JPH05168483A - フラジェリン遺伝子 - Google Patents
フラジェリン遺伝子Info
- Publication number
- JPH05168483A JPH05168483A JP26145791A JP26145791A JPH05168483A JP H05168483 A JPH05168483 A JP H05168483A JP 26145791 A JP26145791 A JP 26145791A JP 26145791 A JP26145791 A JP 26145791A JP H05168483 A JPH05168483 A JP H05168483A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- restriction enzyme
- flagellin
- bacillus
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 title claims abstract description 46
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 12
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims abstract description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 239000000835 fiber Substances 0.000 abstract description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 3
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241001037822 Bacillus bacterium Species 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 241001672648 Vieira Species 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002298 density-gradient ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N methanesulfonic acid Substances CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 好アルカリ性細菌バチルス属由来のフラジェ
リン遺伝子ＤＮＡ及びそのＤＮＡ配列を提供する。 【構成】 Ｃ−１２５株の染色体ＤＮＡから、枯草菌フ
ラジェリン遺伝子をプローブとしてサザンプロティング
法でハイブリダイズした断片画分をｐＵＣベクターに連
結し、大腸菌を形質転換した。次に、コロニーハイブリ
ダイゼーション法により、上記プローブとハイブリダイ
ズする1.５kbのHind III断片と1.２kbのEcoR I断片を得
た。これらの遺伝子について塩基配列の決定を行なっ
た。 【効果】 本発明におけるフラジェリン遺伝子は新規な
フラジェリン遺伝子である。
リン遺伝子ＤＮＡ及びそのＤＮＡ配列を提供する。 【構成】 Ｃ−１２５株の染色体ＤＮＡから、枯草菌フ
ラジェリン遺伝子をプローブとしてサザンプロティング
法でハイブリダイズした断片画分をｐＵＣベクターに連
結し、大腸菌を形質転換した。次に、コロニーハイブリ
ダイゼーション法により、上記プローブとハイブリダイ
ズする1.５kbのHind III断片と1.２kbのEcoR I断片を得
た。これらの遺伝子について塩基配列の決定を行なっ
た。 【効果】 本発明におけるフラジェリン遺伝子は新規な
フラジェリン遺伝子である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は好アルカリ性細菌バチル
ス属菌（alkalophilic Bacillus sp.)に由来し、制限酵
素Hind III認識部位１カ所、制限酵素Pst I 認識部位１
カ所、制限酵素EcoR I認識部位１カ所、制限酵素Acc I
認識部位１カ所及び制限酵素Bgl II認識部位１カ所を有
するフラジェリン遺伝子ＤＮＡに関し、さらにフラジェ
リンをコードするＤＮＡ配列及びそのアミノ酸配列に関
する。
ス属菌（alkalophilic Bacillus sp.)に由来し、制限酵
素Hind III認識部位１カ所、制限酵素Pst I 認識部位１
