JPH05255106A - 血小板減少症治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 培養ヒト正常細胞が産生するインターロイキ
ン−６を有効成分とする血小板減少症治療剤。 【効果】 生体内で効率よく血小板を増加する活性を有
し、またヒト生体内での中和抗体産生の可能性が少ない
ため、優れた血小板減少症治療剤として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規な医薬に関する。よ
り詳しく述べれば、本発明は培養ヒト正常細胞由来のイ
ンターロイキン−６（以下、ＩＬ−６と略す）を用いる
ことにより、効率よく血小板増加の達成される血小板減
少症治療薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】血小板減少は、癌、白血病の化学療法剤
治療に伴い、また骨髄移植、再生不良性貧血などで問題
となっているが、現在これら血小板減少症に対しては対
症療法として血小板輸血が適用されているに過ぎない。
現在、白血球にたいしてＣＳＦ（コロニ−刺激因子）、
赤血球にたいしてＥＰＯ（エリスロポイエチン）が医薬
品として応用されつつあるが、続いて血小板を増加させ
る医薬が期待されている。

【０００３】しかしながら、従来血小板を明確に増加さ
せる合成医薬は知られていない。

【０００４】生体由来の生理活性物質のある種のものは
実験動物に投与することによって、その動物の血小板数
を増加させることが知られている。例えば、 ＩＬ−１（インタ−ロイキン−１）： A. Tewari et a
l., Lncet, 336, 712-714(1990)、 ＩＬ−６（インタ−ロイキン−６）：T. Ishibashi et
al., Blood, 74, 1241-1244(1989) 、および ＬＩＦ（リュ−ケミアインヒビトリ−ファクタ−）：D.
Metcalf et al., Blood, 76, 50-56(1990) などがその例である。しかしながらＩＬ−１は強い炎症
性作用を持ち、頭痛、発熱などを初めとする炎症性の副
作用が懸念される。また、ＬＩＦについてもトランスジ
ェニックマウスの実験から、強い副作用が懸念される。

【０００５】一方、ＩＬ−６は、インタ−フェロンβ₂
（Zilberstein,A.et.at., EMBO J. 5,2529-2537,198
6）、 Ｂ細胞分化因子（ＢＳＦ−２）:(Hirano,T. et.al.,Nat
ure,324,73-76,1986) 、 ２６−ＫＤａプロテイン（Hageman,G.et.al.,Eur.J.Bio
chem., 159,625-632, 1986）、ハイブリド−マ／プラズ
マサイト−マ増殖因子（VanDamme,J.et.al., J.Exp.Me
d., 165,914-919,1987 ）、 肝細胞刺激因子（ＨＳＦ）：（Andus,T.et.al.,FEBS Le
tt.,221,18-22,1987； Gauldie,J.et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7251-72
55,1987 ）、など、別々に研究されてきた生理活性物質
が同一分子であることが分かり、その生理活性の多様性
からＩＬ−６と呼ぶことが提唱され、その名称が定着し
ている。ＩＬ−６は上記したように、その発見に伴う生
理作用の他に最近、in vitroにおいて巨核球の成熟を促
進し（Ishibashi,T.et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA, 86, 5953-5957 ）、in vivo に投与すると血小板が
増加することが報告されている（Ishibashi, T. et a
l., Blood, 74, 1241-1244, Asano, S. et. al.,Bloo
d, 75, 1602-1605, 1990）。

