JPH05115290A - 多糖類の製造方法 - Google Patents
多糖類の製造方法Info
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- JPH05115290A JPH05115290A JP29063191A JP29063191A JPH05115290A JP H05115290 A JPH05115290 A JP H05115290A JP 29063191 A JP29063191 A JP 29063191A JP 29063191 A JP29063191 A JP 29063191A JP H05115290 A JPH05115290 A JP H05115290A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、生育速度の速い海洋性水素資化性
菌を培養することにより、単離生産に有利であり、グル
コースのホモポリマーの特性を有する多糖類、特にグル
コースポリマーを容易かつ工業的に有利に生産する方法
を提供することを目的としている。 【構成】 本発明は、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ
属に属する海洋性水素資化性菌Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉ
ｂｒｉｏ ｍａｒｉｎｕｓ（ヒドロゲノビブリオ・マリ
ヌス）を、Ｈ2 ，Ｏ2 およびＣＯ2 を必須成分とする培
養ガスの存在下に培養し、得られた培養液から多糖類を
分離することを特徴としている。
菌を培養することにより、単離生産に有利であり、グル
コースのホモポリマーの特性を有する多糖類、特にグル
コースポリマーを容易かつ工業的に有利に生産する方法
を提供することを目的としている。 【構成】 本発明は、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ
属に属する海洋性水素資化性菌Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉ
ｂｒｉｏ ｍａｒｉｎｕｓ（ヒドロゲノビブリオ・マリ
ヌス）を、Ｈ2 ，Ｏ2 およびＣＯ2 を必須成分とする培
養ガスの存在下に培養し、得られた培養液から多糖類を
分離することを特徴としている。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、多糖類の製造方法に関
し、詳しくは海洋性水素資化性菌を培養ガスの存在下に
培養して多糖類を生産させ、得られた多糖類を培養液よ
り分離することを特徴とする多糖類の製造方法に関す
る。
し、詳しくは海洋性水素資化性菌を培養ガスの存在下に
培養して多糖類を生産させ、得られた多糖類を培養液よ
り分離することを特徴とする多糖類の製造方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術およびその課題】特開昭５３−１１３０９
２号には、水田土壌より分離されたシュードモナス属に
属するシュードモナス・ハイドロゲノボーラｓｏ．ｎｏ
ｖ．を、水素の存在下で培養し、培養物から多糖類を分
離する多糖類の製造方法が開示されているが、海洋環境
から取得された海洋性水素資化性菌Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏ
ｖｉｂｒｉｏｍａｒｉｎｕｓ（ヒドロゲノビブリオ・マ
リヌス）を培養して多糖類、とくにグルコースポリマー
を生産しうることは知られていない。
２号には、水田土壌より分離されたシュードモナス属に
属するシュードモナス・ハイドロゲノボーラｓｏ．ｎｏ
ｖ．を、水素の存在下で培養し、培養物から多糖類を分
離する多糖類の製造方法が開示されているが、海洋環境
から取得された海洋性水素資化性菌Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏ
ｖｉｂｒｉｏｍａｒｉｎｕｓ（ヒドロゲノビブリオ・マ
リヌス）を培養して多糖類、とくにグルコースポリマー
を生産しうることは知られていない。
【０００３】本発明者らは、既に海洋環境から取得され
た水素資化性菌Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ ｍａ
ｒｉｎｕｓの新たな利用について種々研究の結果、該菌
を特定条件下に培養することにより、多糖類、特にグル
コースのみからなるグリコーゲン様の特性を有するグル
コースポリマーを効率よく生産しうることを見出し、本
発明を完成するに至ったものである。
た水素資化性菌Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ ｍａ
