JPH05103666A - ヒト神経成長因子を発現させるための方法 - Google Patents
ヒト神経成長因子を発現させるための方法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 ヒト神経成長因子（ｈβＮＧＦ）と呼ばれる
ポリペプチドを、組換えバキュロウイルスによって形質
転換または感染された細胞から得るための方法の提供。 【構成】 昆虫スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄ
ｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄ）のセルラインに挿
入された組換えバキュロウィルス遺伝子構築物を使用す
る組換えＤＮＡ技術によって、感染された昆虫細胞を得
て、これにより成熟した生物学的に活性なヒト型神経成
長因子を産出する。
ポリペプチドを、組換えバキュロウイルスによって形質
転換または感染された細胞から得るための方法の提供。 【構成】 昆虫スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄ
ｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄ）のセルラインに挿
入された組換えバキュロウィルス遺伝子構築物を使用す
る組換えＤＮＡ技術によって、感染された昆虫細胞を得
て、これにより成熟した生物学的に活性なヒト型神経成
長因子を産出する。
Description
【０００１】
【発明の目的】本発明は、ヒト神経成長因子(hβＮＧ
Ｆ)と呼ばれるポリペプチドを、組換えバキュロウイル
スによって感染または形質転換された細胞から得るため
の方法に関する。より詳細には、アルスロポッダ・フル
ギペルダ(節足動物フルギペルダ、Arthropoda Frugiper
da)セルラインに挿入するための遺伝子構築物を出発物
質とする組換えＤＮＡ技術によって、この因子の成熟し
た生物学的に活性であるヒト型を産生する感染昆虫細胞
を得るための方法に関する。
Ｆ)と呼ばれるポリペプチドを、組換えバキュロウイル
スによって感染または形質転換された細胞から得るため
の方法に関する。より詳細には、アルスロポッダ・フル
ギペルダ(節足動物フルギペルダ、Arthropoda Frugiper
da)セルラインに挿入するための遺伝子構築物を出発物
質とする組換えＤＮＡ技術によって、この因子の成熟し
た生物学的に活性であるヒト型を産生する感染昆虫細胞
を得るための方法に関する。
【０００２】
Ａ．神経成長因子(ＮＧＦ) 神経成長因子(ＮＧＦ)はマウス肉腫において最初に発見
され[レビ-マンタルシニ(Levi-Montalcini,R)らのJ.Ex
p.Zool.116:321,1951]、その後、雄性マウスの顎下腺
[バロン(Varon,S.)らのBiochemistry6:2202,1967]、お
よびベビ毒液[アンゲレッチ(Angeletti,R.H.)のProc.Na
tl.Acad.Sci.,U.S.A.65:668,1970]から均一な状態にま
で精製された。比較的ＮＧＦが豊富な多くの他の供給源
として、モルモット前立腺[ハーパー(Harper,G.P.)]、
およびヒト胎盤[ゴールドステイン(Goldstein,L.D.)ら
のNeurochem.Res.3:175,1978、ウォーカー(Walker,P.)
らのLife Science 26:195,1980、フィディア特許47745A
88号]などが報告されている。哺乳動物の中枢神経系な
どの他の組織においても少量のＮＧＦが見いだされてい
る[バロンのDiscussions in Neuroscience,II巻,3号,19
85、ヘフチ(Hefti,F.)らのNeuroscience 14:55,1985]。
これらＮＧＦの供給源とその見かけの活性部位との生理
学的相関性は完全には明らかでないが、一般に，ＮＧＦ
は、ＮＧＦに応答する細胞による神経支配を要する種々
の末梢組織から分泌されると提示されている。
され[レビ-マンタルシニ(Levi-Montalcini,R)らのJ.Ex
p.Zool.116:321,1951]、その後、雄性マウスの顎下腺
[バロン(Varon,S.)らのBiochemistry6:2202,1967]、お
よびベビ毒液[アンゲレッチ(Angeletti,R.H.)のProc.Na
tl.Acad.Sci.,U.S.A.65:668,1970]から均一な状態にま
で精製された。比較的ＮＧＦが豊富な多くの他の供給源
として、モルモット前立腺[ハーパー(Harper,G.P.)]、
およびヒト胎盤[ゴールドステイン(Goldstein,L.D.)ら
のNeurochem.Res.3:175,1978、ウォーカー(Walker,P.)
らのLife Science 26:195,1980、フィディア特許47745A
88号]などが報告されている。哺乳動物の中枢神経系な
どの他の組織においても少量のＮＧＦが見いだされてい
る[バロンのDiscussions in Neuroscience,II巻,3号,19
85、ヘフチ(Hefti,F.)らのNeuroscience 14:55,1985]。
これらＮＧＦの供給源とその見かけの活性部位との生理
学的相関性は完全には明らかでないが、一般に，ＮＧＦ
は、ＮＧＦに応答する細胞による神経支配を要する種々
の末梢組織から分泌されると提示されている。
【０００３】マウス顎下腺由来のＮＧＦは、インビトロ
およびインビボにおけるＮＧＦの活性試験で最も広範に
使用されているものである。一次神経細胞およびクロー
ン化セルラインに対するその生物学的活性の範囲がイン
ビトロにおいて決定されている。インビトロにおいてＮ
ＧＦに応答する一次神経細胞の中には、脊髄神経節根由
来の胎児感覚ニューロン(８−１２日胎児)、交感神経節
由来の自律的ノルアドレナリン作動性胎児ニューロン、
発育期の中隔およびクロム親和性副腎細胞由来のコリン
作動性胎児ニューロンがある。感覚および交感神経ニュ
ーロンは生存し発育するためＮＧＦに依存しているが、
コリン作動性ニューロンは生存するためばかりでなく、
その分化、すなわち神経伝達物質と結合する特徴的な表
現型特性の発現のためにもＮＧＦを必要としないようで
ある。発育の第１段階にあるクロム親和性副腎細胞(ニ
ューロン突起から誘導)にＮＧＦを添加すると、ニュー
ロンの表現型が発現される。本明細書に記載するよう
に、インビトロにおいてＮＧＦと応答するセルラインの
中には、クロム親和性細胞腫(ＰＣ１２)細胞およびヒト
神経芽腫細胞と呼ばれるニューロン突起の腫瘍から誘導
されたクロム親和性副腎細胞がある。βＮＧＦでこれら
の細胞を処置した後では、別の態様で挙動し、高度な増
殖期を経て有糸分裂状態に至る。
およびインビボにおけるＮＧＦの活性試験で最も広範に
使用されているものである。一次神経細胞およびクロー
ン化セルラインに対するその生物学的活性の範囲がイン
ビトロにおいて決定されている。インビトロにおいてＮ
ＧＦに応答する一次神経細胞の中には、脊髄神経節根由
来の胎児感覚ニューロン(８−１２日胎児)、交感神経節
由来の自律的ノルアドレナリン作動性胎児ニューロン、
発育期の中隔およびクロム親和性副腎細胞由来のコリン
作動性胎児ニューロンがある。感覚および交感神経ニュ
ーロンは生存し発育するためＮＧＦに依存しているが、
コリン作動性ニューロンは生存するためばかりでなく、
その分化、すなわち神経伝達物質と結合する特徴的な表
現型特性の発現のためにもＮＧＦを必要としないようで
ある。発育の第１段階にあるクロム親和性副腎細胞(ニ
ューロン突起から誘導)にＮＧＦを添加すると、ニュー
ロンの表現型が発現される。本明細書に記載するよう
に、インビトロにおいてＮＧＦと応答するセルラインの
中には、クロム親和性細胞腫(ＰＣ１２)細胞およびヒト
神経芽腫細胞と呼ばれるニューロン突起の腫瘍から誘導
されたクロム親和性副腎細胞がある。βＮＧＦでこれら
の細胞を処置した後では、別の態様で挙動し、高度な増
殖期を経て有糸分裂状態に至る。
【０００４】マウスの顎下腺から得られた神経成長因子
は、化学的および生化学的観点から言っても他の起源の
種よりも充分に特性化されている。ネズミ腺由来のＮＧ
ＦはＺn+原子と配位結合する３つの異なるサブユニット
(α、β、γ)からなる７Ｓ-型のタンパク複合体(分子量
約１４０,０００ダルトン)として作用する。この７Ｓ分
子においてその生物学的活性の点から最も興味深い部分
は、１１８アミノ酸から形成されたそれぞれ分子量１
３,２５０の２つのポリペプチド鎖によって構成されて
いる。各鎖、すなわちそのモノマーは、２つのシステイ
ンアミノ酸残基間で共有結合している３つのジスルフィ
ド架橋を有しており、そのタンパク質の３次構造に強い
安定性が付与されている。互いに弱い結合で結ばれたＮ
ＧＦの２つのモノマーはダイマーを形成し、分子量２
６,５００となっている。その生物学的活性は、２.５Ｓ
として知られているダイマー、またはより普通にはβ-
サブユニットと関連していることが証明されている。こ
のような活性がモノマーにも存在しているか否かは、明
らかでない。本明細書では、hＮＧＦまたはhβＮＧＦま
たは２.５ＮＧＦまたは２.５hＮＧＦなど、いずれの略
語を用いようとも、ヒトＮＧＦの生物学的に活性なタン
パク質を意味するものとする。遺伝子操作法により、Ｎ
ＧＦのβ-サブユニット(βＮＧＦ)の分子をコードして
いる遺伝子の同定が可能となった[スコット(Scott,J.)
らのNature 302:538,1983、ウルリッチ(Ullrich,A.)ら
のNature 303:821,1983]。この分子をコードしているヒ
ト遺伝子は染色体Ｉの短い腕内に配置しており、その生
物学的な活性分子を構成する分子量２６,５００よりも
遥かに大きな分子の合成をコードしている。したがっ
て、この遺伝子はより大きなＮＧＦまたはプロ-ＮＧＦ
前駆体の合成に関する指令を伝達する。さらに、ＮＧＦ
のβ-サブユニットの遺伝子は、鳥類からヒトに至るま
で様々な種間で高度に保存されてることが証明された
[メイアー(Meier,R.)らのEMBO J.5:1489,1986]。本発明
者は、ネズミ、ヒト、ウシおよびニワトリ起源のβＮＧ
Ｆのヌクレオチド配列によってこれら分子の保存部位お
よび非保存部位と、それらの生物学的活性および抗原性
との相関を比較することができた。進化時のβＮＧＦの
保存性は全体として驚くほどに高い。雄性マウスの顎下
腺から精製されたβＮＧＦの成熟型の１１８個アミノ酸
は、ウシβＮＧＦとはそのうち１６個のアミノ酸しか変
動しておらず、ニワトリでは１９個、およびヒト種では
１１個である一方、ウシとヒトとのβＮＧＦ間は６個の
アミノ酸しか異なっていない。すべてのシステイン残基
が全ての種において厳格に保存されている。βＮＧＦの
３つのＳ−Ｓ架橋を還元すると、その生物学的活性が完
全に喪失される。アミノ酸配列の高い全体的な保存性と
免疫化学種の低いレベルの交叉反応性という、見かけ上
の矛盾は、種間のアミノ酸変動が特定の「クラスター
(房)」内に配置していることによる。ヒドロパシートレ
ーサー(hydropathic tracers)を使用することにより、
これらの変動のほとんどは抗原決定基の可能性が考えら
れる親水性部位に起こっていることを証明することがで
きる。これまで研究されたすべての種のＮＧＦ分子で
は、１つの親水性領域のみが完全に保存されていること
が明らかになっている。
は、化学的および生化学的観点から言っても他の起源の
種よりも充分に特性化されている。ネズミ腺由来のＮＧ
ＦはＺn+原子と配位結合する３つの異なるサブユニット
(α、β、γ)からなる７Ｓ-型のタンパク複合体(分子量
約１４０,０００ダルトン)として作用する。この７Ｓ分
子においてその生物学的活性の点から最も興味深い部分
は、１１８アミノ酸から形成されたそれぞれ分子量１
３,２５０の２つのポリペプチド鎖によって構成されて
いる。各鎖、すなわちそのモノマーは、２つのシステイ
ンアミノ酸残基間で共有結合している３つのジスルフィ
ド架橋を有しており、そのタンパク質の３次構造に強い
安定性が付与されている。互いに弱い結合で結ばれたＮ
ＧＦの２つのモノマーはダイマーを形成し、分子量２
６,５００となっている。その生物学的活性は、２.５Ｓ
として知られているダイマー、またはより普通にはβ-
サブユニットと関連していることが証明されている。こ
のような活性がモノマーにも存在しているか否かは、明
らかでない。本明細書では、hＮＧＦまたはhβＮＧＦま
たは２.５ＮＧＦまたは２.５hＮＧＦなど、いずれの略
語を用いようとも、ヒトＮＧＦの生物学的に活性なタン
パク質を意味するものとする。遺伝子操作法により、Ｎ
ＧＦのβ-サブユニット(βＮＧＦ)の分子をコードして
いる遺伝子の同定が可能となった[スコット(Scott,J.)
らのNature 302:538,1983、ウルリッチ(Ullrich,A.)ら
のNature 303:821,1983]。この分子をコードしているヒ
ト遺伝子は染色体Ｉの短い腕内に配置しており、その生
物学的な活性分子を構成する分子量２６,５００よりも
遥かに大きな分子の合成をコードしている。したがっ
て、この遺伝子はより大きなＮＧＦまたはプロ-ＮＧＦ
前駆体の合成に関する指令を伝達する。さらに、ＮＧＦ
のβ-サブユニットの遺伝子は、鳥類からヒトに至るま
で様々な種間で高度に保存されてることが証明された
[メイアー(Meier,R.)らのEMBO J.5:1489,1986]。本発明
者は、ネズミ、ヒト、ウシおよびニワトリ起源のβＮＧ
Ｆのヌクレオチド配列によってこれら分子の保存部位お
よび非保存部位と、それらの生物学的活性および抗原性
との相関を比較することができた。進化時のβＮＧＦの
保存性は全体として驚くほどに高い。雄性マウスの顎下
腺から精製されたβＮＧＦの成熟型の１１８個アミノ酸
は、ウシβＮＧＦとはそのうち１６個のアミノ酸しか変
動しておらず、ニワトリでは１９個、およびヒト種では
１１個である一方、ウシとヒトとのβＮＧＦ間は６個の
アミノ酸しか異なっていない。すべてのシステイン残基
が全ての種において厳格に保存されている。βＮＧＦの
３つのＳ−Ｓ架橋を還元すると、その生物学的活性が完
全に喪失される。アミノ酸配列の高い全体的な保存性と
免疫化学種の低いレベルの交叉反応性という、見かけ上
の矛盾は、種間のアミノ酸変動が特定の「クラスター
(房)」内に配置していることによる。ヒドロパシートレ
ーサー(hydropathic tracers)を使用することにより、
これらの変動のほとんどは抗原決定基の可能性が考えら
れる親水性部位に起こっていることを証明することがで
きる。これまで研究されたすべての種のＮＧＦ分子で
は、１つの親水性領域のみが完全に保存されていること
が明らかになっている。
【０００５】Ｂ．組換えＤＮＡ技術 組換えＤＮＡ技術は、所望のタンパク質を大量に発現で
きる一連のベクターを構築することを可能にした。この
新しい技術により、分子生物学者はＤＮＡ配列を組み立
てて、所望のタンパク質を産生できるハイブリッド分子
を作製することができる。この方法は、制限酵素による
切断、このようにして得られたフラグメントのリガーゼ
による結合、組み立てに使うオリゴヌクレオチドの化学
的合成、および当業界の種々の研究所で開発されている
他の方法[マニアチス(Maniatis,T.)らのMolecular Clon
ing: ALaboratory Manual.コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ラボラト
リーＮＹ,1982]、などの種々の反応を基礎とするもので
ある。高いレベルの発現を行うには、組み立てに使うＤ
ＮＡ要素は特定の必須情報、例えば複製起点、抗生物質
のための選択、発現プロモーター、目的遺伝子の転写ア
クチベーター、および当業者に既知の他の特性を提示し
なければならない。これらの要素を適当に結合させるこ
とにより、問題の遺伝子が転写および翻訳の調節配列に
関して天然の状態で挿入されれば、得られたプラスミド
は発現プラスミドと呼ばれる。この発現プラスミドまた
はベクターは宿主細胞においてタンパク質を発現するこ
とができる。次いで、このタンパク質は精製することが
できる。成長因子などの多くの遺伝子の発現を天然で制
御している要素(プロモーター)はその発現がそれほど強
くなく、知られていないことの多い適切な天然条件下で
のみ活性化される。
きる一連のベクターを構築することを可能にした。この
新しい技術により、分子生物学者はＤＮＡ配列を組み立
てて、所望のタンパク質を産生できるハイブリッド分子
を作製することができる。この方法は、制限酵素による
切断、このようにして得られたフラグメントのリガーゼ
による結合、組み立てに使うオリゴヌクレオチドの化学
的合成、および当業界の種々の研究所で開発されている
他の方法[マニアチス(Maniatis,T.)らのMolecular Clon
ing: ALaboratory Manual.コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ラボラト
リーＮＹ,1982]、などの種々の反応を基礎とするもので
ある。高いレベルの発現を行うには、組み立てに使うＤ
ＮＡ要素は特定の必須情報、例えば複製起点、抗生物質
のための選択、発現プロモーター、目的遺伝子の転写ア
クチベーター、および当業者に既知の他の特性を提示し
なければならない。これらの要素を適当に結合させるこ
とにより、問題の遺伝子が転写および翻訳の調節配列に
関して天然の状態で挿入されれば、得られたプラスミド
は発現プラスミドと呼ばれる。この発現プラスミドまた
はベクターは宿主細胞においてタンパク質を発現するこ
とができる。次いで、このタンパク質は精製することが
できる。成長因子などの多くの遺伝子の発現を天然で制
御している要素(プロモーター)はその発現がそれほど強
くなく、知られていないことの多い適切な天然条件下で
のみ活性化される。
【０００６】そのため、バキュロウイルスのポリヘドリ
ンのプロモーター、または他のプロモーター遺伝子配列
などの、活性が知られているプロモーターが使用され
る。したがって、高いレベルの発現のために使用される
要素は、種々の起源(真核生物、細菌、ウイルスなど)の
ＤＮＡの組合わせ物であり、これにより種々の遺伝子部
分が互いに連結されて、ハイブリッドが形成される。遺
伝子の転写および形質導入活性は、調節配列とコード化
配列との適切な距離に左右される。
ンのプロモーター、または他のプロモーター遺伝子配列
などの、活性が知られているプロモーターが使用され
る。したがって、高いレベルの発現のために使用される
要素は、種々の起源(真核生物、細菌、ウイルスなど)の
ＤＮＡの組合わせ物であり、これにより種々の遺伝子部
分が互いに連結されて、ハイブリッドが形成される。遺
伝子の転写および形質導入活性は、調節配列とコード化
配列との適切な距離に左右される。
【０００７】調節配列が充分に機能するための最良の態
様の１つは、遺伝子を天然遺伝子に占有されていると同
じ位置に導入することである。使用される１つの系は、
調節配列がコード化配列の数個のアミノ酸をも含有して
いるものである。導入した遺伝子と結合して、融合タン
パク質が得られる。他方で、融合タンパク質を取り出せ
ば、より高い生物学的価値を得ることができる。融合タ
ンパク質を使用する方法で行わない場合は、調節配列に
近接して位置する遺伝子を得るための常法は、クローニ
ングを行うことのできる適切な制限部位に左右される。
近くに適合部位が無く、別の部位しか存在しない場合
は、所望の制限部位を含有するオリゴヌクレオチドまた
はリンカーを合成することによってセグメントの結合物
を得ればよい。リンカーを使用することのできる制限部
位が近くに存在しない場合は、Ｂal３１またはＳ１によ
ってＤＮＡを欠失させる手段をとればよい。この場合、
正確に欠失させることができず、最も適切なものを確認
するためにスクリーニング毎に種々のクローンを検査し
なければならない。これらの方法は特に分子生物学者に
とって極めて制限的であり、現在使用できるこの新しい
技術の中から、代替の手法を画策しなければない。例え
ば、複製連鎖反応(ＰＣＲ法)である[サイキ(Saiki)らの
Science 239:487,1988、スカーフ(Scharf,S.J.)のScien
ce 233:1076,1986]。この手法によれば、遺伝子セグメ
ントを１０６倍にまで増幅することが可能である。この
原理の基本は、増幅しようとするＤＮＡ鎖の１つとそれ
ぞれ対合できる２つのオリゴヌクレオチドを使用するこ
とにある。調査する遺伝子配列に関するこの２つのオリ
ゴヌクレオチド間の距離は、産生される分子のディメン
ジョン(dimensions)を決めるものである。これら２つの
オリゴヌクレオチドはこのようにして構築されるので、
各オリゴヌクレオチドの配列内に以後のクローニングを
行うことのできる制限部位が存在するように構築する。
この制限部位は天然に存在するものか、または最小限の
数のヌクレオチドの縮重(degenerating)によって特別に
構築されたものかのいずれかである。部位特異的突然変
異と呼ぶことのできるこの手法は、制限部位を各分子生
物学者の意のままの位置に構築することができる。他の
遺伝子セグメントと適合する部位を構築すれば、クロー
ニングが容易になるばかりでなく、とりわけ別の所望の
遺伝子セグメントの連結を可能にする。実際、組換えＤ
ＮＡ技術によれば、完全にヘテロローガスなポリペプチ
ドを直接発現によって発現させることができ、さらに同
族ポリペプチドのアミノ酸配列の一部に融合したヘテロ
ローガスなポリペプチドを発現させることができる。一
般には、このようにして得られた産物は生物学的に活性
でない[英国特許出願公開第2007676A号、ウェンゼル(We
nzel)のAmerican Scientist 68,664,1980]。
様の１つは、遺伝子を天然遺伝子に占有されていると同
じ位置に導入することである。使用される１つの系は、
調節配列がコード化配列の数個のアミノ酸をも含有して
いるものである。導入した遺伝子と結合して、融合タン
パク質が得られる。他方で、融合タンパク質を取り出せ
ば、より高い生物学的価値を得ることができる。融合タ
ンパク質を使用する方法で行わない場合は、調節配列に
近接して位置する遺伝子を得るための常法は、クローニ
ングを行うことのできる適切な制限部位に左右される。
近くに適合部位が無く、別の部位しか存在しない場合
は、所望の制限部位を含有するオリゴヌクレオチドまた
はリンカーを合成することによってセグメントの結合物
を得ればよい。リンカーを使用することのできる制限部
位が近くに存在しない場合は、Ｂal３１またはＳ１によ
ってＤＮＡを欠失させる手段をとればよい。この場合、
正確に欠失させることができず、最も適切なものを確認
するためにスクリーニング毎に種々のクローンを検査し
なければならない。これらの方法は特に分子生物学者に
とって極めて制限的であり、現在使用できるこの新しい
技術の中から、代替の手法を画策しなければない。例え
ば、複製連鎖反応(ＰＣＲ法)である[サイキ(Saiki)らの
Science 239:487,1988、スカーフ(Scharf,S.J.)のScien
ce 233:1076,1986]。この手法によれば、遺伝子セグメ
ントを１０６倍にまで増幅することが可能である。この
原理の基本は、増幅しようとするＤＮＡ鎖の１つとそれ
ぞれ対合できる２つのオリゴヌクレオチドを使用するこ
とにある。調査する遺伝子配列に関するこの２つのオリ
ゴヌクレオチド間の距離は、産生される分子のディメン
ジョン(dimensions)を決めるものである。これら２つの
オリゴヌクレオチドはこのようにして構築されるので、
各オリゴヌクレオチドの配列内に以後のクローニングを
行うことのできる制限部位が存在するように構築する。
この制限部位は天然に存在するものか、または最小限の
数のヌクレオチドの縮重(degenerating)によって特別に
構築されたものかのいずれかである。部位特異的突然変
異と呼ぶことのできるこの手法は、制限部位を各分子生
物学者の意のままの位置に構築することができる。他の
遺伝子セグメントと適合する部位を構築すれば、クロー
ニングが容易になるばかりでなく、とりわけ別の所望の
遺伝子セグメントの連結を可能にする。実際、組換えＤ
ＮＡ技術によれば、完全にヘテロローガスなポリペプチ
ドを直接発現によって発現させることができ、さらに同
族ポリペプチドのアミノ酸配列の一部に融合したヘテロ
ローガスなポリペプチドを発現させることができる。一
般には、このようにして得られた産物は生物学的に活性
でない[英国特許出願公開第2007676A号、ウェンゼル(We
nzel)のAmerican Scientist 68,664,1980]。
【０００８】神経成長因子βサブユニットのヒト遺伝子
が単離できることにより、重要な新しい可能性が開かれ
た。組換えＤＮＡ技術によってこの稀なタンパク質を充
分量生産することができる。実際上、神経成長タンパク
質は、種々の神経変性疾患を処置するための臨床用途が
許容されている。ＮＧＦβサブユニットを組換えＤＮＡ
技術によって得るというこのトピックに関する文献が存
在する[欧州特許第0121388号、ブルース(Bruce,G.)らの
Neurobiology of Aging 10:89,1989、フー(Hu,G.)らのN
ucleic Acid Research 70:57,1988、エドワード(Edward
s,R.H.)のMolCell Biol 8:2456,1988、エムフォース(Em
fors,P.)のProc.Natl.Acad.Sci.,86:4756,1989、イタリ
ア国特許出願第48564A89号]。生産目的では、微生物細
胞での発現が廉価に実施することができない場合にの
み、細菌よりも哺乳動物細胞が好ましい。実際、特定の
タンパク質では大腸菌(E.coli)などの細菌セルラインに
おいて産生させるのが遥かに経済的であるが、一般には
この宿主／ベクター系はタンパク質を構成するアミノ酸
の線状配列しか忠実に再生できず、不溶性の塊の種がそ
の細菌内に得られるのみである。特定の小分子の場合に
は、この物質からある種の産物を経済的に調製すること
は可能であるので、インターフェロンおよびインビトロ
で適切に折り畳むことのできる分子である何らかの動物
成長タンパク質などの、特定の比較的小さな分子の場合
は、大腸菌は好ましい系であり得る。ただ１つのジスル
フィド結合を有するタンパク質、またはその使用上、充
分に規定された構造を必要としないタンパク質(診断的
抗原またはワクチン成分としての使用)については一般
に、これらの系は最も有益である。
が単離できることにより、重要な新しい可能性が開かれ
た。組換えＤＮＡ技術によってこの稀なタンパク質を充
分量生産することができる。実際上、神経成長タンパク
質は、種々の神経変性疾患を処置するための臨床用途が
許容されている。ＮＧＦβサブユニットを組換えＤＮＡ
技術によって得るというこのトピックに関する文献が存
在する[欧州特許第0121388号、ブルース(Bruce,G.)らの
Neurobiology of Aging 10:89,1989、フー(Hu,G.)らのN
ucleic Acid Research 70:57,1988、エドワード(Edward
s,R.H.)のMolCell Biol 8:2456,1988、エムフォース(Em
fors,P.)のProc.Natl.Acad.Sci.,86:4756,1989、イタリ
ア国特許出願第48564A89号]。生産目的では、微生物細
胞での発現が廉価に実施することができない場合にの
み、細菌よりも哺乳動物細胞が好ましい。実際、特定の
タンパク質では大腸菌(E.coli)などの細菌セルラインに
おいて産生させるのが遥かに経済的であるが、一般には
この宿主／ベクター系はタンパク質を構成するアミノ酸
の線状配列しか忠実に再生できず、不溶性の塊の種がそ
の細菌内に得られるのみである。特定の小分子の場合に
は、この物質からある種の産物を経済的に調製すること
は可能であるので、インターフェロンおよびインビトロ
で適切に折り畳むことのできる分子である何らかの動物
成長タンパク質などの、特定の比較的小さな分子の場合
は、大腸菌は好ましい系であり得る。ただ１つのジスル
フィド結合を有するタンパク質、またはその使用上、充
分に規定された構造を必要としないタンパク質(診断的
抗原またはワクチン成分としての使用)については一般
に、これらの系は最も有益である。
【０００９】本発明は、昆虫細胞／バキュロウイルスの
発現系によって、生物学的に活性なヒト神経成長因子を
高いレベルで発現させるための方法に関する。
発現系によって、生物学的に活性なヒト神経成長因子を
高いレベルで発現させるための方法に関する。
【００１０】バイオテクノロジーと種々の系とにより、
その所望のタンパク質を相当レベルで発現させることが
できる。しかし、この場合、常に生物学的に活性とは限
らない。本発明では、特に発現レベルが高く、かつ第一
に、得られた物質が生物学的に活性であることを考慮に
入れている。hＮＧＦ分子の場合、その原核および真核
生物系における発現が知られている。その原核生物セル
ライン(大腸菌)に関しては、相当量の発現レベルを経済
的に得ることができるが、得られたポリペプチドは、除
去することのできない開始メチオニンを含有しているこ
とが多い。ほとんどの場合、不溶性粒子として存在する
細胞内の沈殿物質を抽出するのに、コートロピック剤(c
oatropic agents)が必要であり、生物学的に活性な物質
を得るには、再折り畳みさせ、その分子のダイマー性(d
imerization)についてチェックしなければならない。留
意しなければならないのは、ＮＧＦ分子が充分に構築さ
れた３つのジスルフィド架橋を含有しており、また分子
の生物学的活性はダイマーを形成する２つの分子の会合
に由来し、それが生物学的活性を保持させている点であ
る。哺乳動物細胞はヒト起源の分子を発現させるために
使用することができるが、その使用による主な欠点は、
調製のために大量の培地と血清を要し、非常に高価な供
給源となっていることであり、このことは工業的過程で
は常に考慮しなければない。さらに、これらの発現レベ
ルは一般に、原核生物系またはウイルス発現により得ら
れるものよりも非常に低い。
その所望のタンパク質を相当レベルで発現させることが
できる。しかし、この場合、常に生物学的に活性とは限
らない。本発明では、特に発現レベルが高く、かつ第一
に、得られた物質が生物学的に活性であることを考慮に
入れている。hＮＧＦ分子の場合、その原核および真核
生物系における発現が知られている。その原核生物セル
ライン(大腸菌)に関しては、相当量の発現レベルを経済
的に得ることができるが、得られたポリペプチドは、除
去することのできない開始メチオニンを含有しているこ
とが多い。ほとんどの場合、不溶性粒子として存在する
細胞内の沈殿物質を抽出するのに、コートロピック剤(c
oatropic agents)が必要であり、生物学的に活性な物質
を得るには、再折り畳みさせ、その分子のダイマー性(d
imerization)についてチェックしなければならない。留
意しなければならないのは、ＮＧＦ分子が充分に構築さ
れた３つのジスルフィド架橋を含有しており、また分子
の生物学的活性はダイマーを形成する２つの分子の会合
に由来し、それが生物学的活性を保持させている点であ
る。哺乳動物細胞はヒト起源の分子を発現させるために
使用することができるが、その使用による主な欠点は、
調製のために大量の培地と血清を要し、非常に高価な供
給源となっていることであり、このことは工業的過程で
は常に考慮しなければない。さらに、これらの発現レベ
ルは一般に、原核生物系またはウイルス発現により得ら
れるものよりも非常に低い。
【００１１】バキュロウイルス系は、工業的目的におい
てより経済的であり、また哺乳動物細胞の場合よりも培
地に費用がかからず、そしてその細胞は正しいジスルフ
ィド架橋の形成を達成させるので得られた物質はその生
物学的活性を無傷で保持しており、さらに分子の再折り
畳みが天然で起こるのでβサブユニットを得るためのダ
イマー形成反応にその再折り畳みを行う必要がなく、し
たがって、このバキュロウイルス系は上記の問題点を解
決するものである。この形質導入後工程はその生物学的
活性にとって重要なものである。
てより経済的であり、また哺乳動物細胞の場合よりも培
地に費用がかからず、そしてその細胞は正しいジスルフ
ィド架橋の形成を達成させるので得られた物質はその生
物学的活性を無傷で保持しており、さらに分子の再折り
畳みが天然で起こるのでβサブユニットを得るためのダ
イマー形成反応にその再折り畳みを行う必要がなく、し
たがって、このバキュロウイルス系は上記の問題点を解
決するものである。この形質導入後工程はその生物学的
活性にとって重要なものである。
【００１２】神経成長因子(βＮＧＦ)などの治療用タン
パク質は、活性でありかつ使用に適しているために、正
しく形成されなければならず、また抗原性応答を伴って
いてはならない。組換えＤＮＡによって得られるタンパ
ク質を入手する方法には、グリコシル化反応、正しいジ
スルフィド結合の形成反応、および他の形質導入後修飾
が包含され得る。大腸菌のセルラインはこれらの要件を
満たすことはできないが、哺乳動物の真核細胞および酵
母は満足できる。バイオテクノロジーにより得られたヒ
トβＮＧＦを薬物として適用しようとする場合には、留
意しなければならない問題がある。
パク質は、活性でありかつ使用に適しているために、正
しく形成されなければならず、また抗原性応答を伴って
いてはならない。組換えＤＮＡによって得られるタンパ
ク質を入手する方法には、グリコシル化反応、正しいジ
スルフィド結合の形成反応、および他の形質導入後修飾
が包含され得る。大腸菌のセルラインはこれらの要件を
満たすことはできないが、哺乳動物の真核細胞および酵
母は満足できる。バイオテクノロジーにより得られたヒ
トβＮＧＦを薬物として適用しようとする場合には、留
意しなければならない問題がある。
【００１３】ＮＧＦの活性はそのダイマー型、すなわち
１１８アミノ酸である２つの類似ポリペプチドの組み立
てに左右されることが証明された。β-メルカプトエタ
ノールによって還元すれば、その生物学的活性が殆ど完
全に消滅される。３つのジスルフィド結合を再生しよう
という試みがあるが、数学的観点から言えば、１５分の
１の確率でしか、相当する天然分子と同等の、正しく構
築された分子が産生されるシステインの再組み立てが行
われない。結局、この分子を大腸菌から入手した場合に
は、その構造の相同性、またはヒトの薬物としての適用
に対しては何の保証もない。
１１８アミノ酸である２つの類似ポリペプチドの組み立
てに左右されることが証明された。β-メルカプトエタ
ノールによって還元すれば、その生物学的活性が殆ど完
全に消滅される。３つのジスルフィド結合を再生しよう
という試みがあるが、数学的観点から言えば、１５分の
１の確率でしか、相当する天然分子と同等の、正しく構
築された分子が産生されるシステインの再組み立てが行
われない。結局、この分子を大腸菌から入手した場合に
は、その構造の相同性、またはヒトの薬物としての適用
に対しては何の保証もない。
【００１４】実際、大腸菌由来のヒトＮＧＦが均一にな
るまで精製されたが、それはネズミβＮＧＦに特異的な
ポリクローナル抗体による免疫ブロッティングに際し
て、生物学的に活性なダイマー型とは帰属できない一連
のバンドを示した。さらに、この構造およびタイプの混
合物の生物学的活性は、胎盤などの天然供給源から精製
された同族のヒト型よりも１０倍高い活性であることが
立証された。他方、神経成長因子を大腸菌にクローニン
グし、得るためのこの方法により、目的とするタンパク
質は高いレベルで発現される。しかし、インビボに投与
した場合に天然に存在する分子の生物学的活性を認識し
て阻害しかねない抗体などの二次効果を惹起させ得る一
連の改変分子が産生される場合もある。同時に、この成
熟分子を大腸菌にクローニングすれば、取り除くことが
できない開始メチオニンが提示されるが、それはこの分
子の暴露部分に位置しているので、免疫原性を確実に示
す。
るまで精製されたが、それはネズミβＮＧＦに特異的な
ポリクローナル抗体による免疫ブロッティングに際し
て、生物学的に活性なダイマー型とは帰属できない一連
のバンドを示した。さらに、この構造およびタイプの混
合物の生物学的活性は、胎盤などの天然供給源から精製
された同族のヒト型よりも１０倍高い活性であることが
立証された。他方、神経成長因子を大腸菌にクローニン
グし、得るためのこの方法により、目的とするタンパク
質は高いレベルで発現される。しかし、インビボに投与
した場合に天然に存在する分子の生物学的活性を認識し
て阻害しかねない抗体などの二次効果を惹起させ得る一
連の改変分子が産生される場合もある。同時に、この成
熟分子を大腸菌にクローニングすれば、取り除くことが
できない開始メチオニンが提示されるが、それはこの分
子の暴露部分に位置しているので、免疫原性を確実に示
す。
【００１５】他の方法は、真核生物細胞にプレプロＮＧ
Ｆをクローニングすることに関連しており、真核生物細
胞内に天然で存在する特異的なペプチダーゼの攻撃性を
利用し、その成熟分子を得るものである。具体的には、
発現をSpodoptera Frugiperda(スポドプテラ・フルギペ
ルダ)細胞で行う。入手可能な文献には、ヒトＮＧＦの
全ゲノムクーンは未だ配列決定されていないと示されて
いるが、その遺伝子は１０kＤaにわたって伸長している
ことが証明されている[ウルリッチ(Ullrich,A.)らのNat
ure 303:821,1983]。このように伸長している遺伝子
は、このゲノム配列全体から出発して通常のクローニン
グを行うことはできない。このタンパク質のコード化部
分のみを含有するcＤＮＡの部分をクローニングしよう
という試みがある。ヒトβＮＧＦの完全なcＤＮＡは未
だ単離されていない(５'側の数個の配列が未だ知られて
いない)が、今では、他の起源(マウス、ウシ、ニワトリ
など)のＮＧＦメッセンジャーについて多くが知られる
ところとなっており[メイアー(Meier,R.)らのEMBO J 5:
1489,1986、セルビー(Selby,H.J.)のJ of Neuron Resea
rch 18:293,1987]、これにより興味深い推論が飛び交っ
ている。マウスＮＧＦの遺伝子は単一コピーとして存在
し、異なる大きさ(ディメンジョン)の少なくとも４種の
メッセンジャーを産生する[セルビー(Selby,M.J.)らのM
ol Cell Biol 7:3057,1987]。これらの種々のディメン
ジョンは特に異なるＡＵＧ開始コドンに反映されてお
り、最も重要なものは成熟タンパク質に関しての−１８
７位および−１２１位である。これらのメッセンジャー
は種々の組織に応じて異なる量で存在している。顎下腺
においては−１８７位から始まるものが−１２１位から
始まるものよりも１０倍豊富に存在している。しかし、
種々の証拠によって、脳において発現される最も高いパ
ーセンテイジのＮＧＦメッセンジャーはまさに−１２１
位のＡＵＧを使用するものであることが証明されてい
る。
Ｆをクローニングすることに関連しており、真核生物細
胞内に天然で存在する特異的なペプチダーゼの攻撃性を
利用し、その成熟分子を得るものである。具体的には、
発現をSpodoptera Frugiperda(スポドプテラ・フルギペ
ルダ)細胞で行う。入手可能な文献には、ヒトＮＧＦの
全ゲノムクーンは未だ配列決定されていないと示されて
いるが、その遺伝子は１０kＤaにわたって伸長している
ことが証明されている[ウルリッチ(Ullrich,A.)らのNat
ure 303:821,1983]。このように伸長している遺伝子
は、このゲノム配列全体から出発して通常のクローニン
グを行うことはできない。このタンパク質のコード化部
分のみを含有するcＤＮＡの部分をクローニングしよう
という試みがある。ヒトβＮＧＦの完全なcＤＮＡは未
だ単離されていない(５'側の数個の配列が未だ知られて
いない)が、今では、他の起源(マウス、ウシ、ニワトリ
など)のＮＧＦメッセンジャーについて多くが知られる
ところとなっており[メイアー(Meier,R.)らのEMBO J 5:
1489,1986、セルビー(Selby,H.J.)のJ of Neuron Resea
rch 18:293,1987]、これにより興味深い推論が飛び交っ
ている。マウスＮＧＦの遺伝子は単一コピーとして存在
し、異なる大きさ(ディメンジョン)の少なくとも４種の
メッセンジャーを産生する[セルビー(Selby,M.J.)らのM
ol Cell Biol 7:3057,1987]。これらの種々のディメン
ジョンは特に異なるＡＵＧ開始コドンに反映されてお
り、最も重要なものは成熟タンパク質に関しての−１８
７位および−１２１位である。これらのメッセンジャー
は種々の組織に応じて異なる量で存在している。顎下腺
においては−１８７位から始まるものが−１２１位から
始まるものよりも１０倍豊富に存在している。しかし、
種々の証拠によって、脳において発現される最も高いパ
ーセンテイジのＮＧＦメッセンジャーはまさに−１２１
位のＡＵＧを使用するものであることが証明されてい
る。
【００１６】この証拠に基づいて、本発明者らは、−１
２１位のメチオニンから始まるヒトβＮＧＦをクローン
した。このヒドロパシープロフィル(hydropathic profi
le)の分析により、−１２１位および−１０４位間のア
ミノ酸がリーダーペプチドとして機能することができる
ことが示され(第１図参照)、これによりこのタンパク質
は分泌され得ることが分かった。生物学的に活性なペプ
チドに相当する＋１位から＋１１８位のアミノ酸配列を
得ることのできる、成熟タンパク質を得るための特定の
ペプチダーゼが存在する。このペプチドは多くのタイプ
の哺乳動物細胞に見いだされるので広在性のペプチドで
ある。プレプロＮＧＦ部分を含有する構築物を種々のタ
イプの細胞にトランスフェクトした場合、成熟ＮＧＦが
分泌されるのが実情であり、したがって、変性および還
元条件下のゲル中で１４kＤaの分子を産生させることが
できる[エドワード(Edwards,R.H.)のMol Cell Biol 8:2
456(1988)]。
２１位のメチオニンから始まるヒトβＮＧＦをクローン
した。このヒドロパシープロフィル(hydropathic profi
le)の分析により、−１２１位および−１０４位間のア
ミノ酸がリーダーペプチドとして機能することができる
ことが示され(第１図参照)、これによりこのタンパク質
は分泌され得ることが分かった。生物学的に活性なペプ
チドに相当する＋１位から＋１１８位のアミノ酸配列を
得ることのできる、成熟タンパク質を得るための特定の
ペプチダーゼが存在する。このペプチドは多くのタイプ
の哺乳動物細胞に見いだされるので広在性のペプチドで
ある。プレプロＮＧＦ部分を含有する構築物を種々のタ
イプの細胞にトランスフェクトした場合、成熟ＮＧＦが
分泌されるのが実情であり、したがって、変性および還
元条件下のゲル中で１４kＤaの分子を産生させることが
できる[エドワード(Edwards,R.H.)のMol Cell Biol 8:2
456(1988)]。
【００１７】神経成長因子のβサブユニットを得るため
の既述した経験に基づいて、本発明者らは全く新規な手
法を使用し、アルスロポッダ・フルギペルダ(Arthropod
a Frugiperda)細胞を感染する天然のバキュロウイルス
と共に組換え物質として使用可能であるベクターを構築
した。プレプロＮＧＦをクローンするためにＰＣＲ法を
使用し、それに、調節配列とコード化配列との距離が可
能な限り天然の状態を保持し、pＶＬベクターのクロー
ニングが容易に行えるよう、制限部位を作成した。突然
変異が行えるように制限部位が既に作成されている、修
飾された成熟ヒトＮＧＦ(hβＮＧＦ)[British Biotechn
ology Ltd (英国、オックスフォード)から供給されてい
る]にプレプロＮＧＦ部分を結合させた。本発明におい
て、これら制限部位の存在を本発明の限定要素と考えて
はならず、その遺伝子の起源もそのように解してはなら
ない。
の既述した経験に基づいて、本発明者らは全く新規な手
法を使用し、アルスロポッダ・フルギペルダ(Arthropod
a Frugiperda)細胞を感染する天然のバキュロウイルス
と共に組換え物質として使用可能であるベクターを構築
した。プレプロＮＧＦをクローンするためにＰＣＲ法を
使用し、それに、調節配列とコード化配列との距離が可
能な限り天然の状態を保持し、pＶＬベクターのクロー
ニングが容易に行えるよう、制限部位を作成した。突然
変異が行えるように制限部位が既に作成されている、修
飾された成熟ヒトＮＧＦ(hβＮＧＦ)[British Biotechn
ology Ltd (英国、オックスフォード)から供給されてい
る]にプレプロＮＧＦ部分を結合させた。本発明におい
て、これら制限部位の存在を本発明の限定要素と考えて
はならず、その遺伝子の起源もそのように解してはなら
ない。
【００１８】この前提にたって、本発明者らはプレプロ
hβＮＧＦをバキュロウイルスのポリヘドリン(polyhedr
in)の制御下にクローンした。この構築物をスポドプテ
ラ・フルギペルダ(Spodoptera Frugiperda)細胞に天然
バキュロウイルスと共にトランスフェクトした。精製し
た後、バキュロウイルスのポリヘドリンおよびその合成
を指令するすべての配列から制御されているヒト神経成
長因子(hＮＧＦ)をそのゲノムまたは染色体に有するキ
メラ組換えウイルスを単離した。この組換えウイルスを
使用し、アルスロポド・フルギペルダ細胞を再度感染さ
せることにより、得られた感染細胞がポリペプチドhβ
ＮＧＦを成熟した生物学的活性な形態で培養培地中に産
生することを証明した。プレプロＮＧＦ部分は、この分
子の組み立てには必須であることが証明され、故にプレ
プロＮＧＦ部分はβ-サブユニットを発現させることが
でき、全遺伝子構築物は正しいと考えられることが示さ
れた。
hβＮＧＦをバキュロウイルスのポリヘドリン(polyhedr
in)の制御下にクローンした。この構築物をスポドプテ
ラ・フルギペルダ(Spodoptera Frugiperda)細胞に天然
バキュロウイルスと共にトランスフェクトした。精製し
た後、バキュロウイルスのポリヘドリンおよびその合成
を指令するすべての配列から制御されているヒト神経成
長因子(hＮＧＦ)をそのゲノムまたは染色体に有するキ
メラ組換えウイルスを単離した。この組換えウイルスを
使用し、アルスロポド・フルギペルダ細胞を再度感染さ
せることにより、得られた感染細胞がポリペプチドhβ
ＮＧＦを成熟した生物学的活性な形態で培養培地中に産
生することを証明した。プレプロＮＧＦ部分は、この分
子の組み立てには必須であることが証明され、故にプレ
プロＮＧＦ部分はβ-サブユニットを発現させることが
でき、全遺伝子構築物は正しいと考えられることが示さ
れた。
【００１９】
【発明の要約】本発明はバキュロウイルス系からヒトＮ
ＧＦのβサブユニットを得るための方法に関する。より
詳細には、本発明は、 −調節配列(ポリヘドリンプロモーター)と目的タンパク
質をコードしている配列との距離が天然のものである遺
伝子構築物の調製、 −野生型ウイルスと共に上記構築物の組換えを誘発させ
る要因、および −ヒト神経成長因子(hＮＧＦ)の成熟型βサブユニット
を、天然の配列に存在しているものとは異なっているそ
のポリペプチドと融合した１つまたはそれ以上のアミノ
酸を存在させずに培養し、得ることを許容する要因 に関する。このようにして得られたポリペプチドは、適
当な標的細胞に対して使用すれば生物学的活性を示す。
本明細書に開示するhβＮＧＦを使用すれば、神経機能
の維持、またはその喪失の予防を行うことができ、慢性
または急性の病的症状、脳血管、感染性、炎症性、圧迫
性、代謝性の障害などの急性疾患の後期の神経変性状
態、および免疫系の調整症状において、神経機能を回復
させることができる。得られたポリペプチドはまた、望
ましくない生物学的活性を示しかねない、ヒト起源の他
の夾雑タンパク質を含有していない。
ＧＦのβサブユニットを得るための方法に関する。より
詳細には、本発明は、 −調節配列(ポリヘドリンプロモーター)と目的タンパク
質をコードしている配列との距離が天然のものである遺
伝子構築物の調製、 −野生型ウイルスと共に上記構築物の組換えを誘発させ
る要因、および −ヒト神経成長因子(hＮＧＦ)の成熟型βサブユニット
を、天然の配列に存在しているものとは異なっているそ
のポリペプチドと融合した１つまたはそれ以上のアミノ
酸を存在させずに培養し、得ることを許容する要因 に関する。このようにして得られたポリペプチドは、適
当な標的細胞に対して使用すれば生物学的活性を示す。
本明細書に開示するhβＮＧＦを使用すれば、神経機能
の維持、またはその喪失の予防を行うことができ、慢性
または急性の病的症状、脳血管、感染性、炎症性、圧迫
性、代謝性の障害などの急性疾患の後期の神経変性状
態、および免疫系の調整症状において、神経機能を回復
させることができる。得られたポリペプチドはまた、望
ましくない生物学的活性を示しかねない、ヒト起源の他
の夾雑タンパク質を含有していない。
【００２０】本発明はさらに、上記のベクターを含有す
る形質転換セルライン、およびhβＮＧＦを産生するそ
の培養物をも目的とするものである。本発明は他に、ニ
ューロン栄養性因子(neuronotropic factor)のβ-ユニ
ットと、天然のガングリオシドまたはその誘導体または
半合成同族体またはその塩との新規な複合体の１つまた
はそれ以上を活性物質として含有する医薬組成物を目的
とする。また、本発明はガングリオシドまたはその誘導
体と神経成長因子ＮＧＦのβサブユニットとの新規複合
体のすべてにおける上記適応症に対する治療上用途をも
包含している。以下に実施例を挙げて本発明の新規化合
物の調製物、その製造方法、その医薬組成物およびそれ
らの用途を説明するが、これらは単なる例示である。
る形質転換セルライン、およびhβＮＧＦを産生するそ
の培養物をも目的とするものである。本発明は他に、ニ
ューロン栄養性因子(neuronotropic factor)のβ-ユニ
ットと、天然のガングリオシドまたはその誘導体または
半合成同族体またはその塩との新規な複合体の１つまた
はそれ以上を活性物質として含有する医薬組成物を目的
とする。また、本発明はガングリオシドまたはその誘導
体と神経成長因子ＮＧＦのβサブユニットとの新規複合
体のすべてにおける上記適応症に対する治療上用途をも
包含している。以下に実施例を挙げて本発明の新規化合
物の調製物、その製造方法、その医薬組成物およびそれ
らの用途を説明するが、これらは単なる例示である。
【００２１】図１はヒト起源の神経成長因子ポリペプチ
ドのβサブユニットにおけるヒドロパシープロフィル
を、文献記載の方法にしたがって示すものである[ホッ
プ(Hopp)らのProc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.78:3824,198
1]。−１２１/−１０４として示している位置はリーダ
ーペプチドを指しており、＋１/＋１１８として示して
いる位置はヒト起源の神経成長因子ポリペプチドのβサ
ブユニットのアミノ酸配列を指している[ウルリッチ(Ul
lrich)らのNature303:821,1983]。図２は発現ベクターp
ＳＶＬhＮＧＦの構築の模式図を示すものである。
ドのβサブユニットにおけるヒドロパシープロフィル
を、文献記載の方法にしたがって示すものである[ホッ
プ(Hopp)らのProc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.78:3824,198
1]。−１２１/−１０４として示している位置はリーダ
ーペプチドを指しており、＋１/＋１１８として示して
いる位置はヒト起源の神経成長因子ポリペプチドのβサ
ブユニットのアミノ酸配列を指している[ウルリッチ(Ul
lrich)らのNature303:821,1983]。図２は発現ベクターp
ＳＶＬhＮＧＦの構築の模式図を示すものである。
【００２２】
【発明の詳しい説明】以下に本発明をいかにして実施す
るかの詳細な説明を行う。この説明は単なる例示であっ
て、いかなる意味においても本発明の限定を意図するも
のではない。当業者ならば明らかと考えられる改変は本
発明の範囲内に包含され得るものである。
るかの詳細な説明を行う。この説明は単なる例示であっ
て、いかなる意味においても本発明の限定を意図するも
のではない。当業者ならば明らかと考えられる改変は本
発明の範囲内に包含され得るものである。
【００２３】制限酵素を用いたＤＮＡ鎖への操作は製造
元の教示にしたがって行った。一般には、プラスミド１
μgは溶液２０μl 内で１単位の酵素を使用して切断し
た。その温度およびインキュベート時間は使用する酵素
に応じて変動するが、一般には３７℃で１時間である。
インキュベートした後はすべて、プラスミドおよび遺伝
子セグメントを４０mＭ トリス-ＨＣl、２０mＭ 酢酸ナ
トリウム、１mＭ ＥＤＴＡ中においてアガロースゲルの
ＬＭＰアガロース[ＢＲＬ、アメリカ合衆国]で精製し、
次いでＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭキット[BIO 101 Inc、米
国カルホルニア、ラ・ジョラ]を用いてそのアガロース
から溶出させる。複製反応を行うには、５'ＤＮＡを１
５℃において１０単位のポリメラーゼ(クレノー)で１５
分間処理した。制限酵素で切断したそのＤＮＡ切断物を
脱リン酸化するためには、細菌アルカリホスファターゼ
[ＧＩＢＣＯ-ＢＲＬ]を使用した。２０μl 中６０℃の
１単位アルカリホスファターゼを使用し、１５０mＭ ト
リス緩衝液(pＨ８)中で１時間反応を行った。反応物２
０μl 中ＤＮＡ０.５μg当たり、リガーゼとしてＴ４
リガーゼを１単位の濃度で１２時間使用した(１３℃)。
ＨＢ１０１細胞に形質転換し、アンピシリン抗生物質を
５０μｇ/ml で含有するＬＢ培地[ルリア・バータニ(Lu
ria Bertani)]のアガロース皿に得られた形質転換細胞
を入れ、選択することにより、正しいプラスミド配列の
確認分析を行った。ＨＢ１０１に含有されたプラスミド
を１００μｇ/ml のアンピシリンのＬＢ中で培養し、次
いでＱuiagenのキット[ＤＩＡＧＥＮ Ｇmbh、ドイツ,デ
ュッセルドルフ]によって、より小さい調製物およびよ
り大きな調製物について精製した。発現ベクターはＱui
agen法によって細菌細胞から調製した。
元の教示にしたがって行った。一般には、プラスミド１
μgは溶液２０μl 内で１単位の酵素を使用して切断し
た。その温度およびインキュベート時間は使用する酵素
に応じて変動するが、一般には３７℃で１時間である。
インキュベートした後はすべて、プラスミドおよび遺伝
子セグメントを４０mＭ トリス-ＨＣl、２０mＭ 酢酸ナ
トリウム、１mＭ ＥＤＴＡ中においてアガロースゲルの
ＬＭＰアガロース[ＢＲＬ、アメリカ合衆国]で精製し、
次いでＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭキット[BIO 101 Inc、米
国カルホルニア、ラ・ジョラ]を用いてそのアガロース
から溶出させる。複製反応を行うには、５'ＤＮＡを１
５℃において１０単位のポリメラーゼ(クレノー)で１５
分間処理した。制限酵素で切断したそのＤＮＡ切断物を
脱リン酸化するためには、細菌アルカリホスファターゼ
[ＧＩＢＣＯ-ＢＲＬ]を使用した。２０μl 中６０℃の
１単位アルカリホスファターゼを使用し、１５０mＭ ト
リス緩衝液(pＨ８)中で１時間反応を行った。反応物２
０μl 中ＤＮＡ０.５μg当たり、リガーゼとしてＴ４
リガーゼを１単位の濃度で１２時間使用した(１３℃)。
ＨＢ１０１細胞に形質転換し、アンピシリン抗生物質を
５０μｇ/ml で含有するＬＢ培地[ルリア・バータニ(Lu
ria Bertani)]のアガロース皿に得られた形質転換細胞
を入れ、選択することにより、正しいプラスミド配列の
確認分析を行った。ＨＢ１０１に含有されたプラスミド
を１００μｇ/ml のアンピシリンのＬＢ中で培養し、次
いでＱuiagenのキット[ＤＩＡＧＥＮ Ｇmbh、ドイツ,デ
ュッセルドルフ]によって、より小さい調製物およびよ
り大きな調製物について精製した。発現ベクターはＱui
agen法によって細菌細胞から調製した。
【００２４】ＰＣＲ反応のためのＤＮＡを周期のあるヒ
ト胎盤から以下のようにして調製した。絨毛膜絨毛の
０.４cm3片をハサミで丁寧に切り出し、５０mＭ トリス
-ＨＣlpＨ７.８、１００mＭ ＥＤＴＡ、１００mＭ Ｎa
Ｃl、１％ＳＤＳの７００μl中に懸濁した。次いで、こ
の中にプロテイナーゼ(Ｋ １００μｇ/ml)３５μl を加
え、そのすべてを５５℃で一晩インキュベートした。次
に、ＲＮＡアーゼＡの１３μｇ/ml 溶液２０μlを加
え、さらに２時間インキュベートした。次いで、得られ
た混合物をフェノールで２回抽出し、クロロホルムで２
回抽出した。次いで、１容量のイソプロパノールを加え
てＤＮＡを精緻な試験管において沈澱させた。この時点
で、７０％および１００％エタノールを数回通し、乾燥
させた。次いで、得られたＤＮＡを試験管中の緩衝液
(１０mＭ トリス-ＨＣl pＨ７.４、１mＭ ＥＤＴＡ)中
に穏やかに振盪させながら溶解した。数時間後、溶解し
たＤＮＡを遺伝子増幅のために準備した。ＰＣＲに使用
するには通常、ＤＮＡは０.１μgで十分である。
ト胎盤から以下のようにして調製した。絨毛膜絨毛の
０.４cm3片をハサミで丁寧に切り出し、５０mＭ トリス
-ＨＣlpＨ７.８、１００mＭ ＥＤＴＡ、１００mＭ Ｎa
Ｃl、１％ＳＤＳの７００μl中に懸濁した。次いで、こ
の中にプロテイナーゼ(Ｋ １００μｇ/ml)３５μl を加
え、そのすべてを５５℃で一晩インキュベートした。次
に、ＲＮＡアーゼＡの１３μｇ/ml 溶液２０μlを加
え、さらに２時間インキュベートした。次いで、得られ
た混合物をフェノールで２回抽出し、クロロホルムで２
回抽出した。次いで、１容量のイソプロパノールを加え
てＤＮＡを精緻な試験管において沈澱させた。この時点
で、７０％および１００％エタノールを数回通し、乾燥
させた。次いで、得られたＤＮＡを試験管中の緩衝液
(１０mＭ トリス-ＨＣl pＨ７.４、１mＭ ＥＤＴＡ)中
に穏やかに振盪させながら溶解した。数時間後、溶解し
たＤＮＡを遺伝子増幅のために準備した。ＰＣＲに使用
するには通常、ＤＮＡは０.１μgで十分である。
【００２５】運搬ベクターの構築 バキュロウイルスのゲノムは非常に大きく(１２５kb)、
個々の制限部位について操作されたことがなかったの
で、運搬構築物とバキュロウイルスとの間で組換え操作
を施す必要がある。この目的では、hＮＧＦ分子が既に
操作されているキメラ性バキュロウイルスを得る。
個々の制限部位について操作されたことがなかったの
で、運搬構築物とバキュロウイルスとの間で組換え操作
を施す必要がある。この目的では、hＮＧＦ分子が既に
操作されているキメラ性バキュロウイルスを得る。
【００２６】利用した運搬ベクターは、単一のＢamＨＩ
がポリヘドリンの直ぐ後方に作成されているＰＶＬであ
った[ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ(カルフォルニア、サンジェ
ゴ)から購入]。このベクター内でクローニングを行うた
め、hＮＧＦ分子を操作し、その遺伝子の直ぐ後方にス
プライシングおよびポリアデニル化部位を付加すること
により、全体を２つのＢamＨＩ部位に包含させてクロー
ニングを容易にした。
がポリヘドリンの直ぐ後方に作成されているＰＶＬであ
った[ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ(カルフォルニア、サンジェ
ゴ)から購入]。このベクター内でクローニングを行うた
め、hＮＧＦ分子を操作し、その遺伝子の直ぐ後方にス
プライシングおよびポリアデニル化部位を付加すること
により、全体を２つのＢamＨＩ部位に包含させてクロー
ニングを容易にした。
【００２７】ＰＶＬバキュロウイルスのための運搬ベク
ター内におけるプレプロＮＧＦのクローニングについて
の詳細な説明 プレプロＮＧＦをＰＣＲ法によってクローンした。２つ
のオリゴヌクレオチドを合成した。塩基９１２２と９１
４７との間の最初の１つは配列：
ター内におけるプレプロＮＧＦのクローニングについて
の詳細な説明 プレプロＮＧＦをＰＣＲ法によってクローンした。２つ
のオリゴヌクレオチドを合成した。塩基９１２２と９１
４７との間の最初の１つは配列：
【化１】 Ｍet Ｓer Ｍet Ｌeu Ｐhe ５'ＧＣＡＴＡＧＣＧＴＡ ＡＴＧ ＴＣＣ ＡＴＧ ＴＴＧ ＴＴＣ Ｔ３' を有していた。開始ＡＵＧの前のヌクレオチドを改変
し、それにより合成したオリゴヌクレオチドは以下の配
列： ＸbaＩ Ｍet Ｓer Ｍet Ｌeu Ｐhe ５'ＴＧＴ ＣＴＡＧ ＡＧＴ ＡＴＧ ＴＣＣ ＡＴＧ ＴＴＧ ＴＴＣ Ｔ３' を有している。このオリゴヌクレオチドは(ＸbaＩ)と呼
ばれる。塩基９５２１から９３４２を含有する第２のオ
リゴヌクレオチド[ウルリッチ、Nature 303:821,1983]
はＰＣＲを行うことができるよう上記の配列と相補的で
あり、配列： ＥcoＲＩ ５'ＧＧＣＧＧ ＡＡＴＴ ＣＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣ３' を有している。
し、それにより合成したオリゴヌクレオチドは以下の配
列： ＸbaＩ Ｍet Ｓer Ｍet Ｌeu Ｐhe ５'ＴＧＴ ＣＴＡＧ ＡＧＴ ＡＴＧ ＴＣＣ ＡＴＧ ＴＴＧ ＴＴＣ Ｔ３' を有している。このオリゴヌクレオチドは(ＸbaＩ)と呼
ばれる。塩基９５２１から９３４２を含有する第２のオ
リゴヌクレオチド[ウルリッチ、Nature 303:821,1983]
はＰＣＲを行うことができるよう上記の配列と相補的で
あり、配列： ＥcoＲＩ ５'ＧＧＣＧＧ ＡＡＴＴ ＣＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣ３' を有している。
【００２８】このオリゴヌクレオチド内には、プレプロ
ＮＧＦを成熟ＮＧＦとひとつにし得るＥcoＲＩ部位が含
有されている。このオリゴヌクレオチドは(ＥcoＲＩ)と
呼ばれる。上記２つのオリゴヌクレオチドは常法に基づ
くホスホルアミダイト法を利用するオリゴヌクレオチド
合成機により、固相において合成した[３８０Ｂ ＤＮＡ
合成機(Applied Biosystems 米国)]。これらをＮＨ
3中、５５℃で１２時間処理し、次いで減圧乾燥した。
２.５Ｍ 酢酸アンモニウムに再懸濁し、次いで３容量の
冷エタノール(−２０℃)を用いて沈澱させた。８０％冷
エタノールで再度洗浄し、水に再懸濁した。これら２つ
のオリゴヌクレオチドの濃度を分光器によって測定し
た。Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cyclerによって
増幅を行ったが、増幅用に使用した試薬は相当するＤＮ
ＡＴＭ 増幅キット[Perkin Elmer-Cetus]中に含有され
ている。各２００μＭのオリゴヌクレオチド、０.５μ
Ｍの各ヌクレオチドdＡＴＰ、dＴＴＰ、dＣＴＰ、dＧＴ
Ｐ、および０.１μgのヒトＤＮＡの混合物、および全混
合物１００μl に０.５単位のＴＡＱポリメラーゼを含
有する反応緩衝液をパラフィン油で覆い、蒸発を防い
だ。増幅反応は、ヒトＤＮＡの場合は装置を３５サイク
ルに設定して行った。両方の場合とも、そのサイクルの
内容は、９４℃で１分、４５℃で２分、７２℃で３分で
あった。３００bp の増幅されたフラグメントは低融解
アガロースゲル[NuSieve]によって精製し、ＧＥＮＥ-Ｃ
ＬＥＡＮＴＭキット[ＢＩＯ １０１Ｉnc、米国カリホル
ニア]を使用してそのアガロースから溶解した。得られ
たＤＮＡを制限酵素ＸbaＩおよびＥcoＲＩで切断し、既
述のように再精製した。このようにして精製された分断
化物質をベクターpＧＥＭ４[Promega]のＸbaＩおよびＥ
coＲＩ部位にクローンした。得られたプラスミドをpＧ
ＥＭ４Ｘba-ＮＧＦと命名した。このプラスミドをＨind
III-ＥcoＲＩ部位で切断し、得られた３００bp フラグ
メントを精製したなら、ベクターpＵＣ１８ＢＢＧ２６
[British Biotechnology Ltd,英国,オックスフォード]
のＨindIII-ＥcoＲＩ部位にクローンした。このプラス
ミドpＵＣ１８ＢＢＧ２６は、天然の遺伝子には存在し
ない制限部位を有している合成hβＮＧＦ遺伝子を含有
しており、それにより特定のドメインを置換することが
できる。得られたベクターをpＵＣ１８hＮＧＦＣと命名
する。
ＮＧＦを成熟ＮＧＦとひとつにし得るＥcoＲＩ部位が含
有されている。このオリゴヌクレオチドは(ＥcoＲＩ)と
呼ばれる。上記２つのオリゴヌクレオチドは常法に基づ
くホスホルアミダイト法を利用するオリゴヌクレオチド
合成機により、固相において合成した[３８０Ｂ ＤＮＡ
合成機(Applied Biosystems 米国)]。これらをＮＨ
3中、５５℃で１２時間処理し、次いで減圧乾燥した。
２.５Ｍ 酢酸アンモニウムに再懸濁し、次いで３容量の
冷エタノール(−２０℃)を用いて沈澱させた。８０％冷
エタノールで再度洗浄し、水に再懸濁した。これら２つ
のオリゴヌクレオチドの濃度を分光器によって測定し
た。Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cyclerによって
増幅を行ったが、増幅用に使用した試薬は相当するＤＮ
ＡＴＭ 増幅キット[Perkin Elmer-Cetus]中に含有され
ている。各２００μＭのオリゴヌクレオチド、０.５μ
Ｍの各ヌクレオチドdＡＴＰ、dＴＴＰ、dＣＴＰ、dＧＴ
Ｐ、および０.１μgのヒトＤＮＡの混合物、および全混
合物１００μl に０.５単位のＴＡＱポリメラーゼを含
有する反応緩衝液をパラフィン油で覆い、蒸発を防い
だ。増幅反応は、ヒトＤＮＡの場合は装置を３５サイク
ルに設定して行った。両方の場合とも、そのサイクルの
内容は、９４℃で１分、４５℃で２分、７２℃で３分で
あった。３００bp の増幅されたフラグメントは低融解
アガロースゲル[NuSieve]によって精製し、ＧＥＮＥ-Ｃ
ＬＥＡＮＴＭキット[ＢＩＯ １０１Ｉnc、米国カリホル
ニア]を使用してそのアガロースから溶解した。得られ
たＤＮＡを制限酵素ＸbaＩおよびＥcoＲＩで切断し、既
述のように再精製した。このようにして精製された分断
化物質をベクターpＧＥＭ４[Promega]のＸbaＩおよびＥ
coＲＩ部位にクローンした。得られたプラスミドをpＧ
ＥＭ４Ｘba-ＮＧＦと命名した。このプラスミドをＨind
III-ＥcoＲＩ部位で切断し、得られた３００bp フラグ
メントを精製したなら、ベクターpＵＣ１８ＢＢＧ２６
[British Biotechnology Ltd,英国,オックスフォード]
のＨindIII-ＥcoＲＩ部位にクローンした。このプラス
ミドpＵＣ１８ＢＢＧ２６は、天然の遺伝子には存在し
ない制限部位を有している合成hβＮＧＦ遺伝子を含有
しており、それにより特定のドメインを置換することが
できる。得られたベクターをpＵＣ１８hＮＧＦＣと命名
する。
【００２９】次いで、このプラスミドをＰvuIIおよびＸ
baＩ部位で切断し、８００bp フラグメントをpＧＥＭ４
ベクターのＰvuIIおよびＸbaＩ部位間にクローンし、そ
れによりベクターpＧＥＭ４ＢamＮＧＦを得た。
baＩ部位で切断し、８００bp フラグメントをpＧＥＭ４
ベクターのＰvuIIおよびＸbaＩ部位間にクローンし、そ
れによりベクターpＧＥＭ４ＢamＮＧＦを得た。
【００３０】このようにすれば、hＮＧＦ遺伝子は２つ
のＢamＨＩ制限部位内に包含される。この時点で、バキ
ュロウイルスpＶＬの発現ベクターをＢamＨＩで開裂
し、アルカリホスファターゼで脱リン酸化し、次いでベ
クターpＧＥＭ４ＢamＮＧＦの７６０bp ＢamＨＩフラグ
メントを挿入して発現ベクターpＳＶＬhＮＧＦを得た。
組換えプラスミドを含有する種々の細菌クローンを分析
し、ＮＧＦ遺伝子がポリヘドリンプロモーターに対して
正しい位置にあるか否かを調査した。図２にはこのクロ
ーニングの概略を示している。
のＢamＨＩ制限部位内に包含される。この時点で、バキ
ュロウイルスpＶＬの発現ベクターをＢamＨＩで開裂
し、アルカリホスファターゼで脱リン酸化し、次いでベ
クターpＧＥＭ４ＢamＮＧＦの７６０bp ＢamＨＩフラグ
メントを挿入して発現ベクターpＳＶＬhＮＧＦを得た。
組換えプラスミドを含有する種々の細菌クローンを分析
し、ＮＧＦ遺伝子がポリヘドリンプロモーターに対して
正しい位置にあるか否かを調査した。図２にはこのクロ
ーニングの概略を示している。
【００３１】昆虫細胞培養 これらの細胞の培養方法自体は、この技術分野の当業者
には周知である。その培養方法は、サマーズ(Summers,
H.D.)らの欧州公開第127 839号、およびスミス(Smith
G.E.)の米国特許第4,745,051号に記載されている。
には周知である。その培養方法は、サマーズ(Summers,
H.D.)らの欧州公開第127 839号、およびスミス(Smith
G.E.)の米国特許第4,745,051号に記載されている。
【００３２】スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera
Frugiperda)(Ｓf９)の細胞は単層で、または懸濁させて
増殖可能であるので、本発明ではそれらを使用した。単
層としては、二酸化炭素の存在下に２５−３０℃で維持
させ、全面成長段階で１週間に２、３回分配する。懸濁
における培養条件は、培地および培養物の容量に左右さ
れる。約２×１０６細胞／ml で高い空気拡散度によっ
て発酵槽中で増殖させる。血清不含の培地を、基礎培地
としてグレース昆虫培養培地(Grace's insectmedium cu
lture)[ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ]から構成させ、それに液状
成分およびペプトンを加える。抗生物質を保存剤として
加える。フェロニックＦ６８(pheronicF68)を振盪に由
来する細胞損傷に対する保護剤として使用する。
Frugiperda)(Ｓf９)の細胞は単層で、または懸濁させて
増殖可能であるので、本発明ではそれらを使用した。単
層としては、二酸化炭素の存在下に２５−３０℃で維持
させ、全面成長段階で１週間に２、３回分配する。懸濁
における培養条件は、培地および培養物の容量に左右さ
れる。約２×１０６細胞／ml で高い空気拡散度によっ
て発酵槽中で増殖させる。血清不含の培地を、基礎培地
としてグレース昆虫培養培地(Grace's insectmedium cu
lture)[ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ]から構成させ、それに液状
成分およびペプトンを加える。抗生物質を保存剤として
加える。フェロニックＦ６８(pheronicF68)を振盪に由
来する細胞損傷に対する保護剤として使用する。
【００３３】組換えウイルスの調製および単離 組換えウイルスの単離方法についての詳細は欧州特許第
0 127 839号に見いだすことができる。一般には、hＮＧ
Ｆ分子を担う運搬ベクターＤＮＡ(２μg)およびウイル
ス性ＡcＮＰＶ ＤＮＡ(１μg)をスポドプテラ・フルギ
ペルダ細胞の単層物に同時形質転換する。３−４日後に
は、得られた細胞はウイルスの取り込み(viral occlusi
ons)を示し、細胞の１０−５０％が感染されている。ウ
イルスは通過して力価１０７を有する媒質(medium)に至
るが、その０.１％−０.５％が組換えウイルスである。
組換えウイルスを単離するための種々の方法は既知であ
る。hＮＧＦ遺伝子をプローブとして使用するハイブリ
ダイゼーションプラーク法、またはhβＮＧＦと交叉反
応するmβＮＧＦに対する抗体を使用することができ
る。本発明の場合、組換えウイルスの単離は、軟アガロ
ースで覆われた細胞単層物の連続希釈法によって行っ
た。２−３サイクル後、組換えウイルスは陰性の取り込
み特性を示した。滅菌パスツールピペットを使用して約
１０,０００ウイルスを含有するプラークを培地２ml 中
に移した。単離すると、これは組換えウイルスを示して
おり、次いでそれは感染に使用でき、そしてβhＮＧＦ
をスポドプテラ・フルギペルダ細胞で産生させることが
できる。
0 127 839号に見いだすことができる。一般には、hＮＧ
Ｆ分子を担う運搬ベクターＤＮＡ(２μg)およびウイル
ス性ＡcＮＰＶ ＤＮＡ(１μg)をスポドプテラ・フルギ
ペルダ細胞の単層物に同時形質転換する。３−４日後に
は、得られた細胞はウイルスの取り込み(viral occlusi
ons)を示し、細胞の１０−５０％が感染されている。ウ
イルスは通過して力価１０７を有する媒質(medium)に至
るが、その０.１％−０.５％が組換えウイルスである。
組換えウイルスを単離するための種々の方法は既知であ
る。hＮＧＦ遺伝子をプローブとして使用するハイブリ
ダイゼーションプラーク法、またはhβＮＧＦと交叉反
応するmβＮＧＦに対する抗体を使用することができ
る。本発明の場合、組換えウイルスの単離は、軟アガロ
ースで覆われた細胞単層物の連続希釈法によって行っ
た。２−３サイクル後、組換えウイルスは陰性の取り込
み特性を示した。滅菌パスツールピペットを使用して約
１０,０００ウイルスを含有するプラークを培地２ml 中
に移した。単離すると、これは組換えウイルスを示して
おり、次いでそれは感染に使用でき、そしてβhＮＧＦ
をスポドプテラ・フルギペルダ細胞で産生させることが
できる。
【００３４】生物学的活性の測定 上記組換えウイルスで感染させた後のスポドプテラ・フ
ルギペルダのセルラインから培養培地中に分泌されるヒ
トＮＧＦの生物学的活性を測定するためのインビトロ試
験は、幼若クロム親和性細胞ＰＣ-１２において行った
[グリーン(Greene L.A.)らのA.Rev.Neurosci.3:353,198
2]。天然ウイルスによって感染させた後のスポドプテラ
・フルギペルダの培養培地を使用して、または培養培地
中に存在するhβＮＧＦの活性を、ネズミもしくはウシ
起源のβＮＧＦに特異的なポリクローナル抗体によって
阻害することにより、上記反応の特異性を評価した。上
記の組換えウシによって感染された細胞は、ヒトＮＧＦ
のβサブユニットを生物学的に活性な形態で産生し、そ
れを培養培地中に分泌した。上清のＳＤＳゲル中におけ
るタンパク質の発現性を調べた。
ルギペルダのセルラインから培養培地中に分泌されるヒ
トＮＧＦの生物学的活性を測定するためのインビトロ試
験は、幼若クロム親和性細胞ＰＣ-１２において行った
[グリーン(Greene L.A.)らのA.Rev.Neurosci.3:353,198
2]。天然ウイルスによって感染させた後のスポドプテラ
・フルギペルダの培養培地を使用して、または培養培地
中に存在するhβＮＧＦの活性を、ネズミもしくはウシ
起源のβＮＧＦに特異的なポリクローナル抗体によって
阻害することにより、上記反応の特異性を評価した。上
記の組換えウシによって感染された細胞は、ヒトＮＧＦ
のβサブユニットを生物学的に活性な形態で産生し、そ
れを培養培地中に分泌した。上清のＳＤＳゲル中におけ
るタンパク質の発現性を調べた。
【００３５】医薬組成物 既述した組換えＤＮＡによって得られたヒトＮＧＦ分子
(βサブユニット)を含有する、ガングリオシドおよびリ
ン脂質をも含有することある医薬組成物の製剤化方法
は、患者に投与することのできる医薬的に許容され得る
組成物を調製するための既知の方法を包含しており、そ
れにより、医薬的に許容され得るビヒクルと共に混合物
中にhＮＧＦ分子の有効量を混合することができる。適
当なビヒクル、および他のタンパク質を含有するその製
剤は、例えば「レミングトンの医薬科学」[Remington's
Pharmaceutical Sciences,マック・パブリッシング・
カンパニー,イーストン,Pa.,米国,1985]に記載されてい
る。これらのビヒクルには、注射用の「沈渣製剤(depos
it formulation)」が包含される。これらのことに基づ
いて、本発明の医薬製剤には、１つまたはそれ以上の医
薬的に許容され得るビヒクルまたは希釈剤を共に含有す
