JPH05301895A - ハイブリッド抗原タンパク質、それを発現する組み換えウイルス、及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ワクチンや診断薬として有用なウイルスの構
成タンパク質と病原ウイルスの小型ペプチドエピトープ
とを有するハイブリッド抗原タンパク質を開発する。 【構成】 ウイルスの構成タンパク質遺伝子と病原ウイ
ルスの小型ペプチドエピトープ遺伝子とを有する組み換
えウイルスを作製し、培養細胞内でこの組み換えウイル
スを発現させることにより、ウイルスの構成タンパク質
と病原ウイルスの小型ペプチドエピトープとを有するハ
イブリッド抗原タンパク質を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ウイルスの構造タンパ
ク質と構成アミノ酸が３００以下である病原ウイルスの
ペプチドエピトープとを有するハイブリッド抗原タンパ
ク質、それを発現する組み換えウイルス、それを用いた
ハイブリッド抗原タンパク質の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、種々の病原ウイルス、細菌、原虫
などの抗原タンパク質において、感染防御に重要な部分
のペプチドエピトープが見いだされており、ワクチンと
して利用することが試みられている（Ｒ．Ａｒｎｏｎ
ａｎｄ Ｍ．Ｓｈａｐｉｒａ，Ｍｏｄｅｒｎ Ａｐｐｒ
ｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ
Ｖｉｒｕｓ ａｎｄＩｍｍｕｎｏｇｅｎｅｃｉｔｙ
（Ｒ．Ｍ．Ｃｈｅｎｏｃｋ ｅｔ．ａｌ．ｅｄｓ．）
ｐ．１０９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
（１９８４））。しかしながら、これらの比較的短鎖の
ペプチドワクチンは一般的に抗原性が低いため、キーホ
ールリンペットヘモシアニンなどと結合させた上に、ア
ジュバントと組み合わせて使用するものであり、アジュ
バントによる炎症などの副作用が起こるという欠点があ
った。

【０００３】一方、組み換えウイルスによる生ワクチン
は安全性も高く、優れた抗原性を示すことが報告されて
いる（特開昭６４−７４９８２号公報など）。そこで、
組み換えウイルスにより合成ペプチドワクチンに相当す
るペプチドエピトープを効率よく発現させることができ
れば、上記ペプチドワクチンの抗原性が低いという欠点
が改善できると考えられる。

【０００４】しかし、本発明者らの実験によると小型の
ペプチドエピトープを組み換えウイルスを用いて発現す
るために、従来通りの大型の抗原タンパク質を発現する
方法（特開昭６４−７４９８２公報など）をそのまま用
いても、小型ペプチドの細胞内での安定性などに問題が
あり、充分な発現量を得ることはできなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】そこで本発明者らは、
かかる従来技術の下で、比較的短鎖のペプチドエピトー
プを発現させるべく鋭意検討を進めた結果、ウイルスの
構造タンパク質をコードする遺伝子と病原ウイルスのペ
プチドエピトープをコードする遺伝子とを組み込んだ組
み換えウイルスを用いると、効率よくウイルスの構造タ
ンパク質と小型エピトープとを有するハイブリッド抗原
タンパク質が得られることを見いだし、本発明を完成す
るに至った。

【０００６】

【課題を解決するための手段】かくして本発明によれ
ば、第１の発明として、ウイルスの構造タンパク質（以
下、構造タンパク質という）と構成アミノ酸が３００以
下、好ましくは、構成アミノ酸が１０〜１５０、より好
ましくは１５〜１００、さらに好ましくは２０〜５０で
ある病原ウイルスのペプチドエピトープ（以下、小型エ
ピトープという）とを有するハイブリッド抗原タンパク
質（以下、ハイブリッドタンパク質という）が提供され
る。

【０００７】また、第２の発明としてそのハイブリッド
タンパク質を発現するウイルスの構造タンパク質をコー
ドする遺伝子（以下、構造タンパク質遺伝子という）と
構成アミノ酸が３００以下である病原ウイルスのペプチ
ドエピトープをコードする遺伝子（以下、小型エピトー
プ遺伝子という）とをウイルスの増殖に非必須な領域に
組み込んだ組み換えウイルスが提供される。さらに、第
３の発明として、この組み換えウイルスを用いたハイブ
リッドタンパク質の製造方法が提供される。

【０００８】本発明において組み換えウイルスの作製に
供されるウイルス（以下、宿主ウイルスという）は、一
般の遺伝子組み換え技術に使用されるウイルスを使用す
ればよく、例えば、ワクチニアウイルス、バキュロウイ
ルス、アビポックスウイルスなどが挙げられる。ペプチ
ドエピトープの由来となった病原ウイルスが感染する動
物と同じ種に感染するウイルスを使用することが好まし
く、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（以下、ＨＩＶとい
う）由来のペプチドエピトープを組み込むのであれば、
ヒトに感染するワクチニアウイルスを使用すればよい。