ｒｉｎｕｓの新たな利用について種々研究の結果、該菌
を特定条件下に培養することにより、多糖類、特にグル
コースのみからなるグリコーゲン様の特性を有するグル
コースポリマーを効率よく生産しうることを見出し、本
発明を完成するに至ったものである。
【０００４】
【問題点を解決するための手段】本発明は、Ｈｙｄｒｏ
ｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ属に属する海洋性水素資化性菌Ｈ
ｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ ｍａｒｉｎｕｓ（ヒド
ロゲノビブリオ・マリヌス）を、Ｈ2 ，Ｏ2およびＣＯ
2 を必須成分とする培養ガスの存在下に培養し、得られ
た培養液から多糖類を分離することを特徴とする多糖類
の製造方法を提供するものである。
ｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ属に属する海洋性水素資化性菌Ｈ
ｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ ｍａｒｉｎｕｓ（ヒド
ロゲノビブリオ・マリヌス）を、Ｈ2 ，Ｏ2およびＣＯ
2 を必須成分とする培養ガスの存在下に培養し、得られ
た培養液から多糖類を分離することを特徴とする多糖類
の製造方法を提供するものである。
【０００５】本発明において用いられる海洋性水素資化
性菌Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ ｍａｒｉｎｕｓ
（ヒドロゲノビブリオ・マリヌス）（以下本菌と略称す
ることがある。）は、理化学研究所、微生物系統保存施
設に申請書受理番号第７６８８号として寄託され、その
入手が容易であり、その菌学的性質は以下の通りであ
る。 グラム染色 − 胞子形成能 − 運動性 ＋ 細胞形態 コンマ状 大きさ ０．２〜０．５×１〜２μｍ 栄養源 Ｈ2 およびＮａ2 Ｓ2 Ｏ3 ＧＣ含量 ４４．１モル％ チトクロム型 ｂ，ｃ，ｏ ヒドロゲナーゼ 膜結合型のみ
性菌Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ ｍａｒｉｎｕｓ
（ヒドロゲノビブリオ・マリヌス）（以下本菌と略称す
ることがある。）は、理化学研究所、微生物系統保存施
設に申請書受理番号第７６８８号として寄託され、その
入手が容易であり、その菌学的性質は以下の通りであ
る。 グラム染色 − 胞子形成能 − 運動性 ＋ 細胞形態 コンマ状 大きさ ０．２〜０．５×１〜２μｍ 栄養源 Ｈ2 およびＮａ2 Ｓ2 Ｏ3 ＧＣ含量 ４４．１モル％ チトクロム型 ｂ，ｃ，ｏ ヒドロゲナーゼ 膜結合型のみ
【０００６】本菌の培養条件は、温度２５〜４５℃、好
ましくは３２〜４２℃、ｐＨ５〜８、好ましくは６〜
７、塩濃度０〜１モル、好ましくは０．２〜０．７モ
ル、培養ガス中のＨ2 濃度７０容量％以上、好ましくは
７８容量％以上、Ｏ2 濃度５〜４０容量％、好ましくは
５〜２０容量％、ＣＯ2 濃度７〜１５容量％、好ましく
は１０〜１２容量％であり、最適培養条件は、温度３７
℃、ｐＨ６．５、塩濃度０．５Ｍおよび培養ガス中のＯ
2濃度５〜１１容量％である。
ましくは３２〜４２℃、ｐＨ５〜８、好ましくは６〜
７、塩濃度０〜１モル、好ましくは０．２〜０．７モ
ル、培養ガス中のＨ2 濃度７０容量％以上、好ましくは
７８容量％以上、Ｏ2 濃度５〜４０容量％、好ましくは
５〜２０容量％、ＣＯ2 濃度７〜１５容量％、好ましく
は１０〜１２容量％であり、最適培養条件は、温度３７
℃、ｐＨ６．５、塩濃度０．５Ｍおよび培養ガス中のＯ
2濃度５〜１１容量％である。
【０００７】本菌は、数多く単離されている、好塩性水
素細菌としては、初の絶対独立栄養性であって、海洋環
境からはじめて取得された海洋性水素資化性菌である。
本菌は、回分培養で比増殖速度約０．６ｈｒ-1というオ
ートトロフ（ａｕｔｏｔｒｏｐｈ）としては非常に速い
生育速度を示し、Ｏ2 分圧４０％、すなわち培養ガス中
の濃度４０容量％下でも良好な生育を示すという酸素耐
性の強いことを特徴としている。
素細菌としては、初の絶対独立栄養性であって、海洋環
境からはじめて取得された海洋性水素資化性菌である。
本菌は、回分培養で比増殖速度約０．６ｈｒ-1というオ
ートトロフ（ａｕｔｏｔｒｏｐｈ）としては非常に速い
生育速度を示し、Ｏ2 分圧４０％、すなわち培養ガス中
の濃度４０容量％下でも良好な生育を示すという酸素耐
性の強いことを特徴としている。
【０００８】本発明における多糖類の好ましい生産条件
を得るにあたり、微生物の生育するための条件の一部を