る神経成長因子の溶液剤、またはその凍結乾燥粉末剤が
包含されるが、これらは総括的なものでなく、またそれ
らは適切なpＨ、および生理学的体液と等張性にするた
めの緩衝化媒質に含有される。凍結乾燥剤を調製する場
合は、例えばマンニトールまたはグリシンなどの支持賦
形剤を使用すればよく、また所望のpＨを有する適切な
等張性緩衝化溶液剤を得るためには、所望の容量の適当
な緩衝化溶液を調製する。所望の容量の等張性溶液剤に
組換えＤＮＡによって得られた神経成長因子の分子を含
有する医薬組成物として、上記と同様の溶液を使用する
ことができ、それには所望のpＨ、例えば中性pＨの等張
性医薬調製物を毎回得るために適当な濃度のリン酸塩ま
たはクエン酸塩を含有する生理学的緩衝化溶液を使用す
ること、が包含されるが、それに限定されない。
(βサブユニット)を含有する、ガングリオシドおよびリ
ン脂質をも含有することある医薬組成物の製剤化方法
は、患者に投与することのできる医薬的に許容され得る
組成物を調製するための既知の方法を包含しており、そ
れにより、医薬的に許容され得るビヒクルと共に混合物
中にhＮＧＦ分子の有効量を混合することができる。適
当なビヒクル、および他のタンパク質を含有するその製
剤は、例えば「レミングトンの医薬科学」[Remington's
Pharmaceutical Sciences,マック・パブリッシング・
カンパニー,イーストン,Pa.,米国,1985]に記載されてい
る。これらのビヒクルには、注射用の「沈渣製剤(depos
it formulation)」が包含される。これらのことに基づ
いて、本発明の医薬製剤には、１つまたはそれ以上の医
薬的に許容され得るビヒクルまたは希釈剤を共に含有す
る神経成長因子の溶液剤、またはその凍結乾燥粉末剤が
包含されるが、これらは総括的なものでなく、またそれ
らは適切なpＨ、および生理学的体液と等張性にするた
めの緩衝化媒質に含有される。凍結乾燥剤を調製する場
合は、例えばマンニトールまたはグリシンなどの支持賦
形剤を使用すればよく、また所望のpＨを有する適切な
等張性緩衝化溶液剤を得るためには、所望の容量の適当
な緩衝化溶液を調製する。所望の容量の等張性溶液剤に
組換えＤＮＡによって得られた神経成長因子の分子を含
有する医薬組成物として、上記と同様の溶液を使用する
ことができ、それには所望のpＨ、例えば中性pＨの等張
性医薬調製物を毎回得るために適当な濃度のリン酸塩ま
たはクエン酸塩を含有する生理学的緩衝化溶液を使用す
ること、が包含されるが、それに限定されない。
【００３６】上記医薬調製物は経口、経直腸、腸管外、
局所、吸入用、脳内に適用することができる。したがっ
て、それは固形または半固形型であり、例えば糖衣錠、
錠剤、ゼラチンカプセル剤、カプセル剤、坐剤、ゼラチ
ン軟カプセルなどである。腸管外または脳内適用のため
には、筋注もしくは皮下投与用の剤形を使用することが
でき、または注入すなわち静脈内もしくは脳内注入用に
使用するができる。したがって、それには、本発明活性
物質の溶液剤、または活性物質の凍結乾燥粉末剤であっ
て、それらの用途に適切かつ生理学的体液に適合する浸
透性を有する１つまたはそれ以上の医薬的に許容され得
る賦形剤または希釈剤が付加されたものを挙げることが
できる。局所投与用には、通常使用するものとしてクリ
ームまたは軟膏の剤形の調製物が当然に考えられ、吸入
用には例えば鼻腔スプレーなどのスプレー剤の調製物を
考えるべきである。本発明の調製物は、ヒトまたは動物
に投与することができる。それらは、溶液剤、スプレー
剤、軟膏およびクリーム剤の場合には活性成分を０.０
１％から１０％含有するものが好ましく、また固形剤の
調製物では活性成分を１％から１００％含有し、そして
５％から５０％含有するものが好ましい。
局所、吸入用、脳内に適用することができる。したがっ
て、それは固形または半固形型であり、例えば糖衣錠、
錠剤、ゼラチンカプセル剤、カプセル剤、坐剤、ゼラチ
ン軟カプセルなどである。腸管外または脳内適用のため
には、筋注もしくは皮下投与用の剤形を使用することが
でき、または注入すなわち静脈内もしくは脳内注入用に
使用するができる。したがって、それには、本発明活性
物質の溶液剤、または活性物質の凍結乾燥粉末剤であっ
て、それらの用途に適切かつ生理学的体液に適合する浸
透性を有する１つまたはそれ以上の医薬的に許容され得
る賦形剤または希釈剤が付加されたものを挙げることが
できる。局所投与用には、通常使用するものとしてクリ
ームまたは軟膏の剤形の調製物が当然に考えられ、吸入
用には例えば鼻腔スプレーなどのスプレー剤の調製物を
考えるべきである。本発明の調製物は、ヒトまたは動物
に投与することができる。それらは、溶液剤、スプレー
剤、軟膏およびクリーム剤の場合には活性成分を０.０
１％から１０％含有するものが好ましく、また固形剤の
調製物では活性成分を１％から１００％含有し、そして
５％から５０％含有するものが好ましい。
【００３７】投与すべき投与量は、個々の適応症、所望
の効果、および選択した投与経路によって変動する。し
かし、ヒトに対する注射(皮下または筋注または脳内)の
毎日の投与量は一般に、体重１kg当たり活性物質０.０
５mｇから５mｇと種々変動する。本発明の医薬製剤とし
てはさらに、新油性賦形剤、例えばグリコゼラチンなど
の水溶性の自動乳化性賦形剤を含有する直腸投与用の坐
剤が挙げられるが、それに限定されない。この調製物で
は、組換えＤＮＡによって得られた神経成長因子を全賦
形剤の重量に対して０.０１％から１％の含量で存在さ
せればよい。この坐剤には、適量のアセチルサリチル酸
塩を含有させることができるが、それに限定されない。
の効果、および選択した投与経路によって変動する。し
かし、ヒトに対する注射(皮下または筋注または脳内)の
毎日の投与量は一般に、体重１kg当たり活性物質０.０
５mｇから５mｇと種々変動する。本発明の医薬製剤とし
てはさらに、新油性賦形剤、例えばグリコゼラチンなど
の水溶性の自動乳化性賦形剤を含有する直腸投与用の坐
剤が挙げられるが、それに限定されない。この調製物で
は、組換えＤＮＡによって得られた神経成長因子を全賦
形剤の重量に対して０.０１％から１％の含量で存在さ
せればよい。この坐剤には、適量のアセチルサリチル酸
塩を含有させることができるが、それに限定されない。
【００３８】以下に本発明の医薬組成物の幾つかを例示
するが、これらは本発明の単なる説明のためのものであ
り、限定を意図するものではない。 Ａ)注射用溶液剤 調製例１− ２ml バイアルは以下の成分を含有する： 活性物質 １μg(3,200BU) 塩化ナトリウム １６mｇ クエン酸緩衝液(pＨ７) ２ml 注射用水に入れる。調製例２− ２ml バイアルは以下の成分を含有する： 活性物質 １０μg(32,000BU) 塩化ナトリウム １６mｇ クエン酸緩衝液(pＨ７) ２ml 注射用水に入れる。
するが、これらは本発明の単なる説明のためのものであ
り、限定を意図するものではない。 Ａ)注射用溶液剤 調製例１− ２ml バイアルは以下の成分を含有する： 活性物質 １μg(3,200BU) 塩化ナトリウム １６mｇ クエン酸緩衝液(pＨ７) ２ml 注射用水に入れる。調製例２− ２ml バイアルは以下の成分を含有する： 活性物質 １０μg(32,000BU) 塩化ナトリウム １６mｇ クエン酸緩衝液(pＨ７) ２ml 注射用水に入れる。
【００３９】調製例３− ２ml バイアルは以下の成分を含有する： 活性物質 １μg(3,200BU) 塩化ナトリウム １６mｇ ガングリオシド(Na塩として) １００mｇ クエン酸緩衝液(pＨ７) ２ml 注射用水に入れる。調製例４− ２ml バイアルは以下の成分を含有する： 活性物質 １０μg(32,000BU) 塩化ナトリウム １６mｇ ガングリオシド(Na塩として) ５０mｇ クエン酸緩衝液(pＨ７) ２ml 注射用水に入れる。調製例５− ２ml バイアルは以下の成分を含有する： 活性物質 １μg(3,200BU) 塩化ナトリウム １６mｇ モノシアロテトラヘキソシルガングリオシド (ＧＭ1)(Na塩として) １００mｇ クエン酸緩衝液(pＨ７) ２ml 注射用水に入れる。
【００４０】調製例６− ２ml バイアルは以下の成分を含有する： 活性物質 １０μg(32,000BU) 塩化ナトリウム １６mｇ モノシアロテトラヘキソシルガングリオシド (ＧＭ1)(Na塩として) １００mｇ クエン酸緩衝液(pＨ７) ２ml 注射用水に入れる。調製例７ (a)２ml アンプルは以下の成分を含有する： 凍結乾燥した活性物質 ４μg(12,800BU) グリシン ３０mｇ (b)２ml アンプルの溶媒は以下の成分を含有する： 塩化ナトリウム １６mｇ クエン酸緩衝液の水溶液 ２ml 注射用水調製例８ (a)２ml バイアルは以下の成分を含有する： 凍結乾燥した活性物質 ４μg(12,800BU) マンニトール ４０mｇ (b)２ml アンプルの溶媒は以下の成分を含有する： 塩化ナトリウム １６mｇ クエン酸緩衝液の水溶液 ２ml 注射用水
【００４１】調製例９ (a)３ml バイアルは以下の成分を含有する： 凍結乾燥した活性物質 １０μg(32,000BU) グリシン ４５mｇ (b)３ml アンプルの溶媒は以下の成分を含有する： 塩化ナトリウム ２４mｇ クエン酸緩衝液の水溶液 ３ml 注射用水調製例１０ (a)３ml バイアルは以下の成分を含有する： 凍結乾燥した活性物質 １０μg(32,000BU) ガングリオシド(Na塩として) １００mｇ グリシン ４５mｇ (b)３ml アンプルの溶媒は以下の成分を含有する： 塩化ナトリウム ２４mｇ クエン酸緩衝液の水溶液 ３ml 注射用水調製例１１ (a)３ml バイアルは以下の成分を含有する： 凍結乾燥した活性物質 １０μg(32,000BU) ガングリオシド(Na塩として) ５０mｇ グリシン ４５mｇ (b)３ml アンプルの溶媒は以下の成分を含有する： 塩化ナトリウム ２４mｇ クエン酸緩衝液の水溶液 ３ml 注射用水
【００４２】調製例１２ (a)３ml バイアルは以下の成分を含有する： 凍結乾燥した活性物質 １μg(3,200BU) モノシアロテトラヘキソシルガングリオシド (ＧＭ1)(Na塩として) １００mｇ グリシン ４５mｇ (b)３ml アンプルの溶媒は以下の成分を含有する： 塩化ナトリウム ２４mｇ クエン酸緩衝液の水溶液 ３ml 注射用水調製例１３ (a)３ml バイアルは以下の成分を含有する： 凍結乾燥した活性物質 １０μg(32,000BU) モノシアロテトラヘキソシルガングリオシド (ＧＭ1)(Na塩として) １００mｇ グリシン ４５mｇ (b)３ml アンプルの溶媒は以下の成分を含有する： 塩化ナトリウム ２４mｇ クエン酸緩衝液の水溶液 ３ml 注射用水
【００４３】調製例１４ (a)３ml バイアルは以下の成分を含有する： 凍結乾燥した活性物質 １０μg(32,000BU) ３-sn-ホスファチジルＬ-セリン ５０mｇ レシチン １５mｇ マンニトール １００mｇ (b)４ml アンプルの溶媒は以下の成分を含有する： マンニトール ６０mｇ 注射用水で４ml にする。調製例１５ (a)３ml アンプルは以下の成分を含有する： 凍結乾燥した活性物質 １０μg(32,000BU) マンニトール ６０mｇ (b)３ml アンプルの溶媒は以下の成分を含有する： 塩化ナトリウム ２４mｇ クエン酸緩衝液の水溶液 ３ml 注射用水
【００４４】Ｂ)皮下注射剤調製例１６ (a)２ml バイアルは以下の成分を含有する： 凍結乾燥した活性物質 ５μg(16,000BU) マンニトール ３０mｇ (b)２ml アンプルの溶媒は以下の成分を含有する： 塩化ナトリウム １６mｇ クエン酸緩衝液の水溶液 ２ml 注射用水
【００４５】Ｃ)直腸経路用坐剤調製例１７ 活性物質 １０μg(32,000BU) ココア脂 ２.５mｇ調製例１８ 活性物質 １０μg(32,000BU) カルボワックス１５４０ １.７５ｇ カルボワックス６０００ ０.７５ｇ調製例１９ 活性物質 １０μg(32,000BU) Ｔween６１ ２.１２５ｇ ラノリン ０.２５ｇ調製例２０ 活性物質 １０μg(32,000BU) グリセリン １.５ｇ 水 ０.２５ｇ ゼラチン ０.２５ｇ
【００４６】これまで本発明を説明してきたが、本明細
書に記載した方法が種々の態様で改変できることは明ら
かである。このような改変は、本発明の思想および範囲
から逸脱するものと解してはならず、当業者にとって自
明と考えられるすべての改変は、本発明の特許請求の範
囲内に包含されるものである。
書に記載した方法が種々の態様で改変できることは明ら
かである。このような改変は、本発明の思想および範囲
から逸脱するものと解してはならず、当業者にとって自
明と考えられるすべての改変は、本発明の特許請求の範
囲内に包含されるものである。
