JPH04506460A - Ｃ４結合タンパク質の融合タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １８、前記宿主がＣＯ３−７細胞またはＣＨＯ細胞である、請求項１７に記載の 単細胞宿主。

１９、前記宿主がｐＪＯＤ、５ＣＤ４．Ｙ１８７．５ＣＲ４を用いて形質転換さ れた、請求項１７に記載の単細胞宿主。

２０、機能性部分およびＣ４ｂｐ単量体を含む、Ｃ４ｂｐ融合ポリペプチド。

２１、前記Ｃ４ｂｐ単量体が、８個のＳＣＲを有し図１の＋１位から＋５４９位 のアミノ酸を含むＣ４ｂｐ単量体、５個のＳＣＲを有し図１の＋１８８位から＋ ５４９位のアミノ酸を含むＣ４ｂｐ単量体、４個のＳＣＲを有し図１の＋２４８ 位から＋５４９位のアミノ酸を含むＣ４ｂｐ単量体、３個のＳＣＲを有し図１の ＋３１４位から＋５４９位のアミノ酸を含むＣ４ｂｐ単量体、および１個のＳＣ Ｒを有し図１の＋４３３位から＋５４９位のアミノ酸を含むＣ４ｂｐ単量体から なる群から選択される、請求項２０に記載のＣ４ｂｐ融合ポリペプチド。

２２、前記機能性部分が、標的分子、酵素、酵素阻害剤、酵素基質、サイトカイ ン、成長因子、コロニー刺激因子、ホルモンおよび毒素に結合するウィルスのレ セプター、細胞のレセプター、細胞のリガンド、細菌の免疫原、寄生生物の免疫 原、ウィルスの免疫原、免疫グロブリンまたはその断片からなる群から選択され る、請求項２０に記載のＣ４ｂｐ融合ポリペプチド。

２３、前記機能性部分が可溶性ＣＤ４タンパク質である、請求項２２に記載のＣ ４ｂｐ融合ポリペプチド。

２４、可溶性ＣＤ４タンパク質が、ＣＤ４　（１１１）、ＣＤ４（１８１）、Ｃ Ｄ４　（１８３）、ＣＤ４　（１８７）−Ｃ４ｂｐ　（ＳＣＲ５）、ＣＤ４　（ １８７）−Ｃ４ｂｐ　（ＳＣＲ３）およびＣＤ４　（３７５）からなる群から選 択される、請求項２３に記載のＣ４ｂｐ融合ポリペプチド。

２５、前君己ポリペプチドが、ＣＤ４　（１８７）−Ｃ４ｂｐ（Ｓ　ＣＲ８）、 ＣＤ４　（１８７）−Ｃ４ｂｐ　（ＳＣＲ５）、ＣＤ４　（１８７）−Ｃ４ｂｐ 　（ＳＣＲ４）、ＣＤ４（１８７）−Ｃ４ｂｐ　（ＳＣＲ３）およびＣＤ４　（ １８７）−Ｃ４ｂｐ（ＳＣＲＩ）からなる群から選択される、請求項２３に記載 のＣ４ｂｐ融合ポリペプチド。

２６、前記機能性部分が、Ｂ型肝炎つィルスｅ抗原性を表すウィルスのポリペプ チドである、請求項２２に記載のＣ４ｇｂｐ融合ポリペプチド。

２７、前記ポリペプチドが、ＨＢｅＡｇ　（２〜８９）−ＣＡＭ　（ＳＣＲ８） 、ＨＢｅＡｇ（２〜１００）　−Ｃ４ｂｐ（ＳＣＲ８）、ＨＢｅＡｇ　（２〜１ ３８）　−Ｃ４ｂｐ　（ＳＣＲ８）およびＨＢｅＡｇ　（２〜１４８）−Ｃ４ｂ ｐ　（ＳＣＲ８）からなる群から選択される、請求項２６に記載のＣ４ｂｐ融合 ポリペプチド。

２８、前記機能性部分が、Ｉ　ＣＡＭＩ、ＥＬＡＭＩ、ＶＣＡＭＩまたはＶＣＡ Ｍｌｂ、およびＬＦＡ３からなる群から選択される細胞のレセプターまたは細胞 のリガンドである、請求項２２に記載のＣ４ｂｐ融合ポリペプチド。

２９、前記機能性部分が、ヒルジン、ヒルジンのＣ末端ポリペプチドおよびヒル ログからなる群から選択される、請求項２２に記載のＣ４ｂｐ融合ポリペプチド 。

３０、前記ポリペプチド部分のＣ末端が、Ｃ４ｂｐ単量体のＮ末端に融合してい る、請求項２０に記載のＣ４ｂｐ融合ポリペプチド。

３１、前記機能性部分が、毒素、抗レトロウィルス剤、酵素基質および酵素阻害 剤からなる群から選択される、請求項２０に記載のｃ４ｂｐ融合ポリペプチド。

３２、前記機能性部分がＡＺＴである、請求項３１に記載のＣ４ｂｐ融合ポリペ プチド。

３３、前記機能性部分が、酵素、放射性核種、蛍光マーカーおよび化学ルミネセ ントマーカーからなる群から選択されるレポーター基を含む、請求項２０に記載 のＣ４ｂｐ融合ポリペプチド。

３４、多量体のＣ４ｂｐ融合タンパク質。

３５、前記タンパク質が多量体のＣＤ４−Ｃ４ｂｐ融合タンパク質である、請求 項３４に記載の融合タンパク質。

３６、前記タンパク質がＣＤ４　（１８７）−Ｃ４ｂｐ　（ＳＣＲ４）融合タン パク質である、請求項３５に記載の融合タンパク質。

３７、前記タンパク質が多量体のＨＢｅＡｇ−Ｃ４ｂｐ融合タンパク質である、 請求項３４に記載の融合タンパク質。

３８、前記タンパク質が、ＥＬＡＭＩ−Ｃ４ｂｐ融合タンハク質、ＶＣＡＭＩ− Ｃ４ｂｐ融合タンハク質、ＶＣＡＭＩｂ−Ｃ４ｂｐ融合タンパク質およびＩＣＡ ＭＩ−Ｃ４ｂｐ融合タンパク質からなる群から選択される、請求項３４に記載の 融合タンパク質。

３９、前記タンパク質がヒルジンＣ４ｂｐ融合タンパク質、ヒルジンＣ末端ポリ ペプチドＣ４ｂｐ融合タンパク質、およびヒルログＣ４ｂル融合タンパク質から なる群から選択される、請求項３４に記載の融合タンパク質。

４０、発現制御配列に作動可能に結合された、Ｃ４ｂｐ融合ポリペプチドをコー ドするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子によって、単細胞宿主を形質転換する 工程を包含する、Ｃ４ｂｐ融合ポリの製造方法。

４１、ヘテロ多量体のＣ４ｂｐ融合タンパク質。

４２、前記融合タンパク質が、ウィルスのレセプター、細胞のレセプターおよび 細胞のりガントからなる群から選択される第一の機能性部分、ならびに毒素およ び抗しトロイルス剤からなる群から選択される第二の機能性部分を含む、請求項 ４１に記載のへテロ多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質。

４３、前記融合タンパク質が、認識分子およびレポーター分子を含む、請求項４ １に記載のへテロ多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質。

４４、前記第一の機能性部分が可溶性ＣＤ４であり、前記第二の機能性部分がＡ ＺＴである、請求項４１に記載のへテロ多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質。

４５、前記融合タンパク質が少なくとも２つの異なる免疫原を含む、請求項４１ に記載のへテロ多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質。

４６、請求項１２の組換えＤＮＡ分子で単細胞宿主を形質転換する工程を包含す る、多量体のＣ４ｂｐ融合タンパク質の製造方法。

４７、請求項３５の多量体ＣＤ４−Ｃ４ｂｐ融合タンパク質または請求項４２の へテロ多量体ＣＤ４−（４ｂｐ融合タンパク質の治療的有効量を患者に投与する 工程を包含する、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ，ＨＩＶ感染または）（ＩＶに対する抗体を 有する患者の治療方法。

４８、融合タンパク質がＣＤ４　（１８７）−ｃ４ｂｐ　（ＳＣＲ４）を含む、 請求項４７に記載の方法。

４９、ヘテロ多量体ＣＤ４−Ｃ４ｂｐ融合タンパク質が、請求項４４に記載の融 合タンパク質である、請求項４７に記載の方法。

５０、請求項４３に記載のへテロ多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質に試料を接触さ せる工程を含む、試料中の標的分子の存在を確認する方法。

５１、請求項４１に記載のへテロ多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質の有効量を患者 に投与する工程を包含する、インビボで標的分子の存在を確認する方法。

５２、ｃ４ｂｐ融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有するレトロウィ ルスを用いて、ヒト体細胞を感染させる工程を包含する、ヒトの病気の治療方法 。

５３、前記ＤＮＡ配列がＣＤ４−Ｃ４ｂｐ融合ポリペプチドを特徴とする請求項 ５２に記載の方法。

５４、組換えヒトＣ４結合タンパク質。

５５、図１のヌクレオチド４位からヌクレオチド１７４３位のＤＮＡ配列を含む ＤＮＡ配列に、作動可能に結合した発現制御配列を含む組換えＤＮＡ分子を用い て、単細胞宿主を形質転換する工程を包含する、組換えＣ４結合タンパク質の製 造方法。

５６、非ヒトＣ４ｂｐ融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む、組換え ＤＮＡ分子。

５７、前記非ヒトがマウスまたはモルモットである、請求項５６に記載の組換え ＤＮＡ分子。

５８、前記ＤＮＡ配列が非ヒトＣ４ｂｐ融合ポリペプチドである、請求項５６に 記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換された単細胞宿主。

５９、前記非ヒトがマウスまたはモルモットである、請求項５８に記載の単細胞 宿主。

６０、機能性部分および非ヒ）Ｃ４ｂｐ単量体を含む、非ヒトＣ４ｂｐ融合ポリ ペプチド。

６１、前記非ヒトがマウスまたはモルモットである、請求項６０に記載のＣ４ｂ ｐ融合ポリペプチド。

６２、多量体の非ヒ）Ｃ４ｂｐ融合タンパク質。

６３、前記非ヒトがマウスまたはモルモットである、請求項６２に記載の多量体 の非ヒトＣ４ｂｐ融合タンパク質。

６４、ヘテロ多量体の非ヒトＣ４ｂｐ融合タンパク質。

６５、前記非ヒトがマウスまたはモルモットである、請求項６４に記載のへテロ 多量体の非ヒトＣ４ｂｐ融合タンパク質。

６６、請求項５６に記載の組換えＤＮＡ分子を用いて単細胞生物を形質転換する 工程を包含する、非ヒ）Ｃ４結合タンパク質の製造法。

６７、前記非ヒトがモルモットまたはマウスである、請求項６６に記載の方法。

明細書 Ｃ４Ａタンパク　の融ムタンパク 及朋１１ｕ飢ｉ野 本発明は多量体およびヘテロ多量体の０４結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）との融合 タンパク質とその組成物およびそれらを用いる方法に関する。よ・り詳細には、 本発明は機能性部分に連結されたＣ４ｂｐ単量体の凝集あるいは集合である多量 体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質に関する。本発明はまたＣ４ｂｐ融合ポリペプチド、 特にＣＤ４−Ｃ４ｂｐ融合ポリペプチドに関する。ここでＣＤ４−Ｃ４ｂｐ融合 ポリペプチドは、好ましくは４つの短いコンセンサス反復領域をもつ、Ｃ４ｂｐ 単量体と融合した可溶性ヒトＣＤ４タンパク質のアミノ酸配列を含有する。

