JPH05184366A - アスパルトキナーゼをコードする遺伝子ｄｎａ及びその利用 - Google Patents
アスパルトキナーゼをコードする遺伝子ｄｎａ及びその利用Info
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- JPH05184366A JPH05184366A JP2465892A JP2465892A JPH05184366A JP H05184366 A JPH05184366 A JP H05184366A JP 2465892 A JP2465892 A JP 2465892A JP 2465892 A JP2465892 A JP 2465892A JP H05184366 A JPH05184366 A JP H05184366A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
からアスパルトキナーゼをコードするＤＮＡを単離し、
この遺伝子の塩基配列を決定した。 【効果】 このアスパルトキナーゼをコードする遺伝子
ＤＮＡを導入したコリネ型細菌内で複製増殖可能なプラ
スミドで形質転換されたブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３株は、Ｌ−リジンの生成量が増加した。
からアスパルトキナーゼをコードするＤＮＡを単離し、
この遺伝子の塩基配列を決定した。 【効果】 このアスパルトキナーゼをコードする遺伝子
ＤＮＡを導入したコリネ型細菌内で複製増殖可能なプラ
スミドで形質転換されたブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３株は、Ｌ−リジンの生成量が増加した。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アスパルトキナーゼ
（Ｅ.Ｃ.２.７.２.４.）をコードする遺伝子を含むコリ
ネ型細菌由来の遺伝子ＤＮＡ、該遺伝子ＤＮＡを含む組
換えプラスミド、該プラスミドで形質転換されたコリネ
型細菌、及び該コリネ型細菌を用いるＬ−リジンの製造
法に関する。
（Ｅ.Ｃ.２.７.２.４.）をコードする遺伝子を含むコリ
ネ型細菌由来の遺伝子ＤＮＡ、該遺伝子ＤＮＡを含む組
換えプラスミド、該プラスミドで形質転換されたコリネ
型細菌、及び該コリネ型細菌を用いるＬ−リジンの製造
法に関する。
【０００２】Ｌ−リジンは、必須アミノ酸として蛋白質
中にその存在が知られ、医薬や食品添加物として用いら
れている。
中にその存在が知られ、医薬や食品添加物として用いら
れている。
【０００３】
【従来の技術】従来、Ｌ−リジンの工業的製造法として
は、グルタミン生産菌であるコリネ型細菌の各種栄養要
求株、各種薬剤耐性株、各種薬剤感受性株を用いてＬ−
リジンを製造する方法が知られている［例えば、特公昭
５１−２１０７８号公報、特公昭５３−１８３３号公
報、特公昭６２−８６９２号公報等参照］。また、組換
え菌を用いた製造法も提案されている［特開昭５６−１
６０９９７号公報、特開昭６０−６２９９４号公報、特
開昭６２−７９７８８号公報等参照］。しかしながら、
従来提案されている方法によるＬ−リジンの製造法で
は、対糖収率が低く及び／又はＬ−リジンの蓄積に限界
があり、新たな観点から、遺伝子工学的手法による菌株
の改良等を含め、Ｌ−リジンをより効率的に生成させる
方法の提供が強く求められている。
は、グルタミン生産菌であるコリネ型細菌の各種栄養要
求株、各種薬剤耐性株、各種薬剤感受性株を用いてＬ−
リジンを製造する方法が知られている［例えば、特公昭
５１−２１０７８号公報、特公昭５３−１８３３号公
報、特公昭６２−８６９２号公報等参照］。また、組換
え菌を用いた製造法も提案されている［特開昭５６−１
６０９９７号公報、特開昭６０−６２９９４号公報、特
開昭６２−７９７８８号公報等参照］。しかしながら、
従来提案されている方法によるＬ−リジンの製造法で
は、対糖収率が低く及び／又はＬ−リジンの蓄積に限界
があり、新たな観点から、遺伝子工学的手法による菌株
の改良等を含め、Ｌ−リジンをより効率的に生成させる
方法の提供が強く求められている。
【０００４】一方、アスパルトキナーゼ（Ｅ.Ｃ.２.７.
２.４.）をコードする遺伝子としては、エシェリヒア・
コリ（Escherichia coli）由来の遺伝子［Journal of B
iological Chemistry，２５６，ｐ１０２２８〜ｐ１０
２３０，１９８１参照］がよく研究されている。また、
グラム陽性細菌由来のアスパルトキナーゼ（Ｅ.Ｃ.２.
７.２.４.）としては、バチルス・サチルス（Bacillus
subtilis）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Cory
neform glutamicum）等が知られている［Journal of Bi
ological Chemistry，２６２，ｐ８７８７−ｐ８７９
８，１９８７；Molecular Microbiology，５，ｐ１１９
７−ｐ１２０４，１９９１参照］。しかしながら、ブレ
ビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）
由来のアスパルトキナーゼ（Ｅ.Ｃ.２.７.２.４.）をコ
ードする遺伝子については従来の報告例は見当らない。
２.４.）をコードする遺伝子としては、エシェリヒア・
コリ（Escherichia coli）由来の遺伝子［Journal of B
iological Chemistry，２５６，ｐ１０２２８〜ｐ１０
２３０，１９８１参照］がよく研究されている。また、
グラム陽性細菌由来のアスパルトキナーゼ（Ｅ.Ｃ.２.
７.２.４.）としては、バチルス・サチルス（Bacillus
subtilis）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Cory
neform glutamicum）等が知られている［Journal of Bi
ological Chemistry，２６２，ｐ８７８７−ｐ８７９
８，１９８７；Molecular Microbiology，５，ｐ１１９
７−ｐ１２０４，１９９１参照］。しかしながら、ブレ
ビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）
由来のアスパルトキナーゼ（Ｅ.Ｃ.２.７.２.４.）をコ
ードする遺伝子については従来の報告例は見当らない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、コリ
ネ型細菌由来のアスパルトキナーゼ（Ｅ.Ｃ.２.７.２.
４.）をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を同種で
あるコリネ型細菌に導入し、該コリネ型細菌を用いて、
新たな観点から効率的にＬ−リジンを製造することであ
る。
ネ型細菌由来のアスパルトキナーゼ（Ｅ.Ｃ.２.７.２.
４.）をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を同種で
あるコリネ型細菌に導入し、該コリネ型細菌を用いて、
新たな観点から効率的にＬ−リジンを製造することであ
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、コリネ型細菌染色
体よりアスパルトキナーゼ遺伝子を単離し、該遺伝子を
適当なベクタープラスミドに導入して、コリネ型細菌を
形質転換し、該形質転換されたコリネ型細菌を用いる
と、効率的にＬ−リジンを製造しうることを見い出し本
発明を完成するに至った。
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、コリネ型細菌染色
体よりアスパルトキナーゼ遺伝子を単離し、該遺伝子を
適当なベクタープラスミドに導入して、コリネ型細菌を
形質転換し、該形質転換されたコリネ型細菌を用いる
と、効率的にＬ−リジンを製造しうることを見い出し本
発明を完成するに至った。
【０００７】かくして本発明によれば、 （１） コリネ型細菌由来のアスパルトキナーゼをコー
ドする遺伝子ＤＮＡ； （２） 該遺伝子ＤＮＡが導入された組換えプラスミ
ド； （３） 該組換えプラスミドで形質転換されたコリネ型
細菌；及び （４） 該形質転換されたコリネ型細菌を用い、グルコ
ースを原料としてＬ−リジンを製造する方法 が提供される。
ドする遺伝子ＤＮＡ； （２） 該遺伝子ＤＮＡが導入された組換えプラスミ
ド； （３） 該組換えプラスミドで形質転換されたコリネ型
細菌；及び （４） 該形質転換されたコリネ型細菌を用い、グルコ
ースを原料としてＬ−リジンを製造する方法 が提供される。
【０００８】以下、本発明についてさらに詳細に説明す
る。
る。
【０００９】本発明の「アスパルトキナーゼをコードす
る遺伝子ＤＮＡ」とは、Ｌ−アスパラギン酸にリン酸を
付加する酵素、すなわちアスパルトキナーゼ（Ｅ.Ｃ.
２.７.２.４.）をコードする遺伝子ＤＮＡを意味するも
のである。
る遺伝子ＤＮＡ」とは、Ｌ−アスパラギン酸にリン酸を
付加する酵素、すなわちアスパルトキナーゼ（Ｅ.Ｃ.
２.７.２.４.）をコードする遺伝子ＤＮＡを意味するも
のである。
【００１０】アスパルトキナーゼをコードする遺伝子を
含むＤＮＡ断片（以下、これを「Ａ断片」と略称するこ
とがある）は、その塩基配列が決定された後においては
合成することも可能であるが、通常はアスパルトキナー
ゼ生産性微生物からクローニングされる場合が多く、そ
の供給源となる微生物としては、コリネ型細菌、殊にブ
レビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavu
m）ＭＪ２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）およびその
由来株が有利に使用される。
含むＤＮＡ断片（以下、これを「Ａ断片」と略称するこ
とがある）は、その塩基配列が決定された後においては
合成することも可能であるが、通常はアスパルトキナー
ゼ生産性微生物からクローニングされる場合が多く、そ
の供給源となる微生物としては、コリネ型細菌、殊にブ
レビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavu
m）ＭＪ２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）およびその
由来株が有利に使用される。
【００１１】これらの供給源微生物からＡ断片を調製す
るための基本的操作の一例を述べれば次のとおりであ
る：Ａ断片は、上記コリネ型細菌、例えばブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４
９７）株の染色体上に存在し、この染色体を適当な制限
酵素で切断することにより生ずる切断断片の中から以下
に述べる方法で分離、取得することができる。
るための基本的操作の一例を述べれば次のとおりであ
る：Ａ断片は、上記コリネ型細菌、例えばブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４
９７）株の染色体上に存在し、この染色体を適当な制限
酵素で切断することにより生ずる切断断片の中から以下
に述べる方法で分離、取得することができる。
【００１２】先ず、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株の培養物から染色体ＤＮＡを抽出する。この
染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＥｃｏＲＩを用
いて染色体ＤＮＡを完全に分解する。
−２３３株の培養物から染色体ＤＮＡを抽出する。この
染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＥｃｏＲＩを用
いて染色体ＤＮＡを完全に分解する。
【００１３】得られるＤＮＡ断片をクローニングベクタ
ー、例えばｐＨＳＧ３９９（宝酒造製）に挿入し、この
ベクターを用いて、アスパルトキナーゼ遺伝子が欠損し
た大腸菌（エシェリヒア・コリ）変異株ＣＧＳＣ５０７
４［エシェリヒア・コリ ジエネテック・ストック セン
ター（Escherichia coli Genetic Stock Center）、デ
パートメントオブバイオロジー、エールユニバーシィテ
ィ（Department of Biology，Yale University)；P.O.B
ox ６６６６ New Haven、CT ０６５１１−７４４、U.S.