【０００９】ワクチニアウイルスの例としては、ＷＲ株
（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、４９、８５７、（１９８４））、
リスター株、温度感受性リスター株（特開昭６２−４４
１７８号）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈ
ｅａｌｔｈ株、ＬＣ１６ｍ８株などの種痘ワクチン株が
例示され、バキュロウイルスの例としては、オートグラ
ファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉｃａ）、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈ
ｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）、ラキブルシア・オウ（Ｒａｃ
ｈｉｐｌｕｓｉａ ｏｕ）、ガレリア・メロネラ（Ｇａ
ｌｌｅｒｉａｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）、ボンビックス・
モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）などが挙げられ、アビ
ポックスウイルスの例としては、ＡＴＣＣ ＶＲ−２５
１、ＡＴＣＣ ＶＲ−２５０、ＡＴＣＣ ＶＲ−２２
９、ＡＴＣＣ ＶＲ−２４９、ＡＴＣＣ ＶＲ−２２
８、西ヶ原株、ＮＰ株（鶏胎化鳩痘毒中野系株）などが
挙げられる。

【００１０】本発明において使用される構造タンパク質
遺伝子は、ウイルスの構造タンパク質として機能するも
のであれば特に限定されないが、例えば、ワクチニアウ
イルス主要外膜抗原ｐ３７（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、３９、
９０３（１９８１））、ワクチニアウイルスヘマグルチ
ニン（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１５０、４５１（１９８
６））、ワクチニアウイルスＡｇ３５抗原（Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．、１８１、６７１（１９９１））などが挙げられ
る。また、これらのタンパク質遺伝子は、構造タンパク
質として機能するものを発現する限りにおいて修飾され
たもの（アミノ酸の欠損、増加、変更を含む）であって
もよい。

【００１１】このようなタンパク質遺伝子のうち、免疫
原性の点から考えると、ウイルスの外膜タンパク質が好
ましく、ウイルスの外膜タンパク質であって感染細胞の
表面に発現するものがより好ましい。このような遺伝子
の具体例としては、ワクチニアウイルス主要外膜タンパ
ク質ｐ３７（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、５８、７５７（１９８
６））、ワクチニアウイルスヘマグルチニンなどが挙げ
られる。また、組み込むウイルスと同じ属に属するウイ
ルスの構造タンパク質を使用する方が好ましい。

【００１２】組み込む構造タンパク質遺伝子の大きさ
は、構造タンパク質の由来となるウイルスが組み込むウ
イルス（以下、宿主ウイルスという）と同じ種のウイル
スであるならば、宿主ウイルスの増殖に影響はないので
特に限定されないが、宿主ウイルスと異種のウイルス由
来の構造タンパク質遺伝子を使用する場合、宿主ウイル
スが増殖できる程度の大きさでなければならず、余り大
きな遺伝子を組み込むことはできない。このような場合
の遺伝子の大きさは、通常、１０，０００塩基以下、好
ましくは２，０００塩基以下である。

【００１３】本発明において使用される小型エピトープ
をコードする遺伝子は、病原ウイルスのエピトープであ
って構成アミノ酸が３００以下、好ましくは１０〜１５
０、より好ましくは１５〜１００、さらに好ましくは２
０〜５０であるものをコードする遺伝子であり、例え
ば、ＨＩＶのＨＧＰ３０をコードする遺伝子（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、２９
５１−２９５５（１９８８））や、ＨＩＶのＶ３をコー
ドする遺伝子（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、８５、１９３２（１９８８））などが挙げ
られる。

【００１４】また、これらのタンパク質遺伝子は、小型
エピトープとして機能するものを発現する限りにおいて
修飾されたもの（アミノ酸の欠損、増加、変更を含む）
であってもよく、さらに天然のウイルスから得られたも
のであっても、ウイルス遺伝子のｃＤＮＡの一部であっ
ても、また合成されたものであってもよい。

【００１５】本発明のハイブリッドタンパク質は、前述
の宿主ウイルスに上記の構成タンパク質遺伝子と小型エ
ピトープ遺伝子とを組み込んだ組み換えウイルスを作製
し、これを適当な宿主細胞内で発現させることにより製
造される。このようなハイブリッドタンパク質の具体例
としては、ワクチニアウイルス由来ｐ３７タンパク質と
ＨＩＶ由来ＨＧＰ３０タンパク質とのハイブリッドタン
パク質、ワクチニアウイルス由来ｐ３７タンパク質とＨ
ＩＶ由来Ｖ３タンパク質とのハイブリッドタンパク質な
どが挙げられる。