カ所、制限酵素EcoR I認識部位１カ所、制限酵素Acc I
認識部位１カ所及び制限酵素Bgl II認識部位１カ所を有
するフラジェリン遺伝子ＤＮＡに関し、さらにフラジェ
リンをコードするＤＮＡ配列及びそのアミノ酸配列に関
する。
【０００２】
【従来の技術】細菌のべん毛線維については大腸菌、サ
ルモネラ菌や枯草菌等でその構造や機能について研究が
進められ、べん毛線維を構成するタンパク質であるフラ
ジェリンについても、そのＤＮＡ配列が明らかにされて
いる。（J.Bacteriol.171 , 3085-3094(1989),168 , 14
79-1483(1986), J.Biol.Chem. 260 , 15758-15′(198
6)）しかし、これらは、主に中性領域に生息する細菌の
フラジェリンについてであり、アルカリ環境に生息する
好アルカリ性細菌のべん毛線維やフラジェリン遺伝子Ｄ
ＮＡの解析は殆ど行なわれていない。
ルモネラ菌や枯草菌等でその構造や機能について研究が
進められ、べん毛線維を構成するタンパク質であるフラ
ジェリンについても、そのＤＮＡ配列が明らかにされて
いる。（J.Bacteriol.171 , 3085-3094(1989),168 , 14
79-1483(1986), J.Biol.Chem. 260 , 15758-15′(198
6)）しかし、これらは、主に中性領域に生息する細菌の
フラジェリンについてであり、アルカリ環境に生息する
好アルカリ性細菌のべん毛線維やフラジェリン遺伝子Ｄ
ＮＡの解析は殆ど行なわれていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題、作用】フラジェリンは
細菌のべん毛線維を構成するタンパク質であり、細菌が
運動する際に推進力を伝えるプロペラ様の働きを持つこ
とが知られている。最近ではべん毛はマイクロマシーン
の材料としても注目されており、材料として用いるため
にはべん毛の構造や機能を明らかにする必要があり、そ
れにはフラジェリン遺伝子ＤＮＡからの解析が不可欠で
ある。また、べん毛線維は菌体外にあり、直接、外部環
境と接しているためアルカリ環境に生息する好アルカリ
性細菌では、フラジェリンがアルカリ適応機構を有する
ことが予想され、これらの解明も興味深いものである。
本発明は好アルカリ性細菌バチルス属由来のフラジェリ
ン遺伝子ＤＮＡ及びそのＤＮＡ配列を提供することを目
的とするものである。
細菌のべん毛線維を構成するタンパク質であり、細菌が
運動する際に推進力を伝えるプロペラ様の働きを持つこ
とが知られている。最近ではべん毛はマイクロマシーン
の材料としても注目されており、材料として用いるため
にはべん毛の構造や機能を明らかにする必要があり、そ
れにはフラジェリン遺伝子ＤＮＡからの解析が不可欠で
ある。また、べん毛線維は菌体外にあり、直接、外部環
境と接しているためアルカリ環境に生息する好アルカリ
性細菌では、フラジェリンがアルカリ適応機構を有する
ことが予想され、これらの解明も興味深いものである。
本発明は好アルカリ性細菌バチルス属由来のフラジェリ
ン遺伝子ＤＮＡ及びそのＤＮＡ配列を提供することを目
的とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、好アルカ
リ性細菌バチルス属由来のフラジェリン遺伝子及びその
遺伝子配列について鋭意研鑚を重ねた結果、本発明に到
達した。
リ性細菌バチルス属由来のフラジェリン遺伝子及びその
遺伝子配列について鋭意研鑚を重ねた結果、本発明に到
達した。
【０００５】フラジェリンの遺伝情報を担うＤＮＡ（以
下 染色体ＤＮＡ と記す）は、好アルカリ性細菌バチ
ルス属に属する微生物から単離精製する。好アルカリ性
細菌バチルス属に属する微生物としては、たとえば、公
知の菌株であるバチルスＣ１２５菌（微工研菌寄第７３
４４号）を用いることができる（以下 Ｃ−１２５株と
記す）。サイトウ、ミウラらの方法（Biochim. Biophy
s. Acta 72 p619〜629(1963) ）によりＣ−１２５株
から染色体ＤＮＡを単離、精製することができる。
下 染色体ＤＮＡ と記す）は、好アルカリ性細菌バチ
ルス属に属する微生物から単離精製する。好アルカリ性
細菌バチルス属に属する微生物としては、たとえば、公
知の菌株であるバチルスＣ１２５菌（微工研菌寄第７３
４４号）を用いることができる（以下 Ｃ−１２５株と
記す）。サイトウ、ミウラらの方法（Biochim. Biophy
s. Acta 72 p619〜629(1963) ）によりＣ−１２５株