【０００６】ＩＬ−６の血小板増加作用についてはすで
に上述のごとく既知例があるが、既知の例はいずれも大
腸菌を宿主とする組換えＤＮＡの手法によって製造され
たものを用いている。組換えＤＮＡの手法による生理活
性蛋白質は原理的に微量の宿主由来の不純物を含有する
可能性を否定できず、本来医薬品としては望ましいもの
ではない。また特に大腸菌を宿主とする場合は、本来生
理活性物質に付与されている糖鎖や他の微細修飾が見ら
れず、生体内に投与したときの生理活性に差のある可能
性があり、また実際に人体に投与した時に、中和抗体産
生の可能性が大きい。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明で解決しようと
する課題は、前記で述べた血小板増加活性を有する従来
の生理活性物質を改良し、安全かつ強い生理活性を持っ
た治療薬を提供することにある。すなわち本発明の目的
は、生体内で効率よく血小板を増加する活性を有し、ヒ
ト以外の宿主由来の不純物の含有を理論的に排除し、で
きる限りヒトの生体内に存在するのに近い構造を理論的
に有し、したがってヒト生体内での中和抗体産生の可能
性をできる限り排除した血小板増加活性を有する医薬を
得ることにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の問
題点を解決し、前記の目的を達成するために鋭意検討を
おこない、本発明に到達した。すなわち本発明は、培養
ヒト正常細胞が産生するインターロイキン−６を有効成
分とする血小板減少症治療剤である。本発明は、培養ヒ
ト細胞由来のＩＬ−６を用いることにより、効率よく血
小板増加の達成される血小板減少症治療薬に関する。ま
た本発明は、生体内に投与したときの血小板増加効率が
良く、また人体に投与したときに中和抗体産生の可能性
の少ない新規な培養ヒト細胞由来のＩＬ−６を成分とす
る血小板減少症治療薬を提供するものである。

【０００９】本発明の目的は前述したように、生体内で
効率よく血小板を増加する活性を有し、ヒト以外の宿主
由来の不純物の含有を理論的に排除し、できる限りヒト
の生体内に存在するのに近い構造を理論的に有し、した
がってヒト生体内での抗体産生の可能性をできる限り排
除した血小板増加活性を有する医薬を得ることにあるの
で、本発明者らは、血小板増加活性を有するＩＬ−６を
培養ヒト正常細胞から取得し、ヒト以外の種由来の不純
物の混入をできる限り避けるようにした。また培養ヒト
正常細胞を生産手段とすることにより、得られるＩＬ−
６は本来生体内で働くＩＬ−６に近いものとなり、すな
わち糖鎖および微細修飾を含んだ構造がヒト生体内ＩＬ
−６に近いものとなるために、ヒトに医薬として投与し
たときに中和抗体産生を相対的に排除することができ、
生体内でのより効率的な有効性を期待することができ
る。

【００１０】本発明の培養ヒト細胞が産生するＩＬ−６
とは、ヒト由来の細胞を培養することによって得られる
ＩＬ−６を意味し、さらに特定すれば、正常細胞すなわ
ち、癌化（極端な形質転換）していない、あるいは癌細
胞由来でない正常細胞であり、好ましくは接着依存性細
胞を培養することによって得られるＩＬ−６である。こ
れらの条件によって得られるＩＬ−６は通常糖鎖の付加
した構造を有する。

【００１１】本発明のヒト正常細胞としては、接着依存
性細胞が好ましい。特に線維芽細胞、内皮細胞、ストロ
−マ細胞などが生体内でのＩＬ−６の源の一つと考えら
れており、その一部は正常細胞に近い形で培養できるの
で特に好適に用いられるが、特にこれらに限定されるも
のではない。

【００１２】本発明のヒト正常細胞のうち特に好適な細
胞は接着依存性であるので、一般的な細胞培養条件にて
培養できる。培養方法については特に限定されるもので
はない。一般的な培養フラスコ、ロ−ラ−ボトル、マイ
クロキャリア（微粒子）、などが好適に用いられるが、
マイクロキャリアが特に好ましい。こうしてヒト正常細
胞の培養によって得られた培養液から標準的な精製法に
より、ほぼ純粋なＩＬ−６を得ることができる。これら
培養および精製法については実施例でその一例を示すが
勿論これに限定されるものではない。

【００１３】本発明の血小板減少症治療剤は前述した方
法で製造されるヒトＩＬ−６を主成分として含有する。
他の成分としては、一般的な医薬添加物が選ばれる。も
ちろん添加物が無くとも本発明の目的は達成される。一
般的には主として安定化のために添加物が加えられる。
そのような医薬添加物としては、日本薬局法に記載され
た、医薬品添加物として使えるタンパク質および／また
は糖類の中から選ばれる。特に好適にはヒト血清アルブ
ミン（ＨＳＡ）、ゼラチン、ソルビト−ル、マンニト−
ルなどの中から適宜あるいは組み合わせて選ばれるが、
もちろんこれらに限定するものではない。