【００１６】以下に、本発明の組み換えウイルスおよび
ハイブリッドタンパク質の一般的な作製方法について説
明する。

【００１７】（第１の組み換えベクターの作製）第１の
組み換えベクターは、目的とするハイブリッドタンパク
質を作製するために使用する構成タンパク質遺伝子を含
んでいる。宿主ウイルスに構成タンパク質遺伝子と小型
エピトープ遺伝子とを相同組み換えにより挿入する場
合、宿主ウイルスの増殖に非必須な遺伝子の一部が構造
タンパク質遺伝子の両端にある必要がある。従って、組
み込むウイルスが宿主ウイルスと異なる種のウイルスの
場合は、宿主となるウイルスの増殖に非必須な遺伝子領
域の一部を構成タンパク質遺伝子の両端に存在させる必
要がある。

【００１８】第１の組み換えベクターの作製の材料とな
るベクターは、特に限定されないが、例えばｐＢＲ３２
２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８などのごときプラスミド
や、λファージ、Ｍ１３ファージなどのごときファー
ジ、ｐＨＣ７９（Ｇｅｎｅ、１１、２９１、（１９８
０））などのごときコスミドが例示される。

【００１９】第１の組み換えベクターの作製は、常法に
従って行うことができる（特開昭６２−４４１７８号公
報、特開平１−２８５１９８号公報、特開平１−１６８
２７９号公報など）。例えば構成タンパク質としてワク
チニアウイルス由来のもの、宿主ウイルスとしてワクチ
ニアウイルスを用いる場合、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ、２、１７５−１７９（１９８１）記載の方法に
したがって調製したワクチニアウイルス由来のＤＮＡを
使用するワクチニアウイルス構成タンパク質遺伝子の一
部、およびその周辺部を適当な制限酵素で切り出し、適
当なベクターに組み込めばよい。

【００２０】（第２の組み換えベクターの作製）このよ
うにして作製した第１の組み換えベクター内の構造タン
パク質遺伝子のいづれかの部分に目的とする小型エピト
ープ遺伝子を挿入または付加して第２の組み換えベクタ
ーを作製する。挿入、または付加にあたっては構造タン
パク質遺伝子と小型エピトープ遺伝子が両方とも正しい
アミノ酸翻訳の読み枠でつながれ、プロモーター部分も
ふくめて両方の遺伝子が共に破壊されないように設計さ
れねばならない。

【００２１】構造タンパク質遺伝子の開始コドンのすぐ
上流へ小型エピトープ遺伝子を付加する場合は、小型エ
ピトープ遺伝子の最上流に開始コドンが必要であり、構
造タンパク質遺伝子の終止コドンのすぐ下流へ小型エピ
トープ遺伝子を付加する場合は、構造タンパク質遺伝子
の終止コドンの除去と小型エピトープ遺伝子の最下流に
ストップコドンを作る必要がある。

【００２２】（第３の組み換えベクターの作製）第２の
組み換えベクターに対し、組み換えウイルスの選択を容
易にするためのマーカー遺伝子が常法により挿入され、
第３の組み換えベクターが作製される。

【００２３】マーカー遺伝子は、特に限定されないが、
例えばβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ａｎｄ Ｃｅｌｌｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、５、３４
０３（１９８５））、Ｅｃｏｇｐｔ遺伝子（Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．、６２、１８４９−１８５４（１９８８））など
が例示される。マーカー遺伝子は、プロモーターの下流
につないだ状態で使用される。

【００２４】マーカー遺伝子につなぐプロモーターとし
ては、組み込むウイルス内で機能するものであれば特に
限定されず、例えば、ワクチニアウイルス内で発現する
ものとしては、７．５Ｋポリペプチドをコードするワク
チニアウイルス遺伝子のプロモーター（以下、７．５Ｋ
プロモーターという）、１９Ｋポリペプチドをコードす
るワクチニアウイルス遺伝子のプロモーター（以下、１
９Ｋプロモーターという）、１１Ｋポリペプチドをコー
ドするワクチニアウイルス遺伝子のプロモーターなどが
例示され、バキュロウイルス内で発現するものとして
は、バキュロウイルスのポリヘドリンをコードするバキ
ュロウイルス遺伝子のプロモーター、バキュロウイルス
の１０Ｋポリペプチドをコードするバキュロウイルス遺
伝子のプロモーターなどが例示され、アビポックスウイ
ルス内で発現するものとしては、アビポックスウイルス
のチミジンキナーゼをコードするアビポックスウイルス
遺伝子のプロモーター、７．５Ｋプロモーター、１９Ｋ
プロモーターなどが例示される。