不足した状態で反応させること、すなわち律速反応をさ
せることにより、糖、蛋白などの生体成分を蓄積すると
いうことが一般に知られていることに鑑みて、前記水素
資化菌に対して、Ｏ2 律速、Ｎ律速およびＭｇ律速を試
み、糖含量がどのように増加していくかについて以下説
明する。ここに、Ｏ2 律速とは溶存酸素濃度が下がるこ
とにより生育曲線が定常期になってしまうことを云い、
換言すれば定常期にＯ2 が不足している状態をいう。例
えば、培養ガスＨ2 ：Ｏ2 ：ＣＯ2 容量比＝８：１：１
で培養を開始し、培養途中で７：２：１として培養を継
続した場合、図４に示されるように、Ｏ．Ｄ．540nm ＝
３０程度でＯ2 律速となる。上記Ｎ速律条件とは、定常
期にＮが不足していることを意味し、例えば（ＮＨ4 ）
2 ＳＯ4 ５ｇ／ｌで培養を開始し、ｐＨ調整をＮＨ4
ＯＨが１０ｍｌ入るまで６Ｎ ＮＨ4 ＯＨで行ない、そ
の後６Ｎ ＮａＯＨに切り替えた場合、図７に示される
ように、Ｏ．Ｄ．540nm ＝１０程度でＮ律速となる。こ
の場合、ＦｅおよびＭｇの添加は行なわれる。上記Ｍｇ
律速条件とは、定常期にＭｇが不足していることを意味
し、例えばＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．２ｇ／ｌで培養
を開始し、途中添加せずに培養を継続した場合、図８に
示されるようにＯ．Ｄ．540nm ＝１０程度でＭｇ律速と
なる。この場合Ｆｅは添加される。したがって、本発明
における多糖類生産条件としては、微生物の量が多くか
つ多糖の生産量が多いという点で定常期においてＯ2 律
速条件で培養することが好ましい。
を得るにあたり、微生物の生育するための条件の一部を
不足した状態で反応させること、すなわち律速反応をさ
せることにより、糖、蛋白などの生体成分を蓄積すると
いうことが一般に知られていることに鑑みて、前記水素
資化菌に対して、Ｏ2 律速、Ｎ律速およびＭｇ律速を試
み、糖含量がどのように増加していくかについて以下説
明する。ここに、Ｏ2 律速とは溶存酸素濃度が下がるこ
とにより生育曲線が定常期になってしまうことを云い、
換言すれば定常期にＯ2 が不足している状態をいう。例
えば、培養ガスＨ2 ：Ｏ2 ：ＣＯ2 容量比＝８：１：１
で培養を開始し、培養途中で７：２：１として培養を継
続した場合、図４に示されるように、Ｏ．Ｄ．540nm ＝
３０程度でＯ2 律速となる。上記Ｎ速律条件とは、定常
期にＮが不足していることを意味し、例えば（ＮＨ4 ）
2 ＳＯ4 ５ｇ／ｌで培養を開始し、ｐＨ調整をＮＨ4
ＯＨが１０ｍｌ入るまで６Ｎ ＮＨ4 ＯＨで行ない、そ
の後６Ｎ ＮａＯＨに切り替えた場合、図７に示される
ように、Ｏ．Ｄ．540nm ＝１０程度でＮ律速となる。こ
の場合、ＦｅおよびＭｇの添加は行なわれる。上記Ｍｇ
律速条件とは、定常期にＭｇが不足していることを意味
し、例えばＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．２ｇ／ｌで培養
を開始し、途中添加せずに培養を継続した場合、図８に
示されるようにＯ．Ｄ．540nm ＝１０程度でＭｇ律速と
なる。この場合Ｆｅは添加される。したがって、本発明
における多糖類生産条件としては、微生物の量が多くか
つ多糖の生産量が多いという点で定常期においてＯ2 律
速条件で培養することが好ましい。
【０００９】本発明において生産される多糖類は、グル
コースのポリマーであって、培養によって得られた培養
液より例えば下記の方法により分離・精製することがで
きる。
コースのポリマーであって、培養によって得られた培養
液より例えば下記の方法により分離・精製することがで
きる。
【００１０】本発明における培養により得られた培養液
を加熱処理後希釈し、遠心分離し、得られた沈でんを水
洗し、アルカリ溶液に懸濁しもとのスケールにする。次
いで氷冷下ホモナイズし、窒素気流下に撹拌し、酸で中
和後セライトを加えて撹拌し、遠心分離する。次いで得
られた上清に氷冷下ＴＣＡを加えて放置後遠心分離す
る。ついで得られた上清をアルカリで中和し、氷冷下エ
タノールを添加して沈でんを形成させ遠心分離する。次
いで得られた沈でん水に溶解後、水に対して透析し、セ
ライトで濾過し、氷冷下エタノールを添加して沈でんを
形成させて遠心分離する。次いで得られた沈でんを５０
％，７０％，９０％エタノール、無水エタノール、エチ
ルエーテルで順次洗浄し、真空乾燥して、精製多糖類が
得られる。
を加熱処理後希釈し、遠心分離し、得られた沈でんを水
洗し、アルカリ溶液に懸濁しもとのスケールにする。次
いで氷冷下ホモナイズし、窒素気流下に撹拌し、酸で中
和後セライトを加えて撹拌し、遠心分離する。次いで得