【図１】 ヒト起源の神経成長因子ポリペプチドのβサ
ブユニットにおけるヒドロパシープロフィルを示すグラ
フである。
ブユニットにおけるヒドロパシープロフィルを示すグラ
フである。
【図２】 発現ベクターpＳＶＬhＮＧＦの構築の模式図
である。
である。
【手続補正書】
【提出日】平成３年５月１５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 37/24 ＡＡＡ 8314−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 13/00 7731−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/10 15/86 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｈ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） 8828−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
Claims (20)
- 【請求項１】 移し換え用(transplacement)遺伝子構築
物が、 (a)成熟型として知られている形態にあるヒト起源の神
経成長因子ポリペプチドのβサブユニット(βＮＧＦ)、
またはその生物学的に活性な誘導体をコードしており、
かつ非天然の制限部位を含有する合成遺伝子配列であっ
て、 (b)この遺伝子配列(a)の５'末端がヒトβＮＧＦのプレ
プロ領域の天然配列の３'末端と融合し、 (c)ヒトβＮＧＦをコードしている遺伝子配列(a)の３'
末端がポリアデニル化およびスプライシング配列と融合
し、 (d)上記遺伝子構築物中に存在するヒトプレプロβＮＧ
ＦをコードしているＤＮＡ配列がポリヘドリンプロモー
ターの調節要素と機能的に連結するもの、である組換え
バキュロウイルス。 - 【請求項２】 細胞感染によって培養培地中にヒトβＮ
ＧＦを発現することのできる請求項１に記載の組換えバ
キュロウイルス。 - 【請求項３】 現在までに知られている成熟型のアミノ
酸配列に融合している１つまたはそれ以上のアミノ酸が
遺伝子構築物に存在していない請求項１または請求項２
に記載の組換えバキュロウイルス。 - 【請求項４】 遺伝子構築物が、プレプロ領域をコード
するＤＮＡ配列を伴わずに成熟型βサブユニットをコー
ドする遺伝子配列を含有するものである請求項３に記載
の組換えバキュロウイルス。 - 【請求項５】 請求項１から請求項４までのいずれかに
よって特徴付られた遺伝子構築物を含有する、それをバ
キュロウイルスのゲノムに導入することのできる組換え
バキュロウイルス移し換え用ベクター。 - 【請求項６】 pＳＶＬhＮＧＦである組換えバキュロウ
イルス移し換え用ベクター。 - 【請求項７】 請求項５または請求項６に記載の組換え
バキュロウイルス移し換え用ベクターを宿主細胞に導入
し、該組換えバキュロウイルス移し換え用ベクター由来
の遺伝子構築物の受容体バキュロウイルスへの移し換え
を行わせ、そして得られた請求項１から請求項４までの
いずれかに記載の組換えバキュロウイルスを単離するこ
と、を特徴とする請求項１から請求項４までのいずれか
に記載の組換えバキュロウイルスを調製するための方
法。 - 【請求項８】 請求項１から請求項４までのいずれかに
記載の組換えバキュロウイルスを含有する、ヒトβＮＧ
Ｆをその成熟型で発現することのできる組換え昆虫細
胞。 - 【請求項９】 スポドプテラ・フルギペルダから得られ
る請求項８に記載の組換え昆虫細胞。 - 【請求項１０】 請求項８または請求項９に記載の組換
え細胞を培養し、得られた培養物からヒト神経成長因子
を回収すること、を特徴とする生物学的に活性なヒト神
経成長因子(βＮＧＦ)を得るための方法。 - 【請求項１１】 天然構造を構成し得る他のサブユニッ
トからβサブユニットを遊離させる必要のない、βサブ
ユニットをその成熟型で得るための請求項１０に記載の
方法。 - 【請求項１２】 ヒト起源の他の産物またはタンパク質
の夾雑がなく、ヒトβＮＧＦが得られる請求項１０また
は請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 請求項１０から請求項１２までのいず
れかに記載の方法によって得られる、ヒト起源の他の産
物またはタンパク質の夾雑のない生物学的に活性なヒト
神経成長因子(βＮＧＦ)。 - 【請求項１４】 請求項１３に記載の生物学的に活性な
ヒト神経成長因子(βＮＧＦ)を含有する医薬調製物。 - 【請求項１５】 天然のガングリオシドまたはその誘導
体もしくは半合成同族体の１つまたはその塩の１つをさ
らに含有する医薬調製物。 - 【請求項１６】 腸管外投与、脳内投与、経口投与、直
腸投与、局所投与、または吸入投与によって投与できる
請求項１４または請求項１５に記載の医薬調製物。 - 【請求項１７】 神経機能の維持、神経機能の予防、ま
たは急性もしくは慢性の疾患における神経機能の回復に
使用され得る、請求項１４または請求項１６に記載の医
薬調製物。 - 【請求項１８】 症状が、脳血管性、感染性、炎症性、
圧迫性、または代謝性障害などの急性病状である請求項
１７に記載の医薬調製物。 - 【請求項１９】 症状が、急性疾患の後期などの慢性の
神経変性タイプである請求項１７に記載の医薬調製物。 - 【請求項２０】 神経系の加齢によって引き起こされる
神経疾患の処置、または免疫系に影響を与える疾患の処
置のための請求項１４または請求項１６に記載の医薬調
製物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT41538A90 | 1990-02-27 | ||
| IT41538A IT1239271B (it) | 1990-02-27 | 1990-02-27 | Processo per l'espressione del fattore di crescita nervoso umano in cellule di artropoda frugiperda via infezione con baculovirus ricombinante |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05103666A true JPH05103666A (ja) | 1993-04-27 |
Family
ID=11250839
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3058439A Pending JPH05103666A (ja) | 1990-02-27 | 1991-02-27 | ヒト神経成長因子を発現させるための方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JPH05103666A (ja) |
| KR (1) | KR910021478A (ja) |
| HU (1) | HUT56881A (ja) |
| IL (1) | IL97324A0 (ja) |
| IT (1) | IT1239271B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| DE69330809T2 (de) * | 1992-06-08 | 2002-05-16 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Therapeutisches Agens für Neutropenie |
| AU5001793A (en) * | 1992-08-12 | 1994-03-15 | Bays-Brown Dermatologics, Inc. | Method of decreasing cutaneous senescence |
| US5618544A (en) * | 1992-08-12 | 1997-04-08 | Bays-Brown Dermatologics, Inc. | Method of decreasing cutaneous senescence |
| US6541447B1 (en) | 1999-09-01 | 2003-04-01 | B & M Healthcare Technologies, Inc. | Wound healing composition and method for use thereof |
| FR2825273B1 (fr) * | 2001-05-29 | 2006-11-24 | Oreal | Composition pour le traitement des signes cutanes du vieillissement |
| IT1394690B1 (it) | 2008-10-23 | 2012-07-13 | Carli De | Metodo di trattamento dermocosmetico della cute mediante applicazione di composizioni contenenti ngf. |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK161152C (da) * | 1983-03-03 | 1991-11-11 | Genentech Inc | Polypeptid med egenskaber som human beta-nervevaekstfaktor og fremgangsmaade til fremstilling deraf, dna-isolat omfattende en sekvens som koder for polypeptidet, replicerbar udtrykkelsesvektor for dna-sekvensen, rekombinant vaertscelle transformeret med vektoren, farmaceutisk praeparat indeholdende polypeptidet og fremg. der omfatter anvendelsen af polypeptidet til fremst. af et farmaceutisk praeparat |
| US4745051A (en) * | 1983-05-27 | 1988-05-17 | The Texas A&M University System | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
| US5272063A (en) * | 1988-11-22 | 1993-12-21 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Process of making human nerve growth factor |
-
1990
- 1990-02-27 IT IT41538A patent/IT1239271B/it active IP Right Grant
-
1991
- 1991-02-21 IL IL97324A patent/IL97324A0/xx unknown
- 1991-02-26 HU HU91643A patent/HUT56881A/hu unknown
- 1991-02-27 KR KR1019910003157A patent/KR910021478A/ko not_active Application Discontinuation
- 1991-02-27 JP JP3058439A patent/JPH05103666A/ja active Pending
- 1991-02-27 EP EP19910102935 patent/EP0444638A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT1239271B (it) | 1993-10-01 |
| IT9041538A1 (it) | 1991-08-27 |
| IL97324A0 (en) | 1992-05-25 |
| HUT56881A (en) | 1991-10-28 |
| EP0444638A2 (en) | 1991-09-04 |
| IT9041538A0 (it) | 1990-02-27 |
| EP0444638A3 (en) | 1992-01-08 |
| HU910643D0 (en) | 1991-09-30 |
| KR910021478A (ko) | 1991-12-20 |
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