JPH05230393A

JPH05230393A - ポリマーの染料およびその調製および使用

Info

Publication number: JPH05230393A
Application number: JP4131366A
Authority: JP
Inventors: Ludger Heiliger; ルトガー・ハイリガー; Hans-Ulrich Siegmund; ハンス−ウルリヒ・ジークムント; Herbert Hugl; ヘルベルト・フクル; Antonius Loebberding; アントニウス・レツベルデイング; Eberhard Kuckert; エベルハルト・クツカート; Bruno Boemer; ブルーノ・ベーマー; Thomas Boecker; トーマス・ベツカー; Guenter Franke; ギユンター・フランケ
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1991-05-03
Filing date: 1992-04-27
Publication date: 1993-09-07
Also published as: CA2067645A1; EP0513560A1; EP0513560B1; US5298583A; DE59203719D1; DE4114482A1

Abstract

(57)【要約】【目的】既知のポリマーの染料より非常に高い強度の
蛍光を示すポリマー染料を提供する。【構成】式（Ｉ）【化１】［Ａ］_a−［Ｂ］_b−［Ｃ］_c−［Ｄ］_d （Ｉ）式中、Ａは水溶性構成ブロックであり、Ｂはエステル、
酸アミド、ウレタン、尿素および／またはチオ尿素の基
を経て共有結合した蛍光染料の分子であり、Ｃは芳香族
の構成ブロックまたは第２蛍光染料であり、該第２蛍光
染料はエステル、酸アミド、ウレタン、尿素および／ま
たはチオ尿素の基を経て共有結合しており、そして蛍光
染料Ｂに対して相補的であり、Ｄはモノマーの構成ブ
ロックであり、該構成ブロックはタンパク質におよび、
必要に応じて、可能ならば成分Ｂおよび／またはＣに、
共有結合し、そしてａ、ｂ、ｃおよびｄは、成分Ａ、
Ｂ、ＣおよびＤの重量％を表し、これらは合計１００重
量％である、のポリマーの染料。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ポリマーの染料、すなわち、ポ
リマー結合染料、それらの調製およびそれらの使用、例
えば、分析手順におけるマーカーとしての使用に関す
る。ポリマーの染料は、結合可能な官能基を含有し、そ
して分析の普通の条件下に水溶性である。ポリマー部分
は通常この水溶性の原因となる。染料それ自体はしばし
ば水不溶性である。

【０００２】生物学的試験系において使用することがで
きる既知のマーカーは、しばしば、劣った加工片の安全
性および特別に装備した実験室（放射性）においてのみ
の制限された取り扱いまたは、例えば、酵素の標識つけ
における、不十分な安定性という欠点を有する。

【０００３】好ましくはアミノ基を含有する染料による
蛍光染料およびそれらの調製は知られている。米国特許
第４，１６６，１０５号は、特定の反応成分、例えば、
抗原の検出に適当であり、そして多数の染料分子を含有
する抗体結合ポリマーから成る試薬を記載している。

【０００４】染料のポリマーは、タンパク質との結合に
利用することができる末端の官能基、および染料分子に
利用することができる、多数の他の官能基を有する。適
当な主鎖のポリマーの例は、ポリエチレンイミン、ポリ
リジン、ポリアミドおよび低分子量のポリカルボン酸で
ある。

【０００５】述べた特許の第１の例は、ポリエチレンイ
ミンおよびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴ
Ｃ）からなり、ポリエチレンイソチオシアネートの１分
子当たり７０の染料分子を含有するポリマーの染料の合
成を記載している。実施例７に従い、８０の結合したフ
ルオレセイン単位を含有するこのようなポリマーの染料
の量子収率の決定はわずかに４％の値を与える。それゆ
え、このポリマーは、その分子量の１００倍で、モノマ
ーのＦＩＴＣの蛍光の約３倍のみを有する。

【０００６】ドイツ国公開明細書第３，９２１，４９８
号は、ジカルボン酸無水物基を含有するコポリマーとア
ミノ基を含有する染料との反応により調製された蛍光ポ
リマーの試薬を記載している。実施例４に従い、この型
の試薬は６０％より多い高い量子収率を与えることが報
告されている。

【０００７】これらの高い量子収率にかかわらず、モル
増幅は、使用するモノマーの染料と比較して、まだ満足
すべきものではない。なぜなら、水溶性ポリマーの主鎖
の分子量はなおまだ低すぎるからである。この系の増幅
の程度は蛍光の強度により決定され、この強度は引き続
いて蛍光のモル吸光度および量子収率との積から計算す
ることができる。

【０００８】したがって、使用するモノマーと比較して
高い増幅を達成するために、両者の因子（蛍光のモル吸
光度および量子収率）は出来だけ高くなくてはならな
い。

【０００９】しかしながら、前述のポリマー系におい
て、これらの因子の少なくとも１つは所望の増幅の達成
に低く過ぎる。

【００１０】今回発見したポリマーの染料は、式（Ｉ）

【００１１】

【化２】［Ａ］_a−［Ｂ］_b−［Ｃ］_c−［Ｄ］_d （Ｉ）式中、Ａは水溶性構成ブロックであり、Ｂはエステル、
酸アミド、ウレタン、尿素および／またはチオ尿素の基
を経て共有結合した蛍光染料の分子であり、Ｃは芳香族
の構成ブロックまたは第２蛍光染料であり、該第２蛍光
染料はエステル、酸アミド、ウレタン、尿素および／ま
たはチオ尿素の基を経て共有結合しており、そして蛍光
染料Ｂに対して相補的であり、Ｄはモノマーの構成ブ
ロックであり、該構成ブロックはタンパク質におよび、
必要に応じて、可能ならば成分Ｂおよび／またはＣに、
共有結合し、そしてａ、ｂ、ｃおよびｄは、成分Ａ、
Ｂ、ＣおよびＤの重量％を表し、これらは合計１００重
量％である、のの一般構造を有することを特徴とする。