から染色体ＤＮＡを単離、精製することができる。
【０００６】このようにして得られた染色体ＤＮＡのベ
クターＤＮＡへの組み込みは、以下のようにして行なう
ことができる。すなわち染色体ＤＮＡおよびベクターＤ
ＮＡのそれぞれを制限酵素で切断したのち、両者の断片
をＴ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼにより処理して、
組換えＤＮＡを得る。得られた組換えＤＮＡ混合物は、
例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、69、p2110-2114
(1972)に記載されているカルシウムイオン処理により、
大腸菌に形質転換を行ない、ベクターＤＮＡを含む形質
転換株を選択される。フラジェリンの遺伝情報を担うＤ
ＮＡ断片が組み込まれたベクターＤＮＡの選択は、例え
ば得られた形質転換株から枯草菌のフラジェリン遺伝子
をＤＮＡプローブとしてコロニーハイブリダイゼーショ
ン法（Proc. Nat. Acad. Sci. USA 、78、p6091-6095)
により行なうことができる。
クターＤＮＡへの組み込みは、以下のようにして行なう
ことができる。すなわち染色体ＤＮＡおよびベクターＤ
ＮＡのそれぞれを制限酵素で切断したのち、両者の断片
をＴ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼにより処理して、
組換えＤＮＡを得る。得られた組換えＤＮＡ混合物は、
例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、69、p2110-2114
(1972)に記載されているカルシウムイオン処理により、
大腸菌に形質転換を行ない、ベクターＤＮＡを含む形質
転換株を選択される。フラジェリンの遺伝情報を担うＤ
ＮＡ断片が組み込まれたベクターＤＮＡの選択は、例え
ば得られた形質転換株から枯草菌のフラジェリン遺伝子
をＤＮＡプローブとしてコロニーハイブリダイゼーショ
ン法（Proc. Nat. Acad. Sci. USA 、78、p6091-6095)
により行なうことができる。
【０００７】上記の方法で得られた組換え体ＤＮＡの挿
入断片についてベクタープラスミドｐＵＣ１１８または
ｐＵＣ１１９にサブクローニング後、大腸菌ＭＶ１１８
４株に形質転換した。得られた形質転換株を基に単離Ｄ
ＮＡを調整し、dideoxy 法（Songer F、Science 、214
、p1205)によりＤＮＡ配列が決定される。このように
して得られたフラジェリン遺伝子ＤＮＡを含むＤＮＡ断
片を図１に、また、フラジェリンのＤＮＡ配列及びアミ
ノ酸配列を図２に示した。これよりフラジェリン遺伝子
ＤＮＡは８１６bpのオープンリーディングフレームから
成り、これより翻訳されるタンパク質は２７２個のアミ
ノ酸から成り、その質量は３００１３Ｄａであることが
わかった。なお、本発明の新規なフラジェリン遺伝子を
使用して得られるフラジェリンはマイクロマシーンの材
料として使用される可能性がある。
入断片についてベクタープラスミドｐＵＣ１１８または
ｐＵＣ１１９にサブクローニング後、大腸菌ＭＶ１１８
４株に形質転換した。得られた形質転換株を基に単離Ｄ
ＮＡを調整し、dideoxy 法（Songer F、Science 、214
、p1205)によりＤＮＡ配列が決定される。このように
して得られたフラジェリン遺伝子ＤＮＡを含むＤＮＡ断
片を図１に、また、フラジェリンのＤＮＡ配列及びアミ
ノ酸配列を図２に示した。これよりフラジェリン遺伝子
ＤＮＡは８１６bpのオープンリーディングフレームから
成り、これより翻訳されるタンパク質は２７２個のアミ
ノ酸から成り、その質量は３００１３Ｄａであることが
わかった。なお、本発明の新規なフラジェリン遺伝子を
使用して得られるフラジェリンはマイクロマシーンの材
料として使用される可能性がある。
【０００８】本発明を実施例によりさらに具体的に説明
する。 実施例1. フラジェリン遺伝子の分離 好アルカリ性バチルス属細菌としてＣ−１２５株を用
い、Ｃ−１２５株の染色体ＤＮＡはサイトウ、ミウラら
の方法（Biochim. Biophys. Acta. 72、p619〜629(196
3) ）に準じて調製した。得られた染色体ＤＮＡを制限
酵素EcoR IおよびHind IIIで部分分解した。これとは別
にベクターｐＵＣ１１８及びｐＵＣ１１９をそれぞれ制
限酵素EcoRIまたはHind IIIで完全分解し、細菌由来の
アルカリフォスファターゼで処理してベクターＤＮＡ断
片とした。このようにして得られた染色体ＤＮＡ断片0.