A．保存菌株］を形質転換し、選択培地に塗抹すること
により、形質転換株を取得する。
ー、例えばｐＨＳＧ３９９（宝酒造製）に挿入し、この
ベクターを用いて、アスパルトキナーゼ遺伝子が欠損し
た大腸菌（エシェリヒア・コリ）変異株ＣＧＳＣ５０７
４［エシェリヒア・コリ ジエネテック・ストック セン
ター（Escherichia coli Genetic Stock Center）、デ
パートメントオブバイオロジー、エールユニバーシィテ
ィ（Department of Biology，Yale University)；P.O.B
ox ６６６６ New Haven、CT ０６５１１−７４４、U.S.
A．保存菌株］を形質転換し、選択培地に塗抹すること
により、形質転換株を取得する。
【００１４】得られる形質転換株よりプラスミドＤＮＡ
を抽出し、制限酵素で解析することにより挿入されたブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来
のＡ断片を確認・取得することができる。
を抽出し、制限酵素で解析することにより挿入されたブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来
のＡ断片を確認・取得することができる。
【００１５】かくして得られるＡ断片をさらに適当な制
限酵素を用いて切断し、得られるＤＮＡ断片を、大腸菌
で複製可能なベクタープラスミドに挿入し、このベクタ
ープラスミドを、通常用いられる形質転換法、例えば、
塩化カルシウム法、電気パルス法等による形質転換によ
り、前記アスパルトキナーゼが欠損した大腸菌変異株に
導入し、選択培地に塗抹する。
限酵素を用いて切断し、得られるＤＮＡ断片を、大腸菌
で複製可能なベクタープラスミドに挿入し、このベクタ
ープラスミドを、通常用いられる形質転換法、例えば、
塩化カルシウム法、電気パルス法等による形質転換によ
り、前記アスパルトキナーゼが欠損した大腸菌変異株に
導入し、選択培地に塗抹する。
【００１６】得られる形質転換体よりプラスミドＤＮＡ
を抽出し、制限酵素で解析することにより挿入されたブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来
のＡ断片を確認・取得することができる。
を抽出し、制限酵素で解析することにより挿入されたブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来
のＡ断片を確認・取得することができる。
【００１７】このようにして得られるＡ断片の一つは、
上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の染
色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩの完全分解により切り
出し、さらにそれを制限酵素ＮｒｕＩで切断することに
よって得られる大きさが約１.７ｋｂのＤＮＡ断片を挙
げることができる。
上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の染
色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩの完全分解により切り
出し、さらにそれを制限酵素ＮｒｕＩで切断することに
よって得られる大きさが約１.７ｋｂのＤＮＡ断片を挙
げることができる。
【００１８】この約１.７ｋｂのアスパルトキナーゼを
コードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を、各種の制限酵素
で切断したときの認識部位数及び切断断片の大きさを下
記表１に示す。
コードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を、各種の制限酵素
で切断したときの認識部位数及び切断断片の大きさを下
記表１に示す。
【００１９】
【表１】 なお、本明細書において、制限酵素による「認識部位
数」は、ＤＮＡ断片又はプラスミドを、制限酵素の存在
下で完全分解し、それらの分解物をそれ自体既知の方法
に従い１％アガロースゲル電気泳動および５％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能な断片の数か
ら決定した値を採用した。
数」は、ＤＮＡ断片又はプラスミドを、制限酵素の存在
下で完全分解し、それらの分解物をそれ自体既知の方法
に従い１％アガロースゲル電気泳動および５％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能な断片の数か
ら決定した値を採用した。
【００２０】また、「切断断片の大きさ」及びプラスミ
ドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシェリヒア・コリのラムダファージ（λphage）
のＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断して得られ
る分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上での
泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒア
・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φｘ１７４
phage）のＤＮＡを制限酵素Ｈａｅ ＩＩＩで切断して
得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリルア
ミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、切
断ＤＮＡ断片又はプラスミドの各ＤＮＡ断片の大きさを
算出する。プラスミドの大きさは、切断断片それぞれの
大きさを加算して求める。なお、各ＤＮＡ断片の大きさ
の決定において、１ｋｂ以上の断片の大きさについて
は、１％アガロースゲル電気泳動によって得られる結果
を採用し、約０.１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大きさ
については４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て得られる結果を採用した。
ドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシェリヒア・コリのラムダファージ（λphage）
のＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断して得られ
る分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上での
泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒア
・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φｘ１７４
phage）のＤＮＡを制限酵素Ｈａｅ ＩＩＩで切断して
得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリルア
ミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、切
断ＤＮＡ断片又はプラスミドの各ＤＮＡ断片の大きさを
算出する。プラスミドの大きさは、切断断片それぞれの
大きさを加算して求める。なお、各ＤＮＡ断片の大きさ
の決定において、１ｋｂ以上の断片の大きさについて
は、１％アガロースゲル電気泳動によって得られる結果
を採用し、約０.１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大きさ
については４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て得られる結果を採用した。
【００２１】一方、上記のブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡを制限酵素ＮｒｕＩ−Ｅ
ｃｏＲＩによって切断することにより得られる大きさが
約１.７ｋｂのＤＮＡ断片については、その塩基配列を
プラスミドｐＵＣ１１８またはｐＵＣ１１９（宝酒造
製）を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法（dideoxyc
hain termination 法、Sanger，F.et.al.，Proc.Natl.A
cad.Sci.USA，７４，ｐ５４６３，１９７７）により決
定することができる。このようにして決定した上記約
１.７ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列のオープンリーディ
ングフレームの存在から決定したアスパルトキナーゼを
コードする遺伝子は、以下に示す配列を有するものであ
り、４２１個のアミノ酸をコードする１２６３の塩基対
から構成されている。
ムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡを制限酵素ＮｒｕＩ−Ｅ
ｃｏＲＩによって切断することにより得られる大きさが
約１.７ｋｂのＤＮＡ断片については、その塩基配列を
プラスミドｐＵＣ１１８またはｐＵＣ１１９（宝酒造
製）を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法（dideoxyc
hain termination 法、Sanger，F.et.al.，Proc.Natl.A
cad.Sci.USA，７４，ｐ５４６３，１９７７）により決
定することができる。このようにして決定した上記約
１.７ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列のオープンリーディ
ングフレームの存在から決定したアスパルトキナーゼを
コードする遺伝子は、以下に示す配列を有するものであ
り、４２１個のアミノ酸をコードする１２６３の塩基対
から構成されている。
【００２２】
【化３】上記の塩基配列を包含する本発明のアスパルト
キナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片は、天然
のコリネ型細菌染色体ＤＮＡから分離されたもののみな
らず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばベックマ
ン社製 System-1 Plusを用いて合成されたものであって
もよい。
キナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片は、天然
のコリネ型細菌染色体ＤＮＡから分離されたもののみな
らず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばベックマ
ン社製 System-1 Plusを用いて合成されたものであって
もよい。
【００２３】また、前記の如くブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡから取得される本発
明のＤＮＡ断片は、アスパルトキナーゼをコードする機
能を実質的に損なうことがない限り、塩基配列の一部の
塩基が他の塩基と置換されていてもよく又は削除されて
いてもよく、或いは新たに塩基が挿入されていてもよ
く、さらに塩基配列の一部が転位されているものであっ
てもよく、これらの誘導体のいずれもが、本発明のアス
パルトキナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片に
包含されるものである。
ラバムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡから取得される本発
明のＤＮＡ断片は、アスパルトキナーゼをコードする機
能を実質的に損なうことがない限り、塩基配列の一部の
塩基が他の塩基と置換されていてもよく又は削除されて
いてもよく、或いは新たに塩基が挿入されていてもよ
く、さらに塩基配列の一部が転位されているものであっ
てもよく、これらの誘導体のいずれもが、本発明のアス
パルトキナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片に
包含されるものである。
【００２４】以上に詳述した大きさが約１.７ｋｂのＤ
ＮＡ断片の制限酵素による切断点地図を図１に示す。
ＮＡ断片の制限酵素による切断点地図を図１に示す。
【００２５】本発明のアスパルトキナーゼをコードする
遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）は、適当なプラスミ
ド、例えば、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機
能を司る遺伝子を少くとも含むプラスミドベクターに導
入することにより、コリネ型細菌内でアスパルトキナー
ゼの高発現可能な組換えプラスミドを得ることができ
る。
遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）は、適当なプラスミ
ド、例えば、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機
能を司る遺伝子を少くとも含むプラスミドベクターに導
入することにより、コリネ型細菌内でアスパルトキナー
ゼの高発現可能な組換えプラスミドを得ることができ
る。
【００２６】また、本発明のアスパルトキナーゼをコー
ドする遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ
型細菌が保有する該遺伝子自身のプロモーターであるこ
とができるが、それに限られるものではなく、アスパル
トキナーゼ遺伝子の転写を開始させるための原核生物由
来の塩基配列であればいかなるプロモーターであっても
よい。
ドする遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ
型細菌が保有する該遺伝子自身のプロモーターであるこ
とができるが、それに限られるものではなく、アスパル
トキナーゼ遺伝子の転写を開始させるための原核生物由
来の塩基配列であればいかなるプロモーターであっても
よい。
【００２７】本発明のＡ断片を導入することができる、
コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少くと
も含むプラスミドベクターとしては、例えば、特開平３
−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３
０；特開平２−２７６５７５号公報に記載のプラスミド
ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣ
ＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平
１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２
及びｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載
のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載
のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に