良肚旦！見 急速に進歩するバイオテクノロジーにおいて、研究者たちは薬剤、ワクチン、診 断薬および他の生物活性分子のための優れた輸送および担体システムを産み出し ている。最適にはこれらのシステムはシステムの有する分子の特性を強化し、不 足している特性を補足し、また異なる分子の有用な特性を組み合わせる。とくに 研究者にとって興味のあることは、生物活性分子の血清中半減期、その標的粒子 や細胞への親和性、生物活性分子の標的能力、生物活性、免疫原性およびいくつ かの分子の同時投与あるいは輸送の可能性である。

ヒトＣ４結合タンパク質（ｈＣ４ｂｐ）は、生物活性分子の輸送担体として多（ の興味ある特徴をもっている。ヒトＣ４ｂｐはヒトの補体系に関与している。補 体系は免疫系に属するタンパク質群で、その機能は侵入細胞の溶解、食細胞の活 性化および系からの異物除去の促進を含む。ｈＣ４ｂｐは補体系のタンノくり質 、特にＣ４タンパク質の作用を制御する。構造的にはｈＣ４ｂｐは柔軟でジスル フィド結合を有する分子であり、長い血清中半減期および生物活性分子をリンパ 節に標的させる能力を持つと推定される。血清中ｈＣ４ｂｐは分子量約５９０ｋ Ｄである。還元下のＳＤＳゲルではｈＣ４ｂｐは約７０ｋＤに強いバンドを作り 、これはジスルフィド結合した多量体タンパク質であることを示唆する。

電子顕微鏡下では、ヒトＣ４ｂｐは７個の単量体の触手をもつ構造である［Ｂ、 　Ｄａｈｌｂａｃｋら、−Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｃ ４ｂ−Ｂｉｎｄｉｎｄｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ｃｏｍｐｌｅｘｅ ｓ　ｗｉｔｈ　Ｖｉｔａａ＋ｉｎ　Ｋ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　 Ｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐｌｅａ＋ｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃ４ｂ−、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　ＵＳＡ、　８０．　ｐｐ、　３４６１ −６５（１９８３＞］。研究者たちはこのヒトＣ４ｂｐの構造を　クモ様と呼ん で来たが、ｈＣ４ｂｐの触手構造の柔軟性はむしろこのタンパク質をタコ様にす る。溶液中Ｘ線分散実験でｈＣ４ｂｐの触手はある種の環境では広がらず、分子 はコンパクトな形をすると推定されることが提言されている［Ｓ、　Ｊ、　Ｐｅ ｒｋｉｎｓ　ら、”Ｕｎｕｓｕａｌ　Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｃ ｏ＋ｏｐｌｅｍｅｎｔ−Ｃｏａ＋ｐｏｎｅｎｔ−Ｃ４ｂ−Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒ ｏｔｅｉｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｃｏ＋ａｐｌｅｍｅｎｔ　ｂｙ　５ｙｎｃｈｒ ｏｔｏｎ　Ｘ−Ｒａｙ　Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍ ｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ−。

Ｂｔｏｃｈｅｍｊ、、　２３３．　ｐｐ、　７９９−８０７（１９８６）］。

単量体Ｃ４ｂｐをコードするｃＤＮＡはクローニングされ特徴付けされティる［ Ｌ、　Ｐ、　Ｃｈｕｎｇら、　−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ 　Ｃｈａｒａｃｔａｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃＤＮＡ　Ｃｏｄｉｎｇ 　ｆｏｒ　Ｃ４ｂ−Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎｏｆ　ｔｈｅ　Ｃ１ａｓｓ ｉｃａｌ　Ｐａｔｈｗａｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ 　Ｓｙｓｔｅｍ−、Ｂｉｏｃｈｅｍｌ、、２３０．　ｐｐ、１３３−４１（１９ ８５）１゜ＣｈｕｎｇらはｈＣ４ｂｐを５４９個のアミノ酸からなるポリペプチ ドとしている。ＤＮＡ配列から推定されるポリペプチドの分子量は還元下ＳＤＳ ゲルで実測された７０ｋＤよりむしろ約６１．５ｋＤである。分子量の差は明か に血清型ポリペプチドに糖鎖がついていることによる。

Ｃｈｕｎｇらによる配列のＮ末端の最初から４９１個のアミノ酸は８個の領域に 分割できる。それらは各々が約６０個のアミノ酸からなり、短いコンセンサス反 復領域（ＳＣＲｓ）と呼ばれる。

これらの領域はＮ末端からＣ末端へ、５ＣＲ８から５ＣＲＩと呼ばれる。ＳＣＲ ドメインは本願の図１のアミノ酸配列で次のように定義される：　５ＣＲ８−＋ １から＋６１：　ＳＣＲ？−＋６２から＋１２３：　５ＣＲ６−４１２４から＋ １８７：　５ＣＲ５−＋１８８から＋２４７；　５ＣＲ４−＋２４８から＋３１ ３．５ＣＲ３−＋３１４から＋３７４；　５ＣＲ２−＋３７５から：＋４３２： 　５ＣＲＩ−＋４３３から＋４９１゜これらのドメインは有意に配列の相同性を 共有しており、各々は類似する位置にシスティン残基を宵する。これらのシステ ィン残基は領域内にジスルフィド結合を規則的に形成する。　［Ｊ、Ｊａｎａｔ ｏｖａ　ら、”Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ　Ｂｏｎｄｓ　Ａｒｅ　Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ 　ＷＨｈｉｎ　ｔｈｅ　５ｈｏｒｔ　Ｃｏｎ５ｅｎｓｕｓ　Ｒｅｐｅａｔ　Ｕｎ ｉｔｓ　ｏｆ　Ｃｏ＋ｇｐｌｅ＋ａｅｎｔ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｐｒｏｔｅ ｉｎｓ：Ｃ４ｂ−Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ”、　Ｂ［ｏｃｈｅ＋ｏ、、 ２８．ｐｐ。

４７５４−６１（１９８９）］、各々のＳＣＲドメイン内で、最初のシスティン 残基は３番目と、および２番目のシスティン残基は４番目と結合し、ダブルルー プのアミノ酸配列を形成する。従ってＳＣＲは糸に通したビーズのように連結さ れている。この領域内ジスルフィド結合のパターンがＣ４ｂｐ単量体の構造的柔 軟性の原因である。

８個のＳＣＲドメインに加えて、ｈＣ４ｂｐはまた、Ｃ末端に５８個のアミノ酸 配列からなるＣ４ｂｐコアを有し、これはこのタンパク質の他の部位との相同性 を有しない。この部位は分子が集合して多量体となる原因である。あるモデルに よると、あるＣ４ｂｐ単量体の＋４９８位にあるシスティンは別の単量体の＋５ １０位にあるシスティンとジスルフィド結合を形成する。

７個のＣ４ｂｐ単量体に加えて、ヒトＣ４ｂｐは他のサブユニットとして４Ｓｋ Ｄポリペプチドを有し、これはジスルフィド結合でＣ４ｂｐ７量体のコアと結合 している［Ａ、旧１１ａｒｐ　ａｎｄ　Ｂ、Ｄａｈｌｂａｃｋ、−Ｎｏｖｅｌ　 ５ｕｂｕｎｉｔ　ｉｎ　Ｃ４ｂ−Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｑｕｉ ｒｅｄ　ｆｏｒＰｒｏｔｅｉｎ　Ｓ　Ｂｉｎｄｉｎｇ−、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ、、　２６３．　ｐｐ、１２７５９−６４（１９８８）］。このサブユニット は、血液凝固の制御に関与するタンＮり質である、タンパク質Ｓに結合する。タ ン１＜り質Ｓに結合すると、プロテアーゼＣが凝固因子■およびＶの活性型から 不活性型への転換を触媒する。

Ｃ４ｂｐはまた、ヒト以外の哺乳類にも存在する。マウスおよびモルモットの両 方から分離されている［Ｓ、　Ｊ、　Ｌｉｎｔｉｎら、”Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ 　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｒ　ｔｈｅ　Ｓｉｇｎａｌ　Ｐｅｐｔｉ ｄｅ　ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｃ４ｂ−ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｉｎｔｅｒｓｐｅ ｃｉｅｓ　Ｃｒｏｓｓ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ　Ｃ４ｂｐ　ｃ ＤＮＡ　５ｅｑｕｅｎｃｅ’、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　２３２．　ｐｐ 、　３２ｇ−３３２（１９８８）］。マウスＣ４ｂｐの分析は、ヒトＣ４ｂｐと 同様に、それの連続するＳＣＩ＋を有することを示している。しかしながら、マ ウスＣ４ｂｐは各々のＣ４ｂｐ単量体内に６個のＳＣＲＬか有せず、多量体は非 化学的結合により互いに結びついている。

現在のところ、Ｃ４ｂｐの構造的特徴はインビボでの治療薬あるいは予防薬の輸 送に利用されていない。バイオテクノロジーの進歩にもかかわらず、薬物、ワク チン、診断薬および生物活性分子の特性や輸送−これには多価性、単一の標的粒 子への親和性、血清中半減期、生物活性および、ある場合には免疫原性が含まれ るーを最適化する方法および製造物への必要性がいまだに存在する。

良五二！１ 本発明は多量体およびペテロ多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質を提供することによ り、これらの問題を解決する。多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質は、薬物、ワクチ ン、診断薬あるいは他の生物活性分子であり得る機能性部分に結合された、Ｃ４ ｂｐ単量体の凝集体あるいは果合体である。ペテロ多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク 質は、異なるＣ４ｂｐ単量体の組み合わせ、興なる機能性部分の組み合わせ、あ るいは両方の組み合わせを有する。本発明はまた、ヒト以外の多量体およびヘテ ロ多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質を提供する。Ｃ４ｂｐ融合ポリペプチドは、機 能性部分に融合あるいは化学的に結合された単量体Ｃ４ｂｐを包含する。