１μg とベクターＤＮＡ断片0.２μg を混合したのち、
Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼを加え１６℃で一夜
反応させ組換えＤＮＡを作成した。得られた組換えＤＮ
Ａを、大腸菌ＭＶ１１８４株コンピテントセルと混合
し、０℃下で１時間静置後、さらに、４２℃で７０秒間
加温して、細胞内に取りこませた。これに３mlのイース
トエキストラクト、トリプトン及びNaClから成るＬＢ培
地を加え３７℃で３時間培養後、アンピシリン１００μ
ｇ／ml、0.０２％のＸ−Gal(５−bromo −４−chloro−
３−indolyl −β−Ｄ−Galactoside)および１mMのＩＰ
ＴＧ(isopropyl−β−Ｄ−thiogalactoside)を含むＬＢ
寒天平板培地上に拡げて、３７℃で１晩培養した。この
平板培地上で、白色のコロニーを作る菌を形質転換体と
して選択した。さらに得られた形質転換株の中から、枯
草菌のフラジェリン遺伝子をＤＮＡプローブとしたジゴ
キシゲニンでラベルしたコロニーハイブリダイゼーショ
ンを行ない、ポジィティブな形質転換株からアルカリ−
ＳＤＳ法によりＣ−１２５株フラジェリン遺伝子を含む
約2.５kbのHind III／EcoR I断片を得た。このＤＮＡ断
片を制限酵素EcoR I及びHind IIIで切断後、アガロース
ゲル電気泳動にかけ、バキュームブロッティングにより
ＤＮＡをメンブラン上に移した後、ジゴキシゲニンでラ
ベルしたサザンハイブリダイゼーションを行なった。そ
の結果、このHind III／EcoR I断片は確かにＣ−１２５
株の染色体ＤＮＡに由来することが示された。
する。 実施例1. フラジェリン遺伝子の分離 好アルカリ性バチルス属細菌としてＣ−１２５株を用
い、Ｃ−１２５株の染色体ＤＮＡはサイトウ、ミウラら
の方法（Biochim. Biophys. Acta. 72、p619〜629(196
3) ）に準じて調製した。得られた染色体ＤＮＡを制限
酵素EcoR IおよびHind IIIで部分分解した。これとは別
にベクターｐＵＣ１１８及びｐＵＣ１１９をそれぞれ制
限酵素EcoRIまたはHind IIIで完全分解し、細菌由来の
アルカリフォスファターゼで処理してベクターＤＮＡ断
片とした。このようにして得られた染色体ＤＮＡ断片0.
１μg とベクターＤＮＡ断片0.２μg を混合したのち、
Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼを加え１６℃で一夜
反応させ組換えＤＮＡを作成した。得られた組換えＤＮ
Ａを、大腸菌ＭＶ１１８４株コンピテントセルと混合
し、０℃下で１時間静置後、さらに、４２℃で７０秒間
加温して、細胞内に取りこませた。これに３mlのイース
トエキストラクト、トリプトン及びNaClから成るＬＢ培
地を加え３７℃で３時間培養後、アンピシリン１００μ
ｇ／ml、0.０２％のＸ−Gal(５−bromo −４−chloro−
３−indolyl −β−Ｄ−Galactoside)および１mMのＩＰ
ＴＧ(isopropyl−β−Ｄ−thiogalactoside)を含むＬＢ
寒天平板培地上に拡げて、３７℃で１晩培養した。この
平板培地上で、白色のコロニーを作る菌を形質転換体と
して選択した。さらに得られた形質転換株の中から、枯
草菌のフラジェリン遺伝子をＤＮＡプローブとしたジゴ
キシゲニンでラベルしたコロニーハイブリダイゼーショ
ンを行ない、ポジィティブな形質転換株からアルカリ−
ＳＤＳ法によりＣ−１２５株フラジェリン遺伝子を含む
約2.５kbのHind III／EcoR I断片を得た。このＤＮＡ断
片を制限酵素EcoR I及びHind IIIで切断後、アガロース
ゲル電気泳動にかけ、バキュームブロッティングにより
ＤＮＡをメンブラン上に移した後、ジゴキシゲニンでラ
ベルしたサザンハイブリダイゼーションを行なった。そ
の結果、このHind III／EcoR I断片は確かにＣ−１２５
株の染色体ＤＮＡに由来することが示された。
【０００９】実施例２ フラジェリン遺伝子の解析１
（塩基配列の決定） 実施例１で得られたＣ−１２５フラジェリン遺伝子を含
むHind III／EcoR I断片についてdideoxy 法により全塩
基配列を決定した。すなわち、このＤＮＡ断片を各制限
酵素で切断後、同一の制限酵素で切断したｐＵＣ１１８
又はｐＵＣ１１９に組換えた後、実施例１で示した方法
によって各々大腸菌ＭＶ１１８４株に取り込ませた後、
アンピシリン５０μｇ／ml、0.０２％のX-Gal 及び１mM
のＩＰＴＧを含むＬＢ寒天平板培地上に拡げ３７℃で１
晩培養した。この平板上で白色のコロニーを作る菌株の
中からミニスクリーニング法（Holmes、D.S and Quigle
y.M.、Anal. Biochem.、114 p193(1981) ）によりプラ
スミドを調製し、制限酵素により解析を行ない、目的の
ＤＮＡ断片が挿入された菌株を選択した。得られた各種
形質転換株から単鎖ＤＮＡを調整し（Vieira. J 、and
Messing. J.MethodsinEnzymology 153 p3-11(198
