JPH05227954A - 新規なグリセロールデヒドロゲナーゼ、その製法及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 可溶化および安定化に界面活性剤を必要とし
ないピロロキノリノキノン依存性グリセロールデヒドロ
ゲナーゼを提供する。 【構成】 （１）次の性質を有するグリセロールデヒド
ロゲナーゼ、その製法およびその用途。 次の反応を触媒する。 グリセロール＋電子受容体→ジヒドロキシアセトン（グ
リセルアルデヒド）＋還元型電子受容体 至適作用ｐＨ：ｐＨ８〜９ ｐＨ安定性：ｐＨ７〜１１ 至適作用温度：２０〜２５℃ 熱安定性：ｐＨ７．０、１０分の反応で３０℃以下で
安定である。 分子量：ゲル濾過法およびＳＤＳアクリルアミドゲル
電気泳動法で７万の分子量を示す。 補欠分子属としてピロロキノリノキノンを含む。 可溶化および安定化に界面活性化剤を必要としない。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規な特性を有するグリ
セロールデヒドロゲナーゼ、その製法およびその用途に
関するものである。本発明のグリセロールデヒドロゲナ
ーゼはピロロキノリノキノン（ＰＱＱ）を補欠分子属と
して有し、可溶化および安定化に界面活性化剤を必要と
しないから、試料中にグリセロールを含む系において、
グリセロールの定量を感度よく定量することができる。

【０００２】

【従来の技術】従来、試料中のグリセロールをグリセロ
ールデヒドロゲナーゼで定量する方法は次の反応式に従
う。 グリセロール＋ＮＡＤ＋→ジヒドロキシアセトン＋ＮＡ
ＤＨ（グリセロールデヒドロゲナーゼ） この方法はＮＡＤのように高価な補酵素を用いていた
が、本発明者らは、より安価で、簡便なグリセロール測
定法を開発しようと考えた。そこで注目したのが人工電
子受容体を利用するＰＱＱ依存性グリセロールデヒドロ
ゲナーゼである。該グリセロールデヒドロゲナーゼは、
既に酢酸菌由来のもの（Ameyama et. al.Agric.Biol.Ch
em.,49,1001-1010(1985)）が報告されている。しかしな
がら該酵素は細胞膜結合型酵素であり、菌体からの可溶
化および安定化に特定の界面活性化剤を必要とし、好ま
しくない界面活性化剤が存在することによりグリセロー
ルの測定において、測定誤差を生じることが考えられ
る。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは上記の背
景を踏まえ、可溶化および安定化に界面活性化剤を必要
としないＰＱＱ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼを
見いだそうと種々試みた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記問題点
を解決するため鋭意研究を重ねた結果、シュードモナス
・エスピー（Pseudomonas sp. ）ＴＥ３４９３から可溶
性のグリセロールデヒドロゲナーゼを見いだし、本発明
を完成するに至った。すなわち本発明は、次の性質を有
するグリセロールデヒドロゲナーゼである。 次の反応を触媒する。 グリセロール＋電子受容体→ジヒドロキシアセトン（グ
リセルアルデヒド）＋還元型電子受容体 至適作用ｐＨ：ｐＨ８〜９ ｐＨ安定性：ｐＨ７〜１１ 至適作用温度：２０〜２５℃ 熱安定性：ｐＨ７．０、１０分の反応で３０℃以下で
安定である。 分子量：ゲル濾過法およびＳＤＳアクリルアミドゲル
電気泳動法で７万の分子量を示す。 補欠分子属としてピロロキノリノキノンを含む。 可溶化および安定化に界面活性化剤を必要としない。

【０００５】また本発明はシュードモナス属に属し、上
記の新規なグリセロールデヒドロゲナーゼの生産能を有
する菌株を栄養培地にて培養し、該培養物から新規なグ
リセロールデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とす
る新規なグリセロールデヒドロゲナーゼの製造法であ
る。更に本発明は試料中のグリセロールを分析する系に
おいて、上記の新規なグリセロールデヒドロゲナーゼを
用いるグリセロールの定量法である。