特に、本発明は融合ポリペプチドＣＤ４（１８７）−Ｃ４ｂｐ（ＳＣＲ４）を提 供する。本発明はまた、単量体Ｃ４ｂｐ融合ポリペプチドを含有する多量体Ｃ４ ｂｐ融合タンパク質に関する。そして本発明はさらに、Ｃ４ｂｐ融合ポリペプチ ドをコードするＤＮＡ配列、それらの配列を含有する組み換えＤＮＡ分子、およ びそれらの分子で形質転換された単細胞性宿主細胞を提供する。本発明はまた、 宿主を培養することによりこれらの融合ポリペプチドを製透す名刀法を提供する 。本発明はまた、治療薬、予防薬あるいは診断薬として、特にＡＩＤＳ、ＡＲＣ および旧Ｖ感染の診断、予防および処置のために有用な、Ｃ４ｂｐ融合ポリペプ チドあるいはタンパク質を包含する組成物を提供する。

本発明の融合タンパク質は、その多量体性、大きなサイズ、触手の柔軟性、およ びリンパ節を通じての移動能力を含む、ｈＣ４ｂｐの種々の特性を有利に利用す る。従って、そのような融合タンパク質中で、機能性部分として単量体Ｃ４ｂｐ に結合された生物活性分子は、次の１つあるいはそれ以上のもので特徴付けられ る：多価性、長い血清中半減期、標的粒子あるいは細胞べの高い親和性、強い生 物活性あるいは免疫原性、および標的能力。

機能性部分の選択によって、本発明による多量体およびヘテロ多量体Ｃ４ｂｐ融 合タンパク質は多くの用途を有する。抗体の抗原結合部、ウィルスのレセプター または細胞のレセプターを含む認識分子は、ある特定の抗原にＣ４ｂｐ融合タン パク質を標的付けるための機能性部分として有用である。このようにして標的付 けた場合、多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質はウィルスの細胞への結合をブロック するのに有用であり、それによってウィルス感染を防ぐ。Ｃ４ｂｐ融合タンパク 質はまた、病理学的炎症の特徴である細胞間結合の抑制に使用される。本発明の 融合タンパク質の多価性および構造的柔軟性により、それらは単価あるいは硬直 した多価分子より強い標的への親和性を有すると考える。本発明の１実施態様で は、機能性部分は、ヒトリンパ球上のレセプター、ＣＤ４である。これはＡＩＤ ＳおよびＡＲＣの原因物質である旧Ｖウィルスの標的である。

本発明によるヘテロ多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質中で、認識分子が毒素、抗レ トロウィルス薬あるいは放射性核種と連結して使用されると、これらのタンパク 質は、その標的を捜して破壊する治療薬となる。認識分子を有するＣ４ｂｐ融合 タンパク質はまた、診断用アッセイの感度増強に有用である。それらは大きな多 量体分子であるため、多くの結合部をホースラディッシーパーオキシダーゼ標識 抗体のようなレポーター分子に提示する。一方では、それらは標的認識分子およ び複数のレポーター基の両方を有するヘテロ多量体の形態をとる。

Ｃ４ｂｐ融合タンパク質の機能性部分が病原体の一つあるいはそれ以上の免疫原 であるとき、本発明のタンパク質はワクチンに有用である。また、機能性部分が 酵素、基質あるいは阻害物である場合、多量体Ｃ４ｂｐ融合タツパク質はより生 物活性の強い薬剤として機能する。

本発明はまた、組み換えとトＣ４ｂｐおよび該タンパク質の製造方法を提供する 。

置皿ｆｆｉ虱肢咀 図ＩＡ−ＩＣはｐＪＯＤ、　Ｃ４ｂｐ、　３．由来のヒトＣ４ｂｐポリペプチド のＩ）ＮＡ配列および推定されるアミノ酸配列を表す。負数字の付いたアミノ酸 はシグナル配列に相当し、それは成熟ポリペプチドには存在しない。本出願を通 して、アミノ酸配列に関するＣ４ｂｐについての言及は本図に記されたのと同等 のものに対応する。

図２はＳＣＲドメインの構造を表す。図は隣接のＳＣＲと連結する短いコンセン サス反復部位（ＳＣＩ？）のアミノ酸配列を描いている。各々のアミノ酸は円で 示されている。以下に述べるように、各々のＳＣＲはシスティン１とシスティン ３との間、およびシスティン２とシスティン４との間の２個のジスルフィド結合 によって、本図に示されるように、結びつけられている。

ループはその中に含まれるシスティンｌとシスティン４との間のアミノ酸配列で 表される。連結部は２つのつながっているループとループの間のアミノ酸配列で 示される。

図３Ａ−３ＢはヒトＣＤ４タンパク質のヌクレオチド配列および推定されるアミ ノ酸配列を表す。ヌクレオチド１位から６３６位はｐＪＯＤ、　５ＣＤ４．　Ｙ １８７．５ｎａＢｌに由来する。ヌクレオチド６３７位から１３７７位はｐ１７ ０．２に由来する。本図ではアミノ酸に一２５位から３７５位までの番号が付い ている。本出願を通して、アミノ酸配列によってＣＤ４について言及するときは 、特に示されない限り、本図と同等のものに対応する。

図４はヒトＣＤ４タンパク質のドメイン構造を表す。番号で示されたアミノ酸は 、図３Ａ−３８による、ジスルフィド結合に関与するシスティン残基である。

図５Ａ−５８＋ｔ　：ｔ　！Ｊ　コｖ　−Ｃ４ｂｐ、　１からＣ４ｂｐ、２０． 　ＳＣＲ，１，ＳＣＲ，４゜ＳＣＲ，８，３１２，２０，３１２，２１，３１２ ，３５および３１２．３６のＤＮＡ配列を表す。全ての配列で、左から右へ５° から３°と定義する。

図６Ａ−６Ｈｉｔブ５　ｘ　ミ）’ｐＪＯＤ、ｃ４ｂｐおよびｐＪＯＤ、　５Ｃ Ｄ４．　Ｙ、　！８７゜５ｎａｉｌの構築を表す。

図７は本発明によるＣＤ４−Ｃ４ｂｐ融合ポリペプチドをコードする配列を含有 するプラスミドの構築を表す。ｒ　ＣＤ４−Ｃ４ｂｐ融合ポリペプチド」はヒト ＣＤ４タンパク質およびＣ４ｂｐのアミノ酸配列を含有する。上のストランドは 、アデノウィルス主要後期プロモーター（Ａｄ　ＭＬＰ）　；　５’非非翻訳列 く５°ＵＴＳ）　；　ＡＴＧ開始コドンおよびシグナル配列をコードする部位； ヒトＣＤ４タンパク質がらチロシンコドン（ＴＡＣ（１ｇ？＞）までをコードす る部位：　５ｎａ８１部位（ＴＡＣＧＴＡ）　；　ＩＩ　１部位（ＡＧＡＴＣＴ ）　；およびＳＶ４０ボリアテニル化制御配列を表す。下のストランドは５ＣＲ ８−ＳＣＲＩコアおよび停止コドンをフードする部位ならびにＭＩＳ遺伝子のポ リアデニル化制御配列を含むｐＪＯＤ、　Ｃ４ｂｐを表す。

図８は、組み換えヒトＣ４ｂｐ（ｒｈＣ４ｂｐ）および血清型ヒトＣ４ｂｐ　（ 血清）のＨＰＬＣによる精製の結果を示す。

図９は、本発明によるＣ４ｂｐ融合ポリペプチドおよびタンパク質の実施態様を 図示する。

図１０は、本文書中に述べるところのＥＬＩＳＡアッセイ１−９ニ使用された抗 体をまとめた表である。

良豆恋１鼠工ヱユ 本文に記載する発明がより十分に理解されるように、詳細な説明を以下に述べる 。

ここでの記述には次の用語が使用される：ｒＣ４結合タンパク質Ｊ　（ｒＣ４ｂ ｐＪ　）とは、図１に示される一３２位から＋５４９位のアミノ酸配列を有する ポリペプチドのことを言う。ポリペプチドの発現がしばしば、シグナル配列の切 除、分子内ジスルフィド結合、糖鎖形成などのような翻訳後修飾を含むことは、 理解されるべきである。従って、ｃ４タンパク質という用語はまた、そのような 修飾を受けたＣ４ｂｐのアミノ酸配列をも意味する。それはまた、天然に存在す る遺伝的多形をも包含する。この用語はまた、天然、組換え、あるいは合成され たＣ４結合タンパク質を含む。

「多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質」および　「ヘテロ多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパ ク質」は各々、Ｃ４ｂｐポリペプチドの凝集体あるいは集合体を包含する。ｒＣ ４ｂｐ融合ポリペプチド」は機能性部分に結合しているＣ４ｂｐ単量体を包含す る。「機能性部分」は、ポリペプチド（「ポリペプチド部分」）または化合物（ 「化学部分」）であり得る。多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質は遺伝的融合、化学 合成、あるいは化学結合の技術によって製造され得る。

機能性部分がポリペプチドであった場合には、遺伝的融合が好適である。これは 例えば、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３′側末端がＣ４ｂｐ単量体を コードするＤＮＡの５′側末端に連結された、Ｃ４ｂｐ融合ポリペプチドをコー ドするハイブリッドＤＮＡ配列を作成することを含む。適当な宿主において発現 されると、このハイブリッドＤＮＡ配列は、集合して多量体となるＣ４ｂｐ融合 ポリペプチドを産生ずる。

本文に使用されているｒ　Ｃ４ｂｐ単量体」は、Ｃ４ｂｐコアを含有するポリペ プチド、あるいは、より好ましくは、少なくとも１個のＳＣＲがＣ４ｂｐコアの Ｎ末端に融合されている、配列を含むポリペプチドである。ｒＣ４ｂｐコア」は 、最小限でも図１の＋４９８位から＋５４９位のアミノ酸を、好ましくは＋４９ ２位から＋５４９位のアミノ酸を含む。本文に使用されているｒｓｃＲＪはＣ４ ｂｐのポリペプチド断片である。ＳＣＲは最小限、ループを含み、最大ではルー プと２個の連結部を含む。「ループ」には、上述で定義されたように、８個のＳ ＣＲドメインの１番目と４番目のシスティンで囲まれるアミノ酸配列が含まれる 。すなわち、ループには５ＣＲ８の＋２位から＋６０位のアミノ酸、５ＣＲ７の ＋６５位から＋１２２位のアミノ酸、５ＣＲ６の＋１２７位から＋１８６位のア ミノ酸、５ＣＲ５の＋１９１位から＋２４６位のアミノ酸、５ＣＲ４の＋２５１ 位から＋３１２位のアミノ酸、５ＣＲ３の＋３１６位から＋３７５位のアミノ酸 、５ＣＲ２の＋３７８位から＋４３２位のアミノ酸、および５ＣＲＩの＋４４６ 位から＋４９０位のアミノ酸が含まれる。「連結部」にはループとループの間、 および（ＳＣＲ８と５ＣＲＩの場合）ループの外側のアミノ酸配列が含まれる。

従って、各々のループは連結部を介して他のループと結合されている。連結部を 有するＳＣＲは連結部を有さないものより好適である。なぜならば連結部無しに 結合している２個のループは、連結部によって結合しているものと同等に柔軟で はありに（いからである。上述で定義された、ＳＣＲ￥Ａ域のアミノ酸配列を包 含するＳＣＲが最適である。例えば、５ＣＲＩおよび５ＣＲａの短いループへの 数個のアミノ酸の付加のように、ＳＣＲのアミノ酸配列に小さな変化が加えられ 得るであろうことは理解されるべきである。