【００２５】プロモーターの下流につないだマーカー遺
伝子は、第２の小型エピトープ遺伝子が挿入、または付
加されたワクチニアウイルス構成タンパク質遺伝子の近
傍でに挿入されて、第３の組み換えベクターが作製され
る。これら第１、第２および第３の組み換えベクターの
構築当たっては、遺伝子操作の容易な大腸菌の系を用い
ればよい。

【００２６】（組み換えウイルスの構築とタンパク質の
製造）前述の方法により得た第３の組み換えベクターを
予めウイルスに感染させた細胞に移入し、ベクターＤＮ
Ａとウイルスゲノムの遺伝子間に相同組み換えを起こさ
せ、組み換えウイルスを構築する。組み換えウイルスの
構築に当たっては、常法に従って行えばよく、例えば、
リン酸カルシウム共沈法、リポソーム法、マイクロイン
ジェクション法、エレクトロポレーション法などによっ
て第３の組み換えベクターをウイルス内に移入させ、得
られる組み換えウイルスを含むウイルス集団を適当な培
地上に培養する。

【００２７】第３の組み換えベクターで挿入されたマー
カー遺伝子に適した方法でプラークを形成させ、目的の
組み換えワクチニアウイルスの候補株を得る。マーカー
遺伝子として、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を用いた場
合には、プラークを形成させた後で、ハロゲン化インド
リル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（以下、ブルオギャル
という）および寒天を含有したイーグルＭＥＭを重層
し、一晩後に青色に染色されるプラークを目的とする組
み換えワクチニアウイルスの候補株とすればよい。

【００２８】これらの候補株の中から目的とする組み換
えウイルスを選択する方法は、目的とする小型エピトー
プ遺伝子をプローブとするハイブリダイゼーション法を
利用してプラークを純化するか、あるいは目的とする小
型エピトープに対する抗血清またはモノクローナル抗体
を用いるイノムアッセイをすればよい。このようにして
得られた組み換えウイルスを宿主細胞に感染させて、培
養するとハイブリッドタンパク質が産生される。

【００２９】ここで用いられる細胞は、宿主となるウイ
ルスが感染するものであれば特に限定されない。宿主と
なるウイルスがワクチニアウイルスである場合、例え
ば、ＴＫ^-１４３（ヒト骨肉腫由来）、ＦＬ（ヒト羊膜
由来）、Ｈｅｌａ（ヒト子宮頸部癌由来）、ＫＢ（ヒト
鼻咽喉癌由来）、ＣＶ−１（サル腎由来）、ＢＳＣ−１
（サル腎由来）、ＲＫ１３（ウサギ腎由来）、Ｌ９２９
（マウス結合組織由来）、ＣＥ（鶏胚）、ＣＥＦ（鶏胎
児線維芽細胞）などが例示され、バキュロウイルスを使
用する場合、例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓ
ｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来のＳ
ｆ９細胞などが例示され、アビポックスウイルスを使用
する場合、例えば、ＣＥ（鶏胚）、ＣＥＦ（鶏胎児線維
芽細胞）などが例示される。

【００３０】このようにして産生されたハイブリッドタ
ンパク質は宿主細胞が生きている間は通常宿主細胞内に
大量に存在するので、細胞を集め破砕して回収すればよ
い。ハイブリッドタンパク質は公知の常法、例えば塩
析、ゲル濾過、イオン交換及びアフィニティーカラムク
ロマトグラフィーによる分離法、高速液体クロマトグラ
フィー、電気泳動による分画法等を適宜組み合わせて採
用する事により精製できる。

【００３１】

【発明の効果】かくして本発明によれば、小型エピトー
プを構造タンパク質とのハイブリッド抗原タンパク質と
して発現することができ、このタンパク質はコンポーネ
ントワクチンの抗原として利用でき、また、組み換えウ
イルスは、生ワクチンとしての利用が期待される。

【００３２】

【実施例】以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的
に説明する。 （実施例１） ワクチニアウイルス主要外膜抗原ｐ３７
遺伝子およびその周辺のクローニングによる第１の組み
換えプラスミドｐＨＰ３７の作製（図１参照）ワクチニ
アウイルスゲノムＤＮＡの調製は、まず、ワクチニアウ
イルスＬＣ１６ｍＯ株（臨床とウイルス、３（３）１３
−１９（１９７５）、以下、ワクチニアウイルスｍＯ株
という）を常法により培養し、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ、２、１７５−１７９（１９８１）記載の方法
により行った。

【００３３】このゲノムＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩと制
限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐ３７遺伝子を含む４
４５２ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。ｐＵＣ１８を制限
酵素ＰｓｔＩと制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、先に
得たＤＮＡ断片を挿入し、第一の組み換えプラスミドｐ
ＨＰ３７を作製した。ｐＨＰ３７の確認は、Ｖｉｒｏ
ｌ．、１７９、２４７−２６６（１９９０）記載の塩基
配列に基づいた制限酵素サイトを確認することよって行
った。