【００１４】本発明の目的である血小板増加活性を具体
的に達成するためには、こうして得られたＩＬ−６を主
成分とする組成物を生体に投与する。投与方法として
は、特に限定するものではないが、一般的な注射、すな
わち静脈注射、皮下注射、筋肉注射、点滴静脈内注入な
どの内適当な一つが選ばれる。経口、経鼻、経肺、経腸
のような経粘膜投与法も場合により、好適に実施され
る。

【００１５】有効投与量としては、１日につき体重１Ｋ
ｇ当たり０．００１から５００μｇの範囲で選ばれる。
好適には０．００５−２０μｇの範囲で選ばれる。ＩＬ
−６はヒトＩＬ−６がマウスにも同様に作用すること
が、一般的に知られているので、ヒトのＩＬ−６をマウ
スで試験することができる。前述の投与量は症状によっ
ても異なり、これらの値に限定されるものでは勿論な
い。

【００１６】投与回数としては通常１日１ないし２回、
もしくは２ないし３日に１回の範囲で選ばれるがこれに
限定されるものではない。通常血小板増加は複数回投与
した後すなわち数日後以降に観察される。血小板増加の
見られる時期は、投与方法によって若干のずれがある。

【００１７】本発明の目的の一つに、より効果的な血小
板増加を挙げているので、本発明者らは本発明のＩＬ−
６と、従来血小板増加の確認されている大腸菌由来のＩ
Ｌ−６との生体に投与したときの血小板増加活性を比較
した。その結果実施例に述べるように明らかな活性の違
いを見出だし本発明を完成するに至った。すなわち本発
明の記載する培養ヒト正常細胞由来のＩＬ−６は、前述
の期待効果だけでなく現実に、血小板増加の効率の面で
も、従来の大腸菌由来ＩＬ−６に対して、優位性をもつ
ことが証明された。

【００１８】

【実施例】以下に本発明を実施例によって、より詳細
に、より具体的に説明するが、もちろんこれによって本
発明が制限されるものではない。なお、ＩＬ−６の活性
評価法は以下の方法により行なった。

【００１９】生物活性の評価法：株細胞７ＴＤ１（ＩＬ
−６依存ハイブリド−マ細胞（J. van Snick et al., E
uropean J. Immunol., 18, 193-197(1988)）を用いて、
それに適当量のＩＬ−６を添加することにより、７ＴＤ
１の細胞増殖をＭＴＴ法により測定し、別途標準ＩＬ−
６の段階希釈サンプルについての増殖活性との比較によ
り、ＩＬ−６の生物活性評価を行った。標準ＩＬ−６と
しては、下記に示す東レ株式会社ヒトＩＬ−６ＥＬＩＳ
Ａキットに添付されているのと同じものを使用した。

【００２０】ＥＬＩＳＡ（酵素免疫評価法）法：抗ＩＬ
−６抗体（N.Ida et al .、Biochem.Biophys.Res.Commu
n.,165,728-734,(1989)）を用いたＥＬＩＳＡ法で測定
した。東レ株式会社製造、ト−レ・フジバイオニクス販
売、ヒトＩＬ−６ＥＬＩＳＡキットを用いてＩＬ−６の
評価を行った。

【００２１】実施例１ヒト細胞由来ＩＬ−６の調製： 本発明のＩＬ−６は一例
として次の方法で調整した。２Ｌのガラス製培養槽に１
Ｌの５％のＮＣＳを含むイーグルＭＥＭ培地中で、細胞
数が１０⁶ ／mlになるようにヒト線維芽細胞をビーズ培
養した（ビーズ：“サイトデックス１”、（ファルマシ
ア社）、３７℃）。その後、培地を少量のカルボキシメ
チルセルロースを含む無血清イーグルＭＥＭ培地１Ｌに
交換し、プライミングとして１０万単位／Ｌのヒト天然
型インターフェロンβを添加した。翌日さらにポリＩ：
ポリＣ５０mg／Ｌ、シクロヘキシミド１０mg／Ｌ添加し
た。その４時間後、アクチノマイシンＤを４mg／Ｌ投入
し、そして、さらに１時間後、産生培地として少量のメ
チルセルロースを含むイーグルＭＥＭ培地に置換し、ス
ーパーインダクション処理を行なっ−た。その後２日間
そのまま培養を続けた（３７℃）。