本発明のＣ４ｂｐ単量体は、ランダムに並べられたＳＣＲを含む、任意の並び方 を含む。しかしながら、本発明の目的は、このＣ４ｂｐ単量体に対する免疫応答 を最も引き起こしにくいタンパク質を製造することである。従って、より好まし くは、Ｃ４ｂｐ単量体のアミノ酸配列は、成熟Ｃ４ｂｐのアミノ酸配列の少なく とも断片に相当し、それには通常、免疫原性がない。従って、Ｃ４ｂｐ単量体、 Ｃ４ｂｐ（ＳＣＲ８）は成熟Ｃ４ｂｐポリペプチドに相当する。

Ｃ４ｂｐ（ＳＣＲ４）は図１の＋２４８位から＋５４９位のアミノ酸配列に相当 する。Ｃ４ｂｐ（ＳＣＲＩ）は図１の＋４３３位から＋５４９位のアミノ酸に相 当する。Ｃ４ｂｐ単量体としてはＣ４ｂｐ（ＳＣＲ４）が最も好適である。

本発明の他の実施態様では、ｃ４ｂｐ４ｂｐ単量々の個数のＳＣＲを含む。最小 の場合にはＳＣＲを含まない。最大では、Ｃ４ｂｐ単量体は約３２個のＳＣＲを 含む。これは、３０個の領域を有し、最も長い既知の反復単位分子であるＣＲＩ と、はぼ同等である［Ｌ、　８゜１［１ｉｃｋｓｔｅｉｎ、−１ｓｏｌａｔｉｏ ｎ　ｏｆ　ＮＯ３−ｔｅｒｍｉｎａｌ　ＣＲＩ（ＣＤ３Ｓ）　Ｃ１ｏｎｅｓａｎ ｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＣＲ Ｉ−ＦＡＳＥＢ　Ｊ、、　２゜ｐ、　Ａ１８３２　＃８９２１（１９８ｇ）］。

８個以上のＳＣＲを含むＣ４ｂｐ単量体はより好ましくは、Ｃ４ｂｐの少なくと も１断片に融合された成熟Ｃ４ｂｐのアミノ酸配列に相当する。例えば、１６個 のＳＣＲからなる単量体は、５ＣＲ８−ＳＣＲＩに融合された５ＣＲ８−ＳＣＲ Ｉを包含する。

Ｃ４ｂｐ単量体をコードするＤＮＡ配列はＣ４ｂｐをコードするＤＮＡ配列に由 来する。これらのＤＮＡ配列を得るには数種の方法がある。

先ず第一に、Ｃ４ｂｐ遺伝子あるいはその縮退形は商業的に入手可能な化学合成 機を用いて化学的に合成し得る。我々は図１に、ヌクレオチド＋１位から＋９６ 位のシグナル配列を含むためにＣ４ｂｐのＤＮＡ配列を示した。それは、３個の サイレントなヌクレオチドの置換えを除き、Ｃｈｕｎｇら（上述）およびＬｉｎ ｔｉｎら（上述）により示された配列を確証する。その差異はヌクレオチド６２ ５位、　１４０２位および１４５９位から始まるコドンにあり、各々ＧＧＣ，Ｔ ＧＧおよびＧＡＧと読まれる。Ｃｈｕｎｇらは、それらのコドンをＧＧＴ、　Ｔ ＧＣおよびＧＡＡと同定している。

第二に、Ｃ４ｂｐポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列はｃ　ＤＮＡライブラ リーをスクリーニングすることにより分離し得る。多くのスクリーニング法が当 業者に知られている。例えば、オリゴヌクレオチドプローブを用いた核酸のハイ ブリダイゼーシヨンにより、コロニーはスクリーニングし得る。プローブは既知 のＣ４ｂｐのＤＮＡ配列の一部を化学的に合成することにより調製され得る。あ るいは、λｇｔｌｌのような発現ベクターにｃＤＮＡライブラリーを構築し、抗 ｈＣ４ｂｐ抗体でコロニーをスクリーニングすることも可能である。

第三に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてｍＲＮＡを増幅することによ り、Ｃ４ｂｐをコードするｃＤＮＡを分離し得る。我々はこの方法を実施例Ｉに おいて述べる。

Ｃ４ｂｐ単量体をコードするＤＮＡ配列は、次に、ポリペプチド部分のような機 能性部分をコードするＤＮＡ配列と融合される。本発明に有用なポリペプチドを コードするＤＮＡ配列は、多くの起源から入手可能である。これは文献に記載さ れたＤＮＡ配列および任意の通常の分子クローニング技術により得られる特定の ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む。

本発明はまた、ヒト以外のＣ４ｂｐ融合ポリペプチドを包含するヒト以外のＣ４ ｂｐ融合タンパク質を包含する。そのような融合ポリペプチドでは、Ｃ４ｂｐ単 量体はヒト以外のＣ４ｂｐのアミノ酸配列に由来するＣ４ｂｐフアおよびＳＣＲ を含有する。多量体に集合する単量体単位を有する任意のヒト以外のＣ４ｂｐが この目的に有用である。そのようなＣ４ｂｐ多量体はモルモットおよびマウスに 存在する［Ｌｉｎｔ　ｉｎら、上述ゴ。マウスＣ４ｂｐは好適である。

なぜならば、そのアミノ酸配列が連続するＳＣＲを含むことが知られているから である。

（以下余白） 広範なポリペプチドが本発明のＣ４ｂｐ融融合タンパ雪質るいは融合ポリペプチ ドの製造に有用である。最も有用なものには、多量体形態で有利に投与されるポ リペプチドが含まれる。

例えば、ウィルスのレセプターあるいは細胞のレセプターあるいはリガンドが有 用である。なぜならば、多数のレセプターを現している粒子や細胞に典型的に結 合するからである。

これらのポリペプチドを含有する融合タンパク質は、ウィルス−細胞間あるいは 細胞−細胞間結合の抑制に関与する治療に有用である。有用なウィルス−細胞レ セプターには、ＩＣＡＭｌ、ラインウィルスレセプター；ポリオウィルスレセプ ター［Ｊ、Ｗｈｉｔｅ　ａｎｄ　Ｄ、Ｌｉｔｔｍａｎ、　”Ｖｉｒａｌ　Ｒｅｃ ｅｐｔｏｒｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　［ｍｍｕｎ。

−ｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ−、Ｃｅ１ｌ、　５６．　ｐｐ、 　７２５−２８　（１９８９）］および、最も好ましくは旧Ｖレセプターである ＣＤ４が含まれる。細胞−細胞レセプターあるいはリガンドには、　ＩＣＡＭＩ 、　ＥＬＡＭｌ、およびＶＣＡＭ！およびＶＣＡＭｌｂのような接着分子ファミ リーおよびそれらに対するリンパ球の対向部分（リガンド）；　リンパ球関連抗 原、ＬＦＡＩ、ＬＦＡ２（ＣＤ２）およびＬＦＡ３、ＣＤＩ　１／ＣＤ１８フア ミリーのメンバー、およびＶＬＡ４が含まれる。これらの分子は病理学的炎症に 関与している［Ｍ、　Ｐ、　Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａら、　”Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃ ａ−ｔｉｏｎｏｆ　ａｎ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ−１ｅ ｕｋｏｃｙｔｅ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅ”、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、、ＵＳＡ、　８４．　ｐｐ、　９２３８−４２（ １９８７）；　Ｌ、０５ｂＯｒｎら、−Ｄｉｒｅｃｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　 ＣＩｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ＶａｓｃｕｌａｒＣｅｌｌ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ　Ｍｏ１ ｅｃｕｌｅ　１：　Ａ　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌ ｉａｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｈａｔ　Ｂｉｎｄｓ　ｔｏ　Ｌｙ＋ａｐｈｏｃｙｔ ｅｓ、−Ｃｅ１ｌ、　５９．ｐｐ、１２０３−１１（１９８９）　ａｎｄ　Ｈｅ ５ｓｒｏｎら、Ｗｏ　９０／１３３００］。

細菌性免疫原、寄生虫性免疫原およびウィルス性免疫原は、ワクチンとして有用 な多量体あるいはへテロ多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質を作成するためのポリペ プチドの部分として有用である。これらの免疫原の細菌からの起源には細菌性肺 炎およびエコつモシスティス性肺炎を起こすのもが含まれる。寄生虫源にはプラ スモディウムのようなマラリア寄生虫が含まれる。ウィルスからの起源には、例 えば牛痘ウィルスおよび羊痘ウィルスのような天然痘ウィルス；ヘルペスシンプ レックスウィルスタイプ１および２、Ｂ−ウィルス、バリセラーシスターウィル ス、サイトメガロウィルス、およびエプスタイン−バーウィルスのようなヘルペ スウィルス；乳１］ｊｊｌ炎ウィルスのようなアデノウィルス；パピローマウィ ルス、ＢＫおよびＪＣウィルスのようなポリオーマウィルス、のようなパポバウ ィルス：アデノウィルス衛生ウィルスのようなパルボウイルス；レオウィルス１ ．２、および３のようなレオウィルス；コロラドダニ熱ウィルスのようなすルビ ウィルス：　ヒトロタウィルスのようなロタウィルス；東部脳炎ウィルスおよび ベネズエラ脳炎ウィルスのようなアルファウィルス；風疹ウィルスのようなルビ ウィルス；黄熱病ウィルス、デング熱ウィルス、日本脳炎ウィルス、ダニ媒介性 脳炎ウィルスおよびＣ型肝炎ウィルスのようなフラビウイルス；ヒトコロナウィ ルスのヨウナコロナウィルス；パラインフルエンザ１．２．　３および４、およ び流行性耳下腺炎ウィルスのようなパラミ牛ンウィルス；麻疹ウィルスのような モルビリウィルス；呼吸器巨細胞ウィルスのようなエコーモウィルス；水胞性口 炎ウィルスのようなベジキニロウィルス；狂犬病ウィルスのようなリサウィルス ；インフルエンザＡおよびＢのようなオルソミキソウィルス；ラクロツセウィル スのようなブンヤウィルス；　リフトヴアレー熱ウィルスのようなフレポルウィ ルス；コンゴ呂血熱ウィルスのようなカイロウィルス；　８里１ｆｆ炎のような ヘパドーナウィルス；１ｃｍウィルス、ライノウィルス、およびＪｕｎｉｎウィ ルスのようなアレナウィルス；　ＨＴＬＶ　［、ＨＴＬＶｌｌ、ＨＩＶ　Ｉおよ び旧Ｖ１１のようなレトロウィルス；ポリオウィルス１．２オヨヒ３、コツフサ キーウィルス、エコーウィルス、ヒトエンテロウィルス、Ａ型肝炎ウィルス、Ｅ 型肝炎ウィルスおよびノーワークウィルスのようなエンテロウィルス；ヒトライ ノウィルスのようなライノウィルス；　Ｍａｒｂｕｒｇ　（病）ウィルスおよび Ｅｂｏｌａウィルスのようなフィロウィルスが含まれる。