【００１２】水溶性構成ブロックＡはイオン性または非
イオン性であることができる。それらは、例えば、アク
リル酸、メタクリル酸、アクリルアミド、メタアクリル
アミドまたはそれらの誘導体である。適当な誘導体の例
は、次の通りである：２−アクロイルアミノ−２−メチ
ル−プロパンスルホン酸、ジアルキルアミノ−アルキル
（メト）アクリレートおよびジアルキルアミノアルキル
（メト）アクリルアミド、例えば、ジメチルアミノエチ
ルメトアクリレート、ジメチルアミノ−プロピル−アク
リルアミドおよびこのような（メト）アクリレートおよ
び（メト）アクリルアミドから誘導された第４級化化合
物。適当な化合物の他の例は、次の通りである：Ｎ−ビ
ニルピロリドン、Ｎ−ビニルピペリドン、Ｎ−ビニルカ
プロラクタム、Ｎ−ビニルホルムアミド、Ｎ−ビニルア
セトアミド、Ｎ−ビニル−Ｎ−メチル−アセトアミドお
よびメチルＮ−ビニル−Ｏ−メチルウレタン。

【００１３】Ｂに対して相補的な第２蛍光染料（＝可能
な成分Ｃ）は、励起後、ある波長の範囲の光を放射し、
前記範囲は特定の蛍光染料Ｂがその最大吸収を有する波
長と異なり、例えば、±３０ｎｍだけ異なる、蛍光染料
を意味すると理解される。

【００１４】適当な蛍光染料Ｂおよび、存在する場合、
Ｃの例は、次の通りである：式（ＩＩ）

【００１５】

【化３】

【００１６】式中、Ｒ^１はＯ−アルキル、Ｎ（アルキ
ル）₂、ＮＨ−アルキル、ＮＨ−ＳＯ₂−アルキル、Ｏ−
トリメチルシリルまたはＮＨ−ＳＯ₂−アリールであ
り、Ｒ²は水素、シアノ、塩素、ヒドロキシル、アルキ
ルまたはアリールであり、そしてＲ^３はフェニルまたは
ヘトアリールである、のクマリン。

【００１７】アルキルは好ましくはＣ_１−Ｃ_６アルキル
であり、アリールは好ましくはフェニルであり、アルキ
レンは好ましくはＣ_１−Ｃ_６アルキレンであり、そして
ヘトアリールは好ましくは（ベンゾ）チアゾリル

【００１８】

【化４】

【００１９】である。

【００２０】Ｒ^１は、また、

【００２１】

【化５】

【００２２】であることができ、ここでＸは酸素、Ｎ−
Ｃ_１−Ｃ_４アルキルまたは（ＣＨ₂）_nであり、ここでｎ
は０または１であることができる。

【００２３】さらに、式（ＩＩＩ）

【００２４】

【化６】

【００２５】式中、Ｒ²およびＲ^３は式（ＩＩ）におい
て与えた意味をもつ、のクマリンは適当である。

【００２６】式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）のクマリン
は、好ましくは、置換基Ｒ^１、Ｒ²およびＲ^３の１つの
上に染料をモノマーの構成ブロックＤまたはそれから利
用可能なポリマーと結合させるための官能基を含有す
る。ＮＨ₂またはＯＨ基はこの目的にとくに適当であ
る。

【００２７】式（ＩＶ）

【００２８】

【化７】

【００２９】式中、Ｒ^１、Ｒ²およびＲ^３はクマリンに
ついて与えた意味を有し（参照、式（ＩＩ）および（Ｉ
ＩＩ））そしてＲ^４はアルキル、好ましくはＣ_１−Ｃ_６
アルキルである、のカーボスチリルは、また、適当であ
る。

【００３０】さらに、式（Ｖ）

【００３１】

【化８】

【００３２】式中、Ｒ⁵は水素またはメチルであり、Ｒ⁶
およびＲ⁷は、互いに独立に、水素または塩素であり、
そしてンであり、ここでアルキルおよびアルキレンは、例え
ば、Ｃ_１−Ｃ_６アルキルまたはＣ_１−Ｃ_６アルキレンで
あることができる、のピラゾリンは適当である。

【００３３】式（ＶＩ）

【００３４】

【化９】

【００３５】式中、Ｒ⁹はアルキルであり、そしてＲ¹⁰
およびＲ¹¹は、互いに独立に、水素、Ｏ−アルキルまた
はＮ（アルキル）₂であり、ここでアルキルは各場合に
おいてＣ_１−Ｃ_６アルキルであり、そして基Ｒ⁹、Ｒ¹⁰
またはＲ¹¹の１つはモノマーの構成ブロックＤまたはそ
れから得られるポリマーとの結合のためのＮＨ₂基を有
する、のナフタルイミドは、また、適当である。