られた上清に氷冷下ＴＣＡを加えて放置後遠心分離す
る。ついで得られた上清をアルカリで中和し、氷冷下エ
タノールを添加して沈でんを形成させ遠心分離する。次
いで得られた沈でん水に溶解後、水に対して透析し、セ
ライトで濾過し、氷冷下エタノールを添加して沈でんを
形成させて遠心分離する。次いで得られた沈でんを５０
％，７０％，９０％エタノール、無水エタノール、エチ
ルエーテルで順次洗浄し、真空乾燥して、精製多糖類が
得られる。
【００１１】本発明において得られる多糖類の純度検定
は、０．１％水溶液のＵＶスキャンおよびゲル濾過によ
り行なった。図１に、本発明で得られた多糖類０．１重
量％水溶液のＵＶスキャンを示す。図１において、縦軸
は吸光度を表わし、横軸は波長を表わす。図１より蛋白
質などを含まない純粋な多糖であることがわかる。図２
に、本発明の多糖類のゲル濾過のパターン、すなわち分
子量分布を示しており、図２より本発明の多糖類は平均
分子量５×１０6 程度の単一のピークを与えていること
がわかる。図２において縦軸は吸光度を表わし、横軸は
フラクショナンバーを表わす。ここにゲル濾過条件は以
下の通り： カラム セハロース ＣＬ−４Ｂ 溶出液 ０．１Ｍリン酸緩衝液 流速 ３４ｍｌ／ｈ カラムキャリブレーション 各種デキストラン（シグマ社製） サンプル濃度 ０．９重量％（４ｍｌ） 図２より平均分子量５×１０6 程度の多糖であることが
わかる。
は、０．１％水溶液のＵＶスキャンおよびゲル濾過によ
り行なった。図１に、本発明で得られた多糖類０．１重
量％水溶液のＵＶスキャンを示す。図１において、縦軸
は吸光度を表わし、横軸は波長を表わす。図１より蛋白
質などを含まない純粋な多糖であることがわかる。図２
に、本発明の多糖類のゲル濾過のパターン、すなわち分
子量分布を示しており、図２より本発明の多糖類は平均
分子量５×１０6 程度の単一のピークを与えていること
がわかる。図２において縦軸は吸光度を表わし、横軸は
フラクショナンバーを表わす。ここにゲル濾過条件は以
下の通り： カラム セハロース ＣＬ−４Ｂ 溶出液 ０．１Ｍリン酸緩衝液 流速 ３４ｍｌ／ｈ カラムキャリブレーション 各種デキストラン（シグマ社製） サンプル濃度 ０．９重量％（４ｍｌ） 図２より平均分子量５×１０6 程度の多糖であることが
わかる。
【００１２】本発明方法により得られる多糖は、学会出
版センター発行（１９８６年）、「澱粉・関連糖質実験
法」、１０５および１３９頁に記載されている多糖の構
成成分について以下のような特徴を有している。 （％） うさぎ肝（％）* β−アミラーゼ分解率 ６２ ４９ 平均単位鎖長 ３６ １８ 平均外部鎖長 ２４ １１ 平均内部鎖長 １１ ６ ＊アグリカルチャル アンド バイオロジカル ケミス
トリー （Agricurtural and Biological Chemirtry)、４５、２
０９−２１６頁、（１９８１年）に記載されているうさ
ぎ肝多糖分析法によったものである。
版センター発行（１９８６年）、「澱粉・関連糖質実験
法」、１０５および１３９頁に記載されている多糖の構
成成分について以下のような特徴を有している。 （％） うさぎ肝（％）* β−アミラーゼ分解率 ６２ ４９ 平均単位鎖長 ３６ １８ 平均外部鎖長 ２４ １１ 平均内部鎖長 １１ ６ ＊アグリカルチャル アンド バイオロジカル ケミス
トリー （Agricurtural and Biological Chemirtry)、４５、２
０９−２１６頁、（１９８１年）に記載されているうさ
ぎ肝多糖分析法によったものである。
【００１３】本発明で得られる多糖類の特性（Ｃｈａｒ
ａｃｔｅｒｉｇａｔｉｏｎ）は下記の通りである。 （１）ニンヒドリン発色によるアミノ酸、アミノ糖の検
出は陰性である。 （２）ＴＬＣによる分析結果、グルコースと思われる発
色が大部分で、他のスポットはいずれも微量である。 （３）ＨＰＬＣによる分析結果を図３に示す。図３にお
いて縦軸は屈折率を表わし、横軸は時間を表わす。図３
よりこのグルコースポリマーの構成糖がグルコースだけ
であることがわかる。
ａｃｔｅｒｉｇａｔｉｏｎ）は下記の通りである。 （１）ニンヒドリン発色によるアミノ酸、アミノ糖の検
出は陰性である。 （２）ＴＬＣによる分析結果、グルコースと思われる発
色が大部分で、他のスポットはいずれも微量である。 （３）ＨＰＬＣによる分析結果を図３に示す。図３にお
いて縦軸は屈折率を表わし、横軸は時間を表わす。図３
よりこのグルコースポリマーの構成糖がグルコースだけ
であることがわかる。
【００１４】本発明で得られる多糖類は、生育速度が速
いことが生産に有利であり、グルコースポリマーである
ことが単離生産に有利である。一方グルコースポリマー
であるため生産量に限界があるが、多糖を培養液中に溶
