Cys Cys Asp 20 25 30 Gly Cys Val Met Cys Glu Cys Asn Ile Met Gly Gln Asn Cys Arg Cys 35 40 45 Asn His Pro Lys Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ser Arg Arg 50 55 60 【００７６】配列番号：３６ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 CAATATATTA ATAGTTAAGA TATCAATTAT TATCAAATC
３９
【図１】 毒液成分の液体クロマトグラフィーによる分
離曲線を示すグラフである。
離曲線を示すグラフである。
【図２】 分離した毒液画分の殺幼虫活性の生物検定結
果を示すグラフである。
果を示すグラフである。
【図３】 プラスミドの組立てを示す説明図である。
【図４】 プラスミドの組立てを示す説明図である。
【図５】 プラスミドの組立てを示す説明図である。
【図６】 プラスミドの組立てを示す説明図である。
（但し図６は図５の続きである。）
（但し図６は図５の続きである。）
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/12 // Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 ゲイリー・ベネット・クイスタッド アメリカ合衆国94040カリフォルニア州マ ウンテン・ビュー、ラセイル・ドライブ 2645番 (72)発明者 ウェイン・スティーブン・スキナー アメリカ合衆国94025カリフォルニア州ポ ートラ・バリー、ミードウッド・ドライブ 165番
Claims (16)
- 【請求項１】 付随するクモのポリペプチド類を含有し
ておらず、下記のアミノ酸配列（配列番号１、式Ａ） 【化１】 （式中、ＡＡ1はＡｌａまたはＧｌｕ、ＡＡ2はＶａｌま
たはＬｅｕ、ＡＡ5はＩｌｅまたはＧｌｎ、ＡＡ8はＧｌ
ｎまたはＶａｌ、ＡＡ9はＧｌｕまたはＡｓｐ、ＡＡ10
はＴｈｒまたはＴｙｒ、ＡＡ12はＡｓｎまたはＡｒｇ、
ＡＡ14はＡｓｎまたはＬｙｓ、ＡＡ15はＬｅｕまたはＶ
ａｌ、ＡＡ16はＰｒｏまたはＧｌｕ、ＡＡ19はＡｓｎま
たはＡｓｐ、ＡＡ20はＧｌｕ、Ｇｌｙ、またはＡｓｐ、
ＡＡ24はＣｙｓまたはＴｙｒである）を含んでいるポリ
ペプチド、または式Ａの配列を含み、さらにＡＡ24の後
に下記の追加的なアミノ酸（配列番号２、式Ｂ） 【化２】 （式中、ＡＡ39はＬｙｓまたはＡｒｇ、ＡＡ40はＡｌ
ａ、Ｍｅｔ、またはＩｌｅ、ＡＡ42はＡｓｎまたはＳｅ
ｒである）を含んでいるポリペプチド、または式Ｂの配
列を含み、さらにＡＡ42の後に追加的なＧｌｕを含んで
いる（式Ｃ）ポリペプチド、または式Ｃの配列を含み、
さらに４３位のＧｌｕの後に下記の追加的なアミノ酸配
列（式Ｄ） −Ｃｙｓ−ＡＡ45 （Ｄ） （ここでＡＡ45はＧｌｕまたはＧｌｙである）を含んで
いるポリペプチド、または式Ｄの配列を含み、さらにＡ
Ａ45の後にＳｅｒを含んでいる（式Ｅ）ポリペプチド、
または下記のアミノ酸配列（配列番号３） 【化３】 を含んでいる式Ｆのポリペプチド、または下記のアミノ
酸配列（配列番号４） 【化４】 を含んでいる式Ｇのポリペプチド、または式Ａ〜Ｇの任
意のポリペプチドと相同であるペプチドを含んでいるポ
リペプチド。 - 【請求項２】 式Ｅ（式中、ＡＡ1はＡｌａ、ＡＡ2はＶ
ａｌ、ＡＡ5はＩｌｅ、ＡＡ8はＧｌｎ、ＡＡ9はＧｌ
ｕ、ＡＡ10はＴｈｒ、ＡＡ12はＡｓｎ、ＡＡ14はＡｓｎ
またはＬｙｓ、ＡＡ15はＬｅｕ、ＡＡ16はＰｒｏ、ＡＡ
19はＡｓｎまたはＡｓｐ、ＡＡ20はＧｌｕまたはＧｌ
ｙ、ＡＡ24はＣｙｓ、ＡＡ39はＬｙｓ、ＡＡ40はＡｌａ
またはＭｅｔ、ＡＡ42はＡｓｎまたはＳｅｒ、ＡＡ45は
ＧｌｕまたはＧｌｙである）で示される請求項１に記載
のポリペプチド。 - 【請求項３】 ＡＡ1はＡｌａ、ＡＡ2はＶａｌ、ＡＡ5
はＩｌｅ、ＡＡ8はＧｌｎ、ＡＡ9はＧｌｕ、ＡＡ10はＴ
ｈｒ、ＡＡ12はＡｓｎ、ＡＡ14はＡｓｎ、ＡＡ15はＬｅ
ｕ、ＡＡ16はＰｒｏ、ＡＡ19はＡｓｎ、ＡＡ20はＧｌ
ｕ、ＡＡ24はＣｙｓ、ＡＡ39はＬｙｓ、ＡＡ40はＡｌ
ａ、ＡＡ42はＡｓｎ、ＡＡ45はＧｌｕである請求項２に
記載のポリペプチド。 - 【請求項４】 Ｐｌｔ−VIである請求項３に記載のポリ
ペプチド。 - 【請求項５】 Ｐｌｔ−Ｖである請求項３に記載のポリ
ペプチド。 - 【請求項６】 式Ｅ（式中、ＡＡ1はＡｌａ、ＡＡ2はＶ
ａｌ、ＡＡ5はＩｌｅ、ＡＡ8はＧｌｎ、ＡＡ9はＧｌ