【００３６】式（ＶＩＩ）

【００３７】

【化１０】

【００３８】式中、Ｒ¹²は水素またはＳＯ₃Ｈであり、
そしてＲ¹³およびＲ¹⁴は、互いに独立に、Ｏ−アルキル
またはＮ（アルキル）₂であり、ここでアルキルは各場
合においてＣ_１−Ｃ_６アルキルであり、そして基Ｒ⁹、
Ｒ¹⁰またはＲ¹¹の１つはモノマーの構成ブロックＤまた
はそれから得られるポリマーとの結合のためのＮＨ₂基
を有する、のピレンは、また、適当である。

【００３９】式（ＶＩＩＩ）

【００４０】

【化１１】

【００４１】フルオレセインおよび式（ＩＸ）

【００４２】

【化１２】

【００４３】のローダミンは、また、適当であり、式
中、Ｙ^-は無色のアニオン、例えば、Ｃｌ^-、Ｂｒ^-、
Ｉ^-、ＨＳＯ₄ ^-または

【００４４】

【化１３】

【００４５】であり、ここでＸはＣｌ、Ｂｒ、Ｉまたは
ＣＨ₃であり、そしてＲ¹⁵およびＲ¹⁸は、互いに独立
に、アルキルまたは

【００４６】

【化１４】

【００４７】であり、ここでアルキルは好ましくはＣ_１
−Ｃ_６アルキルであり、そしてＸは酸素、Ｎ−Ｃ_１−Ｃ
_４アルキルまたは（ＣＨ₂）_nであり、ここでｎは０また
は１であることができる、は、また、適当である。

【００４８】Ｎ⁺Ｒ¹⁵Ｒ¹⁶および／またはＮＲ¹⁷Ｒ
¹⁸は、それらが結合する芳香族環と一緒になって、ま
た、ポリサイクル系、例えば、式（Ｘ）または（ＸＩ）

【００４９】

【化１５】

【００５０】の系を形成することができる。

【００５１】これらおよび他の適当な染料は知られてい
る［参照、例えば、「合成染料の化学（ＴｈｅＣｈｅ
ｍｉｓｔｒｙｏｆＳｙｎｔｈｅｔｉｃＤｙｅ
ｓ）」、Ｖｏｌ．Ｖ、アカデミック・プレス（Ａｃａｄ
ｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）（１９７１）および「蛍光性増
白剤（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＷｈｉｔｅｎｉｎｇ
Ａｇｅｎｔｓ）」、Ｇ．チエメ・フェルラーグ・スツッ
ツガルト（ＴｈｉｅｍｅＶｅｒｌａｇＳｔｕｔｔｇａ
ｒｔ）（１９７５）。

【００５２】Ｃが芳香族構成ブロックである場合、それ
らの例は次の通りである：スチレン、α−メチルスチレ
ン、式（ＸＩＩ）

【００５３】

【化１６】

【００５４】式中、Ｒ¹⁹は水素またはメチルであり、Ｒ
²⁰はＣＨ₂またはＳＯ₂であり、ｍは０または１であり、
そしてＺはハロゲン、ＳＯ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ハロゲ
ン、ＯＭｅ、ＳＯ−ＣＨ₃またはメチルである、の化合
物。ハロゲンは、好ましくは、塩素、臭素またはヨウ
素，とくに塩素または臭素であり、そしてＭｅは１当量
の金属である。

【００５５】１−ビニルナフタレン、２−ビニルナフタ
レン、１−ビニルカルバゾール、式（ＸＩＩ）の化合物
に類似するが、芳香族の親構造としてナフタレンまたは
カルバゾールを含有する化合物または式（ＸＩＩＩ）

【００５６】

【化１７】

【００５７】式中、Ｒ²¹は水素、ＳＯ₃Ｈ、ＣＯＯＨ、
ＳＯ₃ＭｅまたはＣＯＯＭｅであり、ここでＭｅは１当
量の金属であり、そしては水素またはメチルである、の芳香族アミン、フェノー
ル、芳香族ヒドロキシカルボン酸、ヒドロキシスルホン
酸、アミノカルボン酸およびアミノスルホン酸から誘導
された（メト）アクリルアミドまたは（メト）アクリレ
ートは、また、適当である。

【００５８】モノマーの構成ブロックＤは、タンパク質
とおよび、必要に応じて、可能ならば成分Ｂおよび／ま
たはＣと共有結合する反応性または活性化可能な基を含
有する。このような基の例は、ハライド、イミドエステ
ル、ベンゾトリアゾリル、イソシアネート、イソチオシ
アネート、オキシランまたはジイミド基である。Ｄの重
合可能な部分は、例えば、アクリル、メタクリル、ビニ
ルまたはスチリル基であることができる。Ｄは好ましく
は（メト）アクロイルクロライド、Ｎ−ヒドロキシ−ス
クシニミジル（メト）アクリレート、Ｎ−ヒドロキシ−
フタリミジル（メト）アクリレート、Ｎ−（メト）アク
ロイルベンゾトリアゾール、３−または４−イソチオシ
アナトフェニル（メト）アクリレート、２−イソチオシ
アナトエチル（メト）アクリレート、イソチオシアナト
イソプロペニルベンゼン、イソプロペニル−α，α−ジ
メチルベンジルイソシアネート、ビニルオキシランまた
は（メト）アクリル酸とカーボジイミドとの組み合わせ
である。

【００５９】Ｄが共有結合することができるタンパク質
は、抗体、抗原、ハプテンまたは核酸であることができ
る。

【００６０】ａは，例えば、０〜９０重量％であり、ｂ
は、例えば、５〜５０重量％であり、ｃは、例えば、５
〜８９．９９重量％であり、そしてｄは、例えば、０．
０１〜１０重量％である。好ましくは、ａは０、すなわ
ち、別々の水溶性構成ブロックは存在しない。次いで、
合計ｂ＋ｃ＋ｄは１００重量％までであり、そしてｂは
好ましくは１０〜４０重量％であり、ｃは好ましくは５
９〜８９．９５重量％であり、そしてｄは好ましくは
０．０５〜５重量％である。