け出すように育種をするということが考えられる。逆に
グルコースポリマーであるため何らかの生理活性を有す
るということは期待できる。
いことが生産に有利であり、グルコースポリマーである
ことが単離生産に有利である。一方グルコースポリマー
であるため生産量に限界があるが、多糖を培養液中に溶
け出すように育種をするということが考えられる。逆に
グルコースポリマーであるため何らかの生理活性を有す
るということは期待できる。
【００１５】
【発明の効果】本発明によれば、生育速度の速い海洋性
水素資化性菌を培養することにより、単離生産に有利で
あり、グルコースのホモポリマーの特性を有するグルコ
ースのポリマーである多糖類を容易かつ工業的に有利に
生産することができる。
水素資化性菌を培養することにより、単離生産に有利で
あり、グルコースのホモポリマーの特性を有するグルコ
ースのポリマーである多糖類を容易かつ工業的に有利に
生産することができる。
【００１６】
【実施例】以下実施例により本発明をさらに詳しく説明
する。
する。
【００１７】実施例１ 下記組成： （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ２．０ｇ Ｋ2 ＨＰＯ4 ２．５ｇ ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５ｇ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．２ｇ ＮａＣｌ ２９．３ｇ ＣａＣｌ2 １０．０ｍｇ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ １０．０ｍｇ ＮｉＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．６ｍｇ 微量成分溶液 ２ｍｌ 脱イオン水 １０００ｍｌ ｐＨ ７．０ 微量成分溶液 ＭｏＯ3 １．０ｍｇ ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ７．０ｍｇ ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ ０．５ｍｇ Ｈ2 ＢＯ3 １．０ｍｇ ＭｎＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ １．０ｍｇ ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ １．０ｍｇ 脱イオン水 １０００ｍｌ を有する培養液によるなる培地１０００ｍｌ中に、海洋
性水素資化性微生物Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ
ｍａｒｉｎｕｓ（ハイドロゲノビブリオ・マリヌス）菌
を、リアクター培地の１０％だけ接種し、Ｈ2 ：Ｏ2 ：
ＣＯ2 容量比＝８：１：１の混合ガス（１リットル／ｍ
ｉｎ）を入れ、６Ｎアンモニアで培地のｐＨを６．５に
調整しながら、３７℃、撹拌速度１０００ｒｐｍの条件
下振とう培養を開始した。リアクター培養において（Ｎ
Ｈ4 ）2 ＳＯ4 ５．０（ｇ／ｌ）を用いた。培養開始
５０分後に０．２ｇ／ｌ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏを添加
し、培養開始６時間後に２ｇ／ｌ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2
Ｏを添加し、培養開始１１時間後であってＯ．Ｄ．
540nm 値が約８となった時点で上記混合ガスの組成をＨ
2 ：Ｏ2 ：ＣＯ2 容量比＝７：２：１に変化させた。培
養開始それぞれ１０，１２，１５，１８，２２，２６，
３０，３４，４０，４４，４８および５３時間後に６Ｎ
ＮＨ4 ＯＨを３，１５，２３，３５，４５，５７，６
８，７８，９０，９７，１０５および１１３ｍｌ添加し
てｐＨを調整し、５３時間培養実験を行なった。菌体の
増殖はＯ．Ｄ．540nm で検出し、得られた多糖はフェノ
ール硫酸法により定量した。菌体の増殖および多糖の生
産量の経時変化を図４に示す。図４より菌の増殖が定常
期になっても引き続き多糖の含量が経時的に増加し続け
ていることがわかる。培養結果は、下記の通りであっ
た。 培養時間 ５３ｈ 培養後の液量 １．６ｌ ＯＤ540 ７０ 乾燥菌体重量 ３３ｇ／ｌ 細胞壁成分（１０％程度として） ３３×０．１＝３．３ｇ／ｌ 培養液の糖濃度 ９．８７ｇ／ｌ 多糖濃度 ９．８７−３．３＝６．５７ｇ／ｌ 全多糖量 ６．５７×１．６＝１０．５１ｇ 菌体当り多糖量 ９．８７／３３＝０．３０ｇ／ｇdcw 上清中の糖量 ０．５７ｇ