ｕ、ＡＡ10はＴｈｒ、ＡＡ12はＡｓｎ、ＡＡ14はＬｙ
ｓ、ＡＡ15はＬｅｕ、ＡＡ16はＰｒｏ、ＡＡ19はＡｓ
p、ＡＡ20はＧｌｙ、ＡＡ24はＣｙｓ、ＡＡ39はＬｙ
ｓ、ＡＡ40はＭｅｔ、ＡＡ42はＳｅｒ、ＡＡ45はＧｌｙ
である）で示される請求項１に記載のポリペプチド。 - 【請求項７】 式Ｅ（式中、ＡＡ1はＧｌｕ、ＡＡ2はＶ
ａｌ、ＡＡ5はＩｌｅ、ＡＡ8はＧｌｎ、ＡＡ9はＧｌ
ｕ、ＡＡ10はＴｙｒ、ＡＡ12はＡｒｇ、ＡＡ14はＡｓ
ｎ、ＡＡ15はＬｅｕ、ＡＡ16はＰｒｏ、ＡＡ19はＡｓ
ｐ、ＡＡ20はＡｓｐ、ＡＡ24はＣｙｓ、ＡＡ39はＡｒ
ｇ、ＡＡ40はＩｌｅ、ＡＡ42はＳｅｒ、ＡＡ45はＧｌｙ
である）で示される請求項１に記載のポリペプチド。 - 【請求項８】 式Ｄ（式中、ＡＡ1はＡｌａ、ＡＡ2はＶ
ａｌ、ＡＡ5はＩｌｅ、ＡＡ8はＧｌｎ、ＡＡ9はＧｌ
ｕ、ＡＡ10はＴｈｒ、ＡＡ12はＡｓｎ、ＡＡ14はＡｓ
ｎ、ＡＡ15はＬｅｕ、ＡＡ16はＰｒｏ、ＡＡ19はＡｓ
ｎ、ＡＡ20はＧｌｕ、ＡＡ24はＣｙｓ、ＡＡ39はＬｙ
ｓ、ＡＡ40はＡｌａ、ＡＡ42はＡｓｎ、ＡＡ45はＧｌｕ
である）で示される請求項１に記載のポリペプチド。 - 【請求項９】 式Ａ（式中、ＡＡ1はＡｌａ、ＡＡ2はＬ
ｅｕ、ＡＡ5はＧｌｎ、ＡＡ8はＶａｌ、ＡＡ9はＡｓ
ｐ、ＡＡ10はＴｙｒ、ＡＡ12はＡｓｎ、ＡＡ14はＡｓ
ｎ、ＡＡ15はＶａｌ、ＡＡ16はＧｌｕ、ＡＡ19はＡｓ
ｎ、ＡＡ20はＧｌｕ、ＡＡ24はＴｙｒである）で示され
る請求項１に記載のポリペプチド。 - 【請求項１０】 式Ｅ（式中、ＡＡ1はＡｌａ、ＡＡ2は
Ｖａｌ、ＡＡ5はＩｌｅ、ＡＡ8はＧｌｎ、ＡＡ9はＧｌ
ｕ、ＡＡ10はＴｈｒ、ＡＡ12はＡｓｎ、ＡＡ14はＬｙ
ｓ、ＡＡ15はＬｅｕ、ＡＡ16はＰｒｏ、ＡＡ19はＡｓ
ｐ、ＡＡ20はＧｌｙ、ＡＡ24はＣｙｓ、ＡＡ39はＬｙ
ｓ、ＡＡ40はＡｌａ、ＡＡ42はＳｅｒ、ＡＡ45はＧｌｕ
である）で示される請求項１に記載のポリペプチド。 - 【請求項１１】 請求項１に記載のポリペプチドを暗号
化しているヌクレオチドを含んでいる核酸配列、または
これと相同である核酸配列。 - 【請求項１２】 ＤＮＡである請求項１１に記載の核酸
配列。 - 【請求項１３】 請求項１に記載のポリペプチドを暗号
化しているＤＮＡ配列へ機能可能に結合させたバキュロ
ウイルスプロモーターを含む遺伝子組立て物を含んでい
る組換え体バキュロウイルス。 - 【請求項１４】 バキュロウイルスプロモーターがｐ１
０プロモーターである請求項１３に記載のバキュロウイ
ルス。 - 【請求項１５】 ポリペプチドがＰｌｔ−VIである請求
項１４に記載のバキュロウイルス。 - 【請求項１６】 昆虫を組換え体ウイルスで感染させ、
そのウイルスが請求項１に記載のポリペプチドを暗号化
しているＤＮＡ配列へ機能可能に結合させたバキュロウ
イルスプロモーターを含む遺伝子組立て物を含んでいる
ことからなる昆虫の抑制方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US83719492A | 1992-02-11 | 1992-02-11 | |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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|---|---|
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| JP (1) | JPH05310791A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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-
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- 1995-04-25 US US08/428,596 patent/US6265376B1/en not_active Expired - Fee Related
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|---|---|
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| EP0556160A2 (en) | 1993-08-18 |
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