【００６１】式（Ｉ）の本発明によるポリマーの染料の
うちで、Ｃが次のものであるものは好ましい：式（ＸＩ
ＩＩ）の化合物または前述の定義の意味内でＢに対して
相補的でありそして少なくとも１つのカルボキシルまた
はスルホ基および／または少なくとも１つのカルボキシ
レートまたはスルホネート基を含有する蛍光染料、Ｃは
エステル、酸アミド、ウレタン、尿素および／またはチ
オ尿素の基を経て共有結合している。

【００６２】染料Ｂおよびそれに対して相補的である染
料Ｃのとくに好ましい例は、染料ＢとしてローダミンＢ
および染料Ｃとしてフルオレセインである。

【００６３】式（Ｉ）の本発明によるとくに好ましいポ
リマーの染料において、Ｂはエステル、酸アミド、ウレ
タン、尿素および／またはチオ尿素の基を経て共有結合
した式（ＩＩ）のクマリンであり、Ｃはナトリウムスチ
レンスルホネートであり、Ｄは（メト）アクロイルクロ
ライド、Ｎ−ヒドロキシ−スクシニミジル（メト）アク
リレート、Ｎ−ヒドロキシ−フタリミジル（メト）アク
リレート、Ｎ−（メト）アクロイルベンゾトリアゾー
ル、３−または４−イソチオシアナトフェニル（メト）
アクリレート、２−イソチオシアナトエチル（メト）ア
クリレート、イソチオシアナトイソプロペニルベンゼ
ン、イソプロペニル−α，α−ジメチルベンジルイソシ
アネート、ビニルオキシランまたは（メト）アクリル酸
とカーボジイミドとの組み合わせであり、ａは０であ
り、ｂは１２〜３５重量％であり、ｃは６２〜８５重量
％であり、そしてｄは０．０７〜４．５重量％である。

【００６４】式（Ｉ）の本発明によるポリマーの染料
は、例えば、成分Ａ〜Ｄのそれ自体知られているフリー
ラジカル重合により調製することができる。フリーラジ
カルの形成に適当な化合物の例は、過酸化物およびアゾ
化合物、例えば、過酸化ベンゾイルおよびアゾビスイソ
ブチロニトリルであり、そして溶媒の適当な例はジメチ
ルホルムアミドおよびジメチルスルホキシドである。

【００６５】染料の分子ＢおよびＣおよび／または芳香
族構成ブロックＣは、例えば、対応する染料または芳香
族モノマー、例えば、（メト）アクリル酸またはその
（メト）アクリルアミドの共重合によるか、あるいは好
ましくはアミノを含有する染料または芳香族構成ブロッ
クをポリマー類似反応においてポリマーの主鎖の反応性
基と反応させることによって組み込むことができる。

【００６６】Ｄについて、適当な反応性基および反応性
とすることができる基の例は、ハライド、イミドエステ
ル、ベンゾトリアゾリル、イソシアネート、イソチオシ
アネート、オキシランまたはジイミド基である。Ｄが酸
ハライド基を含有する場合、プロトンのスカベンジャ
ー、例えば、第３アミンを使用することは有利である。
染料ＢおよびＣおよび／または芳香族構成ブロックの組
み込みに、および反応性基を生物学的物質と結合する目
的で重合により組み込まれる反応性基を活性化するため
に適当な溶媒は、反応性基に対して不活性である溶媒、
例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシ
ド、ジメチルアセトアミドおよびアセトニトリルであ
る。

【００６７】反応性基を生物学的物質と結合する目的で
加水分解に対して感受性である反応性基の活性化は、例
えば、重合の前後に、アミノアルコールＨ₂Ｎ−Ｒ²⁴−
ＯＨ（ここでＲ²⁴はＣ₁−Ｃ₁₂アルキレンである）によ
り実施することができ、ここでＯＨ官能基が生成し、こ
れを引き続いて、例えば、トリフルオロメタンスルホニ
ル、メタンスルホニル、トリフルオロアセチル、ベンゼ
ンスルホニル、カルボキシベンゼン−３−スルホニルま
たはｐ−トルエンスルホニル基に転化することによって
活性化することができる。

【００６８】さらに、この目的で、また、活性化するこ
とができる脂肪族アルコール基、例えば、ヒドロキシア
ルキル（メト）アクリレート、例えば、ヒドロキシエチ
ル（メト）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メト）
アクリレートまたはブタンジオールモノ（メト）アクリ
レートを、既に、含有するモノマーを組み込むことがで
きる。

【００６９】生物学的物質とポリマーの染料との結合の
ために水性反応媒質を必要としないか、あるいは反応性
基が加水分解に対して安定である場合、染料のポリマー
は前以て活性化しないで生物学的物質と直接させること
ができる。

【００７０】活性化を実施した後、ポリマーの染料はそ
れ自体知られている方法により、例えば、溶媒の蒸発お
よび／または適当な有機媒質中のポリマーの染料の沈澱
により単離ことができる。

【００７１】過剰の試薬は、ポリマーの染料の沈澱の間
に、反復した再沈澱によるか、あるいは水溶性試薬の場
合において、透析または限外ろ過により、分離すること
ができる。