7)）、デュポン社製の蛍光ラベルされたターミネーター
を用いたジデオキシ法により、デュポン社製GENESIS 20
00ＤＮＡシーケンサーシステムを用いて塩基配列を決定
した。決定されたフラジェリン構造遺伝子全塩基配列を
図２に示す。
（塩基配列の決定） 実施例１で得られたＣ−１２５フラジェリン遺伝子を含
むHind III／EcoR I断片についてdideoxy 法により全塩
基配列を決定した。すなわち、このＤＮＡ断片を各制限
酵素で切断後、同一の制限酵素で切断したｐＵＣ１１８
又はｐＵＣ１１９に組換えた後、実施例１で示した方法
によって各々大腸菌ＭＶ１１８４株に取り込ませた後、
アンピシリン５０μｇ／ml、0.０２％のX-Gal 及び１mM
のＩＰＴＧを含むＬＢ寒天平板培地上に拡げ３７℃で１
晩培養した。この平板上で白色のコロニーを作る菌株の
中からミニスクリーニング法（Holmes、D.S and Quigle
y.M.、Anal. Biochem.、114 p193(1981) ）によりプラ
スミドを調製し、制限酵素により解析を行ない、目的の
ＤＮＡ断片が挿入された菌株を選択した。得られた各種
形質転換株から単鎖ＤＮＡを調整し（Vieira. J 、and
Messing. J.MethodsinEnzymology 153 p3-11(198
7)）、デュポン社製の蛍光ラベルされたターミネーター
を用いたジデオキシ法により、デュポン社製GENESIS 20
00ＤＮＡシーケンサーシステムを用いて塩基配列を決定
した。決定されたフラジェリン構造遺伝子全塩基配列を
図２に示す。
【００１０】実施例３ フラジェリン遺伝子の解析２ 実施例２で決定したフラジェリン構造遺伝子について、
Ｃ−１２５株から分離したフラジェリンのアミノ酸分
析、Ｎ末端アミノ酸配列の分析結果と比較した。すなわ
ち、はじめに、Ｃ−１２５株を培養し、対数増殖期の中
期に集菌し、生理食塩水で洗浄した後、バッファーに懸
濁した。この懸濁液を軽い超音波処理にかけてべん毛を
菌体から遊離させ遠心分離（5,000 ｇ×３０分，ｇ：重
力加速度−以下同様）により菌体を除去した。次に上清
を超遠心分離（40,000ｇ×４時間）にかけ、べん毛を沈
渣として回収し、１０−５０％のショ糖密度勾配超遠心
（100,000 ｇ×１８時間）を行ない、べん毛画分を分離
した。さらに、べん毛画分を透析してべん毛サンプルと
した。得られたべん毛サンプルをＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（以下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ と記す）
にかけた結果、フラジェリンの分子量が約３２KDaであ
ることが推定された。アミノ酸分析は、べん毛サンプル
を４Ｎ−メタンスルホン酸で加水分解した後、アミノ酸
分析計を用いて行なった。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで
推定されたフラジェリンの分子量とアミノ酸分析値から
フラジェリンタンパクのアミノ酸組成を算出した。また
Ｎ末端アミノ酸配列の決定はべん毛サンプルをペプチド
シーケンサーにかけることにより行なった。以上のよう
にして得られたフラジェリンタンパクのアミノ酸組成及
びＮ末端アミノ酸配列と、実施例２により決定したフラ
ジェリン構造遺伝子のＤＮＡ配列から求められたアミノ
酸配列とを比較した。フラジェリンのアミノ酸組成は若
干違いがあるもののよく一致しており（表１）、Ｎ末端
アミノ酸配列についても両者のものに違いは認められな
かった（図３）。これらの結果から、実施例２で分離解
析したフラジェリン遺伝子はＣ−１２５株由来のもので
あり、フラジェリンをコードするＤＮＡ配列であること
が確認された。
Ｃ−１２５株から分離したフラジェリンのアミノ酸分
析、Ｎ末端アミノ酸配列の分析結果と比較した。すなわ
ち、はじめに、Ｃ−１２５株を培養し、対数増殖期の中
期に集菌し、生理食塩水で洗浄した後、バッファーに懸
濁した。この懸濁液を軽い超音波処理にかけてべん毛を
菌体から遊離させ遠心分離（5,000 ｇ×３０分，ｇ：重
力加速度−以下同様）により菌体を除去した。次に上清
を超遠心分離（40,000ｇ×４時間）にかけ、べん毛を沈
渣として回収し、１０−５０％のショ糖密度勾配超遠心
（100,000 ｇ×１８時間）を行ない、べん毛画分を分離
した。さらに、べん毛画分を透析してべん毛サンプルと
した。得られたべん毛サンプルをＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（以下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ と記す）
にかけた結果、フラジェリンの分子量が約３２KDaであ
ることが推定された。アミノ酸分析は、べん毛サンプル
を４Ｎ−メタンスルホン酸で加水分解した後、アミノ酸
分析計を用いて行なった。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで
推定されたフラジェリンの分子量とアミノ酸分析値から
フラジェリンタンパクのアミノ酸組成を算出した。また
Ｎ末端アミノ酸配列の決定はべん毛サンプルをペプチド
シーケンサーにかけることにより行なった。以上のよう
にして得られたフラジェリンタンパクのアミノ酸組成及
びＮ末端アミノ酸配列と、実施例２により決定したフラ
ジェリン構造遺伝子のＤＮＡ配列から求められたアミノ
酸配列とを比較した。フラジェリンのアミノ酸組成は若
干違いがあるもののよく一致しており（表１）、Ｎ末端
アミノ酸配列についても両者のものに違いは認められな
かった（図３）。これらの結果から、実施例２で分離解
析したフラジェリン遺伝子はＣ−１２５株由来のもので
あり、フラジェリンをコードするＤＮＡ配列であること
が確認された。
【００１１】
【表１】
【００１２】
【発明の効果】本発明によって新規なフラジェリン遺伝
子が提供される。
子が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で分離したＣ−１２５株フラジェリン遺
伝子を含むＤＮＡ断片である。
伝子を含むＤＮＡ断片である。
【図２】フラジェリン構造遺伝子の全塩基配列およびア
ミノ酸配列を示したものである。
ミノ酸配列を示したものである。
【図３】図３はフラジェリンのＮ末端アミノ酸配列につ
いて、フラジェリン遺伝子の塩基配列とフラジェリンタ
ンパクから分析した結果とを比較したものである。
いて、フラジェリン遺伝子の塩基配列とフラジェリンタ
ンパクから分析した結果とを比較したものである。
Claims (4)
- 【請求項１】 好アルカリ性細菌バチルス属菌に由来
し、制限酵素Hind III認識部位を１カ所、制限酵素Pst
I 認識部位を１カ所、制限酵素EcoR I認識部位を１カ
所、制限酵素Acc I 認識部位を１カ所及び制限酵素Bgl
II認識部位１カ所を有するフラジェリン遺伝子ＤＮＡ。 - 【請求項２】 好アルカリ性細菌バチルス属が、バチル
スＣ１２５菌（微工研菌寄第７３４４号）である「請求
項１」記載のＤＮＡ。 - 【請求項３】 下記のアミノ酸配列をコードするフラジ
ェリン遺伝子ＤＮＡ - 【請求項４】 下記の塩基配列を有する遺伝子ＤＮＡ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26145791A JPH05168483A (ja) | 1991-09-13 | 1991-09-13 | フラジェリン遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26145791A JPH05168483A (ja) | 1991-09-13 | 1991-09-13 | フラジェリン遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05168483A true JPH05168483A (ja) | 1993-07-02 |
Family
ID=17362165
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26145791A Pending JPH05168483A (ja) | 1991-09-13 | 1991-09-13 | フラジェリン遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05168483A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1581119A4 (en) * | 2001-12-17 | 2008-12-03 | Corixa Corp | COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT AND DIAGNOSIS OF INFLAMMATORY ENDURANCE |
-
1991
- 1991-09-13 JP JP26145791A patent/JPH05168483A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1581119A4 (en) * | 2001-12-17 | 2008-12-03 | Corixa Corp | COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT AND DIAGNOSIS OF INFLAMMATORY ENDURANCE |
| US8318901B2 (en) | 2001-12-17 | 2012-11-27 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of inflammatory bowel disease |
| US9175046B2 (en) | 2001-12-17 | 2015-11-03 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of inflammatory bowel disease |
| US9290543B2 (en) | 2001-12-17 | 2016-03-22 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of inflammatory bowel disease |
| US9868779B2 (en) | 2001-12-17 | 2018-01-16 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of inflammatory bowel disease |
| US10457722B2 (en) | 2001-12-17 | 2019-10-29 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of inflammatory bowel disease |
| US10981978B2 (en) | 2001-12-17 | 2021-04-20 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of Inflammatory Bowel Disease |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Maeda et al. | Heat shock protein 60 (GroEL) from Porphyromonas gingivalis: molecular cloning and sequence analysis of its gene and purification of the recombinant protein | |
| Sano et al. | Molecular structures and functions of pyocins S1 and S2 in Pseudomonas aeruginosa | |
| Kodaira et al. | The dnaX gene encodes the DNA polymerase III holoenzyme τ subunit, precursor of the γ subunit, the dnaZ gene product | |
| HU205386B (en) | Process for expressing cloned lysostaphin gene and for producing dna fragment containing the gene, expression vector and transformed host cell | |
| JPH0755153B2 (ja) | 組換えｄｎａ分子及びその製造方法 | |
| JP2004532634A5 (ja) | ||
| JPH04166085A (ja) | 新規プロテアーゼ | |
| CN114107257B (zh) | 一种糖苷水解酶及其应用 | |
| JPH01501600A (ja) | 駆虫タンパク質用の遺伝暗号を含むｄｎａ断片を組み込んでいる雑種遺伝子、プラスミド、そのようなタンパク質を発現する形質転換した藍細菌及び生物抑制剤として用いる方法 | |
| JP2540484B2 (ja) | 殺虫性蛋白質をコ−ドする遺伝子 | |
| JPH05168483A (ja) | フラジェリン遺伝子 | |
| EP0400973A1 (en) | Mycobacterial secretory expression vectors and transformants | |
| JP2551746B2 (ja) | 改良プラスミドベクタ−およびその利用 | |
| US6015696A (en) | Mycobacterial secretory expression vectors and transformants | |
| Faguy et al. | Physical characterization of the flagella and flagellins from Methanospirillum hungatei | |
| JP2890168B2 (ja) | 新規アミノペプチダーゼ | |
| JPH0363356B2 (ja) | ||
| JP2660520B2 (ja) | 排出機能を有するフラジェリンのｎ端アミノ酸配列をコードする塩基配列 | |
| US20070031937A1 (en) | Co-expression of recombinant proteins | |
| JPH05153979A (ja) | ｓｅｃＹタンパク質遺伝子 | |
| JPH09168391A (ja) | 排出機能を有するフラジェリンのｎ端側アミノ酸断片の用途 | |
| JP3089287B2 (ja) | う蝕ワクチンの製造法 | |
| JP2544177B2 (ja) | セルラ―ゼ遺伝子を含むｄｎａ断片 | |
| JP2662044B2 (ja) | Ｄｎａ配列、発現ベクターおよびポリペプチドの周辺質生産方法 | |
| CN118496328A (zh) | 利用SadA蛋白在沙门氏菌中表面呈现表达外源抗原的方法与应用 |