【００３４】（実施例２） ＨＧＰ−３０遺伝子の合成
とｐ３７遺伝子およびＨＧＰ−３０遺伝子を有する第二
の組み換えプラスミドの作製 （１）ｐ３７遺伝子の後半部分を含んだプラスミドｐＧ
Ｈ３７の作製（図２参照） 参考例１で得たｐＨＰ３７を制限酵素ＨｐａＩと制限酵
素ＢｇｌＩＩで切断し、ｐ３７遺伝子の後半部分約１２
６０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。この断片をクレノウ
処理し、平滑末端とした後、制限酵素ＤｒａＩで完全消
化したｐＢＲ３２２（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂ
ｏｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、４３、７７、（１９７
９））へ挿入し、組み換えプラスミドｐＧＨ３７を得
た。ｐＧＨ３７は、ｐ３７遺伝子の終止コドンに重なっ
た位置にただひとつのＤｒａＩサイトを有している。

【００３５】（２）ｐＧＨ３７へのＨＧＰ−３０遺伝子
に相当する合成ＤＮＡの挿入によるプラスミドｐＧＨ３
７ＨＧＰの作製（図２参照） ＨＧＰ−３０遺伝子をコードするＤＮＡ（配列番号１）
をＤＮＡ合成機を用いて合成した。この合成ＤＮＡは、
中央部にＨｉｎｄＩＩＩサイトを持つ。上記（１）で得
たｐＧＨ３７遺伝子を制限酵素ＤｒａＩで処理し、先に
得たＨＧＰ−３０をコードする合成ＤＮＡを挿入し、組
み換えプラスミドｐＧＨ３７ＨＧＰを得た。ｐＧＨ３７
ＨＧＰを制限酵素ＳｓｐＩで処理してｐ３７遺伝子とＨ
ＧＰ−３０遺伝子の間付近のＤＮＡ断片を得、この断片
の塩基配列をメッシングらの方法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ．Ｒｅｓ．、９、３０９−３２１（１９８１））によ
って確認したところ、ｐＧＨ３７ＨＧＰを制限酵素Ｄｒ
ａＩで処理したために、ｐ３７遺伝子とその下流にある
ＨＧＰ−３０遺伝子の間には終止コドンは消失し、チロ
シンをコードするコドンになったことがわかった。

【００３６】（３）ｐ３７遺伝子後方周辺配列、および
ｐ３７遺伝子前半配列の付加による組み換えプラスミド
ｐＫＰＨＧＰ３０の作製（図３、４参照） 上記（２）で得たｐＧＨ３７ＨＧＰを制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩと制限酵素ＳｓｐＩで切断し、ＨＧＰ−３０遺伝
子の後半部分を含む３６１ｂｐのＤＮＡ断片を回収し
た。また、上記（１）で得たｐＨＰ３７を制限酵素Ｐｓ
ｔＩと制限酵素ＳｓｐＩで切断し、ｐ３７遺伝子の後方
配列を含む約１２５０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。次
に、ｐＵＣ１８を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩと制限酵素Ｐ
ｓｔＩで処理し、回収した３６１ｂｐのＤＮＡ断片と約
１２５０ｂｐのＤＮＡ断片を挿入し、組み換えプラスミ
ドｐＨＰＲｅａｒを作製した。

【００３７】同様に、上記（２）で得たｐＧＨ３７ＨＧ
Ｐを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩと制限酵素ＳｓｐＩで切断
し、ＨＧＰ−３０遺伝子の前半部分を含む９１ｂｐのＤ
ＮＡ断片を回収した。また、上記（１）で得たｐＨＰ３
７を制限酵素ＫｐｎＩと制限酵素ＳｓｐＩで切断し、ｐ
３７遺伝子の前方配列を含む約１０５０ｂｐのＤＮＡ断
片を回収した。次に、ｐＵＣ１８を制限酵素ＨｉｎｄＩ
ＩＩと制限酵素ＫｐｎＩで処理し、回収した９１ｂｐの
ＤＮＡ断片と約１０５０ｂｐのＤＮＡ断片を挿入し、組
み換えプラスミドｐＨＫＦｒｏｎｔを作製した。

【００３８】このようにして得た組み換えプラスミドｐ
ＨＰＲｅａｒを制限酵素ＰｓｔＩと制限酵素ＨｉｎｄＩ
ＩＩで切断し、ＨＧＰ−３０遺伝子の後半部分およびｐ
３７遺伝子の後方周辺部分の配列を含む約１５１０ｂｐ
のＤＮＡ断片を回収した。また、組み換えプラスミドｐ
ＨＫＦｒｏｎｔを制限酵素ＰｓｔＩと制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩで切断し、ＨＧＰ−３０遺伝子の前半部分および
ｐ３７遺伝子の前方部分の配列を含む約１１４０ｂｐの
ＤＮＡ断片を回収した。ｐＵＣ１８を制限酵素ＰｓｔＩ
と制限酵素ＫｐｎＩで処理し、回収した二つの断片を挿
入し、組み換えプラスミドｐＫＰＨＧＰ３０を得た。