【００７２】次いで、精製したポリマーの染料を乾燥
し、次いで本発明によるポリマーの染料を得ることがで
きる。

【００７３】次いで、活性化した染料のポリマーを生物
学的基質（例えば、抗体または適当な官能化されたオリ
ゴヌクレオチド）と水溶液中で反応させることができ
る。得られた混合物を試験において直接または前以て精
製後にさえ使用することができる（例えば、イムノアッ
セイまたは遺伝子のプローブ試験）。

【００７４】適当な官能化されたオリゴヌクレオチドは
知られている。それらは、例えば、アミノ、メルカプト
またはヒドロキシル官能を中間のスペーサーを経て含有
するオリゴヌクレオチド意味すると理解される。

【００７５】このような試験の性能の決定に重要な性質
は感受性である。今日普通のほとんどの試験において、
それは反応性マーカーにより達成される。しかしなが
ら、この方法はとくに応用における重大な欠点（放射線
の危険、物質の分解、使用済み物質の廃棄の困難、特別
の実験室の装置、特別の人員の訓練）を有し、これらは
日常的方法に対するこの固有に有利な強力な試験の拡張
をこれまで妨害してきている［参照、例えば、ＷＯ８８
−０２７８４およびファーマシア１９８８年４月２１日
の（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）］。

【００７６】放射性標識つけを問題のない染料の標識つ
けと置換するために、いくつかの試みなされてきてい
る。これは放射性標識つけの欠点を回避するが、それを
使用して達成される感度は多数の試験について十分では
ない［参照、例えば、核酸の研究（ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄｓＲｅｓ．）１６、４９５７］。

【００７７】これは本発明によるポリマーの染料は放射
線を使用しないで感度の増加という利点を生ずる場合で
ある。

【００７８】本発明によるポリマーの染料は、通常、Ｍ
ｎ＝２×１０³〜５×１０⁶ダルトン程度の平均分子量を
有する。約１０⁴〜１０⁶ダルトンの分子量は好ましい。

【００７９】分析の普通の条件下に、ポリマーの染料の
少なくとも０．１％、好ましくは少なくとも１％は水性
媒質の中に可溶性である。

【００８０】分析の普通の条件は、生物学的試験におい
て、とくに結合分析の方法、例えば、イムノアッセイま
たは遺伝子のプローブ試験において存在する条件であ
る。これらの条件は、例えば、約７０℃までの温度およ
び約３〜１１の間のｐＨ値からなる。特定の試験におい
て、本質的特徴はポリマーの染料の水溶性である。なぜ
なら、これは生物学的分析の方法において染料を使用可
能とするからである。

【００８１】本発明によるポリマーの染料は既知のポリ
マーの染料より非常に高い強度の蛍光を示す。なぜな
ら、それらを使用することによって、モル吸光度に加え
て、高い量子収率を同時に達成することができるからで
ある。本発明によるポリマーの染料は、しばしば、１０
０より大きい増幅の程度に到達する。（参照、実施例
６）。

【００８２】実施例１重合可能な染料のモノマーのクマリンＩｂの調製４ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂中に溶解した１．３５ｇのアクリロ
イルクロライドは、０℃において窒素雰囲気下に、６５
ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂中に溶解した４ｇのクマリンＩａ

【００８３】

【化１８】

【００８４】に滴々添加する。次いで混合物を室温に加
温し、そしてさらに２時間撹拌し、形成した沈澱を吸引
濾過し、ＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄し、そして高真空下に室温に
おいて乾燥した。

【００８５】クマリンＩｂの収量は定量的である。

【００８６】実施例２重合可能な染料のモノマーのクマリンＩＩｂの調製５ｍｌのＤＭＡＣ中に溶解した０．９ｇのアクリロイル
クロライドを、ｏ℃において窒素雰囲気下に、５０ｍｌ
のＤＭＡＣ中に溶解した４ｇのクマリンＩＩａ

【００８７】

【化１９】

【００８８】に滴々添加する。この溶液の半分を滴々添
加した後、５ｍｌのＤＭＡＣ中に溶解した１．０３ｇの
トリエチルアミンを同時に添加する。滴々添加が完結し
た後、この混合物を室温に加温し、そしてさらに２時間
撹拌し、形成した沈澱を濾過し、濾液を高真空下に濃縮
し、そしてエーテルから結晶化する。

【００８９】クマリンＩＩｂの収率は８５％である。

【００９０】実施例３重合可能なコモノマーのナフチルアクリレートの調製４ｇのβ−ナフトールを、実施例２に記載する条件下
に、２．４８ｇのアクリロイルクロライドおよび２．７
７ｇのトリエチルアミンと反応させる。収率７８％。

【００９１】実施例４重合可能な反応性基の調製５ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂中に溶解した５ｇのイソシアナトエ
チルメタクリレートを、０℃において、４５ｍｌのＣＨ
₂Ｃｌ₂中に溶解した３．７７ｇのアミノヘキサノールに
滴々添加する。次いで、この混合物を室温に加温し、そ
してさらに１時間撹拌する。ＣＨ₂Ｃｌ₂を回転蒸発器で
高真空下に蒸発させ、そして粗生成物をエーテルから結
晶化する。収量は定量的である。

【００９２】実施例５ポリマーの染料の調製１ｇの実施例２からのクマリンＩＩｂおよびナトリウム
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホネート
（Ｎａ−ＰＳＳ）またはメタクリル酸（ＭＡＡ）、ナフ
チルアクリレート（実施例３）および１２ｍｇのＡＩＢ
Ｎ（合計のモノマーの重量４ｇ、表１における組成）を
２５ｍｌのＤＭＳＯの中に導入し、装置を排気し、Ｎ₂
でガス化し、この方法を反復し、この溶液を６５℃に加
熱し、そして１５時間反応させる。反応溶液を２００ｍ
ｌのアセトンに滴々添加し、形成した沈澱を濾過し、そ
して乾燥する。粗製のポリマーを限外ろ過する（１０，
０００ダルトンをカットオフする）。

【００９３】収率７０〜８０％。

【００９４】

【表１】表１染料のポリマーと脂肪族および芳香族の成分との量子収率の比較ＡＢＣＤＥＦＮａ−ＰＳＳ − − 75% − 50% − Ｎａ−ＡＭＰＳ − 75% − 50% − − ＭＡＡ 75% − − − − − クマリンＩＩｂ 25% 25% 25% 25% 25% 100%* ナフチルアクリレート − − − 25% 25% − 量子収率¹ 0.23¹ 0.15¹ 0.5¹ 0.25¹ 0.5¹ 0.3³ 0.39² 0.41² ＊実施例２からのモノマー¹ Ｈ₂Ｏ中、ｐＨ９² ＤＭＳＯ中、ｐＨ９³ Ｈ₂Ｏ／ｐＨ９、部分的にのみ溶解。

【００９５】実施例６ポリマーの分子量への増幅度の依存性ポリマーＣ₂を実施例５からのポリマーＣにおけるよう
に調製するが、ただし１２ｍｌのＤＭＳＯを２０ｍｌの
ＤＭＳＯの代わりに重合に使用した。

【００９６】分子量およびそれらの分布を、水性ゲル透
過クロマトグラフーと低い角度のレーザー光線の散乱
（ＬＡＬＬＳ）との組み合わせにより決定した。

【００９７】ポリマー中のフルオロフォアの百分率を、
次の式により決定した：（ポリマーの吸光／ｇ）／（クマリンＩＩｂの吸光／
ｇ）×１００％

【００９８】

【表２】染料％Ｍ_n Ｍ_w Ｍ_w 増幅度Ｕ＝− -1 Ｍ_n ポリマーＣ 22 108,000 259,000 1.39 50.8 （実施例５から）ポリマーＣ₂ 22 337,000 787,000 1.33 158.5実施例７互いに対して相補的である２つの蛍光染料を含有するポ
リマーの調製２ｇのヒドロキシエチルメタクリレートを８ｍｌのジメ
チルアセトアミド中に溶解し、２０ｍｇのＡＩＢＮを添
加し、反応フラスコを排気し、排気し、高い純度の窒素
でガス化し、この方法を３回反復し、この混合物を６５
℃に加熱し、そして１５時間反応させる。冷却後、１０
ｍｌのＤＭＳＯおよび１０ｍｇのテトラメチルローダミ
ンイソチオシアネートをこの粗製溶液に添加し、そして
８０℃において６時間撹拌した。次いで２５０ｍｇのフ
ルオレセインイソチオシアネートを添加し、そしてこの
混合物を８０℃においてさらに１５時間撹拌した。この
生成物を酢酸エチル中の粗製溶液から沈澱させ、吸引濾
過し、そしてエタノール／エーテル中で２回再沈澱さ
せ、そして高真空下に乾燥した。

【００９９】粗製ポリマーを実施例５に記載するように
限外ろ過した。

【０１００】水／メタノールの中にｐＨ１１において溶
解し、５００ｎｍで励起したポリマーの放射スペクト
ル、すなわち、蛍光の吸光度最大は、５７５ｎｍ、ロー
ダミンの放射波長、において広い肩を示し、これは量子
収率の２７％に寄与した。（その寄与は、７３％の合計
の量子収率に相当する合計の領域の積分から計算し
た）。したがって、フルオレセインからローダミンへの
効率よいエネルギーの転移が起こり、その結果ローダミ
ンは増感されるようになる。５４９．４ｎｍにおいて励
起した、すなわち、吸光最大におけるローダミンの直接
励起の、同一溶液は、その最大が５７４．７ｎｍであり
かつその量子収率が３０％である放射を示した。

【０１０１】実施例８結合可能なポリマーの染料の合成この手順は実施例５からのポリマーＣの手順に類似した
が、追加の２００ｍｇの実施例４からの反応性モノマー
を添加した。１ｇの

【０１０２】

【化２０】

【０１０３】３−（クロロスルホニル）安息香酸およ
び、３０分後、０．５ｇのトリエチルアミンをＤＭＳＯ
を含有するポリマー溶液に添加し、この混合物を室温に
おいて１反応させ、そして生成物を沈澱させ、そして実
施例５に記載するように限外ろ過した。

【０１０４】実施例９１００μｇの配列ＣＴＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＣ
ＴＴＣＴＣＣＣＣＴＧＡＧＴＣＴＧＴ［合成は
Ｎ．Ｄ．シンハ（Ｓｈｉｎｈａ）およびＲ．Ｍ．クック
（Ｃｏｏｋ）、核酸の研究（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
ｓＲｅｓｅａｒｃｈ）１６、２６５９（１９８８）に
従う］のアミノリンクオリゴヌクレオチドを３００μｌ
の炭酸塩緩衝液（ｐＨ９）の中に溶解し、そして２００
μｌの炭酸塩緩衝液中の過剰の実施例８に従うポリマー
の蛍光染料を添加する。この反応は室温において６０時
間かけて実施する。仕上げはバイロラド−バイオ−ゲル
（Ｂｉｏｒａｄ−Ｂｉｏ−Ｇｅｌ）Ｐ４のゲル濾過によ
るか、あるいはＲＰ１８の逆相高性能液体クロマトグラ
フィーによりトリエチルアンモニウムアセテート／アセ
トニトリルを溶離剤として使用することによって実施す
る。

【０１０５】実施例１０１００μｌの配列ＡＴＣＴＡＣＴＧＧＣＴＣＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴのアミノリンクオリゴヌク
レオチドを２００μｌの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９）の中に
溶解し、そして２００μｌの炭酸塩緩衝液中の過剰の実
施例８に従うポリマーの蛍光染料を添加し、そしてこの
混合物を室温において６０時間撹拌する。仕上げのため
に、反応混合物全体をポリＡ−セファロース４Ｂカラム
（５ｍｌ）（ファーマシア）に適用する。結合しない染
料を適用緩衝液（Ａ）（下を参照、２０ｍｌ）を使用し
て洗浄除去し、このカラムを溶離緩衝液（Ｂ）（下を参
照、３０ｍｌ）で洗浄し、そしてカップリング生成物を
最後に溶離緩衝液（Ｃ）（下を参照、４０ｍｌ）を使用
して洗浄除去する。

【０１０６】適用緩衝液（Ａ）：１．５１３ｇのトリ
ス、１０．２３ｇのＮａＣｌ、０．５６ｇのＥＤＴＡを
７５０ｍｌの水中に溶解し、そしてこの溶液をホルムア
ミドで１リットルにする。

【０１０７】溶離緩衝液（Ｂ）：７．４５ｇのＫＣｌを
１００ｍｌの適用緩衝液Ａ中に溶解する。

【０１０８】溶離緩衝液（Ｃ）：３．７ｇのＫＣｌおよ
び５０ｍｌのホルムアミドを適用緩衝液Ａで１００ｍｌ
にする。

【０１０９】ＤＮＡプローブ試験においてこうして標識
したアミノリンクオリゴヌクレオチドを使用することに
よって、モノマーの蛍光染料で標識したＤＮＡプローブ
と比較して増加した感度が達成される。

【０１１０】実施例１１免疫学的試験系におけるポリマーの蛍光染料の使用１０ｍｇの実施例８に従うポリマーの染料を１０ｍｌの
０．５モルの炭酸塩／重炭酸塩の緩衝液の中にｐＨ９．
０において溶解する。５ｍｌの炭酸塩緩衝液ｐＨ９．０
（０．５モル）中の５ｍｇのホスホジエステラーゼ［シ
グマ（Ｓｉｇｍａ）からのガラガラヘビの毒から］を添
加し、この混合物を室温において４時間撹拌し、次いで
冷蔵庫の中で反応を一夜続ける。次いでｐＨを１ＮのＮ
ａＯＨで１１とし、そして粗製の溶液をクロマトグラフ
ーにかける（ｐＨ１１の０．０２モルの炭酸塩緩衝液中
のファーマシアからのセファクリルＳ−５００、１６ｍ
ｍのカラム直径、高さ１００ｃｍ）。

【０１１１】５００ｍｌの炭酸塩緩衝液が通過した後、
カラムを１０００ｍｌの水中の２．５％強度のアンモニ
ア溶液で洗浄した。

【０１１２】２００ｍｌの溶離体積において第１ピーク
はＰＤＥ活性＊および蛍光を含有する。

【０１１３】転化しない染料および転化しないＰＤＥは
後に溶離される。

【０１１４】＊ＰＤＥ活性についての試験：４００μｌの溶離液６００μｌの０．１モルのトリス緩衝液ｐＨ８．８２００μｌの０．３モルのマグネシウムアセテートおよ
び１０００μｌの１ミリモルのビス（ｐ−ニトロフェニ
ル）ホスフェートを１０５分間３７℃において反応させ
ると、黄色が発生する。

【０１１５】本発明の主な特徴および態様は、次の通り
である。

【０１１６】１、式（Ｉ）

【０１１７】

【化２１】［Ａ］_a−［Ｂ］_b−［Ｃ］_c−［Ｄ］_d （Ｉ）式中、Ａは水溶性構成ブロックであり、Ｂはエステル、
酸アミド、ウレタン、尿素および／またはチオ尿素の基
を経て共有結合した蛍光染料の分子であり、Ｃは芳香族
の構成ブロックまたは第２蛍光染料であり、該第２蛍光
染料はエステル、酸アミド、ウレタン、尿素および／ま
たはチオ尿素の基を経て共有結合しており、そして蛍光
染料Ｂに対して相補的であり、Ｄはモノマーの構成ブ
ロックであり、該構成ブロックはタンパク質におよび、
必要に応じて、可能ならば成分Ｂおよび／またはＣに、
共有結合し、そしてａ、ｂ、ｃおよびｄは、成分Ａ、
Ｂ、ＣおよびＤの重量％を表し、これらは合計１００重
量％である、のポリマーの染料。

【０１１８】２、成分Ｃは蛍光染料であり、前記蛍光染
料は、励起後、ある波長の範囲の光を放射し、前記範囲
は特定の蛍光染料Ｂがその最大吸収を有する波長と±２
０ｎｍだけ異なる、上記第１項記載のポリマーの染料。

【０１１９】３、成分Ａはアクリル酸、メタクリル酸、
アクリルアミド、メタアクリルアミドまたはそれらの誘
導体である、上記第１項記載のポリマーの染料。

【０１２０】４、成分Ｃは、スチレン、α−メチルスチ
レン、式（ＸＩＩ）

【０１２１】

【化２２】

【０１２２】式中、Ｒ¹⁹は水素またはメチルであり、Ｒ
²⁰はＣＨ₂またはＳＯ₂であり、ｍは０または１であり、
そしてＺはハロゲン、ＳＯ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ハロゲ
ン、ＯＭｅ、ＳＯ−ＣＨ₃またはメチルであり、ここで
Ｍｅは１当量の金属である、の化合物、１−ビニルナフ
タレン、２−ビニルナフタレン、１−ビニルカルバゾー
ル、式（ＸＩＩ）の化合物に類似するが、芳香族の親構
造としてナフタレンまたはカルバゾールを含有する化合
物または式（ＸＩＩＩ）

【０１２３】

【化２３】

【０１２４】式中、Ｒ²¹は水素、ＳＯ₃Ｈ、ＣＯＯＨ、
ＳＯ₃ＭｅまたはＣＯＯＭｅであり、ここでＭｅは１当
量の金属であり、そしては水素またはメチルである、の芳香族アミン、フェノー
ル、芳香族ヒドロキシカルボン酸、ヒドロキシスルホン
酸、アミノカルボン酸およびアミノスルホン酸から誘導
された（メト）アクリルアミドまたは（メト）アクリレ
ートである、上記第１項記載のポリマーの染料。

【０１２５】５、成分Ｄは（メト）アクロイルクロライ
ド、Ｎ−ヒドロキシ−スクシニミジル（メト）アクリレ
ート、Ｎ−ヒドロキシ−フタリミジル（メト）アクリレ
ート、Ｎ−（メト）アクロイルベンゾトリアゾール、３
−または４−イソチオシアナトフェニル（メト）アクリ
レート、２−イソチオシアナトエチル（メト）アクリレ
ート、イソチオシアナトイソプロペニルベンゼン、イソ
プロペニル−α，α−ジメチルベンジルイソシアネー
ト、ビニルオキシランまたは（メト）アクリル酸とカー
ボジイミドとの組み合わせである、上記第１項記載のポ
リマーの染料。

【０１２６】６、Ｄは抗体、抗原ハプテンまたは核酸に
共有結合している、上記第１項記載のポリマーの染料。

【０１２７】７、ａは０〜９０重量％であり、ｂは５〜
５０重量％であり、ｃは５〜８９．９９重量％であり、
そしてｄは０．０１〜１０重量％である，上記第１項記
載のポリマーの染料。

【０１２８】８、成分ＢはローダミンＢであり、そして
成分Ｃはフルオレセインである、上記第１項記載のポリ
マーの染料。

【０１２９】９、成分Ａ〜Ｄをフリーラジカル重合する
ことからなる、上記第１項記載のポリマーの染料を調製
する方法。

【０１３０】１０、フリーラジカルは過酸化物またはア
ゾ化合物である、上記第９項記載の方法。

【０１３１】１１、ジメチルスルホキシドまたはジメチ
ルホルムアミドを溶媒として使用する、上記第９項記載
の方法。

【０１３２】１２、上記第１項記載のポリマーの染料を
使用する、生物学的物質を標識する方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ハンス−ウルリヒ・ジークムントドイツ連邦共和国デー4150クレーフエルト１・ローンシユトラーセ100 (72)発明者ヘルベルト・フクルドイツ連邦共和国デー5060ベルギツシユグラートバツハ２・ゲマルケンベーク９ (72)発明者アントニウス・レツベルデイングドイツ連邦共和国デー5600ブツペルタール１・アムローム105 (72)発明者エベルハルト・クツカートドイツ連邦共和国デー5090レーフエルクーゼン１・アムシエルフエンブラント67 (72)発明者ブルーノ・ベーマードイツ連邦共和国デー5060ベルギツシユグラートバツハ２・マクス−プランク−シユトラーセ53 (72)発明者トーマス・ベツカードイツ連邦共和国デー4000デユツセルドルフ１・フオービンケルアレー28 (72)発明者ギユンター・フランケドイツ連邦共和国デー5653ライヒリンゲン１・ランドラト−トリムボルン−シユトラーセ60

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式（Ｉ）【化１】［Ａ］_a−［Ｂ］_b−［Ｃ］_c−［Ｄ］_d （Ｉ）式中、Ａは水溶性構成ブロックであり、Ｂはエステル、酸アミド、ウレタン、尿素および／また
はチオ尿素の基を経て共有結合した蛍光染料の分子であ
り、Ｃは芳香族の構成ブロックまたは第２蛍光染料であり、
該第２蛍光染料はエステル、酸アミド、ウレタン、尿素
および／またはチオ尿素の基を経て共有結合しており、
そして蛍光染料Ｂに対して相補的であり、Ｄはモノマ
ーの構成ブロックであり、該構成ブロックはタンパク質
におよび、必要に応じて、可能ならば成分Ｂおよび／ま
たはＣに、共有結合し、そしてａ、ｂ、ｃおよびｄは、
成分Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの重量％を表し、これらは合計
１００重量％である、のポリマーの染料。
【請求項２】成分Ａ〜Ｄをフリーラジカル重合するこ
とからなる、請求項１のポリマーの染料を調製する方
法。
【請求項３】請求項１のポリマーの染料を使用する、
生物学的物質を標識する方法。