性水素資化性微生物Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ
ｍａｒｉｎｕｓ（ハイドロゲノビブリオ・マリヌス）菌
を、リアクター培地の１０％だけ接種し、Ｈ2 ：Ｏ2 ：
ＣＯ2 容量比＝８：１：１の混合ガス（１リットル／ｍ
ｉｎ）を入れ、６Ｎアンモニアで培地のｐＨを６．５に
調整しながら、３７℃、撹拌速度１０００ｒｐｍの条件
下振とう培養を開始した。リアクター培養において（Ｎ
Ｈ4 ）2 ＳＯ4 ５．０（ｇ／ｌ）を用いた。培養開始
５０分後に０．２ｇ／ｌ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏを添加
し、培養開始６時間後に２ｇ／ｌ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2
Ｏを添加し、培養開始１１時間後であってＯ．Ｄ．
540nm 値が約８となった時点で上記混合ガスの組成をＨ
2 ：Ｏ2 ：ＣＯ2 容量比＝７：２：１に変化させた。培
養開始それぞれ１０，１２，１５，１８，２２，２６，
３０，３４，４０，４４，４８および５３時間後に６Ｎ
ＮＨ4 ＯＨを３，１５，２３，３５，４５，５７，６
８，７８，９０，９７，１０５および１１３ｍｌ添加し
てｐＨを調整し、５３時間培養実験を行なった。菌体の
増殖はＯ．Ｄ．540nm で検出し、得られた多糖はフェノ
ール硫酸法により定量した。菌体の増殖および多糖の生
産量の経時変化を図４に示す。図４より菌の増殖が定常
期になっても引き続き多糖の含量が経時的に増加し続け
ていることがわかる。培養結果は、下記の通りであっ
た。 培養時間 ５３ｈ 培養後の液量 １．６ｌ ＯＤ540 ７０ 乾燥菌体重量 ３３ｇ／ｌ 細胞壁成分（１０％程度として） ３３×０．１＝３．３ｇ／ｌ 培養液の糖濃度 ９．８７ｇ／ｌ 多糖濃度 ９．８７−３．３＝６．５７ｇ／ｌ 全多糖量 ６．５７×１．６＝１０．５１ｇ 菌体当り多糖量 ９．８７／３３＝０．３０ｇ／ｇdcw 上清中の糖量 ０．５７ｇ
【００１８】得られた多糖は、グルコースポリマーでシ
エメル（Ｓｈｅｍｃｌ）、に従って分離・精製を行なっ
た。その詳細は下記の通りである。培養終了後の菌体培
養液を９０℃で１０分間加熱処理し、蒸留水で希釈し、
７０００ｒｐｍの条件下１０分間遠心分離により上清を
除いた。次いで分離された沈でんを水洗し、１Ｎ Ｎａ
ＯＨに懸濁し元のスケールにし、氷冷下にホモジナイズ
し、窒素気流下、室温で３時間撹拌し、ＨＣｌで中和
後、、セライトを加え数分間撹拌し、９０００ｒｐｍで
２０分間遠心分離により沈でんを除去した。次いで分離
された上清に、氷冷下ＴＣＡを５％となるように加え、
一晩４℃に保持し、９０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離
により沈でんを除去した。次いで、分離された上清を６
Ｎ ＮａＯＨで中和し、氷冷下５０％エタノールを加え
て沈でんを形成させ、６０００ｒｐｍ、１０分間遠心分
離により上清を除去した。次いで、分離された沈でんを
水に溶かして約１％溶液とし、水に対して透析し、セラ
イト濾過を行ない、氷冷下４０％エタノールで沈でんを
形成させ、６０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離により上
清を除去した。次いで分離された沈でんを５０％，７０
％，９０％エタノール、無水エタノール、エチルエーテ
ルで順次洗浄し、真空乾燥し、精製多糖２．５３ｇを得
た。なお、最初の菌体量は、３５ｇであった。得られた
精製多糖は、前記したゲル濾過およびＵＶスキャンによ
り確認した。
エメル（Ｓｈｅｍｃｌ）、に従って分離・精製を行なっ
た。その詳細は下記の通りである。培養終了後の菌体培
養液を９０℃で１０分間加熱処理し、蒸留水で希釈し、
７０００ｒｐｍの条件下１０分間遠心分離により上清を
除いた。次いで分離された沈でんを水洗し、１Ｎ Ｎａ
ＯＨに懸濁し元のスケールにし、氷冷下にホモジナイズ
し、窒素気流下、室温で３時間撹拌し、ＨＣｌで中和
後、、セライトを加え数分間撹拌し、９０００ｒｐｍで
２０分間遠心分離により沈でんを除去した。次いで分離
された上清に、氷冷下ＴＣＡを５％となるように加え、
一晩４℃に保持し、９０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離
により沈でんを除去した。次いで、分離された上清を６
Ｎ ＮａＯＨで中和し、氷冷下５０％エタノールを加え
て沈でんを形成させ、６０００ｒｐｍ、１０分間遠心分
離により上清を除去した。次いで、分離された沈でんを
水に溶かして約１％溶液とし、水に対して透析し、セラ
イト濾過を行ない、氷冷下４０％エタノールで沈でんを