【００３９】（４）ｐ３７遺伝子前方配列の付加による
第２の組み換えプラスミドｐＨＰＨＧＰ３０の作製（図
５参照） 上記（３）で得た組み換えプラスミドｐＫＰＨＧＰ３０
を制限酵素ＰｓｔＩと制限酵素ＫｐｎＩで切断し、ｐ３
７遺伝子後方周辺部分配列およびｐ３７遺伝子を含む約
２６５０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。

【００４０】また、上記（１）で得た組み換えプラスミ
ドｐＨＰ３７を制限酵素ＫｐｎＩと制限酵素ＨｉｎｄＩ
ＩＩで切断し、ｐ３７遺伝子の前方周辺部分配列を含む
約１８９０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。ｐＵＣ１８を
制限酵素ＰｓｔＩと制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、
回収した二つの断片を挿入し、組み換えプラスミドｐＨ
ＰＨＧＰ３０を作製した。

【００４１】（実施例３） 第２の組み換えプラスミド
ｐＨＰＨＧＰ３０へのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の組
み込みによる第３の組み換えプラスミドｐＨＰＨＧＰ３
０Ｚの作製（図６参照） （１）ワクチニアウイルス７．５Ｋプロモーター下流へ
のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の組み込んだｐＮＺ７６
の作製 β−ガラクトシダーゼ遺伝子は、Ｇｅｎｅ、２８、１２
７−１３２（１９８４）記載のプラスミドｐＭＡ００１
を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し回収した。７．５Ｋプロ
モーターの下流にポリリンカーをつないだプラスミドｐ
ＡＫ８（特開昭６４−７４９８２号公報）をＢａｍＨＩ
で処理し、先に回収したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を
挿入し、組み換えプラスミドｐＮＺ７６を得た。

【００４２】（２）第２の組み換えプラスミドｐＨＰＨ
ＧＰ３０へのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の組み込みに
よる第３の組み換えプラスミドｐＨＰＨＧＰ３０Ｚの作
製 上記（１）で得たｐＮＺ７６を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ
と制限酵素ＳｍａＩで切断し、７．５Ｋプロモーターと
β−ガラクトシダーゼ遺伝子のつながったＤＮＡ断片を
回収し、さらにクレノウ処理し、約４ＫｂｐのＤＮＡ断
片を得た。前述の参考例２（４）で得た組み換えプラス
ミドｐＨＰＨＧＰ３０を制限酵素ＳｎａＢＩで処理し、
先に得た約４ＫｂｐのＤＮＡ断片を挿入し、組み換えプ
ラスミドｐＨＰＨＧＰ３０Ｚを作製した。

【００４３】 （実施例４） 組み換えワクチニアウイルスの作製 ２５ｃｍ²のカルチャーボトルに培養されたＲＫ−１３
細胞にワクチニアウイルスＷＲ株を０．１ｐ．ｆ．ｕ．
／細胞の割合で接種し、４５分後、１０μｇの実施例３
で得た組み換えプラスミドｐＨＰＨＧＰ３０Ｚを２．２
ｍｌの滅菌水に溶解し、樋高ら（蛋白・核酸・酵素、２
７、３４０−（１９８５））の方法によってＤＮＡ−リ
ン酸カルシウム共沈物をつくり、その０．５ｍｌを感染
ＲＫ−１３細胞に滴下した。３０分間、３７℃、７％Ｃ
Ｏ₂インキュベーターに静置し、５％牛胎児血清を含む
イーグルＭＥＭ４．５ｍｌを加えた。その３時間後、培
養液を交換し、４８時間、３７℃、７％ＣＯ₂インキュ
ベーター中で培養し、培養細胞毎に３度凍結融解し、組
み換え体を含むウイルス液を得た。

【００４４】組み換え体の選択のため、１０ｃｍペトリ
皿に培養されたＲＫ−１３細胞に上記のウイルス液を接
種し、３０分後、０．８％アガロース、５％牛胎児血清
を含むイーグルＭＥＭを積層し、３日間培養後、感染細
胞に０．８％アガロース、０．５ｍｇ／ｍｌのブルオギ
ャル（ＢＲＬ社製）を含むイーグルＭＥＭを積層し、１
４時間後に青色に染まったプラークからパスツールピペ
ットでウイルスを抜き取り、これを２％ゼラチンを含む
リン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳという）に懸濁
し、一部はドットハイブリダイゼーションをするため、
ナイロンまたはニトロセルロースメンブレンにスポット
し、残りは−２０℃で保存した。

【００４５】スポットしたメンブレンは、０．５Ｎ水酸
化ナトリウム水溶液で１０分間、１Ｍトリス塩酸緩衝液
で５分間の処理を後、１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５
Ｍトリス塩酸緩衝液で５分間処理した。２倍ＳＳＣ（１
倍ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ
クエン酸ナトリウムを含む）で飽和させ、８０℃、２時
間焼き付けた。

【００４６】その後、これを４倍ＳＥＴ（０．６Ｍ塩化
ナトリウム、０．０８Ｍトリス塩酸、４ｍＭのＥＤＴ
Ａ、ｐＨ７．８）−１０倍Ｄｅｎｈａｒｄｔ−０．１％
ＳＤＳからなる混合液で６８℃、２時間処理した。４倍
ＳＥＴ−１０倍Ｄｅｎｈａｒｄｔ−０．１％ＳＤＳ−
０．１％Ｎａ₄Ｐ₂Ｏ₇−５０μｇ／ｍｌ変性サケ精子Ｄ
ＮＡとカイネーションによって³²Ｐで標識したＨＧＰ−
３０合成遺伝子を入れて、６８℃、１４時間ハイブリダ
イゼーションした。洗浄後、メンブレンとＸ線フィルム
を重ね、オートラジオグラフィーを行い、フィルムが黒
化するスポットを選択した。

【００４７】黒化したスポットに対応するウイルス液
（ウイルス量ｍ．ｏ．ｉ．＝３×１０^-6）を再度ＲＫ−
１３細胞に接種し、３０分後、０．８％アガロース、５
％牛胎児血清を含むイーグルＭＥＭを積層し、３日間培
養後、さらに０．８％アガロース、０．５ｍｇ／ｍｌの
ブルオギャルを含むイーグルＭＥＭを積層し、１４時間
後に青色に染まったプラークについて、上記と同様の操
作を行い、出現するプラークがすべてドットハイブリダ
イゼーションで黒化するまで純化を繰り返した。こうし
て得られたウイルスは、目的の組み換えワクチニアウイ
ルスであり、これをｖ３７ＨＧＰ３０と命名した。

【００４８】（比較例１） ｐ３７遺伝子を有さず小型
エピトープＨＧＰ−３０遺伝子を有する組み換えワクチ
ニアウイルスの構築 （１）ウイルスの構造タンパク質ｐ３７遺伝子を有さず
小型エピトープＨＧＰ−３０遺伝子を有する組み換えプ
ラスミドの作製（図３参照） ｐＡＫ８を制限酵素ＳａｌＩと制限酵素ＥｃｏＲＩで処
理し、ＤＮＡ合成機で合成した塩基配列（配列番号２、
５’上流側にＳａｌＩサイトを有し、３’下流側にＥｃ
ｏＲＩサイトを有する）を持つＨＧＰ−３０合成遺伝子
を挿入し、組み換えプラスミドｐＡＫ８ＨＧＰ３０を作
製した。ｐＡＫ８ＨＧＰ３０では、ワクチニアウイルス
ＴＫ遺伝子が破壊され、ワクチニアウイルス７．５Ｋプ
ロモーターの下流に、開始コドンと終止コドンを前後に
有するＨＧＰ３０合成遺伝子が結合された状態となって
いる。

【００４９】（２）組み換えワクチニアウイルスの構築 組み換えプラスミドとしてｐＨＰＨＧＰ３０Ｚの代わり
に、上記（１）で得た組み換えプラスミドｐＡＫ８ＨＧ
Ｐ３０を使用し、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン
でウイルスを選択すること以外は、実施例４と同様の方
法で組み換えワクチニアウイルスを構築し、得られた組
み換えワクチニアウイルスをｖＴＫＨＧＰ３０と命名し
た。

【００５０】（実施例５） 組み換えワクチニアウイル
スの感染細胞での発現 組織培養用チャンバースライド上で５％牛胎児血清を含
むイーグルＭＥＭで増殖させたＲＫ−１３細胞に、ｍ．
ｏ．ｉ．＝１の本発明の組み換えワクチニアウイルスｖ
３７ＨＧＰ３０、または比較例で構築したｖＴＫＨＧＰ
３０をそれぞれ接種し、３７℃で１時間放置後、それぞ
れウイルス液をのぞき、細胞をイーグルＭＥＭで洗浄
し、５％牛胎児血清を含むイーグルＭＥＭを加えた。１
６時間後、イーグルＭＥＭを除き、軽くＰＢＳで洗い、
風乾後室温で５分間アセトン処理し、細胞をそれぞれ固
定した。

【００５１】一次抗体として抗ＨＧＰ−３０モノクロー
ナル抗体（バイラルテクノロジーズインク社製）、二次
抗体としてイソチアン酸フルオレセイン結合抗マウスＩ
ｇＧ抗体（ＴＡＧＯ社製）を使用する間接蛍光抗体法に
より、蛍光顕微鏡を用いて蛍光による特異的な発行を観
察した。その結果、本発明の組み換えワクチニアウイル
スｖ３７ＨＧＰ３０は、多量の小型エピトープＨＧＰ−
３０を発現しているが、比較例の構造タンパク質遺伝子
を有さない組み換えワクチニアウイルスｖＴＫＨＧＰ３
０は、小型エピトープＨＧＰ−３０を全く発現していな
ことがわかった。

【００５２】（実施例６）ウエスタンブロッティングを
用いた組み換えワクチニアウイルス感染細胞でのハイブ
リッドタンパク質の発現の確認 １０ｃｍ²の培養プレートに５％牛胎児血清を含むイー
グルＭＥＭを用いて増殖させたＲＫ−１３細胞に、ｍ．
ｏ．ｉ．＝１の実施例４で構築した組み換えワクチニア
ウイルスｖ３７ＨＧＰ３０またはワクチニアウイルスＷ
Ｒｏｒｍｏ株をそれぞれ接種し、３７℃で１時間放置
後、それぞれウイルス液をのぞき、細胞をイーグルＭＥ
Ｍで洗浄し、５％牛胎児血清を含むイーグルＭＥＭを加
えた。１６時間後、イーグルＭＥＭを除き、軽くＰＢＳ
で洗い、遠心管に移して３０００ｒｐｍで５分間遠心分
離し細胞を回収した。

【００５３】次に、１００μｌのリシスバッファー（Ｎ
ａｔｕｒｅ、２２７、６８０（１９７０））を加えて再
び細胞を懸濁した後、１００℃で５分間処理した。次に
１５，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離で得られた上
清をサンプルとし常法に従ってウエスタンブロッティン
グを行った。なお、使用した一次抗体は実施例５で用い
たものと同一である。ウエスタンブロッティングの結
果、ｖ３７ＨＧＰ３０感染細胞では、約４０Ｋｄのはっ
きりしたバンドが認められたのに対し、親株として用い
たワクチニアウイルスは全くバンドが認められなかっ
た。このことにより、ｖ３７ＨＧＰ３０感染細胞におい
てｐ３７タンパク質にＨＧＰ−３０タンパク質が付加さ
れたハイブリッドタンパク質が発現していることがわか
った。

【図面の簡単な説明】

【図１】組み換えプラスミドｐＨＰ３７の作製方法を示
した説明図である。

【図２】組み換えプラスミドｐＧＨ３７ＨＧＰの作製方
法を示した説明図である。

【図３】組み換えプラスミドｐＨＰｒｅａｒと組み換え
プラスミドｐＨＫＦｒｏｎｔの作製方法を示した説明図
である。

【図４】組み換えプラスミドｐＫＰＨＧＰ３０の作製方
法を示した説明図である。

【図５】組み換えプラスミドｐＨＰＨＧＰ３０の作製方
法を示した説明図である。

【図６】組み換えプラスミドｐＨＰＧＨＰ３０Ｚの作製
方法を示した説明図である。

【００５４】

【配列表】配列番号：1 配列の長さ：94 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATAGCGTAC ATCAAAGGAT AGATGTAAAA GACACCAAGG AAGCTTTAGA GAAGATAGAG 60 GAAGAGCAA AACAAAAGTA AGAAAAAGGC TTAA 94

【００５５】

【配列表】配列番号：2 配列の長さ：104 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCGACATGT ATAGCGTACA TCAAAGGATA GATGTAAAAG ACACCAAGGA AGCTTTAGAG 60 ＡＡＧＡＴＡＧＡＧ ＧＡＡＧＡＧＣＡＡＡ ＡＣＡＡＡＡＧＴＡＡ ＧＡＡＡ
ＡＡＧＧＣＴ ＴＡＡＧ １０４

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/275 9284−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 7/01 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/39 ＺＮＡ 15/62 15/86 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:92）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ウイルスの構造タンパク質と構成アミノ
   酸が３００以下である病原ウイルスのペプチドエピトー
   プとを有するハイブリッド抗原タンパク質。
2. 【請求項２】 ウイルスの構造タンパク質をコードする
   遺伝子と構成アミノ酸が３００以下である病原ウイルス
   のペプチドエピトープをコードする遺伝子とをウイルス
   の増殖に非必須な領域に組み込んだ組み換えウイルス。
3. 【請求項３】 請求項２記載の組み換えウイルスを用い
   た請求項１記載のタンパク質の製造方法。