【０００６】本発明の酵素の性質は以下の通りである。 次の反応を触媒する。 グリセロール＋電子受容体→ジヒドロキシアセトン（グ
リセルアルデヒド）＋還元型電子受容体 至適作用ｐＨ：ｐＨ８−９ ｐＨ安定性：ｐＨ７−１１ 至適作用温度：２０−２５℃ 熱安定性：ｐＨ７．０、１０分の反応で３０℃以下で
安定である。 分子量：ゲル濾過法およびＳＤＳアクリルアミドゲル
電気泳動法で７万の分子量を示す。 補欠分子属としてピロロキノリノキノンを含む。 可溶化および安定化に界面活性化剤を必要としない。

【０００７】本発明の酵素の起源は上記性質を有するグ
リセロールデヒドロゲナーゼを産生しうるものであれば
動物、植物、微生物など如何なる起源のものを用いても
良い。好ましくは、上記性質を有するグリセロールデヒ
ドロゲナーゼを産生しうるシュードモナス属細菌であっ
て、好適な例としてはシュードモナス・エスピー（Pseu
domonas sp. ）ＴＥ３４９３が挙げられる。シュードモ
ナス・エスピーＴＥ３４９３は土壌中より分離した菌株
であり、その菌学的性質は以下の通りである。 （ａ）形態 （１）菌形：短かん菌 （２）細胞の大きさ：２．０〜２．５×１．０μｍ （３）運動性：あり。 （４）細胞の多形性：なし。 （５）胞子の有無：なし。 （６）グラム染色性：陰性。 （７）抗酸性：陰性。 （ｂ）各培地における生育状態 （１）肉汁寒天平板培養：３０℃、４８時間培養で淡褐
色円形のコロニーを形成する。コロニーの周縁は全縁、
もしくは波状であり、隆起状である。表面は滑らかで光
沢を有し、不透明である。色素の生成はない。 （２）肉汁寒天斜面培養：生育は良好で（１）に同じ。 （３）肉汁液体培養：生育は良好で、やや濁り沈さも少
しある。 （４）肉汁ゼラチン穿刺培養：上部でのみ良好な生育を
示す。ゼラチンは液化しない。 （５）リトマスミルク：色に変化はない。ミルクは固化
する。 （ｃ）生理学的性質 （１）硝酸塩の還元：陰性。 （２）脱窒反応：陰性。 （３）ＭＲテスト：陰性。 （４）ＶＰテスト：陰性。 （５）インドールの生成：陰性。 （６）硫化水素の生成：陰性。 （７）デンプンの加水分解：陰性。 （８）クエン酸の利用：Koser の培地、Christensen の
培地ともに陽性。 （９）無機Ｎ源の利用：アンモニウム塩は利用するが、
硝酸塩は利用しない。 （１０）色素の生成：色素を生成しない。 （１１）ウレアーゼ：陰性。 （１２）オキシダーゼ：陽性。 （１３）カタラーゼ：陽性。 （１４）β−ガラクトシダーゼ：陰性。 （１５）アルギニンジヒドラーゼ：陽性。 （１６）リジンデカルボキシラーゼ：陰性。 （１７）オルニチンデカルボキシラーゼ：陰性。 （１８）トリプトファンデアミナーゼ：陰性。 （１９）β−グルコシダーゼ：陰性。 （２０）生育の範囲：ｐＨ５．０〜１０．０で生育。温
度２０〜３７℃で生育。４２℃で生育しない。 （２１）酸素に対する態度：好気性。 （２２）Ｏ−Ｆテスト：Ｏ（酸化） （２３）糖からの酸の生成 Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−フラクトース − Ｄ−ガラクトース ＋ Ｄ−マンノース ＋ Ｄ−キシロース − Ｄ−ソルビット − Ｄ−マンニトール − イノシット − Ｌ−ラムノース − サッカロース − マンノース − ラクトース − Ｄ−メリビオース − Ｄ−アミダクリン − グリセリン − でんぷん −