形成させ、６０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離により上
清を除去した。次いで分離された沈でんを５０％，７０
％，９０％エタノール、無水エタノール、エチルエーテ
ルで順次洗浄し、真空乾燥し、精製多糖２．５３ｇを得
た。なお、最初の菌体量は、３５ｇであった。得られた
精製多糖は、前記したゲル濾過およびＵＶスキャンによ
り確認した。
【００１９】実施例２ 培養ガス組成Ｈ2 ：Ｏ2 ：ＣＯ2 容量比＝８：１：１を
途中で変化させなかった以外実施例１と同様にして、４
３時間培養実験を行なった。菌体の増殖および多糖の生
産量の経時変化を図５に示す。１．９（ｇ／ｌ）の精製
多糖を得た。図５よりこの培養条件では、定常期におい
て、糖の含量も定常になり増加していないこと、および
増殖しているときには菌の量が増えているのでこれとと
もに糖も増加していることがわかる。培養結果による
と、Ｏ．Ｄ．540nm ２０および糖濃度１．９０（ｇ／
ｌ）であった。
途中で変化させなかった以外実施例１と同様にして、４
３時間培養実験を行なった。菌体の増殖および多糖の生
産量の経時変化を図５に示す。１．９（ｇ／ｌ）の精製
多糖を得た。図５よりこの培養条件では、定常期におい
て、糖の含量も定常になり増加していないこと、および
増殖しているときには菌の量が増えているのでこれとと
もに糖も増加していることがわかる。培養結果による
と、Ｏ．Ｄ．540nm ２０および糖濃度１．９０（ｇ／
ｌ）であった。
【００２０】実施例３ 培養開始５時間後０．２ｇ／ｌ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ
を添加し、培養開始１０時間後２ｇ／ｌ ＭｇＳＯ4 ・
７Ｈ2 Ｏを添加し、培養開始８，１０および１２時間後
にそれぞれ６Ｎ ＮＨ4ＯＨを３ｍｌ，８ｍｌおよび１
０ｍｌ添加し、培養開始１５時間後および３０時間後に
６Ｎ ＮａＯＨ ２３ｍｌを添加してｐＨ調整を行なっ
た以外、実施例１と同様に３０時間培養実験を行なっ
た。菌体の増殖および多糖の生産量の経時変化を図６に
示す。１．７５（ｇ／ｌ）の精製多糖を得た。図６より
Ｏ2律速の場合と比べて糖の含量が多くないこと、およ
び定常期になると糖の増加も定常的となり、Ｏ2 律速時
のように糖が蓄積されてきていないことがわかる。得ら
れた結果は下記の通りであった。 培養時間 ３０ｈ ＯＤ540 １８．３ 乾燥菌体重量 ８．６ｇ／ｌ 細胞壁成分（１０％程度として） ８．６×０．１＝０．８６ｇ／ｌ 培養液の糖濃度 １．７５ｇ／ｌ 多糖濃度 １．７５−０．８６＝０．８９ｇ／ｌ 菌体当り多糖量 ０．８９／８．５＝０．１０ｇ／ｇdcw
を添加し、培養開始１０時間後２ｇ／ｌ ＭｇＳＯ4 ・
７Ｈ2 Ｏを添加し、培養開始８，１０および１２時間後
にそれぞれ６Ｎ ＮＨ4ＯＨを３ｍｌ，８ｍｌおよび１
０ｍｌ添加し、培養開始１５時間後および３０時間後に
６Ｎ ＮａＯＨ ２３ｍｌを添加してｐＨ調整を行なっ
た以外、実施例１と同様に３０時間培養実験を行なっ
た。菌体の増殖および多糖の生産量の経時変化を図６に
示す。１．７５（ｇ／ｌ）の精製多糖を得た。図６より
Ｏ2律速の場合と比べて糖の含量が多くないこと、およ
び定常期になると糖の増加も定常的となり、Ｏ2 律速時
のように糖が蓄積されてきていないことがわかる。得ら
れた結果は下記の通りであった。 培養時間 ３０ｈ ＯＤ540 １８．３ 乾燥菌体重量 ８．６ｇ／ｌ 細胞壁成分（１０％程度として） ８．６×０．１＝０．８６ｇ／ｌ 培養液の糖濃度 １．７５ｇ／ｌ 多糖濃度 １．７５−０．８６＝０．８９ｇ／ｌ 菌体当り多糖量 ０．８９／８．５＝０．１０ｇ／ｇdcw
【００２１】実施例４実施例１における、０．２ｇ／ｌ
ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．１ｇ／ｌ ＦｅＳＯ4 ・
７Ｈ2 Ｏおよび２ｇ／ｌ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏの添加
に代えて、培養培養開始６時間後に０．１ｇ／ｌ Ｆｅ
ＳＯ4 ・７Ｈ2Ｏを添加し、培養開始１１，１３，１
６，２０，２４，２８，３８および５７時間後に、それ
ぞれ６ＮＮＨ4 ＯＨ ８，１１，１４，１８，２０，２
２，２４，２６および２６ｍｌを添加してｐＨを調整
し、培養ガス組成を変化させなかった以外、実施例１と
同様に５７時間培養実験を行なった。１．９（ｇ／ｌ）
の精製多糖を得た。菌体の増殖および多糖の生産量の経
時変化を図８に示す。図８よりＯ2 律速に比べて糖の含
量が多くないことがわかる。得られた結果は下記の通り