記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４
４；特開昭５７−１３４５００号に記載のｐＣＧ１；特
開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭
５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４及びｐＣＧ
１１等を挙げることができる。
コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少くと
も含むプラスミドベクターとしては、例えば、特開平３
−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３
０；特開平２−２７６５７５号公報に記載のプラスミド
ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣ
ＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平
１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２
及びｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載
のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載
のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に
記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４
４；特開昭５７−１３４５００号に記載のｐＣＧ１；特
開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭
５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４及びｐＣＧ
１１等を挙げることができる。
【００２８】中でもコリネ型細菌の宿主−ベクター系で
用いられるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌
内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型
細菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とをもつ
ものが好ましく、例えば、プラスミドｐＣＲＹ３０、ｐ
ＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲ
Ｙ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ
３ＫＸ等が好適に使用される。
用いられるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌
内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型
細菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とをもつ
ものが好ましく、例えば、プラスミドｐＣＲＹ３０、ｐ
ＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲ
Ｙ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ
３ＫＸ等が好適に使用される。
【００２９】上記プラスミドベクターｐＣＲＹ３０を調
製する方法としては、ブレビバクテリウム・スタチオニ
ス（Brevibacterium stationis）ＩＦＯ１２１４４（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−２５１５）からプラスミドｐＢＹ５０３
（このプラスミドの詳細については特開平１−９５７８
５号公報参照）ＤＮＡを抽出し、制限酵素ＸｈｏＩで大
きさが約４.０ｋｂのプラスミドの複製増殖機能を司る
遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出し、制限酵素ＥｃｏＲ
ＩおよびＫｐｎＩで大きさが約２.１ｋｂのプラスミド
の安定化機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出
す。これらの両断片をプラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒
造製）のＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ部位及びＳａｌＩ部位に
組み込むことにより、プラスミドベクターｐＣＲＹ３０
を調製することができる。
製する方法としては、ブレビバクテリウム・スタチオニ
ス（Brevibacterium stationis）ＩＦＯ１２１４４（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−２５１５）からプラスミドｐＢＹ５０３
（このプラスミドの詳細については特開平１−９５７８
５号公報参照）ＤＮＡを抽出し、制限酵素ＸｈｏＩで大
きさが約４.０ｋｂのプラスミドの複製増殖機能を司る
遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出し、制限酵素ＥｃｏＲ
ＩおよびＫｐｎＩで大きさが約２.１ｋｂのプラスミド
の安定化機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出
す。これらの両断片をプラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒
造製）のＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ部位及びＳａｌＩ部位に
組み込むことにより、プラスミドベクターｐＣＲＹ３０
を調製することができる。
【００３０】次に、上記プラスミドベクターへの本発明
のＡ断片の導入は、例えばプラスミドベクター中に１個
所だけ存在する制限酵素部位を、該制限酵素で開裂し、
そこに前記Ａ断片および開裂したプラスミドベクターを
必要に応じてＳ１ヌクレアーゼで処理して平滑末端とす
るか、または適当なアダプターＤＮＡの存在下にＤＮＡ
リガーゼ処理で連結させることにより行うことができ
る。
のＡ断片の導入は、例えばプラスミドベクター中に１個
所だけ存在する制限酵素部位を、該制限酵素で開裂し、
そこに前記Ａ断片および開裂したプラスミドベクターを
必要に応じてＳ１ヌクレアーゼで処理して平滑末端とす
るか、または適当なアダプターＤＮＡの存在下にＤＮＡ
リガーゼ処理で連結させることにより行うことができ
る。
【００３１】プラスミドｐＣＲＹ３０への本発明のＡ断
片の導入は、プラスミドｐＣＲＹ３０を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで開裂させ、そこに前記アスパルトキナーゼをコー
ドする遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）をＤＮＡリガ
ーゼで連結させることにより行うことができる。
片の導入は、プラスミドｐＣＲＹ３０を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで開裂させ、そこに前記アスパルトキナーゼをコー
ドする遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）をＤＮＡリガ
ーゼで連結させることにより行うことができる。
【００３２】このようにして造成されるプラスミドｐＣ
ＲＹ３０に本発明の大きさが約１.７ｋｂのＡ断片を導
入した組換えプラスミドは、Ｌ−リジンの製造に好適に
用いることができる組換えプラスミドの一つであり、本
発明者らはこれをプラスミドｐＣＲＹ３０−ＡＫと命名
した。プラスミドｐＣＲＹ３０−ＡＫの作成方法の詳細
については、後記実施例４で説明する。
ＲＹ３０に本発明の大きさが約１.７ｋｂのＡ断片を導
入した組換えプラスミドは、Ｌ−リジンの製造に好適に
用いることができる組換えプラスミドの一つであり、本
発明者らはこれをプラスミドｐＣＲＹ３０−ＡＫと命名
した。プラスミドｐＣＲＹ３０−ＡＫの作成方法の詳細
については、後記実施例４で説明する。
【００３３】このようにして造成されるアスパルトキナ
ーゼ遺伝子を含むコリネ型細菌内で複製増殖可能なプラ
スミドを、宿主微生物に導入して該微生物の培養物を用
いてＬ−リジンを安定に効率よく生産することが可能と
なる。
ーゼ遺伝子を含むコリネ型細菌内で複製増殖可能なプラ
スミドを、宿主微生物に導入して該微生物の培養物を用
いてＬ−リジンを安定に効率よく生産することが可能と
なる。
【００３４】本発明によるプラスミドで形質転換しうる
宿主微生物としては、コリネ型細菌、例えばブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１
４９７）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）、ブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＴ−１１（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１５００）、ブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３−ＡＢＤ−２１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１
４９９）等が挙げられる。
宿主微生物としては、コリネ型細菌、例えばブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１
４９７）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）、ブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＴ−１１（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１５００）、ブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３−ＡＢＤ−２１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１
４９９）等が挙げられる。
【００３５】なお、上記のＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８の
菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の菌株を親株として
ＤＬ−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付与されたエタノ
ール資化性微生物である（特公昭５９−２８３９８号公
報第３〜４欄参照）。また、ＦＥＲＭ ＢＰ−１５００
の菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の菌株を親株とし
たＬ−α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ高活性変異株
である（特開昭６２−５１９９８号公報参照）。さら
に、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９９の菌株はＦＥＲＭ ＢＰ−
１４９７の菌株を親株としたＤ−α−アミノ酪酸デアミ
ナーゼ高活性変異株である（特開昭６１−１７７９９３
号公報参照）。
菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の菌株を親株として
ＤＬ−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付与されたエタノ
ール資化性微生物である（特公昭５９−２８３９８号公
報第３〜４欄参照）。また、ＦＥＲＭ ＢＰ−１５００
の菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の菌株を親株とし
たＬ−α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ高活性変異株
である（特開昭６２−５１９９８号公報参照）。さら
に、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９９の菌株はＦＥＲＭ ＢＰ−
１４９７の菌株を親株としたＤ−α−アミノ酪酸デアミ
ナーゼ高活性変異株である（特開昭６１−１７７９９３
号公報参照）。
【００３６】これらの微生物の他に、ブレビバクテリウ
ム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagene
s）ＡＴＣＣ６８７１、同ＡＴＣＣ１３７４５、同ＡＴ
ＣＣ１３７４６；ブレビバクテリウム・デバリカタム
（Brevibacterium divaricatum）ＡＴＣＣ１４０２０；
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibac
terium lactofermentum）ＡＴＣＣ１３８６９；コリネ
バクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutam
icum）ＡＴＣＣ３１８３１等を宿主微生物として用いる
こともできる。
ム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagene
s）ＡＴＣＣ６８７１、同ＡＴＣＣ１３７４５、同ＡＴ
ＣＣ１３７４６；ブレビバクテリウム・デバリカタム
（Brevibacterium divaricatum）ＡＴＣＣ１４０２０；
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibac
terium lactofermentum）ＡＴＣＣ１３８６９；コリネ
バクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutam
icum）ＡＴＣＣ３１８３１等を宿主微生物として用いる
こともできる。
【００３７】なお、宿主としてブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３由来の菌株を用いる場合、本菌株が
保有するプラスミドｐＢＹ５０２（特開昭６３−３６７
８７号公報参照）のため、形質転換が困難である場合が
あるので、そのような場合には、本菌株よりプラスミド
ｐＢＹ５０２を除去することが望ましい。そのようなプ
ラスミドｐＢＹ５０２を除去する方法としては、例え
ば、継代培養を繰り返すことにより自然に欠失させるこ
とも可能であるし、人為的に除去することも可能である
［Bact.Rev．３６ ｐ.３６１〜４０５（１９７２）参
照］。上記プラスミドｐＢＹ５０２を人為的に除去する
方法の一例を示せば次のとおりである。
ラバムＭＪ−２３３由来の菌株を用いる場合、本菌株が
保有するプラスミドｐＢＹ５０２（特開昭６３−３６７
８７号公報参照）のため、形質転換が困難である場合が
あるので、そのような場合には、本菌株よりプラスミド
ｐＢＹ５０２を除去することが望ましい。そのようなプ
ラスミドｐＢＹ５０２を除去する方法としては、例え
ば、継代培養を繰り返すことにより自然に欠失させるこ
とも可能であるし、人為的に除去することも可能である
［Bact.Rev．３６ ｐ.３６１〜４０５（１９７２）参
照］。上記プラスミドｐＢＹ５０２を人為的に除去する
方法の一例を示せば次のとおりである。
【００３８】宿主ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−
２３３の生育を不完全に阻害する濃度のアクリジンオレ
ンジ（濃度：０.２〜５０μｇ／ｍｌ）もしくはエチジ
ウムブロミド（濃度：０.２〜５０μｇ／ｍｌ）等を含
む培地に、１ｍｌ当り約１０細胞になるように植菌し、
生育を不完全に阻害しながら約２４時間約３５℃で培養
する。培養液を希釈後寒天培地に塗布し、約３５℃で約
２日培養する。出現したコロニーから各々独立にプラス
ミド抽出操作を行い、プラスミドｐＢＹ５０２が除去さ
れている株を選択する。この操作によりプラスミドｐＢ
Ｙ５０２が除去されたブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ−２３３由来菌株が得られる。
２３３の生育を不完全に阻害する濃度のアクリジンオレ
ンジ（濃度：０.２〜５０μｇ／ｍｌ）もしくはエチジ
ウムブロミド（濃度：０.２〜５０μｇ／ｍｌ）等を含
む培地に、１ｍｌ当り約１０細胞になるように植菌し、
生育を不完全に阻害しながら約２４時間約３５℃で培養
する。培養液を希釈後寒天培地に塗布し、約３５℃で約
２日培養する。出現したコロニーから各々独立にプラス
ミド抽出操作を行い、プラスミドｐＢＹ５０２が除去さ
れている株を選択する。この操作によりプラスミドｐＢ
Ｙ５０２が除去されたブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ−２３３由来菌株が得られる。
【００３９】このようにして得られるブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ−２３３由来菌株への前記プラスミド
の形質転換法としては、エシェリヒア・コリ及びエルビ
ニア・カロトボラについて知られているように［Calvi
n，N.M．and Hanawalt，P.C.，Journal of Bacteriolog
y，１７０，２７９６（１９８８）；Ito，K.，Nishid
a，T．and Izaki．K.，Agricultural and Biological C
hemistry，５２，２９３（１９８８）参照］、ＤＮＡ受
容菌へのパルス波通電［Satoh，Y．et al.，Journal of
Industrial Microbiology，５，１５９（１９９０）参
照］によりプラスミドを導入することが可能である。
ム・フラバムＭＪ−２３３由来菌株への前記プラスミド
の形質転換法としては、エシェリヒア・コリ及びエルビ
ニア・カロトボラについて知られているように［Calvi
n，N.M．and Hanawalt，P.C.，Journal of Bacteriolog
y，１７０，２７９６（１９８８）；Ito，K.，Nishid
a，T．and Izaki．K.，Agricultural and Biological C
hemistry，５２，２９３（１９８８）参照］、ＤＮＡ受
容菌へのパルス波通電［Satoh，Y．et al.，Journal of
Industrial Microbiology，５，１５９（１９９０）参
照］によりプラスミドを導入することが可能である。
【００４０】上記の方法で形質転換して得られるアスパ
ルターゼ産生能を有するコリネ型細菌、例えばブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来株の培養方法を
以下に述べる。
ルターゼ産生能を有するコリネ型細菌、例えばブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来株の培養方法を
以下に述べる。
【００４１】培養は炭素源、窒素源、無機塩等を含む通
常の栄養培地で行うことができ、炭素源としては、例え
ばグルコース、エタノール、メタノール、廃糖蜜等が、
そして窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等
がそれぞれ単独もしくは混合して用いられる。また、無
機塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二
水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この
他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティー
プリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の
栄養素を培地に添加することができる。
常の栄養培地で行うことができ、炭素源としては、例え
ばグルコース、エタノール、メタノール、廃糖蜜等が、
そして窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等
がそれぞれ単独もしくは混合して用いられる。また、無
機塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二
水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この
他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティー
プリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の
栄養素を培地に添加することができる。
【００４２】培養は、通常、通気撹拌、振盪等の好気条
件下に、約２０〜約４０℃、好ましくは約２５℃〜約３
５℃の温度で行うことができる。培養途中のｐＨは５〜
１０、好ましくは７〜８付近とすることができ、培養中
のｐＨ調整は酸又はアルカリを添加して行うことができ
る。
件下に、約２０〜約４０℃、好ましくは約２５℃〜約３
５℃の温度で行うことができる。培養途中のｐＨは５〜
１０、好ましくは７〜８付近とすることができ、培養中
のｐＨ調整は酸又はアルカリを添加して行うことができ
る。
【００４３】培養開始時の炭素源濃度は、好ましくは１
〜５容量％、更に好ましくは２〜３容量％である。ま
た、培養期間は通常１〜７日間とすることができ、最適
期間は３日間である。
〜５容量％、更に好ましくは２〜３容量％である。ま
た、培養期間は通常１〜７日間とすることができ、最適
期間は３日間である。
【００４４】このようにして得られる培養物から各々菌
体を集めて、水又は適当な緩衝液で洗浄し、Ｌ−リジン
生成反応に使用することができる。
体を集めて、水又は適当な緩衝液で洗浄し、Ｌ−リジン
生成反応に使用することができる。
【００４５】Ｌ−リジン生成反応においては、これらの
菌体をそのまま用いることができ、あるいは超音波処理
等を加えた菌体破砕物、さらにそれから分離回収した粗
酵素又は精製酵素として、あるいはそれらを適当な担体
に固定化して用いることができる。以上に述べた如き菌
体の破砕物や粗または精製酵素、固定化物等を本明細書
ではまとめて「菌体処理物」という。
菌体をそのまま用いることができ、あるいは超音波処理
等を加えた菌体破砕物、さらにそれから分離回収した粗
酵素又は精製酵素として、あるいはそれらを適当な担体
に固定化して用いることができる。以上に述べた如き菌
体の破砕物や粗または精製酵素、固定化物等を本明細書
ではまとめて「菌体処理物」という。
【００４６】しかして本発明に従えば、グルコースを、
上記培養菌体又は菌体処理物と接触させて、Ｌ−リジン
を生成せしめることからなるＬ−リジンの製造法が提供
される。
上記培養菌体又は菌体処理物と接触させて、Ｌ−リジン
を生成せしめることからなるＬ−リジンの製造法が提供
される。
【００４７】グルコースと上記培養菌体又は菌体処理物
との接触は、通常の酵素反応と同様に、水性媒体中にお
いて、好ましくは約２０〜約４０℃、特に約２５〜約３
５℃において行なうことができる。
との接触は、通常の酵素反応と同様に、水性媒体中にお
いて、好ましくは約２０〜約４０℃、特に約２５〜約３
５℃において行なうことができる。
【００４８】生成するＬ−リジンは例えば、高速液体ク
ロマトグラフィー等の手段により反応液から分離回収す
ることができる。
ロマトグラフィー等の手段により反応液から分離回収す
ることができる。
【００４９】
【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。
例によりさらに具体的に説明する。
【００５０】実施例１ ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のアス
パルトキナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片
（Ａ断片）のクローン化 （Ａ） ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の
全ＤＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地［組成：尿素２ｇ、(ＮＨ4)2ＳＯ4 ７
ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０.５ｇ、ＭｇＳ
Ｏ4 ０.５ｇ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4
４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２.５ｇ、カザミノ酸
５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、
グルコース２０ｇ、蒸留水１ｌ］１ｌに、ブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４
９７）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得
られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチームを含む
１０ｍＭ ＮａＣｌ−２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８.
０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ溶液１５ｍｌに懸濁し
た。次にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍ
ｌになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さら
にドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０.５％になる
ように添加し、５０℃で６時間保温して容菌した。この
溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加
し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心
分離（５,０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、
上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０.３Ｍとなるよ
うに添加した後、２倍量のエタノールをゆっくりと加え
た。水層とエタノール層の間に存在するＤＮＡをガラス
棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄した後、風乾し
た。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.
５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４
℃で一晩静置し、以後の実験に用いた。
パルトキナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片
（Ａ断片）のクローン化 （Ａ） ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の
全ＤＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地［組成：尿素２ｇ、(ＮＨ4)2ＳＯ4 ７
ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０.５ｇ、ＭｇＳ
Ｏ4 ０.５ｇ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4
４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２.５ｇ、カザミノ酸
５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、
グルコース２０ｇ、蒸留水１ｌ］１ｌに、ブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４
９７）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得
られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチームを含む
１０ｍＭ ＮａＣｌ−２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８.
０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ溶液１５ｍｌに懸濁し
た。次にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍ
ｌになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さら
にドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０.５％になる
ように添加し、５０℃で６時間保温して容菌した。この
溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加
し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心
分離（５,０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、
上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０.３Ｍとなるよ
うに添加した後、２倍量のエタノールをゆっくりと加え
た。水層とエタノール層の間に存在するＤＮＡをガラス
棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄した後、風乾し
た。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.
５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４
℃で一晩静置し、以後の実験に用いた。
【００５１】（Ｂ） 組換え体の創製 上記（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の全ＤＮＡ溶液の９０μｌを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ ５０units を用い、３７℃で１時間反応させ完全分
解した。このＥｃｏＲＩ分解ＤＮＡにクローニングベク
ターｐＨＳＧ３９９（宝酒造より市販）を制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩで切断した後、脱リン酸化処理したものを混合
し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.６）、１０ｍＭジ
チオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
２及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１unitの各成分を添加し（各
成分の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応さ
せ、結合させた。
−２３３の全ＤＮＡ溶液の９０μｌを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ ５０units を用い、３７℃で１時間反応させ完全分
解した。このＥｃｏＲＩ分解ＤＮＡにクローニングベク
ターｐＨＳＧ３９９（宝酒造より市販）を制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩで切断した後、脱リン酸化処理したものを混合
し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.６）、１０ｍＭジ
チオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
２及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１unitの各成分を添加し（各
成分の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応さ
せ、結合させた。
【００５２】（Ｃ） アスパルトキナーゼをコードする
遺伝子を含むプラスミドの選択 上記遺伝子の選抜に用いたアスパルトキナーゼ欠損大腸
菌変異株は、エシェリヒア・コリＣＧＳＣ ５０７４
（ｔｈｒ Ａ１１０１、ｌｙｓ Ｃ１００１、ｍｅｔ Ｌ
１０００）である［（ ）内はアスパルトキナーゼ遺伝
子型（Genotype）を示す］。上記（Ｂ）項で得られたプ
ラスミド混液を用い、塩化カルシウム法（Journalof Mo
lecular Biology，５３，１５９，１９７０）により前
記エシェリヒア・コリＣＧＳＣ５０７４株を形質転換
し、クロラムフェニコール５０ｍｇを含む選択培地［Ｋ
2ＨＰＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、（ＮＨ4)2ＳＯ4 １
ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.１ｇ、グルコース２０ｇ及
び寒天１６ｇを蒸留水１ｌに溶解］に塗抹した。
遺伝子を含むプラスミドの選択 上記遺伝子の選抜に用いたアスパルトキナーゼ欠損大腸
菌変異株は、エシェリヒア・コリＣＧＳＣ ５０７４
（ｔｈｒ Ａ１１０１、ｌｙｓ Ｃ１００１、ｍｅｔ Ｌ
１０００）である［（ ）内はアスパルトキナーゼ遺伝
子型（Genotype）を示す］。上記（Ｂ）項で得られたプ
ラスミド混液を用い、塩化カルシウム法（Journalof Mo
lecular Biology，５３，１５９，１９７０）により前
記エシェリヒア・コリＣＧＳＣ５０７４株を形質転換
し、クロラムフェニコール５０ｍｇを含む選択培地［Ｋ
2ＨＰＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、（ＮＨ4)2ＳＯ4 １
ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.１ｇ、グルコース２０ｇ及
び寒天１６ｇを蒸留水１ｌに溶解］に塗抹した。
【００５３】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＨＳＧ３９９の長さ
２.２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約３.８ｋｂの挿入
ＤＮＡ断片が認められた。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＨＳＧ３９９の長さ
２.２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約３.８ｋｂの挿入
ＤＮＡ断片が認められた。
【００５４】本プラスミドをｐＨＳＧ３９９−ＡＫと命
名した。
名した。
【００５５】（Ｄ） アスパルトキナーゼをコードする
遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ）断片のサブクローニング 上記（Ｃ）項で得たプラスミドｐＨＳＧ３９９−ＡＫに
含まれるＤＮＡ挿入断片を、必要な部分だけに小型化す
るために、プラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造より市販）
へアスパルトキナーゼをコートする遺伝子を含むＤＮＡ
断片を下記のとおりサブクローニングした。
遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ）断片のサブクローニング 上記（Ｃ）項で得たプラスミドｐＨＳＧ３９９−ＡＫに
含まれるＤＮＡ挿入断片を、必要な部分だけに小型化す
るために、プラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造より市販）
へアスパルトキナーゼをコートする遺伝子を含むＤＮＡ
断片を下記のとおりサブクローニングした。
【００５６】上記（Ｃ）項で得たプラスミドｐＨＳＧ３
９９−ＡＫを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｒｕＩで切断した
ものと、プラスミドｐＵＣ１１９を制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ、ＳｍａＩで切断したものを混合し、５０ｍＭトリス
緩衝液（ｐＨ７.６）、１０ｍＭジチオスレイトール、
１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及びＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ１unit の各成分を添加し（各成分の濃度は最終
濃度である）、１２℃で１５時間反応させ、結合させ
た。
９９−ＡＫを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｒｕＩで切断した
ものと、プラスミドｐＵＣ１１９を制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ、ＳｍａＩで切断したものを混合し、５０ｍＭトリス
緩衝液（ｐＨ７.６）、１０ｍＭジチオスレイトール、
１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及びＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ１unit の各成分を添加し（各成分の濃度は最終
濃度である）、１２℃で１５時間反応させ、結合させ
た。
【００５７】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法（Journal of Molecular Biology，５３，１５
９，１９７０）により前記エシェリヒア・コリＣＧＳＣ
５０７４株を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む
選択培地［Ｋ2ＨＰＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、（ＮＨ
4)2ＳＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.１ｇ、グルコ
ース２０ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１ｌに溶解］に塗抹
した。
シウム法（Journal of Molecular Biology，５３，１５
９，１９７０）により前記エシェリヒア・コリＣＧＳＣ
５０７４株を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む
選択培地［Ｋ2ＨＰＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、（ＮＨ
4)2ＳＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.１ｇ、グルコ
ース２０ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１ｌに溶解］に塗抹
した。
【００５８】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＵＣ１１９の長さ
３.２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約１.７ｋｂの挿入
ＤＮＡ断片が認められた。各種の制限で切断したとき
の、長さ約１.７ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素認識部位
数および切断断片の大きさは前記表１に示したとおりで
あった。このＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図を図１に
示す。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＵＣ１１９の長さ
３.２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約１.７ｋｂの挿入
ＤＮＡ断片が認められた。各種の制限で切断したとき
の、長さ約１.７ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素認識部位
数および切断断片の大きさは前記表１に示したとおりで
あった。このＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図を図１に
示す。
【００５９】また上記で得たプラスミドを各種制限酵素
で切断して、切断断片の大きさを測定した。その結果を
下記の表２に示す。
で切断して、切断断片の大きさを測定した。その結果を
下記の表２に示す。
【００６０】
【表２】 上記の制限酵素により特徴づけられるプラスミドをｐＵ
Ｃ１１９−ＡＫと命名した。
Ｃ１１９−ＡＫと命名した。
【００６１】以上によりアスパルトキナーゼをコードす
る遺伝子を含む大きさが約１.７ｋｂのＤＮＡ断片（Ｅ
ｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片）を得ることができた。
る遺伝子を含む大きさが約１.７ｋｂのＤＮＡ断片（Ｅ
ｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片）を得ることができた。
【００６２】実施例２ アスパルトキナーゼをコードする遺伝子の塩基配列の決
定 実施例１の（Ｄ）項で得られたアスパルトキナーゼをコ
ードする遺伝子を含む長さが約１.７ｋｂのＤＮＡ断片
について、その塩基配列をプラスミドｐＵＣ１１８また
はｐＵＣ１１９（宝酒造製）を用いるジデオキシヌクレ
オチド酵素法（dideoxy chain termination 法）（Sahg
er，F.et al.，Proc.Nat.Acad.Sci．USA７４，５４６
３，１９７７）により図２に示した戦略図に従って決定
した。
定 実施例１の（Ｄ）項で得られたアスパルトキナーゼをコ
ードする遺伝子を含む長さが約１.７ｋｂのＤＮＡ断片
について、その塩基配列をプラスミドｐＵＣ１１８また
はｐＵＣ１１９（宝酒造製）を用いるジデオキシヌクレ
オチド酵素法（dideoxy chain termination 法）（Sahg
er，F.et al.，Proc.Nat.Acad.Sci．USA７４，５４６
３，１９７７）により図２に示した戦略図に従って決定
した。
【００６３】その塩基配列中のオープンリーディングフ
レームの存在から、アスパルトキナーゼをコードする遺
伝子は、下記配列に示す塩基配列を有する４２１個のア
ミノ酸をコードする１２６３の塩基対より構成されてい
ることが判明した。
レームの存在から、アスパルトキナーゼをコードする遺
伝子は、下記配列に示す塩基配列を有する４２１個のア
ミノ酸をコードする１２６３の塩基対より構成されてい
ることが判明した。
【００６４】
【化４】実施例３ コリネ型細菌内で複製し安定なプラスミドベクターｐＣ
ＲＹ３０の作成 （Ａ） プラスミドｐＢＹ５０３の調製 プラスミドｐＢＹ５０３は、ブレビバクテリウム・スタ
チオニスＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１
５）から分離された分子量約１０メガダルトンのプラス
ミドであり、特開平１−９５７８５号公報に記載のよう
にして調製した。半合成培地Ａ培地［尿素２ｇ、（ＮＨ
4)2ＳＯ4 ７ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０.
５ｇ、ＭｇＳＯ4 ０.５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍ
ｇ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２.５
ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビチオン２００μｇ、塩酸チアミ
ン２００μｇ、グルコース２０ｇ及び蒸留水１ｌ］１ｌ
に、ブレビバクテリウム・スタチオニスＩＦＯ１２１４
４を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られ
た菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチームを含む緩衝
液［２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭグルコース］２０ｍ
ｌに懸濁し、３７℃で１時間反応させた。反応液にアル
カリ−ＳＤＳ液［０.２Ｎ ＮａＯＨ、１％（Ｗ／Ｖ）Ｓ
ＤＳ］４０ｍｌを添加し、緩やかに混和して室温にて１
５分間静置した。次に、この反応液に酢酸カリウム溶液
［５Ｍ酢酸カリウム溶液６０ｍｌ、酢酸１１.５ｍｌ、
蒸留水２８.５ｍｌの混合液］３０ｍｌを添加し、充分
混和してから氷水中に１５分間静置した。
ＲＹ３０の作成 （Ａ） プラスミドｐＢＹ５０３の調製 プラスミドｐＢＹ５０３は、ブレビバクテリウム・スタ
チオニスＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１
５）から分離された分子量約１０メガダルトンのプラス
ミドであり、特開平１−９５７８５号公報に記載のよう
にして調製した。半合成培地Ａ培地［尿素２ｇ、（ＮＨ
4)2ＳＯ4 ７ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０.
５ｇ、ＭｇＳＯ4 ０.５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍ
ｇ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２.５
ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビチオン２００μｇ、塩酸チアミ
ン２００μｇ、グルコース２０ｇ及び蒸留水１ｌ］１ｌ
に、ブレビバクテリウム・スタチオニスＩＦＯ１２１４
４を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られ
た菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチームを含む緩衝
液［２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭグルコース］２０ｍ
ｌに懸濁し、３７℃で１時間反応させた。反応液にアル
カリ−ＳＤＳ液［０.２Ｎ ＮａＯＨ、１％（Ｗ／Ｖ）Ｓ
ＤＳ］４０ｍｌを添加し、緩やかに混和して室温にて１
５分間静置した。次に、この反応液に酢酸カリウム溶液
［５Ｍ酢酸カリウム溶液６０ｍｌ、酢酸１１.５ｍｌ、
蒸留水２８.５ｍｌの混合液］３０ｍｌを添加し、充分
混和してから氷水中に１５分間静置した。
【００６５】溶菌物全量を遠心管に移し、４℃で１０分
間、１５,０００×ｇの遠心分離にかけ、上澄液を得
た。
間、１５,０００×ｇの遠心分離にかけ、上澄液を得
た。
【００６６】これに等量のフェノール−クロロホルム液
（フェノール：クロロホルム＝１：１混和液）を加え懸
濁した後、遠心管に移し、室温下で５分間、１５,００
０×ｇの遠心分離にかけ、水層を回収した。水層に２倍
量のエタノールを加え、−２０℃で１時間静置後、４℃
で１０分間、１５,０００×ｇの遠心分離にかけ、沈澱
を回収した。
（フェノール：クロロホルム＝１：１混和液）を加え懸
濁した後、遠心管に移し、室温下で５分間、１５,００
０×ｇの遠心分離にかけ、水層を回収した。水層に２倍
量のエタノールを加え、−２０℃で１時間静置後、４℃
で１０分間、１５,０００×ｇの遠心分離にかけ、沈澱
を回収した。
【００６７】沈澱を減圧乾燥後、ＴＥ緩衝液［トリス１
０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ；ＨＣｌにてｐＨ８.０に調
整］２ｍｌに溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液［５
倍濃度のＴＥ緩衝液１００ｍｌに塩化セシウム１７０ｇ
を溶解させた液］１５ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌエチジウム
ブロマイド溶液１ｍｌを加えて、密度を１.３９２ｇ／
ｍｌに合わせた。この溶液を１２℃で４２時間、１１
６,０００×ｇの遠心分離を行った。
０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ；ＨＣｌにてｐＨ８.０に調
整］２ｍｌに溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液［５
倍濃度のＴＥ緩衝液１００ｍｌに塩化セシウム１７０ｇ
を溶解させた液］１５ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌエチジウム
ブロマイド溶液１ｍｌを加えて、密度を１.３９２ｇ／
ｍｌに合わせた。この溶液を１２℃で４２時間、１１
６,０００×ｇの遠心分離を行った。
【００６８】プラスミドｐＢＹ５０３は紫外線照射によ
り遠心管内で下方のバンドとして見い出される。このバ
ンドを注射器で遠心管の側面から抜きとることにより、
プラスミドｐＢＹ５０３を含む分画液を得た。
り遠心管内で下方のバンドとして見い出される。このバ
ンドを注射器で遠心管の側面から抜きとることにより、
プラスミドｐＢＹ５０３を含む分画液を得た。
【００６９】次いでこの分画液を等量のイソアミルアル
コールで４回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去
し、その後にＴＥ緩衝液に対して透析を行った。このよ
うにして得られたプラスミドｐＢＹ５０３を含む透析液
に３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を最終濃度３０ｍＭに添加し
た後、２倍量エタノールを加え、−２０℃１時間静置し
た。この溶液を１５,０００×ｇの遠心分離にかけてＤ
ＮＡを沈降させ、プラスミドｐＢＹ５０３を５０μｇ得
た。
コールで４回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去
し、その後にＴＥ緩衝液に対して透析を行った。このよ
うにして得られたプラスミドｐＢＹ５０３を含む透析液
に３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を最終濃度３０ｍＭに添加し
た後、２倍量エタノールを加え、−２０℃１時間静置し
た。この溶液を１５,０００×ｇの遠心分離にかけてＤ
ＮＡを沈降させ、プラスミドｐＢＹ５０３を５０μｇ得
た。
【００７０】（Ｂ） プラスミドベクターｐＣＲＹ３０
の作成 プラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）０.５μｇに制
限酵素ＳａｌＩ（５units）を３７℃１時間反応させ、
プラスミドＤＮＡを完全に分解した。
の作成 プラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）０.５μｇに制
限酵素ＳａｌＩ（５units）を３７℃１時間反応させ、
プラスミドＤＮＡを完全に分解した。
【００７１】前記（Ａ）項で調製したプラスミドｐＢＹ
５０３の２μｇに制限酵素ＸｈｏＩ（１unit）を３７℃
で３０分間反応させ、プラスミドＤＮＡを部分分解し
た。両者のプラスミドＤＮＡ分解物を混合し、制限酵素
を不活性化するために６５℃で１０分間加熱処理した
後、該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５０ｍＭ
トリス緩衝液ｐＨ７.６、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍ
Ｍジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ及びＴ４ ＤＮＡ
リガーゼ１unit になるように各成分を強化し、１６℃
で１５時間保温した。この溶液を用いてエシェリヒア・
コリＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造製）を形質転
換した。
５０３の２μｇに制限酵素ＸｈｏＩ（１unit）を３７℃
で３０分間反応させ、プラスミドＤＮＡを部分分解し
た。両者のプラスミドＤＮＡ分解物を混合し、制限酵素
を不活性化するために６５℃で１０分間加熱処理した
後、該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５０ｍＭ
トリス緩衝液ｐＨ７.６、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍ
Ｍジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ及びＴ４ ＤＮＡ
リガーゼ１unit になるように各成分を強化し、１６℃
で１５時間保温した。この溶液を用いてエシェリヒア・
コリＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造製）を形質転
換した。
【００７２】形質転換株は３０μｇ／ｍｌ（最終濃度）
のカナマイシン、１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）のＩＰ
ＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド）１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）のＸ−ｇａｌ（５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド）を含むＬ培地（トリプトン１０ｇ、酵母
エキス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び蒸留水１ｌ、ｐＨ７.
２）で３７℃にて２４時間培養し、生育株として得られ
た。これらの生育株のうち、白いコロニーで生育してき
たものを選択し、各々プラスミドをアルカリ−ＳＤＳ法
［T.Maniatis，E.F.Fritsch，J.Sambrook，“Molecular
cloning"（１９８２）ｐ９０〜９１参照］により抽出
した。
のカナマイシン、１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）のＩＰ
ＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド）１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）のＸ−ｇａｌ（５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド）を含むＬ培地（トリプトン１０ｇ、酵母
エキス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び蒸留水１ｌ、ｐＨ７.
２）で３７℃にて２４時間培養し、生育株として得られ
た。これらの生育株のうち、白いコロニーで生育してき
たものを選択し、各々プラスミドをアルカリ−ＳＤＳ法
［T.Maniatis，E.F.Fritsch，J.Sambrook，“Molecular
cloning"（１９８２）ｐ９０〜９１参照］により抽出
した。
【００７３】その結果、プラスミドｐＨＳＧ２９８のＳ
ａｌＩ部位にプラスミドｐＢＹ５０３由来の約４.０ｋ
ｂの断片が挿入されたプラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒ
ｉが得られた。
ａｌＩ部位にプラスミドｐＢＹ５０３由来の約４.０ｋ
ｂの断片が挿入されたプラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒ
ｉが得られた。
【００７４】次に同様の方法を用い、前記（Ａ）項で得
られたプラスミドｐＢＹ５０３ＤＮＡを制限酵素Ｋｐｎ
Ｉ及びＥｃｏＲＩにて処理して得られる約２.１ｋｂの
ＤＮＡ断片を上記プラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉの
ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、プラス
ミドベクターｐＣＲＹ３０を調製した。
られたプラスミドｐＢＹ５０３ＤＮＡを制限酵素Ｋｐｎ
Ｉ及びＥｃｏＲＩにて処理して得られる約２.１ｋｂの
ＤＮＡ断片を上記プラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉの
ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、プラス
ミドベクターｐＣＲＹ３０を調製した。
【００７５】実施例４ プラスミドｐＣＲＹ３０−ＡＫの作成及びコリネ型細菌
への導入 実施例１の（Ｃ）項で得られたプラスミドｐＨＳＧ３９
９−ＡＫ ５μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＮｒｕＩを各
５units 用い、３７℃で１時間反応させ分解したもの
と、ＢａｍＨＩリンカー（宝酒造より市販）１μｌを混
合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.６）、１０ｍＭ
ジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ１unit の各成分を添加
し（各成分の濃度は最終濃度である）、１２℃で１５時
間反応させ結合させた。
への導入 実施例１の（Ｃ）項で得られたプラスミドｐＨＳＧ３９
９−ＡＫ ５μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＮｒｕＩを各
５units 用い、３７℃で１時間反応させ分解したもの
と、ＢａｍＨＩリンカー（宝酒造より市販）１μｌを混
合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.６）、１０ｍＭ
ジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ１unit の各成分を添加
し（各成分の濃度は最終濃度である）、１２℃で１５時
間反応させ結合させた。
【００７６】このＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ ３units
を用い３７℃で１時間反応させ分解したものと、実施
例３の（Ｂ）項で得られたプラスミドｐＣＲＹ３０ １
μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ １unit を用い、３７℃で１
時間反応させ分解したものを混合し、５０ｍＭトリス緩
衝液（ｐＨ７.６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１
ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２およびＴ４ ＤＮＡ
リガーゼ１unit の各成分を添加し（各成分の濃度は最
終濃度である）、１２℃で１５時間反応させ結合させ
た。このプラスミドを用いて、前記方法に従い前記エシ
エリヒア・コリＣＧＳＣ５０７４株を形質転換し、カナ
マイシン５０μｇ／ｍｌを含む選択培地［Ｋ2ＨＰＯ4
７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、（ＮＨ4)2ＳＯ4 １ｇ、ＭｇＳ
Ｏ4・７Ｈ2Ｏ０.１ｇ、グルコース２０ｇ及び寒天１６
ｇを蒸留水１ｌに溶解］に塗抹した。
を用い３７℃で１時間反応させ分解したものと、実施
例３の（Ｂ）項で得られたプラスミドｐＣＲＹ３０ １
μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ １unit を用い、３７℃で１
時間反応させ分解したものを混合し、５０ｍＭトリス緩
衝液（ｐＨ７.６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１
ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２およびＴ４ ＤＮＡ
リガーゼ１unit の各成分を添加し（各成分の濃度は最
終濃度である）、１２℃で１５時間反応させ結合させ
た。このプラスミドを用いて、前記方法に従い前記エシ
エリヒア・コリＣＧＳＣ５０７４株を形質転換し、カナ
マイシン５０μｇ／ｍｌを含む選択培地［Ｋ2ＨＰＯ4
７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、（ＮＨ4)2ＳＯ4 １ｇ、ＭｇＳ
Ｏ4・７Ｈ2Ｏ０.１ｇ、グルコース２０ｇ及び寒天１６
ｇを蒸留水１ｌに溶解］に塗抹した。
【００７７】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＣＲＹ３０の長さ
８.６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、大きさ１.７ｋｂの挿入
ＤＮＡ断片が認められた。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＣＲＹ３０の長さ
８.６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、大きさ１.７ｋｂの挿入
ＤＮＡ断片が認められた。
【００７８】上記の如く調製されたプラスミドＤＮＡ
を、コリネ型細菌へ形質転換した。
を、コリネ型細菌へ形質転換した。
【００７９】形質転換は、電気パルス法を用いて次のと
おり行った。
おり行った。
【００８０】ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３
３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）プラスミドｐＢＹ５０
２除去株を１００ｍｌの前記Ａ培地で対数増殖初期まで
培養し、ペニシリンＧを１ユニット／ｍｌになるように
添加して、さらに２時間振盪培養し、遠心分離により菌
体を集め、菌体を２０ｍｌのパルス用溶液（２７２ｍＭ
Sucrose、７ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、１ｍＭ ＭｇＣｌ2；ｐ
Ｈ７.４）にて洗浄した。さらに菌体を遠心分離して集
め、５ｍｌのパルス用溶液に懸濁し、０.７５ｍｌの細
胞と、前記で得られたプラスミドＤＮＡ溶液５０μｌと
を混合し、水中にて２０分間静置した。ジーンパルサー
（バイオラド社製）を用いて、２５００ボルト、２５μ
ＦＤに設定し、パルスを印加後氷中に２０分間静置し
た。全量を３ｍｌの前記Ａ培地に移し３０℃にて１時間
培養後、カナマイシン１５μｇ／ｍｌ（最終濃度）を含
む前記Ａ寒天培地に植菌し３０℃で２〜３日間培養し
た。出現したカナマイシン耐性株より、前記実施例３
（Ａ）項に記載の方法を用いてプラスミドを得た。この
プラスミドを各種制限酵素で切断して、切断断片の大き
さを測定した。その結果を下記の表３に示す。
３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）プラスミドｐＢＹ５０
２除去株を１００ｍｌの前記Ａ培地で対数増殖初期まで
培養し、ペニシリンＧを１ユニット／ｍｌになるように
添加して、さらに２時間振盪培養し、遠心分離により菌
体を集め、菌体を２０ｍｌのパルス用溶液（２７２ｍＭ
Sucrose、７ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、１ｍＭ ＭｇＣｌ2；ｐ
Ｈ７.４）にて洗浄した。さらに菌体を遠心分離して集
め、５ｍｌのパルス用溶液に懸濁し、０.７５ｍｌの細
胞と、前記で得られたプラスミドＤＮＡ溶液５０μｌと
を混合し、水中にて２０分間静置した。ジーンパルサー
（バイオラド社製）を用いて、２５００ボルト、２５μ
ＦＤに設定し、パルスを印加後氷中に２０分間静置し
た。全量を３ｍｌの前記Ａ培地に移し３０℃にて１時間
培養後、カナマイシン１５μｇ／ｍｌ（最終濃度）を含
む前記Ａ寒天培地に植菌し３０℃で２〜３日間培養し
た。出現したカナマイシン耐性株より、前記実施例３
（Ａ）項に記載の方法を用いてプラスミドを得た。この
プラスミドを各種制限酵素で切断して、切断断片の大き
さを測定した。その結果を下記の表３に示す。
【００８１】
【表３】 上記制限酵素により特徴づけられるプラスミドをｐＣＲ
Ｙ３０−ＡＫと命名した。
Ｙ３０−ＡＫと命名した。
【００８２】なお、プラスミドｐＣＲＹ３０−ＡＫによ
り形質転換されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２
３３−ＡＫは、茨城県つくば市東１丁目１番３号の工業
技術院微生物工業技術研究所に、平成３年１２月１６日
付で：微工研菌寄第１２６５８号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２
６５８）として寄託されている。
り形質転換されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２
３３−ＡＫは、茨城県つくば市東１丁目１番３号の工業
技術院微生物工業技術研究所に、平成３年１２月１６日
付で：微工研菌寄第１２６５８号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２
６５８）として寄託されている。
【００８３】実施例５ プラスミドｐＣＲＹ３０−ＡＫの安定性 前記のＡ培地１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに
分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したものに、実施
例４で得た形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３−ＡＫを植菌し、３０℃にて２４時間振盪培養
を行った後、同様にして調製したＡ培地１００ｍｌを５
００ｍｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃で１５分間
滅菌したものに、１ｍｌ当たり５０cells の割合になる
ように植継し、同じく３０℃にて２４時間振盪培養を行
った。次に遠心分離して集菌し、菌体を洗浄後、カナマ
イシンを１５μｇ／ｍｌの割合で添加したＡ培地及び無
添加のＡ培地を用いて調製した平板培地に一定量塗抹
し、３０℃にて１日培養後生育コロニーをカウントし
た。
分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したものに、実施
例４で得た形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３−ＡＫを植菌し、３０℃にて２４時間振盪培養
を行った後、同様にして調製したＡ培地１００ｍｌを５
００ｍｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃で１５分間
滅菌したものに、１ｍｌ当たり５０cells の割合になる
ように植継し、同じく３０℃にて２４時間振盪培養を行
った。次に遠心分離して集菌し、菌体を洗浄後、カナマ
イシンを１５μｇ／ｍｌの割合で添加したＡ培地及び無
添加のＡ培地を用いて調製した平板培地に一定量塗抹
し、３０℃にて１日培養後生育コロニーをカウントし
た。
【００８４】この結果、カナマイシン添加および無添加
培地に生育したコロニーは同数であること、さらにＡ培
地生育コロニーは全てカナマイシン添加培地に生育する
こと、すなわち該プラスミドの高度の安定性を確認し
た。
培地に生育したコロニーは同数であること、さらにＡ培
地生育コロニーは全てカナマイシン添加培地に生育する
こと、すなわち該プラスミドの高度の安定性を確認し
た。
【００８５】実施例６ Ｌ−リジンの生産 培地（尿素０.４％、硫酸アンモニウム１.４％、ＫＨ2
ＰＯ4 ０.０５％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.０５％、ＭｇＳＯ4・
７Ｈ2Ｏ ０.０５％、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ２ｐｐｍ、Ｆ
ｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２ｐｐｍ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ
２ｐｐｍ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２ｐｐｍ、ＮａＣｌ ２
ｐｐｍ、ビオチン２００μｇ／ｌ、チアミン・ＨＣｌ
１００μｇ／ｌ、カザミノ酸０.１％、酵母エキス０.１
％）１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに分注、滅
菌（滅菌後ｐＨ７.０）した後ブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）ＭＪ２３３−ＡＫ
（ＦＥＲＭ Ｐ−１２６５８号）を植菌し、無菌的にグ
ルコースを５ｇ／ｌの濃度になるように加え、３０℃に
て２日間振盪培養を行った。
ＰＯ4 ０.０５％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.０５％、ＭｇＳＯ4・
７Ｈ2Ｏ ０.０５％、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ２ｐｐｍ、Ｆ
ｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２ｐｐｍ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ
２ｐｐｍ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２ｐｐｍ、ＮａＣｌ ２
ｐｐｍ、ビオチン２００μｇ／ｌ、チアミン・ＨＣｌ
１００μｇ／ｌ、カザミノ酸０.１％、酵母エキス０.１
％）１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに分注、滅
菌（滅菌後ｐＨ７.０）した後ブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）ＭＪ２３３−ＡＫ
（ＦＥＲＭ Ｐ−１２６５８号）を植菌し、無菌的にグ
ルコースを５ｇ／ｌの濃度になるように加え、３０℃に
て２日間振盪培養を行った。
【００８６】次に、本培養培地（グルコース５％、硫酸
アンモニウム２.３％、ＫＨ2ＰＯ4０.０５％、Ｋ2ＨＰ
Ｏ4 ０.０５％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.０５％、Ｆｅ
ＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０ｐｐｍ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ
２０ｐｐｍ、ビオチン２００μｇ／ｌ、チアミン・ＨＣ
ｌ １００μｇ／ｌ、カザミノ酸０.３％、酵母エキス
０.３％）の１０００ｍｌを２ｌ容通気撹拌槽に仕込
み、滅菌（１２０℃、２０分間）後、前記前培養物の２
０ｍｌを添加して、回転数１０００ｒｐｍ、通気量１ｖ
ｖｍ、温度３３℃、ｐＨ７.６にて２４時間培養を行っ
た。
アンモニウム２.３％、ＫＨ2ＰＯ4０.０５％、Ｋ2ＨＰ
Ｏ4 ０.０５％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.０５％、Ｆｅ
ＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０ｐｐｍ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ
２０ｐｐｍ、ビオチン２００μｇ／ｌ、チアミン・ＨＣ
ｌ １００μｇ／ｌ、カザミノ酸０.３％、酵母エキス
０.３％）の１０００ｍｌを２ｌ容通気撹拌槽に仕込
み、滅菌（１２０℃、２０分間）後、前記前培養物の２
０ｍｌを添加して、回転数１０００ｒｐｍ、通気量１ｖ
ｖｍ、温度３３℃、ｐＨ７.６にて２４時間培養を行っ
た。
【００８７】培養終了後、培養物５００ｍｌから遠心分
離にて集菌後、脱塩蒸留水にて２度洗浄した菌体を反応
液［（ＮＨ4)2ＳＯ4 ２ｇ／ｌ；ＫＨ2ＰＯ4 ０.５ｇ／
ｌ；ＫＨ2ＰＯ4 ０.５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.
５ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０ｐｐｍ；ＭｎＳＯ4
・４〜６Ｈ2Ｏ ２０ｐｐｍ；チアミン塩酸塩１００μｇ
／ｌ；ｐＨ７.６］の１０００ｍｌに懸濁後、該懸濁液
を２ｌ容通気撹拌槽に仕込み、グルコース９ｇを添加し
て、回転数３００ｒｐｍ、通気量０.１ｖｖｍ、温度３
３℃、ｐＨ７.６にて２４時間反応を行った。
離にて集菌後、脱塩蒸留水にて２度洗浄した菌体を反応
液［（ＮＨ4)2ＳＯ4 ２ｇ／ｌ；ＫＨ2ＰＯ4 ０.５ｇ／
ｌ；ＫＨ2ＰＯ4 ０.５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.
５ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０ｐｐｍ；ＭｎＳＯ4
・４〜６Ｈ2Ｏ ２０ｐｐｍ；チアミン塩酸塩１００μｇ
／ｌ；ｐＨ７.６］の１０００ｍｌに懸濁後、該懸濁液
を２ｌ容通気撹拌槽に仕込み、グルコース９ｇを添加し
て、回転数３００ｒｐｍ、通気量０.１ｖｖｍ、温度３
３℃、ｐＨ７.６にて２４時間反応を行った。
【００８８】反応終了後、遠心分離（４０００ｒｐｍ、
１５分間、４℃）にて除菌した上清液中のＬ−リジンを
定量した。その結果、上清液中のＬ−リジン生成量は、
１.５ｇ／ｌであった。
１５分間、４℃）にて除菌した上清液中のＬ−リジンを
定量した。その結果、上清液中のＬ−リジン生成量は、
１.５ｇ／ｌであった。
【００８９】この反応終了後の培養液５００ｍｌを、強
酸性陽イオン交換樹脂（Ｈ+ 型）のカラムに通してＬ−
リジンを吸着させ、水洗後、０.５Ｎアンモニア水で溶
出させた後、Ｌ−リジン画分を濃縮し、冷エタノールで
Ｌ−リジンの結晶を折出させた。その結果、４００ｍｇ
のＬ−リジン結晶を得た。
酸性陽イオン交換樹脂（Ｈ+ 型）のカラムに通してＬ−
リジンを吸着させ、水洗後、０.５Ｎアンモニア水で溶
出させた後、Ｌ−リジン画分を濃縮し、冷エタノールで
Ｌ−リジンの結晶を折出させた。その結果、４００ｍｇ
のＬ−リジン結晶を得た。
【００９０】また、比較例として、同様の条件にて、ブ
レビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavu
m）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を培養
し、同様の条件にて反応させた後上清液中のＬ−リジン
を定量した。その結果、上清液液中のＬ−リジン生成量
は０.６ｇ／ｌであった。
レビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavu
m）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を培養
し、同様の条件にて反応させた後上清液中のＬ−リジン
を定量した。その結果、上清液液中のＬ−リジン生成量
は０.６ｇ／ｌであった。
【００９１】
【化５】
【図１】本発明のアスパルトキナーゼをコードする遺伝
子を含むＤＮＡ断片の制限酵素による切断点地図。
子を含むＤＮＡ断片の制限酵素による切断点地図。
【図２】大きさが約１.７ｋｂの本発明ＤＮＡ断片の塩
基配列決定のための概略図。
基配列決定のための概略図。
【化２その１】
【化２その２】
【化２その３】
【化３その１】
【化３その２】
【化３その３】
【化３その４】
【化３その５】
【化４その１】
【化４その２】
【化４その３】
【化４その４】
【化４その５】
【化５その１】
【化５その２】
【化５その３】
【化５その４】
【化５その５】
フロントページの続き (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号三 菱油化株式会社筑波総合研究所内
Claims (8)
- 【請求項１】 コリネ型細菌由来のアスパルトキナーゼ
（Ｅ.Ｃ.２.７.２.４.）をコードする遺伝子ＤＮＡ。 - 【請求項２】 コリネ型細菌がブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）ＭＪ２３３である請
求項１記載の遺伝子ＤＮＡ。 - 【請求項３】 次のＤＮＡ塩基配列 【化１】 で示されるアスパルトキナーゼ（Ｅ.Ｃ.２.７.２.４.）
をコードする遺伝子ＤＮＡ。 - 【請求項４】 次のアミノ酸配列 【化２】で示されるアスパルトキナーゼ（Ｅ.Ｃ.２.７.
２.４.）をコードする遺伝子ＤＮＡ。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子
ＤＮＡが導入された組換えプラスミド。 - 【請求項６】 請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子
ＤＮＡと、コリネ型細菌内で複製増殖機能を司る遺伝子
を含むＤＮＡを保有する組換えプラスミド。 - 【請求項７】 請求項６記載の組換えプラスミドで形質
転換されたコリネ型細菌。 - 【請求項８】 グルコースを、請求項７記載のコリネ型
細菌の培養菌体又は菌体処理物と接触させてＬ−リジン
を生成せしめることを特徴とするＬ−リジンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2465892A JPH05184366A (ja) | 1992-01-14 | 1992-01-14 | アスパルトキナーゼをコードする遺伝子ｄｎａ及びその利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2465892A JPH05184366A (ja) | 1992-01-14 | 1992-01-14 | アスパルトキナーゼをコードする遺伝子ｄｎａ及びその利用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05184366A true JPH05184366A (ja) | 1993-07-27 |
Family
ID=12144251
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2465892A Pending JPH05184366A (ja) | 1992-01-14 | 1992-01-14 | アスパルトキナーゼをコードする遺伝子ｄｎａ及びその利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05184366A (ja) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004500072A (ja) * | 1999-12-30 | 2004-01-08 | アーカー−ダニエルズ−ミッドランド カンパニー | 遺伝子増幅によるリジン産生の増加 |
| EP1702980A1 (en) | 1999-07-01 | 2006-09-20 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum gene encoding Hpr of phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system |
| US7273721B2 (en) | 1999-06-25 | 2007-09-25 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in membrane synthesis and membrane transport |
| US7393675B2 (en) | 1999-06-25 | 2008-07-01 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in carbon metabolism and energy production |
| US7410766B2 (en) | 1999-07-01 | 2008-08-12 | Basf Se | Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins |
| US7439050B2 (en) | 1999-06-25 | 2008-10-21 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding diaminopimelate epimerase |
| EP2940039A1 (de) | 2014-04-30 | 2015-11-04 | Evonik Degussa GmbH | Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren in Corynebakterien unter Verwendung eines Glycin spaltenden Systems |
| EP2940143A1 (de) | 2014-04-30 | 2015-11-04 | Evonik Degussa GmbH | Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren unter Verwendung eines alkaliphilen Bakteriums |
| DE102014208199A1 (de) | 2014-04-30 | 2015-11-05 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren unter Verwendung eines alkaliphilen Bakteriums |
-
1992
- 1992-01-14 JP JP2465892A patent/JPH05184366A/ja active Pending
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7273721B2 (en) | 1999-06-25 | 2007-09-25 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in membrane synthesis and membrane transport |
| US7393675B2 (en) | 1999-06-25 | 2008-07-01 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in carbon metabolism and energy production |
| US7439050B2 (en) | 1999-06-25 | 2008-10-21 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding diaminopimelate epimerase |
| EP1702980A1 (en) | 1999-07-01 | 2006-09-20 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum gene encoding Hpr of phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system |
| US7410766B2 (en) | 1999-07-01 | 2008-08-12 | Basf Se | Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins |
| US7425435B2 (en) | 1999-07-01 | 2008-09-16 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins |
| JP2004500072A (ja) * | 1999-12-30 | 2004-01-08 | アーカー−ダニエルズ−ミッドランド カンパニー | 遺伝子増幅によるリジン産生の増加 |
| JP2011062217A (ja) * | 1999-12-30 | 2011-03-31 | Archer-Daniels-Midland Co | 遺伝子増幅によるリジン産生の増加 |
| JP4963152B2 (ja) * | 1999-12-30 | 2012-06-27 | アーチャー・ダニエルズ・ミッドランド カンパニー | 遺伝子増幅によるリジン産生の増加 |
| EP2940039A1 (de) | 2014-04-30 | 2015-11-04 | Evonik Degussa GmbH | Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren in Corynebakterien unter Verwendung eines Glycin spaltenden Systems |
| EP2940143A1 (de) | 2014-04-30 | 2015-11-04 | Evonik Degussa GmbH | Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren unter Verwendung eines alkaliphilen Bakteriums |
| DE102014208199A1 (de) | 2014-04-30 | 2015-11-05 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren unter Verwendung eines alkaliphilen Bakteriums |
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