【０００８】上記菌学的性質同定のための実験法は主と
して長谷川武治編著、改訂版「微生物の分類と同定」学
会出版センター（１９８５年）によって行った。また分
類同定の基準として「バージッス・マニュアル・オブ・
デタミネイティブ・バクテリオロジー」第８版を参考に
した。以上の文献および菌学的性質から本菌はシュード
モナス属に属するとみなされる。さらに本菌は種々の性
質がシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）と
よく一致したが、水溶性蛍光色素を産生しないので、本
菌株をシュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp. ）
ＴＥ３４９３と命名した。なお本菌は工業技術院微生物
工業技術研究所に微工研菌寄第１２２９８号として寄託
されている。

【０００９】本発明の酵素を製造するにあたっては、上
記グリセロールデヒドロゲナーゼ生産菌を栄養培地に培
養し、該培養物からグリセロールデヒドロゲナーゼを採
取することにより製造できる。グリセロールデヒドロゲ
ナーゼ生産菌の培養にあたって使用する培地としては、
使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他
必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地、
天然培地いづれも使用できる。炭素源としては、例えば
グルコース、グリセロール等が使用される。窒素源とし
ては、例えばペプトン類、肉エキス、酵母エキス等の窒
素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニ
ウム等の無機窒素含有化合物が使用される。無機物とし
ては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネ
シウム等が使用される。またグリセロールデヒドロゲナ
ーゼの生産誘導物質として、グリセロールを培地に添加
しておくことが望ましい。培地は通常振とう培養、ある
いは通気撹はん培養で行う。培養温度は２０〜４０℃、
好ましくは２５〜３７℃、培養ｐＨは５〜９の範囲で、
好ましくは７〜８に制御するのが良い。これら以外の条
件下でも使用する菌株が生育すれば実施できる。培養期
間は通常１〜１０日で生育し、菌体内にグリセロールデ
ヒドロゲナーゼが生産蓄積される。

【００１０】本発明の酵素の精製法は一般に使用される
精製法を用いれば良い。例えば、抽出法には超音波破
砕、ガラスビーズを用いる機械的な破砕、フレンチプレ
ス、界面活性剤などいずれを用いても良い。さらに抽出
液については、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネ
シウムや塩化カルシウムなどの金属凝集法、プロタミン
やポリエチレンイミンなどの凝集法、さらにはＤＥＡＥ
（ジエチルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カル
ボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマ
ト法などにより精製することができる。またこれらの方
法で得られた粗酵素液や精製酵素液は、例えば、スプレ
ードライや凍結乾燥により粉末化できる。さらには適当
な担体に固定化して固定化酵素として使用できる。

【００１１】次に本発明の新規なグリセロールデヒドロ
ゲナーゼの活性測定法を示す。反応液に５０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．７ｍｌ，０．１Ｍグリセ
ロール０．１ｍｌ，酵素液を加えて全液量を０．９ｍｌ
とする。２５℃で５分間予備加温を行った後、０．１Ｍ
フェリシアン化カリウムを０．１ｍｌ添加して反応を開
始する。硫酸第２鉄・デュパノール試薬を０．５ｍｌ添
加して反応を停止させる。蒸留水を３．５ｍｌ加えて全
液量を５ｍｌとし、２５℃で３０分放置後に６６０ｎｍ
での吸光度を測定する。盲検は酵素液の代わりに蒸留水
を加え、上記同様に操作を行う。グリセロールデヒドロ
ゲナーゼの活性の表示は、上記条件下で１分間で１マイ
クロモルのグリセロールを酸化する酵素活性を１単位
（Ｕ）とする。

【００１２】また本発明は試料中のグリセロールを分析
する系において、新規なグリセロールデヒドロゲナーゼ
を用いるグリセロールの定量法である。グリセロールを
含む試料としては、食品、血清や血奬等が挙げられ、本
発明のグリセロールデヒドロゲナーゼを用いて以下の方
法でグリセロールを定量できる。電子受容体として、例
えばフェリシアン化カリウムを用い、吸光度の減少を測
定するか、または２，６−ジクロロフェノールインドフ
ェノールとフェナジンメトスルフェートの共存下で吸光
度の減少を測定する。さらにはフェナジンメトスルフェ
ートとニトロテトラゾリウムブルー存在下で生成するホ
ルマザン発色を測定することで定量できる。また本発明
の酵素は血清や血奬等の中性脂肪測定にも有利に使用す
ることができる。すなわちこれらの試料の中性脂肪は、
例えばリポプロテインリパーゼにより遊離脂肪酸とグリ
セロールに分解されるが、ここで生じたグリセロールを
本発明のグリセロールデヒドロゲナーゼを使用し、上記
方法を利用して定量することができる。中性脂肪測定時
には精神病治療患者、透析患者では遊離グリセロールが
問題になるが、本発明のクリセロールデヒドロゲナーゼ
を用いればグリセロールを予め消去するか、もしくはそ
の量を測定しておくことで真の中性脂肪値を求めること
が可能である。本発明の酵素は可溶化または安定化に特
定の界面活性剤を使用しないので、グリセロールの測定
時において、好ましくない界面活性剤の使用により起き
る測定誤差を回避することが可能である。

【００１３】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示
す。 実施例１ グリセロール０．５％、ＮａＮＯ₃ ０．２％、（Ｎ
Ｈ₄ ）₂ ＳＯ₄ ０．２％、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ １％、ＫＨ₂ Ｐ
Ｏ₄ １％、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．０２％、酵母エキ
ス０．０５％を含む培地１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口
フラスコに移し、１２１℃、１５分間オートクレーブを
行った。種菌として、シュードモナス・エスピー（Pseu
domonas sp.）ＴＥ３４９３（微工研菌寄第１２２９８
号）を一白菌耳植菌し、３０℃で２４時間培養し、種培
養液とした。次に同培地６ｌを１０ｌ容ジャーファーメ
ンターに移し、１２１℃で１５分間オートクレーブを行
い、放冷後、種培養液１００ｍｌを移し、３００ｒｐ
ｍ，通気量２ｌ／分、３０℃で３０時間培養した。培養
液を遠心分離にて集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁
した。フレンチプレスで処理し、遠心分離を行い、上清
液を得た。得られた粗酵素液を硫安分画、ＤＥＡＥーセ
ルロースクロマトグラフィー、ＤＥＡＥートヨパールク
ロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマト
グラフィー、ゲル濾過の順に分画し、比活性１５Ｕ／ｍ
ｇの酵素標品を得た。得られたグリセロールデヒドロゲ
ナーゼは下記の特性を有していた。 (1)下記の反応を触媒した。 グリセロール＋電子受容体→ジヒドロキシアセトン（グ
リセルアルデヒド）＋還元型電子受容体 (2)電子受容体 フェリシアン化カリウム、２，６−ジクロロフェノール
インドフェノール、Wurster's blue、ニトロテトラゾリ
ウムブルー等を利用した。 (3)Ｋｍ値 グリセロールに対するＫｍ値は２．４５ｍＭであった。 (4)至適ｐＨ ５０ｍＭマクルバイン緩衝液（ｐＨ５．０〜６．０）、
５０ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）、５
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０〜９．０）、およ
び５０ｍＭグリシン／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０〜１
１．０）中での酵素活性を測定した。その結果は図１に
示す通りであって、至適ｐＨはｐＨ８．０−９．０であ
った。 (5)安定ｐＨ 本発明の酵素を至適ｐＨの測定で用いた緩衝液中で５
℃、１日間保存してその残存活性を測定した。その結果
は図２に示す通りであって、安定ｐＨはｐＨ７．０〜１
１．０であった。 (6)至適温度 各温度における酵素活性を測定した。その結果は図３に
示す通りであって、至適温度は２０〜２５℃であった。 (7)熱安定性 本発明の酵素を５０ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）中で１０分間保温した後、残存する酵素活性を測定
した。その結果は図４に示す通りであって、３０℃まで
安定であった。 (8)吸収スペクトル 精製酵素は２８０、４１５、５２３、５５２ｎｍに特異
的な吸収を示した（図５）。 (9)補欠分子属 本発明の酵素をピリジンヘムクロモゲンスペクトルで分
析したところ、酵素１分子当り１分子のチトクロムＣを
含むことがわかった。また酵素を有機溶媒処理によって
ＰＱＱを遊離させた後、その含量を酵素定量法で測定し
たところ酵素１分子当りＰＱＱ１分子を含むことが明か
となった。 (10)分子量 セファデクスＧ−２００を用いたゲル濾過法により分析
したところ分子量は約７０、０００であった。またＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥの結果も分子量約７０、０００を示した。

【００１４】

【実施例２】グリセロールを０．０１、０．０２、０．
０４，０．０６、０．０８、０．１０マイクロモル含む
６種類の試料溶液を作製し、これらの溶液０．１ｍｌに
酵素液０．８、ｌを加え、全量を０．９ｍｌとして２５
℃で５分間放置した後、フェリシアン化カリウム溶液
０．１ｍｌを加えて反応を開始した。２５℃で２０分間
反応させ、反応停止液に硫酸第２鉄・デュパノール試薬
０．５ｍｌを加えて反応を停止した。ついでこの反応混
合液に蒸留水３．５ｍｌを加え、２５℃で３０分放置
後、分光光度計で６６０ｎｍの吸光度を測定した。結果
は図６に示す通りであって、グリセロールの量が０．０
１〜０．１マイクロモルまで直線となり、定量が可能で
あった。

【００１５】

【発明の効果】本発明では可溶化および安定化に界面活
性化剤を必要としないＰＱＱ依存性グリセロールデヒド
ロゲナーゼが得られる。本酵素を用いることにより高価
な補酵素を用いることなく、簡便で安価にグリセロール
の定量が可能である。

【図面の簡単な説明】

図１は反応ｐＨと本発明酵素の相対活性との関係を示す
グラフであり、図２はｐＨ安定性を示すグラフであり、
図３は反応温度と本発明酵素の相対活性との関係を示す
グラフであり、図４は温度安定性を示すグラフであり、
図５は本発明酵素の吸収スペクトルを示す図である。ま
た図６はグリセロールの検量線である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の性質を有するグリセロールデヒドロ
   ゲナーゼ 次の反応を触媒する。 グリセロール＋電子受容体→ジヒドロキシアセトン（グ
   リセルアルデヒド）＋還元型電子受容体 至適作用ｐＨ：ｐＨ８〜９ ｐＨ安定性：ｐＨ７〜１１ 至適作用温度：２０〜２５℃ 熱安定性：ｐＨ７．０、１０分の反応で３０℃以下で
   安定である。 分子量：ゲル濾過法およびＳＤＳアクリルアミドゲル
   電気泳動法で７万の分子量を示す。 補欠分子属としてピロロキノリノキノンを含む。 可溶化および安定化に界面活性化剤を必要としない。
2. 【請求項２】 シュードモナス属に属し、請求第１項記
   載の新規なグリセロールデヒドロゲナーゼの生産能を有
   する菌株を栄養培地にて培養し、該培養物から新規なグ
   リセロールデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とす
   る新規なグリセロールデヒドロゲナーゼの製造法。
3. 【請求項３】 試料中のグリセロールを分析する系にお
   いて、請求第１項記載の酵素を用いるグリセロールの定
   量法。