であった。 培養時間 ４０ｈ ＯＤ540 ２０ 乾燥菌体重量 ９．４ｇ／ｌ 細胞壁成分（１０％程度として） ９．４×０．１＝０．９４ｇ／ｌ 培養液の糖濃度 １．９０ｇ／ｌ 多糖濃度 １．９０−０．９４＝０．９６ｇ／ｌ 菌体当り多糖量 ０．９６／９．４＝０．１０ｇ／ｇdcw
ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．１ｇ／ｌ ＦｅＳＯ4 ・
７Ｈ2 Ｏおよび２ｇ／ｌ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏの添加
に代えて、培養培養開始６時間後に０．１ｇ／ｌ Ｆｅ
ＳＯ4 ・７Ｈ2Ｏを添加し、培養開始１１，１３，１
６，２０，２４，２８，３８および５７時間後に、それ
ぞれ６ＮＮＨ4 ＯＨ ８，１１，１４，１８，２０，２
２，２４，２６および２６ｍｌを添加してｐＨを調整
し、培養ガス組成を変化させなかった以外、実施例１と
同様に５７時間培養実験を行なった。１．９（ｇ／ｌ）
の精製多糖を得た。菌体の増殖および多糖の生産量の経
時変化を図８に示す。図８よりＯ2 律速に比べて糖の含
量が多くないことがわかる。得られた結果は下記の通り
であった。 培養時間 ４０ｈ ＯＤ540 ２０ 乾燥菌体重量 ９．４ｇ／ｌ 細胞壁成分（１０％程度として） ９．４×０．１＝０．９４ｇ／ｌ 培養液の糖濃度 １．９０ｇ／ｌ 多糖濃度 １．９０−０．９４＝０．９６ｇ／ｌ 菌体当り多糖量 ０．９６／９．４＝０．１０ｇ／ｇdcw
【図１】本発明の多糖類の０．１％水溶液のＵＶスキャ
ンのグラフである。
ンのグラフである。
【図２】本発明の多糖類のゲル濾過のパターンのグラフ
である。
である。
【図３】本発明の多糖類のＨＰＬＣによる分析結果を表
わすグラフである。
わすグラフである。
【図４】本発明における菌の増殖および多糖類の生産量
の経時変化を示すグラフである。
の経時変化を示すグラフである。
【図５】本発明における菌の増殖、多糖類の生産量およ
び溶存酸素の経時変化を示すグラフである。
び溶存酸素の経時変化を示すグラフである。
【図６】本発明における菌の増殖および多糖類の生産量
の経時変化を示すグラフである。
の経時変化を示すグラフである。
【図７】本発明における菌の増殖および多糖類の生産量
の経時変化を示すグラフである。
の経時変化を示すグラフである。
Claims (2)
- 【請求項１】 Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ属に属
する海洋性水素資化性菌Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉ
ｏ ｍａｒｉｎｕｓ（ヒドロゲノビブリオ・マリヌス）
を、Ｈ2 ，Ｏ2 およびＣＯ2 を必須成分とする培養ガス
の存在下に培養し、得られた培養液から多糖類を分離す
ることを特徴とする多糖類の製造方法。 - 【請求項２】 該多糖類が、グルコースポリマーである
請求項１記載の多糖類の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29063191A JP3064061B2 (ja) | 1991-10-09 | 1991-10-09 | 多糖類の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29063191A JP3064061B2 (ja) | 1991-10-09 | 1991-10-09 | 多糖類の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05115290A true JPH05115290A (ja) | 1993-05-14 |
| JP3064061B2 JP3064061B2 (ja) | 2000-07-12 |
Family
ID=17758482
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29063191A Expired - Fee Related JP3064061B2 (ja) | 1991-10-09 | 1991-10-09 | 多糖類の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3064061B2 (ja) |
-
1991
- 1991-10-09 JP JP29063191A patent/JP3064061B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3064061B2 (ja) | 2000-07-12 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |