JPH04506605A - トランス活性化作用を有するタンパク質、前記タンパク質を発現させるベクター、セルラインおよびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 トランス活性化作用を有するタンパク質、前記タンパク質を発現させるベクター 、セルラインおよびその使用本発明は新規な精製ポリペプチド、このポリペプチ ドを発現させるベクター、このポリペプチドに対する遺伝子、このポリペプチド の産生方法、およびこのポリペプチドの使用に関する。

特に、この遺伝子および遺伝子産物は、所望の遺伝子産物の発現を増加させるた めに使用され得る。

ヒト免疫不全’）イ）Ｉス（ＨＩＶ−１；ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　Ｉ、ＬＡＶまたは ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　Ｉ／ＬＡＶとも称されル）ハ、後天性免疫不全症候群（ＡＩ ＤＳ）および関連疾患の病因であるは、無症候状態が長く続いた後、免疫系およ び中枢神経系が段階的に変性することである。ウィルスの研究から、複製が高度 に調節されること、並びにＴ−リンパ球のＣＤ４陽性ヘルパーサブセツトの潜伏 感染と溶菌感染が顧織培養物で生ずることが認められる［ｚａｇｕ＋７ら、５ｃ ｉｅｎｃｃ　２３１　＋８５０−８５３（１９８６）コ。病気の間感染ウィルス の力価は低いままであるので、感染患者におけるウィルスの発現は調節されてい るようにみえる。ＨＩＶ−■の複製およびゲノム組織化の分子研究から、ＨＩＶ −１は複数の遺伝子をコードすることが判明した［Ｒａｔｎｅｒら、Ｎａｔｕｒ ｅに共通である。しかしながら、ゲノムは多くのレトロウィルスらの文献の記載 内容は参照により本願明細書に含まれるものとするコ。他の遺伝子ｖｐｒも同定 されたが、その作用は知られていない［Ｗｏｎｇ−３ｊｕｌ、　Ｆ、ら、ＡＩＤ Ｓ　Ｒｅｓ、ａｎｄ　Ｈ’１ｌｌｌｌ！ＩＩ　Ｒｅｔｒｏ−ｙｉｒｕｓｅｓ　３ 　：　３３−３９（１９８７）　、この文献の記載内容は参照により本願明細書 に含まれるものとする］。

他のレトロウィルス、すなわちＨＩｖ−ＩＩおよびＳｉａ＋ｉａｎ免疫不全ウィ ルス（ＳＩＶ）（以前は５ＴＬＶ−１１１と称され機能性遺伝子、その発現産物 およびその特性を調べることは、ウィルスの生活サイクルを理解する上で重要で ある。

更に、所望の産物の発現を増加させるべく広範囲の発現系で使用され得る遺伝子 および／または遺伝子産物が望まれている。

発明の要旨 今回、我々は広範囲の発現系で所望の産物の発現を増加させるべく使用され得る 新規なタンパク質を発見した。このタンパン質は、トランス活性化作用を与える ために十分な数の下記アミノ酸 ｕｃｃｑＨｓｓｕｃｖｒｑｑｉｕｔａｕａａｓｕ活性化作用を有するタンパク質 をコードするために十分な数の、ＨＩＭ株ＢＲＵ、ＭＡＬおよびＥＬＩのＲ読み 取り枠に対応するヌクレオチドに対応することが好ましい。

トランス活性化作用を有するタンパク質をコードするために十分な数の、ＨＩＶ 株ＢＲＵＳＭＡＩ、およびＥＬＩ（７）Ｒ読み取り枠に対応するヌクレオチドに 対応するヌクレオチドセグメントを含む発現ベクターを構築することが可能であ る。このベクターは十分な数の全（ｅｎｔｉｒｅ）　ＨＩ　Ｖゲノムに対応する ヌクレオチドを含まない。好ましくは、ベクターは本質的にｒａｐミルタンパク 発現させるに必要なヌクレオチドセグメントと配列から構成される。

ｖｐ工ベクターは安定なりｐｒセルを作成するためにセルラインをトランスフェ クトするために使用され得る。

上記したヱλｉ−ベクターは所望の異種遺伝子産物の産生を増加させるために使 用され得る。これは、所望の異種遺伝子産物を含む予選択の（ｐｒｅ−ｓｅｌｅ ｃｔｅｄ）セルラインをヱλゴーベクターを用いてトランスフェクトするか、ま たは予選択のセルラインをヱλニーベクターと所望の異種遺伝子産物を含む発現 ベクターを用いてトランスフェクトするか、または所望の異種遺伝子産物をも含 む１旦」、ベクターを使用し予選択のセルラインを該ベクターを用いてトランス フェクトすることにより達成され得る。

或いは、工且エセルラインをトランスフェクトして異種遺伝子発現を増加させる ために所望の異種遺伝子を含む発現ベクターを使用することもできる。

ある。

第２図は、ＨＩＶ株　ＨＸＢｃ２．ＢＨ５，ＢＨＩＯ，ＢＲＵ及びＥＬＩから誘 導される転写発現体の構築を示す図である。

第３図は、活性ヱλゴー蛋白質を発現することができるヌクレオチド断片の構築 を示す図である。

第４図は、公表されたＨＩＶ配列から推定されるｖｐｒ−蛋白質のサイズを示す 図である。

第５図は、数種のＨＩＶ株のｖｐ工蛋白質の推定アミノ酸配列を示す。

第６図は、数種のＨＩＶ株由来の３５８−メチオニン標識蛋白質の免疫沈降を示 すオートラジオグラムである。

子のウィルスによってトランスフェクトされた細胞とにおける細胞増殖率及びシ ンシチウム形成の比較である。

第９図は、異種遺伝子の発現に及ぼす活性１１工蛋白質の作用を示すグラフであ る。

第１０図は、異種遺伝子の発現に及ぼす活性ｖｐ工蛋白質の作用を示すグラフで ある。

第１１図は、ウィルス上清中の３５８−システィン標識蛋白質の免疫沈降物を時 間に対して示したオートラジオグラムである。

第１２図は、細胞溶解物中の３５８−システィン標識蛋白質の免疫沈降物を時間 に対して示したオートラジオグラムである。

第１３図は、ヱλ１−　又はｖｐｒ−遺伝子でトランスフェクトされた培養物中 の逆転写酵素を示す。

発明の詳細な説明 本発明者らは、活性型のｖｐ工蛋白質及びその活性型蛋白質を発現する遺伝子を 発見した。

この蛋白質は、トランス活性化作用（ｔｒｘｎｓｔｃｊ川ｔｔｎｇ　ｅ用ｃｔ） をもつウィルス蛋白質をコードするのに十分な数の、ＨＩＶ又はＳＩＶ株（総称 的にＨＩＶと呼ぶ）のＲオープンリーディングフレームのヌクレオチドに相当す る遺伝子によって発現される。好ましくは、該ヌクレオチドは、ＨＩＶ−１株Ｂ ＲＵ。

ＭＡＬ又はＥＬＩのＲオーブンリーディングフレームに相当する。

二豆工遺伝子は、ｖｉｆ遺伝子の一部及び１見工遺伝子の第１エキソンと重なり 合っている。第１図を参照せよ。この遺伝子は、公知のスプライス受容体部位、 及び、制限エンドヌクレアーゼを使用するような標準技術を利用することによっ て、ＨＩＶゲノムから容易に切り出すことができる。あるいは、この配列に基づ いて合成ヌクレオチド配列を調製することが可能である。

トランス活性化の性質をもつ蛋白質は、一般に、１５ｋＤ蛋白質である。この蛋 白質は、活性ウィルス蛋白質Ｒ又はｒａｐ蛋白質と呼ばれている。好ましくは、 ｒａｐ蛋白質は、Σ５＞ス活性化機能をもつのに十分な数の、ＭＥＱＡＰＥＤＱ ＧＰＱＲＥＰ）ＩＮＥＷＴＬＲＬＬＥＥＬＫＮＥＡＹＲＨＦ　ＰＲＩＷＬＩＩＧ ＬＧＱＩＩ　ＩＹ　ＥＴＹＧＤＴＷＡＧＡ　ＥＡ　Ｉ　ＩＲＩ　ＬＱＱＬＬ　Ｆ 　ＩＨＦＲＩfｃＱＨ ３ＲＩＧＶＴＱＱＲＲＡＲＮＧＡＳＲ３に対応するアミノ酸を有する。該蛋白質 のトランス活性化特性に影響を及ぼさないアミノ酸の置換体、欠失体及び／又は 付加体は−ｒａｐ−蛋白質と呼ばれる。例えば、第５図に示されるＢＲＵ及びＥ ＬＩの蛋白質はともに、トランス活性化の性質を有する。但し、これら２つの株 の間にはアミノ酸置換がいくつか存在していた。同様に、出発Ｍｅｔの欠失は、 Ｌ１λ蛋白質のトランス活性化機能に影響を及ぼさないだろう。

この性質は経験的に容易に決定することができる。例えば、機能性ｒａｐ蛋白質 を発現すると考えられているヌクレオチ配列でトランスフェクトされた細胞中で の特定の異種遺伝子、好ましくはマーカーの遺伝子の発現と、欠陥のあるｖｐｒ 配列、例えば該Ｒオープンリーディングフレーム内の１２０ヌクレオチド付近に 停止コドンを有する配列、をもつ相同遺伝子のベクターによってトランスフェク トされた細胞中での前記異種遺伝子の発現との比較によって決定できる。

該細胞中での異種遺伝子の発現を欠陥叉」コー配列と比較すると、機能性−ｒａ ｐ−蛋白質によって結果的に少なくとも異種遺伝子発現のダブリングが生じる。

フレームによって特定される蛋白質の存在は、この領域にまたがる保存されたオ ープンリーディングフレーム（Ｒと称する）の存在によって、及び、このオープ ンリーディングフレームによって特定されるものとして予言された蛋白質を認識 する、焼入かのＨＩ　Ｖ−１感染患者体内での抗体の存在によって推定された。

そのような抗体は、ＨＩＶ−１感染患者全ての血清中に見出されたわけではなか った。その後、ｖｐ工遺伝子配列がほとんどノＨＩ　Ｖ−Ｉ及びＨＩＶ−１１分 離株中に、並びに、ＳＩｖＡＧＭ分離株ではそうではないがＳＩｖＭＡｃ分離株 中に無傷で存在することが報告された。報告されたヌクレオチド配列に基づいて 、ｌｏｎｇ−１１ｇｉｌらは、ＢＨＩＯ，ＢＨ５，ＨＸＢ−２及びＨ９株は７７ 番目のアミノ酸の後に終止コドンを含むこと、ｐマ 一方、ＢＲＵ、ＡＲＶ、ＨＡＴ−３，ＥＬＩ及びＭＡＬ株はフレームシフトの精 巣としてさらに１８又は１９アミノ酸を発現することができることを示した。Ｈ ＸＢ−２及びＢＨＩＯ由来のＲ遺伝子はウィルス蛋白質を産生ずるのに十分なも のであるべきであることも報告された。この報告に基づいて、この遺伝子により 発現される蛋白質の機能を決定しようと試みられたが、胞毒性を示した。

しかしながら、本発明者らは、多くのＨＩＶ株に関して報告された配列がそのヌ クレオチド配列に明らかに誤りを含むことを見出した。

従って、これらのＨＩＶ株は活性型のｒａｐ蛋白質を産生ずると考えられてきた が、それらは実際Ｒオープンリーディングフレーム中に早期（ｐｒｅｍｍｊｕｃ 　）終止コドンを含むことから、それらのＨＩＶ株は該蛋白質を産生じない。そ れ故、多くのＨＩＶ株は、この領域中に機能性蛋白質をコードする能力をもつよ うに思われるけれども、それらは早期に該蛋白質を終止させる突然変異を受ける ために、それらのＨＩＶ株はそのような能力をもたない。

意外にも、本発明者らは、ウィルスの増殖には不要であるが、ｖｐｒ蛋白質はト ランス内で（ｉｎ一旦ｘｎｓ　）蛋白質の発現を増強するための能力を有するこ とを見出した。従って、本発明者らは、機能性ウィルス蛋白質を、その最初の名 称（工」１−及びＲオープンリーディングフレーム）に言及して、及び、この遺 伝子によって付与される表現型、即ち迅速な増殖、を示すためる。

該オープンリーディングフレームに相当するヌクレオチドに対応するヌクレオチ ド断片を含むだろう。このヌクレオチドは、ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−Ｉ＋又は５Ｉ Ｖ（総称的１．：ＨＩＶと呼ぶ）由来のＲ領域に相当する。ＨＩＶ−１のＢＲＵ 、ＭＡＬ又はＥＬ１株のＲオープンリーディングフレームに相当するヌクレオチ ドが好ましい。このベクターは、ＨＩＶ又はＳＩＶゲノム全体に相当するヌクレ オドを含まない。好ましくは、該ベクタ様において、ＨＩｖ及びＳＩＶゲノム由 来のヌクレオチドに相当する前記ヌクレオチドは、本質的に活性１１工遺伝子に 相当するヌクレオチドから成る。このヌクレオチドはＲＮＡであっても、また、 ＤＮＡであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。

ヱλ１−ベクターは、この分野で周知の標準技術によって調製することができる 。例えば、ｖｐｒベクターは、活性ｖｐ工遺伝子と、この遺伝子の下流（３′） のポリアデニル化配列と、ｖｐ工遺伝子の発現を可能にするプロモーターとを含 むように構築することができる。例えば、公知の発現ベクターを用いて、適切な スプライス受容体及び供与体部位並びに適切な制限エンヌクレオチド断片を挿入 することができる。ベクターはまた、複製起点を含むのが好ましい。該ベクター 中に含まれるプロモーターは、公知のプロモーターのいずれであってもよく、そ の選択は、使用を望む宿主細胞に支配される。そのようなプロモーターには、Ａ ＫＶ、５Ｌ３−３及びＦｒ１ｅｎｄウイルスノようなレトロウィルスプロモータ ーが包含される。レトロウィルスプロモーターの使用が好ましい。ベクターはま た、エンハンサ−を含むこともできる。そのようなエンハンサ−は、この分野で 公知であり、例えばウィルスエンハンサ−が挙げられる。ベクターは、組織特異 的なエンハンサ−を含むのが好ましい。より好ましくは、エンハンサ−はプロモ ーターと同じ種類のものである。

ている。従って、この蛋白質を用いて、例えばクロラムフェニコールアセチルト ランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子産物のような所望の異種遺伝子産物の発現を 刺激することが可能である。

た、それと同時トランスフェクトされるベクター上にある異種遺伝子、及び、す でに細胞内に存在する異種遺伝子の発現を刺激するだろう。あるいは、安定な− ｒａｐ−細胞系を作って、それらの細胞系を、所望の異種遺伝子を含むベクター でトランスフェクトすることも可能である。このトランスフェクトされた細胞を 培養した後、所望の蛋白質を集める。所望の蛋白質を得るために用いられる特定 の方法は、発現されるべき特定の所望の蛋白質が何であるかに依存するだろう。

このように、機能性ｒａｐ蛋白質は、広範囲の発現系で異種遺伝子の発現を大い に刺激した。このような系には、レトロウィルスプロモーター、ウィルスプロモ ーター又は細胞プロモーターの制御下での異種遺伝子の発現をもつものが含まれ る。例スフエクションされている対照細胞と比較して、数種の異な本細胞系内で の発現を３〜８倍の範囲で増強した。そのヌクレオチド配列が、機能性ｒａｐ蛋 白質を発現するのに十分な数の、ＥＬＩ株由来のヌクレオチドに相当し、Ｒ３Ｖ 　ＬＴＲに対しＩｎ＋ｋｔｊ細胞中に同時トランスフェクトされた活性１１工遺 伝子を含むベクターは（第７図参照）、対照ベクターと比較したとき、下記第１ 表に示す結果を与えた。

エンハンサーープロモーター　−Ｖ　ｐ　ｒ　＋　Ｖ　ｐ　ｒ　ＥＬ　１（レト ロウィルス） ＨＩＶ−１１３−４ ＨＩ　Ｖ−２１３ ＳＬ３　１　１０ Ｒ８Ｖ　１　８ ＨＴＬＶ−１１３ （ＤＮＡウィルス） ＣＭＶ　１　３ ＳＶ４０　１　３ （細胞調節領域） ｃｆｏｓ　１　２ ＩＬ２−Ｒ−Ｈｙｂ、　１　５ 第１表によって実証されるように、ｒａｐ蛋白質は、例えば細胞型特異性の全く ないウィルス（レトロウィルス及びＤＮＡウィルスの両方）及び細胞プロモータ ーのような多様なエンハンサーープロモーターの制御下での異種遺伝子発現作用 を刺激ができる。９０％以上の純度、より好ましくは９５％以上の純度を得るこ とができる。

の取り込み能力やその発現能力が異なっているかもしれない。

しかしながら、適切なプロモーターを用いることによって、広範囲の細胞を好適 に使用することが可能である。例えば、Ｒａｊｉ細胞、ＨＵＴ７８細胞、Ｊｕｒ ｋａｔ細胞、ＨｅＬａ細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞が好ましい。ヒトＴ細胞及びＢ 細胞が一般に有用である。典型的には、哺乳動物細胞が好適であろうが、本発明 の細胞系はこれに限定されない。

ベクターはまた、形質転換細胞の検出を助けるためのマーカー遺伝子を含む。こ れには、真核細胞において抗生物質Ｇ４１８に対して主要な選択可能な耐性を付 与する細菌性ネオマイシン（ｎ　ｅ　ｏ）耐性遺伝子のような抗生物質耐性遺伝 子が含まれる［５ｏｕｔｂｅｒｎと　Ｂｅｒｇ、Ｊ、Ｍｏ１．　＾ｐｐｌ、Ｇｅ ｎｅＬ　１　：　３２７〜３４１　（１９８２）］。該ベクターを用いて、例え ばｐｓｉ／２（エコトロピック）及びｐｓｉＡＭ（アンホトロピック）細胞系中 に導入することにより、リン酸カルシウム共沈殿法によって細胞系を形質転換す ることができる［Ｗｉｇｌｅｒら、　Ｃｅ１ｌ　１６　：　７７７〜７８５（１ ９７９）］。これらの細胞系は、構成的に、ウィルス転写体をパッケージするこ とができないマウス白血病ウィルス蛋白質を生８４）；　Ｍａｎｎら、　Ｃｅ１ ｌ　３３　：　１５３〜１５’９　（１９８３）］　。ｖ　ｐ　ｒ配列及びネオ マイシン耐性配列を含むベクターからの転写体をマウス白血病ウィルス粒子内に パッケージングするような改変をベクターに施すことが可能である。トランスフ ェクションして２日後、マーカーを探すことによって、即ち抗生物質Ｇ４１８を 用いることによって細胞を選択することができる。Ｇ４１８耐性Ｇ４１８耐性の ｐｓｉ２及びｐｓｉＡＭクローンを単離し、多量のマウスウィルス粒子を産生ず るクローンを選択して、テスト細胞を感染するために使用する。次に、これらの 細胞を標準培地中で培養し、必要なものを採集する。

り所望の蛋白質の発現を増強することが可能となろう。

とを区別することが可能である。他の抗体もまた作ることがでち、これを用いて 抗体を作ることができる。得られる抗体は、計画される特定の用途に応じてポリ クローナルであっても、モノクローナルであってもよい。そのような抗体は、当 業者に周知の確立された技術によって調製することができる。例えば、キーホー ル・リンペ・ソト俸ヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）にオリゴペプチドを結合したり 、また、ウサギのような動物にそのオリゴペプチドに対する抗体を作らせること も可能である。典型的には、約２週間の期間、ペプチド−ＫＬＨ接合体を数回注 入して抗体を作る。次に、標準技術によって血清から抗体を集める。

あるいは、ハイブリドーマ細胞を形成するための標準融合技術を用いることによ って、該蛋白質に対する抗体を生成する細胞中でモノクローナル抗体を作ること も可能である。一般に、これは、ミエローマ細胞のような不死化細胞系と、抗体 産生細胞とを融合してハイブリッド細胞を調製することを含む。

ｖｐｒ蛋白質のアッセイは、標準技術を用いて行うことができる。例えば、予め 決められたサンプル、即ち生物学的検体をテスト用に採用したり、また、ｖｐｒ 蛋白質のＮ末端部分に抗体を付加することができる。モノクローナル抗体を用い ることが好ましい。次に、反応があるかどうか、即ち、抗体と抗原の間で複合体 が形成されるかどうかを決定するために、該サンプルをスクリーニングする。あ るいは、公知のイムノアッセイ法を用いて、例えば、競合イムノアッセイ又はイ ムノメトリック（サンドイッチ）アッセイを用いて、該ウィルス蛋白質の抗原決 定基に対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれかを用いてア ッセイすることができる。

以下の実施例により本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明の理解 を助けるために提供されるものであり、これに限定されないと解釈されるべきで ある。

実施例 活性タンパクをコードする弘遺伝子の能力は、Ｍｅｌｊｏｎ、Ｄ。

Ａ、ら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、１２：　７０３５−７０５６　（１９ ８４）の方法を用いて、生体外網状赤血球トランスレーション溶解物（ＩＨｔｊ ｅ）　［Ｐｅｌｈａｍ、　Ｈ，Ｐ、Ｂ、ｅｌ　ａｔ、、［！ｏｒ、Ｊ、　Ｂｉａ ｃｈｅｍ、６７：　２４７−２５６　（１９８６）］を生体外で調製したＲＮＡ でプログラミングすることにより試験した。この実験のためのテンプレートはＳ Ｐ６バクテリオフアージＲＮ＾ポリメラーゼプロモーターに対して３°に位置す るＨＸＢｃ２プロウィルス［Ａ＋１ａ９１Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９：　６９−７ ３　（１９８５）コのフラグメントに由来した。図２に示すように、このＲＮＡ 転写物に存在するウィルス、・−ケンス（配列）は、料りのＣ−末端ｆ４９９３ 位の５ｔｕ１部位）からｅｎｖ−のＮ−末端（５９３４位のＫｐｎ１部位）まで 延びている。プラスミドを直鎖化するために用いた内部制限部位を矢印で示す。

１？ＮＡ−由来のフラグメントを用いて生体外溶解物中で製造された夕、・バク は、３５Ｓ−メチオニンでラベルし、５Ｏ９−ＰＡＧＥを用いて大きさで分離し た。

プラスミドは、）ＩＩＶ　インサートに対して３′のポリリＸＢｃ２ ンカーにおけるＥＣｏＲｌ部位で消化することにより直鎖化し、［Ｐｅ１ｌｅｆ ｔｕ、１．及びＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、　Ｎ、、　Ｃｅ１ｌ　４０：　５１５−５ ２６　（１９８５）１の記載と同様に、５Ｐ６ＲＮ＾ポリメラーゼによる生体外 での転写用のテンプレートとして使用した。ただし、ＧＴＰ及びＣａｐ類縁ｗ７ ＧｐｐｐＧの濃度は、それぞれ０．２及び１．１１ｍＭに上げた。

メツセンジャーＲＮＡは　［５−”ＨＩＧＴＰでラベルし、記載のように精製し た。等モル量のＲＮＡ　（等量の放射能）の生体外でのトランスレーションは、 網状赤血球の溶解物中で行った［Ｐｅｌｈａｍ。

Ｈ，Ｐ、　Ｂ、　、　ら、Ｅｕ「、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、６７：　２４７− ２５６　（１９８６）］　、インキュベーションは、３５Ｓ−システィンの存在 下に、３０℃で３０分間行った。ラベルした生成物は直接、１５ＸＳＤＳ−ＰＡ ＧＥにより分析するか、又は予め、遊離の免疫ウサギ血清で免疫沈殿した［Ｌｅ ｅυリー抗血清は、ｖｐ＋−アミノ酸配列のＮ−末端部分の最初の１９個のアミ ノ酸に対応するオリゴペプチドを用いることによって作られた。このアミノ酸配 列は、ＨｌｖのＢＲＵサブストレインが作られると予見される■Ｌタンパクに対 応した。得られたペプチドはキーホールリンベットヘモシアニン（ＫＬＨ）　と 複合され、３匹のウサギの中で抗体を作るのに使用した。標準的な方法を用いて 、抗原の多重注入がなされた。その後、ウサギは、オリゴペプチドを認識する抗 体が産生されたことを示した。

生体外で作られたＲＮＡはユ、皿とｒｅｗの最初のエクソン、ることはできない 。

本発明者らは、他の旧■ウィルス株からの同じセクションに対応するテンプレー トを用いて、上記の手順を追試した。使用したウィルス株はＢｌ（５，ＢＩＩＩ Ｏ，ＥＬＩ及びＢＲＵであった。これらの株中で生体外で作られたＲＮＡは、こ れらの株のいくつかがｖｐｕドする能力を有することを除いて、ＨＸＢｃ２での それと同じ能力を持っていた。

これらの株の予見されたｖｐ＋タンパクを図４に示す。これらの株のこれらのタ ンパクの予見されたアミノ酸配列を図５に示す。ダッシュは同一のアミノ酸配列 を指している。

ＨＩＶのＥＬＩ、　ＭＡＬ及びＢＲＵ株の領域に対応するＲＮＡのトランスレー ションは、抗ｖｐｏ、　抗血清によって認識された１５ｋＤのタンハクヲ作ル。

図６は、ソレソれＨＸＥｃ２．　ＢＨ３，ＢｔｌｌＯ及びＥｌ、１株での免疫沈 殿された生成物のオートラジオグラムを示す。ＨＸＢｃ２゜Ｂｌ５．　ＢＨＩＯ 及びＥＬＩ（７）Ｌ／−：／Ｉは全体を示す。ＨＸＢｃ２．　Ｂｔｌｌｔｌ　及 びＥＬＩのレーン２はプレ免疫血清を示す。Ｂｌ５のレーン２は血清及び抗血清 を作るために用いた合成ペプチドを示す。ＨＸＢｃ２、ＢＨＩＯ及びＥＬＩのレ ーン４は！ペプチド抗血清及びペプチドを示す。ＥＬＩのレーン３は１５に′Ｄ のペプチドが作られたことを示す。ＢＨＩＯ及びＢ）１５由来の類似のＲＮＡの トランスレーションは８ｋＤ及び５ｋＤのポリペプチドを与えた（それぞれ、レ ーン３及び２）。ｔｌＸＢｃ２由来のＲＮＡのトランスレーションは検知しつる 量のタンパクを与えなかった（図６のレーン３）。このデータは報告された配列 に基づいて予見されるデータと一致しない。

図４及び５を参照されたい。これは、ＢＨＩＯ株がと１−転写解読枠に未成熟な 停止コドンを含むためであろうと思われる。Ｂｌ（１０゜ＥＬＩ、ＢＲｌｌ及び ＭＡＬのマｐｒ遺伝子のヌクレオチド配列の比較は、Ｂｌ（１０配列に１つのＴ が挿入されたことを示している。これは、停止コドンが存在する他の枠への枠シ フトを引き起こすであろう。したがって、）ＩＩＶ−１の多くの株が１５ｋＤタ ンパクをコードする能力を有すると思われるが、多くのプロウィルスクローンは 実際にはこの能力を持たないと考えられる。

ＨＩＶ−１の１１ＩＢ株のＨＸｆｌｃ２プロウィルスの■しタンパクは、タンパ クの発現を阻害する２つの広く分離された塩基の変化を有するため、１５ｋＤタ ンパクの発現のためには欠陥があると考えられる。同様に、ＢＨ５Ｖｌｌ＋遺伝 子もまた、文献記載の配列データとは異なってタンパクの未成熟状態での停止に 導く　２ケ所の突然変異を含んでいると考えられる。ＢｉＩ３の生体外トランス レーション生成物は５ｋＤマーカーよりも早いと思われ、そこで文献記載のもの よりも上流におそらくは停止コドンが存在することを示している。すなわち、驚 くべきことに、本発明者らは、ＷＯｎｇ−Ｈａａｌの報告とは反対に、ＢＲＵ、 　ＥＬＩ及びＭＡＬ株は枠シフトを有しておらず、また、ＢＨＩＯ，Ｂｌ５．　 ＨＸＢｃ２株と同じく同一のタンパクを発現せず、むしろ、機能性タンパクを発 現するということを見い出した。

二領域を除いて相同遺伝子のプロウィルス対は、バックボーンとしてＩＩＸＢｃ ２プロウィルス及びＩＩＲＵプロウィルスからのｙｐｒ−遺伝子を含むフラグメ ントを用いて構築された。図３を参照されたい。）ＩＸＢｅ２組換え体（ＩＩＸ ＢＲＵ）中の■Ｌ領領域、」虹（ＥｃｏＲｌ、　４２３４）のＣ末端からＩＩＲ Ｕの−ｅｎｖ　（Ｋｐｎｌ、　５９３４）のＮ末端まで延びている。図３を参照 されたい。アミノ酸４０に停止コドンを導入する、ＮＣ０Ｉ枠シフト突然変異が 誘導されて、−υ弘−相同遺伝子組換え体、ＨＸＢＲＵ　ｙｐｒ−が生じた。

すべてのプラスミドは標準的な手法により、製造業者の教示にしたがって制限酵 素及び修飾酵素を用いて作製した。ＨＩＶ転写体は標準的な手法によりこれらの ベクターに挿入した。ジャーカット細胞はＤＥＡＥ−デキストリン法により１０ μｇの試験するプラスミドを用いてトランスフェクトした。

次いで、培養物を、全細胞数及び巨大多核細胞、シンシチウムの出現についてモ ニターした。細胞数についてウィルス複製について観察された。図８を参照され たい。図８のグラフにおいて、四角印を付したラインは正常細胞のものであり、 この細胞はどのプロウィルスでもトランスフェクトされていない。三角印を付し たラインはｖｐ＋プロウィルスでトランスフェクトした細胞の時間の経過に対す る細胞増殖を示している。一方、丸印を付したラインはニーウィルス（ＨＸＢＲ ＩＩ　ｙｐｒ−）でトランスフェクトした細胞の細胞増殖を示している。

すべての細胞培養物において、細胞数は通常トランスフェクション後、５日間の 間増加した。次の３日間（８日目）に、の場合に比べて著しく低かった。１１１ 日目でに、全細胞数は数は、６日目から９日目にかけて増加し続けた。

大きな多核巨大細胞の出現の速度論的挙動における差異も、」Ｃ及びユ１ウィル スで感染した培養物において認められた。トランスフェクション後２日以内に、 ニーウィルスで感染した培養物中で、シンシチウムが最初顕著であり、３〜５日 目までに最高に達し、９〜１１日目までにはほんの少しのシンシチウムが残存す る状態となった。これに対して、ニープロウィルスで感染した培養物中ではシン シチウムの数は５〜９日目の間で最大となった。１２２日目でに、マｐｒ＋ウィ ルスで感染した培養物中ではシンシチウムは全く残っていなかった。し遺伝子と その遺伝子産物は細胞毒性活性には必要ではないが、細胞毒性効果のタイミング に影響を与えることが判った。

ウィルス粒子の製造に対する活性■Ｌタンパクの効果を、主たるウィルスキャプ シドタンパクである１１２４及び細胞外ＲＴのレベルによって測定したと同様に 、上溝中に放出されたウィルス量によって測定した。細胞をペレット化し、上清 中に存在するＲＴ及びｐ２４に付随するライロン（ｖｉ＋ｏｎ）の量を標準的な アッセイ法を用いて測定した。図１３は、−５μ　遺伝子で感染した培養物中で 、逆転写酵素はトランスフェクション後３日までに検出され、３〜４日後にピー クに達するが、ウィルスの製造は１２ないし１３日までには極端に低下したこと を示す。反対に、−リ」−プロウィルスでトランスフェクトした細胞中では、逆 転写酵素は５日目に培養物中で検出された。１２ないし１３日においてもかなり の量の製造されたウィルスが存在した。ｐ２４アッセイから得られたデータはこ れらの結果と極めてパラレルな関係にあった。ニープロウィルスの製造において 、再び、ラグが認められた。図１３において、三角印を付したラインは３５Ｓシ ステインでラベルしたタンパクをＡＩＤＳ患者の血清で免疫沈殿することにより 、ウィルス特異的タンパクの発現プロフィールをトランスフェクション後の様々 な日に測定した。図１１及び図１２を参照されたい。３日目には、ｇｐ１６０． 　ｇｐ１２Ｑ、ｐｓ５゜ｐ２４及びｐ１７を、ｙｐｒ　プロウィルス（ＨＸＢＲ Ｕ）で感染した細胞から免疫沈殿することができる。ｖｐｒ−プロウィルスで感 染した細胞中には、３日目にウィルスタンパクは全く検出されなかった。

細胞溶解物及びウィルス上清の両方において、早い時点で、」！プロウィルスで 感染した培養物中に比べて、より多くの作られた。したがって、これらの実験か ら、活性なりｐｒ遺伝子（」且）は、ウィルスに急速増殖のフェノタイプを与え るタンパクを製造することが分かった。

活性なｒａｐ　（ｖｐｒ　）発現ベクターを標準的な手法を用いて作製した。こ のベクターは、機能性ｒａｐミルタンパク現するのに十分な数の旧ＶのＥＬＩプ ロストレインの■二ヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含むＩＩＮＡフラグ メントを有していた。

このフラグメントは、図７に示したプラスミド中のＲＳＶ　ＬＴＲに対して３° 　にクローニングした。このプラスミドはまた、５１４０ポリアデニル化シグナ ルを含んでいた。ｖｐｒ−配列は示した部位で、発現ベクターに挿入した。ＨＩ Ｖ　ＬＴＲをＲ３Ｖプロモーターで置換した点を除いて実質的に同一の発現ベク ターが、ＲＯＩｅＩｌら、ＰＮＡＳ　８５：　２０７１−２０７５　（１９８８ １に記載されている。対照プラスミドもまた、停止コドンが５１７１部位（３５ アミノ酸）の■Ｌ読み取り枠に挿入されていることを除いて同じプラスミドを用 いて作製した。このプラスミドは、他の旧Ｖタンパクを発現するのに十分な数の 旧Ｖ遺伝子の他のタンパクに対応するヌクレオチドを含まない。

Ｇｏｒｍａｎら、Ｍｏｌ、　Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　２：　１０４４　（１９８ ２）に記載のようにＣＡＴ遺伝子を含むＰＳＶ２ＣＡＴ−に基づくプラスミドを 作製した。図７の下の部分を参照されたい。このプラスミドはＳＶ４０ポリアデ ニル化シグナル及びエンハンサ−を含んでいた。使用したエンハンサーープロモ ーターは表１に示したように置き換えた。−例では、それは、Ｇｏｒ＋ｏｎらに 記載のＳＶ４０エンハンサ−ブロモターを含んでいた。以下のエンハンサーープ ロモーターを標準的な手法を用いて、この部位でプラスミドに挿入した：Ｈ！Ｖ −１．　ＨＩＶ−２，ＳＬ３．　ＲＳＶ、　ＨＴＬＶ−１，ＣＭＶ、　ｃｏｏｓ 、ＩＬ−２−Ｒ−Ｈ７ｂ　０マｐｒ＋遺伝子の活性転換能を以下のようにして測 定した。ジャーカット（Ｊｏ＋ｋａｔ）細胞をＤＥＡＥ−デキストラン法により 、１０μｇのＣＡＴプラスミドと、１０μｇの」■　遺伝子を含むプラスミド（ Ｒ発現プラスミド）かもしくはＩＯμｇの一リュー遺伝子を含むプラスミド（対 照プラスミド）のいずれかとを用いてコトランスフェクトした。トランスフェク ションの４８時間後、Ｇｏｒｔａｘｎ本明細書に含ませる）に記載のように、細 胞溶解物をＣＡＴ酵素活性についてアッセイした。表１のデータで示したように 、ｗｐｒ−ベクターはＣＡＴの発現を増進する。ＨＩＭ　ＬＴＩＩに導かれたＣ ＡＴ遺伝子の発現は、対照の発現体（エクスプレッサー）に比べて、活性■Ｌ遺 伝子の存在下で３〜４倍増大した。図９を参照されたい。三角印を付したライン はＲ発現プラスミドでトランスフェクトしたジャーカット細胞を示し、一方、丸 印を付したラインは対照プラスミドでトランスフェクトしたジャーカット細胞を 示している。ＣＡＴ発現や同じような増大は、上記の方法をｆａｔ細胞を安定に 産生ずるジャーカット細胞中で行った場合に見い出された。■二とｊａｔ活性化 は累積的であった。５Ｌ３ＬＴＲに導かれたＣＡＴ遺伝子の発現は、対照に比べ て、活性ｖｐｒ−遺伝子の存在下で８〜１０倍増大した。図ＩＱを参照されたい 。

図１０において、三角印を付したラインはＲ発現プラスミドでトランスフェクト したジャーカット細胞中でのＣＡＴ変換率（％）を示し、一方、丸印を付したラ インは対照プラスミドでトランスフェクトしたジャーカット細胞を示している。

上記の開示に基づいて、本発明の概念から離れることなく、多くの変更及び上の 特定例からの変形例などを当業者が容易になし得ることは明らかであり、本発明 は、クレームの範囲によってのみ制限を受けるものである。

く ＣＡＴ　災昧ギＺ さ　８　８　８　８ ＣＡＴ丈襖キ２ ９４１１人　上　清 ３１３呂　６日８　９日８　１２日ｇ 工日月乙／８−ｉｉｌＶｐＩＪ ３２色　乙８目　９６呂　１２６＠ ｐ２４−−　９１１９ｍ　’−曽、、５恋幹写１Ｍ禾 １３佼 χ１３　ａＪ 国際調査報告

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）トランス活性化作用を有するタンパク質を発現させるために十分な数 のＨＩＶゲノムの活性ｖｐｒ遺伝子に対応するヌクレオチドを含むヌクレオチド セグメント、および（ｂ）ヌクレオチドセグメントの上流のプロモーターを含む ベクターであって、前記ベクターが全ＨＩＶゲノムを含まない前記ベクター。
2. ２．ヌクレオチドセグメントが、十分な数のＨＩＶ株ＥＬＩ、ＭＡＬおよびＢＲ Ｕのｖｐｒ遺伝子に対応するヌクレオチドを含む請求項１のベクター。
3. ３．ヌクレオチドセグメントがＤＮＡである請求項１のベクター。
4. ４．ヌクレオチドセグメントがＲＮＡである請求項１のベクター。
5. ５．ヌクレオチドセグメントが本質的にｖｐｒ遺伝子に対応するヌクレオチドか ら構成される請求項１のベクター。
6. ６．トランス活性化作用を有するタンパク質を発現させる活性ｖｐｒ遺伝子を含 むが、全ＨＩＶゲノムを含まないＤＮＡセグメント。
7. ７．ＤＮＡセグメントが本質的に活性ｖｐｒ遺伝子から構成される請求項６のＤ ＮＡセグメント。
8. ８．プロモーターがウィルスプロモーターであり、ベクターがエンハンサー及び ポリアデニル化配列をも含む請求項２のベクター。
9. ９．請求項６の活性ｖｐｒ遺伝子より産生されるトランス活性化作用を有する実 質的に純粋な組換えタンパク質。
10. １０．請求項１のヌクレオチドセグメントにより産生されるタンパク質。
11. １１．タンパク質が約１５ｋＤの分子量を有する請求項９のタンパク質。
12. １２．特に請求項１１のタンパク質と反応する抗体。
13. １３．抗体を産生するために十分な数の請求項９のタンパク質のＣ−末端部分の アミノ酸に対応する免疫原性オリゴペプチド。
14. １４．請求項１３の免疫原性オリゴペプチドより発生する抗体。
15. １５．（ａ）所定のサンプルを採取し、（ｂ）請求項１４の抗体を加え、ついで （ｃ）所定のサンプルから抗体との複合体が形成されているか調べる ことからなる活性ウィルスタンパク質Ｒの存在のアッセイ方法。
16. １６．請求項１のベクターにより形質転換されるセルライン。
17. １７．（ａ）請求項１５のセルラインを所望の異種遺伝子産物を発現し得る予選 択の異種遺伝子を食むベクターを用いてトランスフェクトし、ついで （ｂ）セルを増殖培地で培養する ことからなる高レベルの所望の異種遺伝子産物を産生する方法。
18. １８．（ａ）予選択のセルを、所望の遺伝子産物を発現し得る所定の異種遺伝子 を含む第一ベクターと予選択のセルを形質転換するための請求項１のベクターで ある第二ベクターとを用いてトランスフェクトし、ついで （ｂ）形質転換された予選択のセルを増殖培地で培養することからなる高レベル の所望の異種遺伝子産物を産生する方法。
19. １９．（ａ）所望の異種遺伝子産物を発現するセルを請求項１のベクターを用い てトランスフェクトし、ついで（ｂ）セルを増殖培地で培養する ことからなる高レベルの所望の異種遺伝子産物を産生する方法。
20. ２０．（ａ）セルを、所望の異種遺伝子産物を発現し得る予選択の異種遺伝子を 含むベクターを用いてトランスフェクトし、ついで （ｂ）セルを請求項１１のタンパク質を補充した増殖培地で培養する ことからなる高レベルの所望の異種遺伝子産物を産生する方法。