【００２２】撹拌を停止し、マイクロキャリアを沈降さ
せた後、上清および産生培地での洗液をろ過し、１Ｌを
別の撹拌装置付き容器に移した。この産生液に滅菌した
“ブル−セファロ−スＣＬ−６ＢＦＦ”（ファルマシア
社）を投入し、１５℃，４日間撹拌しながらバッチ吸着
させた。撹拌停止後、ブル−担体を沈降させ上清を別の
容器に移した。シリカ担体は、リン酸ナトリウム緩衝液
中で高圧蒸気滅菌（１２１℃、３０分）したのち、４ｍ
ｌずつ２本のカラムに充填して直列に接続させた。これ
に、ブル−担体の素通り上清を流速２０ｍｌ／ｈｒで流
した。全量流した後、２本のカラムを別々に精製した。
それぞれリン酸ナトリウム緩衝液２５ｍｌを流した後、
２０ｍＭ塩酸を流してインターロイキン−６含有画分１
０ｍｌを回収した。この塩酸回収液にさらに硫酸アンモ
ニウムを１．３３Ｍになるように添加し、４℃、１晩ゆ
るやかに撹拌した。沈殿物を３０００ｒｐｍ，３０分遠
心分離（４℃）、除去した。

【００２３】分離した上清を疎水性クロマトグラフィ−
用担体である“ブチルトヨパ−ル６５０Ｍ”１ｍｌ（東
ソ−社）を充填したカラムに流し、吸着させた。このカ
ラムを１．３３Ｍの硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ塩
酸、１．３３Ｍの硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液で洗浄した後、５０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液で回収した。その後、逆相系のクロマトグ
ラフィ−であるＯＤＳカラム（Ｃ₁₈）（ＹＭＣ−Ｐａｃ
ｋ ＯＤＳ Ａ−３１２ Ｓ−５ １２０Ａ，ＹＭＣ
社）を装着した高速液体クロマトグラフィ−（島津ＬＣ
−４Ａ）を用いて、０．１％トリフロロ酢酸を含有する
水と０．１％トリフロロ酢酸を含有するアセトニトリル
でグラジエント溶出させヒト天然型インターロイキン−
６ピ−クを分取した。こうして得られたヒト天然型イン
ターロイキン−６を“セファデックスＧ−２５”（ファ
ルマシア社）で５ｍＭギ酸を溶媒としてゲルろ過しアセ
トニトリルを含まないインターロイキン−６溶液を得
た。

【００２４】上記で調製したＩＬ−６の純度は逆相ＨＰ
ＬＣ法で９５％以上であった。上記ＩＬ−６は前記に示
す評価法で活性を持ったＩＬ−６であることを確認し
た。

【００２５】実施例２大腸菌由来ＩＬ−６の調製： 既知文献（T. Hirano ら、
Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３２４，７３（１９８６））と
同じ遺伝子配列を持つＩＬ−６ｃＤＮＡを骨格とするＩ
Ｌ−６発現ベクタ−を下記の方法で作成した。

【００２６】甲状腺癌由来細胞株ＮＩＭ−１細胞（通山
薫ら、日本血液学会雑誌、５３巻、８０５（１９９０）
を培養して通常の方法で調製したｍＲＮＡから、逆転写
酵素で合成したｃＤＮＡ混合物から下記２本のＤＮＡオ
リゴマ− ＣＣＧＡＴＣＧＡＴＧＣＣＡＧＴＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡ および ＧＣＣＡＣＧＧＡＴＣＣＴＡＣＡＴＴＴＧＣＣＧＡＡＧ をプライマ−としてＰＣＲ反応を行った。得られた増幅
ＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩとＢａｍＨＩで消化した後、
得られたＤＮＡ断片を大腸菌発現ベクタ−ｐＫＭ６(Tan
aka et al., J. Interferon Res., 6,429-35(1986)) の
ＣｌａＩ部位とＢｇｌＩＩ部位の間に挿入して、発現Ｉ
Ｌ−６ベクタ−ｐＫＭＩＬ−６を得た。このｐＫＭＩＬ
−６を大腸菌ＨＢ１０１に導入し、組換え体を得た。こ
の組換え体を下記のように培養して大腸菌組換え型ＩＬ
−６を調製した。

【００２７】ヒトインターロイキン−６発現プラスミド
を保持する大腸菌ＨＢ１０１／ｐＫＭＩＬ−６を、３０
Ｌ容ジャーを用いて培養した。３０Ｌの増殖用培地（リ
ン酸１カリウム０．３％、リン酸２ナトリウム０．６
％、塩化ナトリウム０．５％、塩化アンモニウム０．１
％、グルコース０．５％、カザミノ酸０．５％、硫酸マ
グネシウム１ｍＭ、硫酸第１鉄３μＭ、ビタミンＢ1 ６
μｇ／ｍｌ、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）を３０Ｌ容
ジャーに仕込み、上記組換え体を植菌した。ジャーは、
攪拌数３００ｒｐｍ、通気量１ＶＶＭ、２５℃の条件で
運転した。トリプトファンオペロンの誘導物質であるイ
ンドールアクリル酸を加え、グルコースとカザミノ酸を
添加しながら６０時間培養した。培養菌体を１０，００
０×ｇ２０分間の遠心分離操作により集めた。菌体は、
約８９５ｇ得られた。集めた菌体を１ｍＭＥＤＴＡ、１
００ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス塩酸バッファー
ｐＨ８．０にＯＤ550nm が２０となるように懸濁した。
菌体をマントンゴーリンにより破砕し、遠心分離を行
い、破砕抽出物を回収した。抽出液中の蛋白量は２３５
ｇ、インターロイキン−６は４９５ｍｇであった。ここ
でＩＬ−６の量は、前記のＥＬＩＳＡ法で測定した（以
下同じ）。

【００２８】抽出液をシリカカラム５．５Ｌに吸着さ
せ、酸性溶液で溶出した。ＩＬ−６は４６２ｍｇ回収し
た。溶出液に硫酸アンモニウムを終濃度１．３３Ｍ添加
して、遠心により、不溶性不純物を除去した。次にブチ
ルカラム（ブチルトヨパール東ソー社製）２００ｍｌに
吸着させ、低塩中性溶液で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
純度検定法により純度８４％のＩＬ−６を２３７ｍｇ得
た。溶出したＩＬ−６をそのままヘパリンカラム（ＡＦ
ヘパリントヨパール 東ソー社製）８０ｍｌに吸着させ
た。中性塩バッファーで溶出した。純度９１％のＩＬ−
６を１１４ｍｇ得た。溶出液をさらにブチルカラム（ブ
チルトヨパール 東ソー社製）２００ｍｌで再度精製し
て、ＩＬ−６を６６ｍｇ得た。上記で調製したＩＬ−６
の純度は逆相ＨＰＬＣ法で９５％以上であった。上記Ｉ
Ｌ−６は実施例１に記載した評価法で活性を持ったＩＬ
−６であることを確認した。

【００２９】別途ベ−リンガ−・マンハイム社より購入
した大腸菌にて製造したＩＬ−６を、上記ＩＬ−６評価
法にて測定したところ、１ｍｇの表示に対して、ＥＬＩ
ＳＡ法で０．４ｍｇＩＬ−６以下であり、購入段階での
失活のためか、タンパク質重量に対してＩＬ−６活性が
低下していると判断し、以下の実験には使用しなかっ
た。

【００３０】実施例３マウス皮下注射での血小板増加活性： 実施例１で得たＩ
Ｌ−６を試験サンプルとしてＣ５７ＢＬ／６マウス
（雄、６週齢）に投与し、血小板増加活性を調べた。投
与剤型はＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）、Ｄ−ソルビト
−ルをそれぞれ０．４％、および０．２％含んだ等張溶
液として、０．１ｍｌ／マウスの容量で頸背部皮下に投
与した。第１図および表１に示すＩＬ−６量を１日２回
１２時間おきに、３日間、５日間、７日間、１０日間投
与した。投与量および血小板測定時期に応じて群分け
し、それぞれ最終投与後３時間目にマウスを屠殺し、血
小板数を測定した。１群６匹としてコントロール群を含
んで下記の用量で試験を実施した。コントロールはＩＬ
−６を含まないビ−クルの投与を意味する。

【００３１】被験マウスの血小板数は以下のプロトコ−
ルで測定した。エーテル麻酔下、えき下動脈より全血採
血し、抗凝固剤として１５％ＥＤＴＡ・２Ｋを１／１０
０容、添加し、自動血球数測定装置Ｃｅｌｌｔａｃ（日
本光電社）にて血小板数を測定した。結果を表１に示
す。表１から明らかなように、用いた全投与量で、投与
開始後５日目以降に、血小板数が有意に増加した。

【００３２】

【表１】

【００３３】実施例４マウスにおける血小板増加作用の用量依存性： 実施例１
で得たＩＬ−６を試験サンプルとしてＣ５７ＢＬ／６マ
ウス（雄、８週齢、１群６匹）に投与し、血小板増加作
用の用量依存性を調べた。ＩＬ−６の投与量は４００μ
ｇ／ｋｇ，１００μｇ／ｋｇ，２５μｇ／ｋｇ，６．４
μｇ／ｋｇ，１．６μｇ／ｋｇの５種類に設定し、生理
食塩水に溶解させたものを投与した。投与方法として
は、マウスの背部皮下に１日１回行い、投与容量は１匹
当たり１００μｌとした。７日間投与した時点で血小板
数を測定した。被験マウスの血小板数は以下のプロトコ
−ルで測定した。エーテル麻酔下、腋下静脈より全血採
血し、抗凝固剤として１５％ＥＤＴＡ・２Ｋを１／１０
０容、添加し、自動血球数測定装置Ｋ−１０００（東亜
医用電子）を用いて測定した。なお、対照としてはＩＬ
−６の代わりに生理食塩水を投与したマウスの血小板数
を１００％として、これに対する測定血小板数の割合を
表示した。

【００３４】その結果ＩＬ−６の投与７日目の時点で、
上記用量の高い順に従って用量依存的な血小板の増加作
用が得られ、それぞれ１３５±５％，１２９±３％，１
１７±２％，１０７±２％，１０５±４％の増加を示し
た。（±での表示は標準誤差を表す。） 実施例５ヒト細胞由来ＩＬ−６と大腸菌由来ＩＬ−６との血小板
増加作用の比較： 本発明のＩＬ−６、即ち実施例１のヒ
ト細胞由来ＩＬ−６と実施例２の大腸菌型ＩＬ−６と
の、血小板増加活性の比較を行った。比較方法として
は、各種用量のＩＬ−６をマウスの皮下に１１日間連続
投与して血小板増加率の時間的な変動を比較した。投与
方法、測定方法は実施例４と同様に行なった。結果を表
２に示す。表中、±ＳＥは標準誤差を示している。

【００３５】

【表２】

【００３６】その結果、最高用量４００μｇ／ｋｇを投
与した場合の経時的変化をみると、ヒト細胞由来ＩＬ−
６と大腸菌由来ＩＬ−６共に投与７日目に血小板増加率
が最高値を示し、それぞれ１３８．３±６％と１２６．
４±４％となった。

【００３７】また投与９日目以降を比較すると、ヒト細
胞由来ＩＬ−６の場合１１日目にも１１５．４±５％と
有意（ｐ＜０．０５）な血小板増加を認めたが、大腸菌
由来ＩＬ−６の場合には１０６．３±４％と正常値近く
に回復してしまうことを認めた。このことから、ヒト細
胞由来ＩＬ−６の方が血小板増加効果が長期間持続でき
るといえる。さらに、投与７日目の時点で血小板増加作
用の用量反応曲線をＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋの
ｐｌｏｔに変換して、ＥＤ₅₀値と最大増加率を求めた。

【００３８】その結果、ヒト細胞由来ＩＬ−６のＥＤ５
０値は１６．０μｇ／ｋｇ，血小板の最大増加率１３８
％となった。一方、大腸菌由来ＩＬ−６のＥＤ５０値は
２４．７μｇ／ｋｇで最大増加率１２８％となった。こ
の結果を基に、ＩＬ−６の用量と血小板増加率の２要因
について二元配置の分散分析法で有意差検定を行ったと
ころ、両ＩＬ−６の薬効には有意差（ｐ＜０．０５）が
認められた。即ち、ヒト細胞由来ＩＬ−６の血小板増加
作用は、大腸菌由来ＩＬ−６より有意に強かった。

【００３９】実施例６ヒト細胞由来ＩＬ−６と大腸菌由来ＩＬ−６のレセプタ
−に対する親和性： 単球細胞U937株およびミエロ−マ細
胞U266株に発現されているIL-6レセプタ−に対する、ヒ
ト細胞由来ＩＬ−６と大腸菌由来ＩＬ−６の親和性の違
いを ¹²⁵Ｉ標識したヒト細胞由来ＩＬ−６、大腸菌由来
ＩＬ−６を用いて常法に従い測定した(Ann.N.Y.Acad.Sc
i., 51,660-672,1949)。ヒト細胞由来ＩＬ−６と大腸菌
由来ＩＬ−６への ¹²⁵Ｉ標識はT.Tagaら(J.Exp.Med.,16
6,967-981,1987) に記載されている方法により行った。
結果を表２に示す。その結果、U937株およびU266株に発
現しているIL-6レセプタ−への親和性は、ヒト細胞由来
ＩＬ−６が大腸菌由来ＩＬ−６よりも約２倍強いことが
明かになった。

【００４０】

【表３】

【００４１】実施例７ヒト細胞由来ＩＬ−６の急性毒性： 実施例１で得られた
ヒト細胞由来ＩＬ−６を最大１０ｍｇ／ｋｇの用量でマ
ウスに尾静脈注射した。投与剤型はＨＳＡ（ヒト血清ア
ルブミン）、Ｄ−ソルビト−ルをそれぞれ０．２％、お
よび０．２％含んだ等張溶液として、１０ｍｌ／Ｋｇの
容量で投与した。投与用量は０．０１、０．１、１、お
よび１０ｍｇ／Ｋｇで、各群３匹で試験した。検査項目
は一般的毒性検査法によった。

【００４２】その結果、一般的毒性検査法の各試験項目
においてビ−クル投与群と差はなく、本急性毒性試験で
は、実施例１で得られたＩＬ−６は最大１０ｍｇ／ｋｇ
まで致命的な毒性を示さなかった。

【００４３】

【発明の効果】本発明によって、生体内で効率よく血小
板を増加する活性を有し、ヒト以外の宿主由来の不純物
の含有を理論的に排除し、できる限りヒトの生体内に存
在するのに近い構造を理論的に有し、したがってヒト生
体内での中和抗体産生の可能性をできる限り排除した、
培養ヒト正常細胞由来のＩＬ−６を成分とする血小板減
少症治療薬を得ることに有効である。上記の点において
実際に本発明の実施例では、ヒト細胞由来ＩＬ−６は生
体内投与における血小板増加活性において有効であるこ
とが示された。さらに本発明のＩＬ−６は、従来の組換
えＤＮＡ型ＩＬ−６に比して優位性を有するのは自明で
あり、実際に大腸菌型ＩＬ−６よりも血小板増加率にお
いてより高い効率を示すことが示された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 新妻 洋 北海道札幌市厚別区もみじ台北５−３−10 (72)発明者 桜井 信豪 静岡県三島市4845番地（町、丁目表示な し） 東レ株式会社三島工場内 (72)発明者 細井 和男 静岡県三島市4845番地（町、丁目表示な し） 東レ株式会社三島工場内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 培養ヒト正常細胞が産生するインターロ
   イキン−６を有効成分とする血小板減少症治療剤。
2. 【請求項２】 培養ヒト正常細胞が接着依存性ヒト細胞
   である請求項１記載の血小板減少症治療剤。
3. 【請求項３】 培養ヒト正常細胞が線維芽細胞である請
   求項１または２記載の血小板減少症治療剤。
4. 【請求項４】 インターロイキン−６が、培養ヒト正常
   細胞をマイクロキャリア上で培養して得られたものであ
   る請求項１〜３記載の血小板減少症治療剤。