さらに詳細には、本発明はＢ型肝炎ｅ抗原性を有するウィルスポリペプチドを含 むポリペプチド部分を含んだＣ４ｂｐ融合ポリペプチドを提供する。Ｂ型肝炎つ ィルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）をコードするＤＮＡ配列はり、Ｍｉｍｍｓ　ら°Ｐ ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ。

ａｎｄ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏ ｆ　ａ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｒ＋ｔ　ＤＮＡ−ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｈｅｐａｔｉｔ ｉｓ　Ｂ　ｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ−、Ｖｉｒａｌ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　ａｎｄ　 Ｌｉｖｅｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ、　ｐｐ、　２４８−２５１　Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ ５ｓ、　Ｉｎｃ、（１９８８）に記載されている。この配列によりコードされる アミノ酸はＢ型肝炎ウィルスコア抗原（ｒ　ＨＢｃＡｇＪ　）　（サブタイプａ ｄｗ２）の１４４個のアミン末端アミノ酸に相当する。あるいは、Ｍ、　Ｐａ５ ｅｋらの−Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　Ｖｉｒｕｓ　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅ ｉｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎＥ、ｃｏｌｉ−、Ｎａｔｕｒｅ、　２８２゜ ｐｐ、　５７５−５７９（１９７９）に記載されているように、ＨＢｅＡｇをコ ードするＤＮＡ配列は、ＨＢｃＡｇの１から１４４位のアミノ酸に相当する配列 を含む。ＨＢｅＡｇをコードするＤＮＡ配列はまた、）Ａｕｒｒａ！らの米合衆 国特許第４７５８５０７号に記載されている方法により取得され得る。我々はこ こに、ＨＢｅＡｇのアミノ酸２番（Ａｓｐ）からＸまでをコードするＤＮＡ配列 あるいはこれを有するポリペプチドを”ＨＢｅＡｇ（２−Ｘ）”と称する。

標的分子に結合する免疫グロブリンあるいはその断片もまた、機能性部分として 有用である。免疫グロブリン分子は２価であるが、イムノグロブリン−Ｃ４ｂｐ 融合タンパク質は多価となり、標的に対する増強された親和性あるいは結合性を 示し得る。抗体の単一領域（ｄＡｂ）が有用であることが証明されている［Ｅ、 　Ｓ、　Ｗａｒｄら、−Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ａ　Ｒ ｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　ｏｆ　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｉｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｖａ ｒｉａｂｌｅ　Ｄｏ＋ｍａｉｎｓ　５ｅｃｒｅｔｅｄ　ｆｒｏ＋ａ　Ｅｓｃｈｅ ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ、ＮａｔＬｌｒｅ、　３４１．　ｐｐ、　５４４−４６ （１９８９）ｌｏ特異抗原を認識するモノクローナルＦａｂ断片はＷ、　Ｄ、　 Ｈｕｓｅらの技法により作製し得、各々のドメインは、本発明による多量体ある いはへテロ多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質の機能性部分として使用され得る［Ｗ 、　Ｄ、　Ｈｕｓｅら、　−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｌａｒｇｅ　Ｃ ｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　Ｌｉｂｒａｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｎ＋＋ａｕｎｏ ｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｉｎ　ＰｈａｇｅＬａｍｂｄａ−、５ ｃｉｅｎｃｅ、　２４６．　ｐｐ、　１２７５−８１（１９８９）］、　（Ａ、 ５ｋｅｒｒａａｎｄ　Ａ、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、−Ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　ａ 　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｒａ＋ｍｕｎｏｇｌｏｂｕｔｉｎ　Ｆｖ　Ｆｒａｇｍ ｅｎｔ　＋ｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ−，５ｃｉｅｎｃｅ、２４０ ．　ｐｐ。

１０３８−４３　（１９８ｇ）も参照）。

さらに、機能性部分が酵素、酵素基質あるいは酵素阻害剤の場合、増強された生 物活性を有する物質として多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質を製造し得る。我々は そのような物質がより強い生物活性を示すと考える。なぜならば多量体は、部分 の密度がより高くなり、そして高い代謝回転速度を示すからである。例えば、組 織プラスミノゲン活性化因子を有する多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質は、その− 価の対応物よりも強い血餅溶解触媒作用を有すると思われる。ヒルジン、ヒルジ ンペプチドのＣ末端（ＰＣＴ特許出願Ｗ０９０１０３３９１に記載、ここに引用 文献として加える）およびヒルジンの構造を基本とする分子（即ち１９９０年７ 月６日に出願のＵ、Ｓ、特許出願第５４９３８８号に記載のヒルローブ、ここに 引用文献として加える）を有する多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク賃は、これらのポ リペプチドの単量体よりも強い抗凝固活性を示し得る。

他の有用な部分は種々のＩＦＮ−α、特に　Ｃ２、Ｃ５、Ｃ８、ＩＦＮ−βおよ びＩＦＮ−γを含むサイトカイン、ＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−３゜ＩＬ−４， ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−７およびＩＬ−８を含む種々のインクロイキン、お よび腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αおよびβようなポリペプチドが含まれる。さらに、 機能性部分は、例えば、単球コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー 刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳ Ｆ）　、　エリスロポエチン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、および成長ホ ルモンおよびインシュリンを含むヒトおよび動物ホルモンを含む。

本発明の１つの実施態様では、多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質はＣＤ４−Ｃ４ｂ ｐ融合ポリペプチドを包含する。ＣＤ４は、ＡＩＤＳおよびＡＲＣの原因因子で ある旧Ｖを認識する白血球、１９７８球上のレセプターである［Ｐ、　Ｊ、　Ｍ ａｄｄｏｎら、−Ｔｈｅ　Ｔ４　Ｇｅｎｅ　Ｅｎｃｏｄｅｓｔｈｅ　ＡＩＤＳ　 Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｎｄ　Ｉｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｔ ｈｅ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｂｒａｉｎ−、Ｃｅ１ｌ 、　４７．　ｐｐ、　３３３−４８（１９８６月。詳細には、ＣＤ４は、ＨＩＶ ウィルスの表面タンパク質であるｇｐ１２０／１６０を認識する。これらの融合 ポリペプチドでは、機能性部分はＣＤ４あるいはその断片、好ましくは可溶性Ｃ Ｄ４を包含するポリペプチド部分である。　全ヒトＣＤ４蛋白質をコードするＤ ＮＡのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列が報告されている［Ｐ、　Ｊ、 　Ｍａｄｄｏｎら、”Ｔｈｅ　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉ ｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅｏｆ　ａ　ｃＤＮＡ　Ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｔ　 Ｃｅ１ｌ　５ｕｒｆａｃｅ　ＰｒｏｔｅｉｎＴ４：　Ａ　ＮｅｗＭｅｍｂｅｒ　 ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｂｕｌｉｎ　Ｇｅｎｅ　Ｆａ＋ａｉｌｙ−、 Ｃｅ１ｌ、　４２゜ｐｐ、９３−１０４　（１９８５）；　Ｄ、Ｒ，Ｌｉｔｔｍ ａｎら、−Ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ　ＣＤ４５ｅｑｕｅｎｃｅ”、　Ｃｅ１ｌ、　５ ５．　ｐ、５４１（１９８８）］。その推定−次構造に基いて、ＣＤ４蛋白質は 次のような機能性ドメインに分割される：（以下余白） 疎水性／分泌シグナル　−２５から一１疎水性／膜貫通配列　＋３７１がら＋３ ９１非常に親水性／細胞質内　＋３９２から＋４３１第一免疫グロブリン関連ド メインはさらに、約＋９５位のアミノ酸から始まる、可変部関連（ｖ）部位およ び連結部関連（Ｊ）部位に分割され得る。［Ｓ、　Ｊ、　Ｃ１ａｒｋら、−Ｐｅ ｐｔｉｄｅ　ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｏ−ｔｉｄｅＳｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｒａ ｔ　ＣＤ４　（Ｗ３／２５）　Ａｎｔｉｇｅｎ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒＤｅ ｒｉｖａｔｉｏｎ　ｆｒｏｒａ　ａ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｗｉｔｈ　Ｆｏｕｒ 　Ｉ＋ｕ＋ｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ　Ｄｏｍａｉｎｓ−、Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、　８４．　ｐｐ、　１ ６４９−５３　（１９８７）］ これらのドメインはまた、領域内ジスルフィド結合により形成される構造的ドメ インに概略的に相応する。従って、ジスルフィド結合は第一免疫グロブリン関連 ドメインの＋１６位と＋８４位のアミノ酸を、第二免疫グロブリン関連ドメイン の＋１３０位と＋１５９位のアミノ酸を、および第四免疫グロブリン関連ドメイ ンの＋３０３と＋３４５位のアミノ酸を連結させる。図４は図３Ａ−３Ｂのヒｌ −ＣＤ４蛋白質の領域構造を表す。

可溶性ＣＤ４蛋白質は、膜貫通ドメインおよび細胞質内ドメインを除去するため に、全長ＣＤ４蛋白質を＋３７５位のアミノ酸で切断することにより構築された 。そのような蛋白質は組み換えＤＮＡ技術により作製されており、組ｍ元可溶性 ｃＤ４（ｒｓＣＤ４）と称される［Ｒ，Ａ、　Ｆｉｓｈｅｒら、”旧Ｖ　Ｉｎｆ ｅｃｔｉｏｎ　Ｉｓ　Ｂｌｏｃｋｅｄ　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｂｙ　Ｒｅｃｏｍｂ ｉｎａｎｔ　５ｏｌｕｂｌｅ　ＣＤ４°、　Ｎａｔｕｒｅ、　３３１．　ｐｐ、 １Ｂ−７８（１９８８）ｒ　Ｆｉｃｈｅｒら、　ＰＣＴ特許出願Ｗ０８９１０１ ９４０（こコニ引用文献として加えるル。これらの可溶性ＣＤ４蛋白質は、ブロ ックあるいは競合的結合機序により、ＣＤ４”Ｊンパ球／ＨＩＶの相互作用を有 利に妨害し、このことにより、ＣＤ４蛋白質を発現している細胞の旧Ｖｇ染を抑 制する。箪−免疫グロブリン関連ドメインは、ｇｐ１２０／１６０に結合するに 十分である。可溶性のウィルスレセプターとして作用するので、可溶性ＣＤ４蛋 白質は、ＣＤ４　”リンパ球への旧Ｖの結合およびウィルスに起因する合胞形成 を抑制する抗ウイルス治療薬として有用である。

本発明で有用なＣＤ４ポリペプチドには、ｇｐ１２０／１６ｏに結合するか、ま たは抑制する、全てのＣＤ４ポリペプチドが含まれる。

これらには、図３Ａ−３８の＋３７１位から＋３９１位のアミノ酸である膜貫通 ドメインを欠いた、ＣＤ４断片が含まれる。そのような断片はＣＤ４の切断型で あるか、あるいは第四免疫グロブリン関連ドメインが親水性細胞質内ドメインに 直接連結された融合蛋白質であり得る。ポリペプチドの二次構造はその機能にと って重要なので好ましくは、可溶性ＣＤ４蛋白質はドメイン内のジスルフィド結 合が可能となるに十分なだけのドメインであって、次の免疫グロブリンドメイン の最初のシスティンを含むには不十分なドメインを含有する。この範囲内にあれ ば、ある種のアミノ酸配列は、より強い親和性でｇｐ１６０／１２０に結合する 。

我々はここで、随意にＮ末端メチオニンを含む、図３Ａ−３Ｂの相位から＋Ｘ位 のアミノ酸を含むＣＤ４ポリペプチドをｒＣＤ４（Ｘ）Ｊと呼ぶ。

例えば、図３Ａ−３Ｂを参照して、第一〇の免疫グロブリン様ドメインを含む可 溶性ＣＤ４蛋白質は、好ましくは、少な（とも＋１位から＋８４位のアミノ酸を 、多くとも＋１位から＋１２９位のアミノ酸を含む。最も好ましくは、可溶性Ｃ Ｄ４蛋白質は＋１位から＋１１１位のアミノ酸を含む［ＣＤ４（１１１）］。最 初の２個の免疫グロブリン様ドメインを含む可溶性ＣＤ４蛋白質は好ましくは、 少なくともで＋１位から＋１５９位のアミノ酸を、多くとも相位から＋３０２位 のアミノ酸を含む。より好ましくは、可溶性ＣＤ４蛋白質は少なくとも＋１位か ら＋１７５位のアミノ酸を、多くとも＋１位から＋１９０位のアミノ酸を含む。

最も好ましくは、可溶性ＣＤ４蛋白質は＋１から＋１８１位のアミノ酸［ＣＤ４ （１８１）］、＋１から＋１８３位のアミノ酸［ＣＤ４　（１８３）］、あるい は村から＋１８７位のアミノ酸［ＣＤ４　（１８７）］を含む。最初の４個の免 疫グロブリン様蛋白質領域を含む可溶性ＣＤ４蛋白質は好ましくは、少なくとも ＋１位から＋３４５位のアミノ酸を、多くとも＋１位から＋３７５位のアミノ酸 を含む［ＣＤ４（３７５）］。これらの任意の分子も随意に、図３Ａ−３Ｂの一 ２５位から一１位のアミノ酸である、ＣＤ４シグナル配列を含み得る。またこれ らの分子は随意に、図３−Ａ−３８の＋１位のアミノ酸の前にメチオニン残基を 含み得る。

本発明の融合ポリペプチドおよび方法に有用な可溶性ＣＤ４蛋白質は、様々な方 法で製造され得る。我々は図３Ａ−３８にｐＪＯＤ。

５ＣＤ４．　Ｙ１８７およびｐ１７０．２から得られた、ＣＤ４　ｃＤＮＡの全 ヌクレオチド配列、およびそれから推定されるアミノ酸を示した。図３Ａ−３Ｂ と同等の系によると、Ｔ細胞から分離された成熟ＣＤ４蛋白質のアミノ末端アミ ノ酸は、図３の１３６位のヌクレオチドに位置するリジンである［Ｄ、　Ｒ，Ｌ ｉｔｔｍａｎら、上述］。可溶性ＣＤ４蛋白質はまた、＋６２位のアミノ酸がＣ ＧＧでコードされるアルギニンであるもの、および＋２２９位がＴＴＴでコード されるフェニルアラニンであるものを含む。従って、我々がＣＤ４に言及すると きは、これらの置換の一方または両方を含んだアミノ酸配列が含まれることを意 図する。可溶性ＣＤ４ポリペプチドはオリゴヌクレオチド特異性変異誘導法およ び制限酵素による消化、それに続くリンカ−の挿入のような通常の技法、あるい は全長ＣＤ４蛋白質の酵素による消化により作製され得る。

可溶性ＣＤ４タンパク質は以下のものに記載の工程による組換え技術により産生 される該タンパク質を含む。二同出願人による係属中の同種出願である、１９８ ７年９月４日に提出された米合衆国特許出願番号第０９４３２２号、１９８８年 １月７日に提出された出願第１４１６４９号、１９８９年５月２４日に提出され た出願策３５１９４５号およびＰＣＴ特許出願第ＷＯ３９１０１９４０号として 公開された１９８８年９月１日に提出されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ８８ １０２９４０号。これらに開示されているものをここに参考文献として加える。

可溶性ＣＤ４タンパク質をコードするＤＮＡ配列を特徴とする微生物および組換 えＤＮＡ分子としては、ＰＣＴ特許出願番号第Ｗｏ　８９１０１９４０号に記載 の培養物が例示される。それらは、１９８７年９月２日にＩｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｉ ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、　Ｉｎｃ、　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ ｎ、　Ｌｉｎｔｈｉｃｕｍ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡに寄託され、次のよう に認定された。

ＥＣ１００：　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ８３／ｐＥｃ１００　−　ＩＶＩ　１０１４ ６ＢＧ３７７：　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１／ｐＢＧ３７７　−　ＩＶＩ　１ ０１４７ＢＧ３８０：　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１／ｐＢＧ３８０　−　ＩＶ Ｉ　１０１４８ＢＧ３８１：　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１／ｐＢＧ３８１　− 　ＩＶＩ　１０１４９゜そのような微生物および組換えＤＮＡ分子としてはまた 、１９８８年１月６日にＩｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎ ｃ、ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、次のように認定された 培養物も例示される。

ＢＧ−３９１：　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１／ｐＢＧ３９１　−　ＩＶＩ　１ ０１５１ＢＧ−３９２：　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１／ｐＢＧ３９２　−　Ｉ ＶＩ　１０１５２８Ｇ−３９３：　Ｅ、ｃｏｌｊ　ＭＣ１０６１／ｐＢＧ３９３ 　−　ＩＮ　１０１５３８Ｇ−３９４：　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１／ｐＢＧ ３９４　−　ＩＶＩ　１０１５４８Ｇ−３９６：　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１ ／ｐ８Ｇ３９６　−　ＩＶＩ　１（１１５５２０３−５：　Ｅ、ｃｏｌｉ　５Ｇ ９３６／ｐ２０３−５　−　ＩＶＩ　１０１５６さらに、そのような微生物およ び組換えＤＮＡ分子としては、１９８８年８月２４日に　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｉ ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ、Ｉｎｃ、ｃｕｌｔｕｒｅｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託さ れ、次のように認定された培養物が例示される。

２１１−１１：　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ａ８９／１）ＢＧ２１１−１１　−　ＩＶＩ　 １０１８３２１４−１０：　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ａ８９／ｐＢＧ２１４−１０　−　 ＩＶＩ　１０１８４２１５−７　：　Ｅ、ｃｏｌｊ　Ａ８９／ｐＢＧ２１５−７ 　−　ＩＶＩ　１０１８５ＣＤ４−Ｃ４ｂｐ融合ポリペプチドを含む多量体Ｃ４ ｂｐ融合タンパク質は、多様な薬剤組成物および方法に有用である。ＣＤ４−Ｃ ４ｂｐ融合タンパク質は、その競合的に結合する特長により、ＨＩＶのＴ４＋リ ンパ球への結合を有利に抑制する。そしてそれらは、ｇｐ１２０／１６０タンパ ク質を発現し、ＨＩＶを産生じている旧Ｖ感染細胞を、活発に破壊する。従って 、ＣＤ４−Ｃ４ｂｐ融合タンパク質は、ＡＩＤＳ、　ＡｆｆＣ，ＨＩＶに感染し 、あるいは旧Ｖに対する抗体を有するヒトを治療する薬剤の組成物および方法に 使用され得る。それらはまた、［Ｖ感染の免疫障害作眉の軽減、あるいは旧ｖｇ 染の発生および拡散の予防に有用である。さらにこれらのＣＤ４−Ｃ４ｂｐ融合 タンパク質および方法は、例えばサル免疫不全ウィルスのようなレトロウィルス により引き起こされる、ヒトを含む哺乳類のＡＩＤＳ様疾病の治療に使用され得 る。

Ｃ４ｂｐ融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、多量体Ｃ４ｂｐ融合蛋白 質の生産に有用である。好ましい工程は、発現されたポリペプチドを多量体に適 正に集合させる宿主での、そのようなりＮＡ配列の発現を含む。

当業者には周知のように、本発明のＤＮＡ配列の発現のためには、ＤＮＡ配列は 適当な発現ベクター中で発現制御配列に有効に連結され、適当な単細胞宿主を形 質転換する発現ベクターに組込まれねばならない。このように本発明のＤＮＡ配 列を発現制御配列に有効に連結することは、もちろん、該ＤＮＡ配列の上流の正 しいリーディングフレーム内に翻訳開始シグナルを備えることを含む。発現され るべき特定のＤＮＡ配列がメチオニンで始まらない場合は、開始シグナルは生成 物のＮ末端に位置する付加アミノ酸、メチオニンとなる。このようなメチオニル 基含有生成物が本発明の組成物および方法に直接使用され得るが、一方メチオニ ンを使用前に取り去ることが、通常、より望まれる。メチオニンと共に発現され るポリペプチドからの、そのようなＮ末端メチオニンの除去法は当業者に知られ ている。例えば、ある種の宿主および発酵条件は、インビボで実質的にすべての Ｎ末端メチオニンを除去させる。他の宿主はインビトロでのＮ末端メチオニンの 除去を必要とする。

しかしながら、インビボおよびインビトロでのそのような方法は当業者には周知 のことである。

多様な宿主／発現ベクターの組合わせが本発明のＤＮＡ配列の発現に使用され得 る。例えば、有用な発現ベクターは次に示すような染色体ＤＮＡ、非染色体ＤＮ Ａ、および合成りＮＡ配列のセグメントからなる二種々の既知のＳＶ４０誘導体 および細菌プラスミド、例えばｃｏｌＥｌ、　ｐｃＲｌ、　ｐＢＲ３２２，ｐＭ Ｂ９およびそれらの誘導体を含むＥ、ｃｏＪｉ虫来プラスミド、ＲＰ４のような 宿主範囲の広いプラスミド；ファージＤＮＡ、例えばＮＭ９８９のようなλファ ージのような他のＤＮＡ）１−ジ；２μプラスミドあるいはその誘導体のような 酵母プラスミド；および、ファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を使用するよ うに改変されたプラスミドのような、プラスミドとファージＤＮＡとの組合わせ に由来するベクター。

さらに、ＤＮＡ配列に有効に連結されるとそのＤＮＡ配列の発現を制御する配列 である、任意の多様な発現制御配列が、本発明のＤＮＡ配列を発現するこれらの ベクターに使用され得る。そのような有用な発現制御配列には、例えば、ＳＶ４ ０あるいはアデノウィルスの初期および後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系 、ＴＡＣあるいはＴＲＣ系、λファージの主要オペレーターおよびプロモーター 領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセレートキナーゼある いは他の解糖酵素のプロモーター、Ｐｂｏ２のような酸ホスファターゼのブロー モター、酵母α接合因子のプロモーター、バ牛ユ口ウィルスの多角体プロモータ ーおよび、原核細胞または真核細胞あるいはそれらのウィルスの遺伝子の発現を 制御することが知られている他の配列およびそれらの種々の組合わせを含む。

また、多様な単細胞宿主細胞が、本発明のＤＮＡ配列の発現に有用である。これ らの宿主は次に挙げる周知の原核細胞および真核細胞を含む二大腸菌株、シェー ドモナス、バチルス、ストレプトマイセス、酵母のような真菌類、ならびにＣＨ Ｏおよびマウス細胞、ＣＯ５−１，ＣＯ５−７、ＢＳＣＬ、Ｂ５Ｃ４０およびＢ ＭＴＩＯのようなアフリカミドリザル細胞のような動物細胞、昆虫細胞および組 織培養におけるヒト細胞および植物細胞。動物細胞での発現には、我々はＣＨＯ 細胞およびＣＯ５−７細胞を好む。

必ずしも全てのベクターおよび発現制御配列が、本発明のＤＮＡ配列の発現に同 等には機能しないことは理解されるべきである。同様に、必ずしもすべての宿主 が同じ発現システムで同等には機能しない。しかし、当業者はこれらのベクター 、発現制御配列および宿主を、過度の実験作業をせずに本発明の範囲から逸脱す ることなく選択し得る。例えば、ベクターの選択にあたって宿主は考慮されねば ならない。なぜならば、ベクターはその中で複製しなければならないからである 。ベクターのコピー数、そのコピー数の制御能力、およびそのベクターにコード されている、たとえば抗生物質マーカーのような他のタンパク質の発現もまた考 慮されるべきである。

発現制御配列の選択にあたって、種々の因子もまた考慮されるべきである。これ らには例えば、系の相対的強さ、本発明の特定のＤＮＡ配列に対する制御能力お よび適合性が、特に潜在的二次構造に関して、含まれる。単細胞宿主は次のこと を考慮して選択されるべきである二選ばれたベクターとの適合性、本発明のＤＮ Ａ配列の発現による産物の、該細胞に対する毒性、該細胞の分泌特性、タンパク 質の立体構造を正しく形成する能力、発酵の必要性、および本発明のＤＮＡ配列 により発現した、コードされている生成物の精製の簡便性。

す、またはＣＩ（Ｏ細胞あるいはＣＯ５−７細胞のような動物細胞の大量培養に より発現する、種々のベクター／発現制ａｍ構／宿主の組み合わせを、当業者は 選択し得る。

本発明の一実施態様によると、プラスミドｐＪｏＩ）−ｓ　（ｕ　ｕ　ニ記載） に挿入され、ＣＯ５−７あるいはＣＨＯ細胞で発現された、ＣＤ４−Ｃ４ｂｐ融 合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、自然に７量体ＣＤ４−Ｃ４ｂｐ融合 タンパク質に集合する融合ポリペプチドを産生ずる。

本発明のＤＮＡ配列の発現によって産生されるポリペプチドおよびタンパク質は 、発酵あるいは動物細胞培養から単離され、あらゆる多様な通常の方法で精製さ れる。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、最も適当な分離および精 製技術を選択し得る。

Ｃ４ｂｐ融合ポリペプチドはまた、固相合成法［Ｒ，Ｂ、　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌ ｄ、　”５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　１ ．　Ｔｈｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ＯｆＡ　Ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ”、　Ｊ 、ＡｔＣｈｅ＋ｓ、Ｓｏｃ、、８３．　ｐｐ、２１４９−５４　（１９６３）Ｊ のような通常のペプチド合成技術を用いて、化学的に合成し得る。その後、多量 体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質は、Ｃ４ｂｐ融合ポリペプチドの内部あるいはポリペ プチド間のジスルフィド結合をインビトロで形成することにより製造され得る。

遺伝的融合および化学的合成に加えて、多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質の製造に 有用な他の方法は、単量体Ｃ４ｂｐに機能性部分を化学的に結合することによる 。この方法はポリペプチド部分または化学部分の両方に有用である。機能性部分 は、例えばｈＣ４ｂｐそのものあるいは多量体組み換えｈＣ４ｂｐのような、個 別のＣ４ｂｐ単量体あるいは既に多量体に集合したＣ４　ｂｐ単量体に結合され 得る。

化学的結合には数種の方法が使用される。これらには例えば、次のものを使用す る方法が含まれるニゲルタルアルデヒド［Ｍ、Ｒｅ１ｃｈｌｉｎ、−Ｕｓｅ　ｏ ｆ　Ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ　ａｓ　ａ　ＣｏｕｐｌｉｎｇＡｇｅｎｔ　 ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ＋Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ 　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、７０．ｐｐ、　１５９−６５（１９８０）］、］Ｎ− エチルーＮ’−３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド［Ｔ、　Ｌ、　 Ｇｏｏｄｆ　ｒ　１ｅｎｄら、−Ａｎｔｉ−ｂｏｄｉｅｓｔｏ　Ｂｒａｄｙｋｉ ｎｉｎ　ａｎｄ　Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ：　Ａ　Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｃａｒｂｏ− ｄｉｉｍｉｄｅｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、５ｃｉｅｎｃｅ、１４４． ｐｐ、１３４４−４６（１９６４）］または、］Ｎ−エチルーＮ’−３−ジメチ ルアミノプロピル）−カルボジイミドとコハク酸化担体の混合物［Ｍ、Ｈ，Ｋｌ ａｐｐｅｒ　ａｎｄ　［、Ｍ、Ｋｌｏｔｚ。

−Ａｃｙｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　Ａｃ１ｄ　ａｎ ｈｙｄｒｉｄｅｓ−、ＭｅｔｈｏｄｓＩｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２５．ｐｐ 、５３１−３６（１９７２）］、または　ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ ｍｐａｎｙ　Ｃａｔａｌｏｇに記載のへテロ二機能性またはホモ二機能性架橋剤 。化学結合はＣ４ｂｐ単量体の一部位に限られていないので、一つ以上の機能性 部分を各々のＣ４ｂｐ単量体に結合することが可能である。さらに、過ヨウ素酸 ナトリウム法［Ｐ、に、Ｎａｋａｎｅ　ａｎｄ　Ａ、Ｋａｗａｏｉ、　−Ｐｅｒ ｏｘｉｄａｓｅ−１ａｂｅｌｅｄ　Ａｎｔｉｂ。

ｄｙ：　Ａ　Ｎｅｗ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ−、Ｊ、Ｈ ｉｓｔｏｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｒａ、、　２２．ｐｐ、　１０８４−９１（ １９８４）］を用いてタンパク賃上のグリカンに機能性部分を結合させ得る。

ヘテロ多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質は、異なるＣ４ｂｐ単量体の組合わせ、異 なる機能性部分の組合わせ、あるいはそれら両方の組合わせを包含する。例えば 、ヘテロ多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質は、１つ以上のＣ４ｂｐ単量体（例えば Ｃ４ｂｐ、　５ＣＲ４およびＣ４ｂｐ、　５ＣＲ８）と１つのタイプの機能性部 分との組合わせ、１つのタイプのＣ４ｂｐ単量体と１つ以上のタイプの機能性部 分（例えば認識分子およびレポーター基）との組合わせ、１つ以上のＣ４ｂｐ単 量体の組み合わせと１つ以上の機能性部分の組合わせとの組合わせ、および、全 てのＣ４ｂｐ単量体が機能性部分に融合あるいは化学的に結合しているわけでは ない組み合わせを包含する。

２つの異なるポリペプチド部分を含有するヘテロ多量体ｃ４ｂｐ融合タンパク質 は、異なる２つのポリペプチドをそれぞれコードするＤＮＡ配列を１宿主内で発 現させることよって有利に製造される。適当なシステムで発現すると、ポリペプ チドは集合して、１つ以上のタイプの機能性部分を含む多量体融合タンパク質に なる。

本発明の別の実施態様によると、ポリペプチド部分および化学部分、または２つ の異なる化学部分を特徴とするヘテロ多量体もまた製造され得る。上述のように 、部分は、集合以前あるいは以後にポリペプチドに化学的に結合され得る。

ヘテロ多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質は、異なる部分の性質が互いに補充し合う とき、特に有用である。例えば、本発明により、特定の標的粒子あるいは細胞に 結合するレセプターと、毒素あるいは抗レトロウィルス剤とを融合タンパク質中 に組合わせて、標的性毒素あるいは標的性レトロウィルス剤を作製することが可 能である。毒素として有用なポリペプチドはリチン、アブリン、アンギオゲニン 、シェードモナス外毒素Ａ５ポークウィード抗ウィルスタンパク質、サポリン（ ５ａｐｏｒｉｎ）　、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）およびジフテリア毒素、ある いはそれらの毒性部分が含まれるが、これらだけに限らない。有用な抗レトロウ ィルス剤はスラミン、アジドチミジン（ＡＺＴ）、ジデオキシシチジン、ならび にカスタノスペルミン、デオキシノジリマイシン・（ｄｅｏｘｙｎｏ　ｊｉｒｉ Ｂｃ　ｉｎ）およびそれらの誘導体のようなグルコンダーゼ阻害剤を含む。

本発明のへテロ多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質はまた、試料中あるいはインビボ での標的分子の存在を確認する診断薬として有用である。そのようなタンパク質 は、標的分子に結合する免疫グロブリンまたはその断片（Ｆａｂ、　ｄＡｂ）　 ＣＷａｒｄら参照、上述］のような認識分子である１つの機能性部分および、放 射性核種、酵素（ホースラディソシニパーオキシダーゼのような）あるいは、蛍 光または化学ルミネッセンスマーカーである２番目の機能性部分を包含する。多 量体Ｃ４ｂｐは大きいので、多くのレポーター基の結合が可能であり、それがシ グナルを増強する。これらのへテロ多量体は例えば、ＥＬＩＳＡ型のアッセイで 試料に接触する認識分子として抗体と置き換えられたり、インビボの造影剤とし て使用され得る。

本発明によるヘテロ多量体Ｃ４ｂｐ融合タンノ４り質はまた、複合ワクチンとし ても使用され得る。例えば、そのような融合タンパク質は同じ感染因子からの数 種の異なる抗原決定基を用いて構築され得る。さらに、ポリオ、麻疹、流行性耳 下腺炎および他の小児ワクチンに使用されているような数種の感染因子からの抗 原決定基を含有する融合タンパク質を製造し得、従って、複合ワクチンが作製さ れる。

本発明による多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質はまた、通常付随しているヒトＣ４ ｂｐのタンパク質Ｓ−結合サブユニットをも含む。

そのようなタンパク質は最初のＣ４ｂｐ融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配 列および２番目のタンパク質Ｓ−結合サブユニットをコードするＤＮＡ配列を用 いた宿主の形質転換において産生される。これらのＤＮＡ配列は発現すると、Ｃ ４ｂｐポリペプチドは集合してタンパク質Ｓ結合サブユニットの付随した多量体 となる。　Ｃ４ｂｐポリペプチドが通常７量体（タンノくり質Ｓ−結合サブユニ ットを含まない）に集合する一方、もし単量体ポリペプチドが通常より小さいか 、あるいは大きい場合、それらは例えば８量体あるいは６量体に集合し得る。従 って、本出願で言及する多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質は７量体のＣ４ｂｐ融合 タンパク質以外のものも含む。

本発明の薬物学的組成物は、典型的には有効量の本発明のＣ４ｂ９融合タンパク 質および薬物学的に許容し得る担体を包含する。本発明の治療方法は、薬物学的 に許容し得る方法で患者をそれらの組成物で処置する過程を包含する。°これら の組成物はヒトを含むすべての哺乳類の処置に使用され得る。本発明の薬物学的 組成物は多様な形態をとり得る。これらは例えば、錠剤、丸剤、散剤、液体溶液 あるいは懸濁液、リポソーム、座剤、注射および輸液可能な溶液、および持続放 出型のような、固体、半固体および液体の投与形態を含む。好まし形態は、意図 する投与法および治療応用に依る。該組成物はまた、好ましくは、当業者には知 られている通常の薬物学的に許容できる担体およびアジュバントを含む。

概して、本発明の薬物的組成物は、例えばαインターフェロンのような薬物学的 に重要なポリペプチドに使用されるものに類似の方法および組成物を用いて製剤 化され、投与され得る。そして、本発明の融合タンパク質は凍結乾燥形態で保存 され、投与直前に滅菌水で戻され、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、あるいは病 巣内経路のような通常の投与経路により投与され得る。有効投与量は約１０−１ ００μｇ／ｋｇ体重７日の範囲にあり、低用量および高用量もまた有用であるこ とが認められる。通常の投与量は含有される特定の分子部分によって変化するこ とが理解される。

さらに、Ｃ４ｂｐ融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は体性遺伝子治療に 使用され得る。これは、例えば、ヒト体細胞の感染に好適なレトロウィルスを基 礎とするベクターに、ＤＮＡ配列を挿入することを含む［Ａ、Ｋａｓｉｄら８” Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ 　ｏｆ　Ｈｕａ＋ａｎ　Ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ　Ｌｙｍｐｈｏ ｃｙｔｅｓ　ａｓ　Ｖｅｈｉｃｌｅｓ　ｆｏｒ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ−ｍｅｄ ｉａｔｅｄ　Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ−、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｅｔ、、ＵＳＡ、　８７．　ｐｐ、　４７３−７７　（１９９０）］。

例えば、ＡＩＤＳあるいはＪＲＣ患者は次のように処置されるであろう・先ス、 ＣＤ４−Ｃ４ｂｐ融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を特徴とするレトロ ウィルスを調製する。次に患者からＴ細胞を分離し、インビトロでそれらを前記 レトロウィルスに感染させる。それからこれらの細胞を患者に再導入し、そこで ベクターが発現して、細胞はＣＤ４−Ｃ４ｂｐポリペプチドを分泌する。

本発明がよりよく理解されるように、次の実施例を以下に述べる。これらの実施 例は解説のみを目的とし、どのような場合にも本発明の範囲を限定するように解 釈されない。

以下に述べる実施例で用いられた、クローニング、制限酵素による切断、ＤＮＡ 断片の分離、フレノウ酵素およびデオキシリボヌクレオチド３リン酸（ｄＸＴＰ ）による充填、ライゲート、Ｅ、　ｃｏｌ　ｉの形質転換　のような分子生物学 的技術は、Ｊ、　Ｓａｍｂｒ。

ＯｋらＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍ ａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙ。

ｒｋ（１９８９）に例証され、さらに詳細に記載されている通常のプロトフール である。

実り寓」町−ｒ−０４ＰＡタンパク　のクローニング我々は次の方法でヒトＣ４ 結合タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を分離した。ヒト肝細胞（Ｈｅｐ　Ｇ ２）をＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、 　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ、　ＵＳＡ、　ＡＴＣＣＨＢ　８０ ６５より入手した。我々はこれらの細胞からポリアデニル化ｍＲＮＡを、グアニ ジウムインチオシアネート／オリゴｄＴセルロース法［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上 述、　ｐｐ、　７．１９−７．２２］を用いて分離した。５μｇのポリアデニル 化ｍＲＮＡ、　Ｍｏ−ＭＬＶ逆転写酵素、およびプライマーＣ４ｂｐ、　３を用 いて、アンチセンスＣ４ｂｐ単鎖ｃＤＮＡを合成した。

（すべてのオリゴヌクレオチドプライマーおよびスプリントプローブのＤＮＡ配 列は図５Ａ−５Ｂに示される。）次に、二次ｃＤＮＡ鎖をＧｕｂｌｅｒ−Ｈｏｆ ｆｍａｎ法［Ｕ、Ｇｕｂｌｅｒ　ａｎｄ　Ｂ、Ｊ、Ｈｏｆｆｍａｎ、　”Ａ　Ｓ ｉｍｐＩｅ　ａｎｄ　Ｖｅｒｙ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　 Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ　ｃＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｔｅｓ−、Ｇｅｎｅ、　２５． 　ｐｐ、　２６３−６９　（１９ｇ３）　］を用いて合成した。

Ｃ４ｂｐのｃＤＮＡ配列をＰＣＲ法［Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ら、上述、　１４章］ を用いて増幅した。我々はすべての増幅を、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよび、 Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰで予め酸化されたプライマーを用い て行った。オリゴヌクレオチドＣ４ｂ＄）、　１をセンスプライマー（アンチセ ンスストランドとハイブリダイズする）として、およびＣ４ｂｐ、　２をアンチ センスプライマーとして用いた。増幅された断片をフレノウ酵素およびｄＸＴＰ で満たした。これはＣ４ｂｐをコードする１７４６ｂｐの断片を産生じ、転写開 始および停止シグナルで枠どった。この断片の同一性をＳ　ｎａＢ　ｌおよびＰ ｓｔｌによる消化で証明した。Ｃ４ｂｐのＤＮＡ配列から予想されたように、５ ｎａＢＩによる消化は１４３６ｂｐの断片を、また５ｎａＢＩ／Ｐｓｔｌによる 消化は１０４７ｂｐの断片を産生じた。

次にＣ４ｂｐをコードする断片を、以下のように作成される動物性発現ベクター ｐＪＯＤ−Ｓに挿入した。（図６Ｂ−６Ｃ参照）。

先ず、我々はｐＪＯＤ−ＬＯを入手した。欧州特許出願第３４３７８３号に記載 のように、ｐＪＯＤ−１０は以下のように調製され得る。ブラスミ　ドｐｓＶ２ −ＤＨＦＲ，（ＡＴＣＣ３７１４６，Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕ ｒｅ　Ｃａ１ｌｅｃｔｉｏｎ）　［Ｓ、　Ｓｕｂｒａｍａｎｉ　ら、−Ｅｘｐｒ ｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ　Ｒｅ ｄｕｃｔａｓｅ　Ｃｏｍｐｌｅｎ＋ｅｎｔａｒｙ　Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌ ｅｉｃ　Ａｃｔｄ　ｉｎ　５１ｍ１ａｎ　Ｖｉｒｕｓ　４０　Ｖｅｃｔｏｒｓ− 、Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、１．　ｐｐ、　８５４−６４　（１ ９８１）　］をＡｐａｌおよびＥｃｏＲＩで消化し、４４２０ｂｐの断片を分離 した。次に、Ａｐａｌルミｌオーバーハングガストリン遺伝子の＋１９０から＋ ２３３のヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列［Ｋ、　５ａｔｏ　ら、−Ａ　５ ｐｅｃｉｆｉｃ　ＤＮＡ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌｓ　Ｔｅｒ＋ｍ１ ｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｇａ５ｔｒ ｆｎ　Ｇｅｎｅ＋Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、、　６．　ｐｐ、　１０３２−４３　（１９８６）図４］、Ｘｈｏ１ 部位、およびＥｃｏＲＩオーバーハングを有する合成二本鎖ＤＮＡを作製した。

このオリゴヌクレオチドを、ｐｓＶ２−ＤＩ（ＦＲから取られた４４２０ｂｐの 断片に連結し、得られたプラスミドをｐＤＴ４と呼んだ。プラスミド１）ＤＴ４ を次に、ＡａｔｌｌおよびＸｈｏｌで消化し、４３９１ｂ＋）の断片を分離した 。ミューラー管抑制物質発現ベクターｐＤ１［Ｒ，Ｌ、ｃａｔｅ　ｅｔａｌ、、 　＋ｌ５ｏｌａｔｆｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂｏｖｉｎｅ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　 Ｇｅｎｅｓ　ｆｏｒ　Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　５ｕｂｓｔ ａｎｃｅ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｕ＋５ａｎＧｅｎ ｅ　ｉｎ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌｓ−、Ｃｅ１１．　４５．　ｐｐ、６８５− ９６　（１９８６）　］を、次にＡａｔ　Ｉ　＋およびＳａｌ　Ｉで消化し、得 られた５４６２ｂｐの断片を分離した。この断片を１）ＤＴ４の４３９１ｂｐ断 片に連結してｐＪＯＤ−１０を作製した。

我々はｐＪＯＤ−１０を旧ｎｄｌｌｌおよびＢｓｔＥＩＩで消化し、ミューラー 管抑制物質をコードしない大きい断片を分離した。その断片を平滑末端にし、Ｓ ａｉ＋リンカ−を端に連結し、ベクターに自己連結させた。これはｐＪＯＤ−Ｓ を生成した。

次にＣ４ｂｐをコードする断片を挿入するため、ｐＪＯＤ−Ｓを調製した。プラ スミドを唯一のＳａｌ　１部位でのＳａｔ　Ｉによる消化により線形化し、フレ ノウ酵素およびｄＸＴＰで満たすした。そしてそれに、Ｃ４ｂｐをコードする断 片を、丁４　ＤＩＪＡ　リガーゼおよびＡＴＰを用いて連結した。連結混合物を Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩに電気搾孔法により導入した。機器とともに供給され たプロトコールに基いて、電気搾孔を２５　μＦＤ、　２．　Ｓｋｉ、　２００ ｏｈｍで旧ｏＲａｄ　ＧＥＮＥ　ＰＵＬＳＥＲＲを用いて行った［Ｂｉｏｒａｄ 　Ｃａｔａｌｏｇ、　−Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｔｒａｎｓｆｏ ｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｕ１ｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ　Ｉｎｓｔｒｕｍ ｅｎｔ　Ｍａｎｕａｌｏ、　２１６５−２０９８．　ｖｅｒｓｉｏｎ　２−８９ ］ｏ　その後、適正な方向に挿入部分を有するプラスミドを、３２ｐ標識合成オ リゴヌクレオチドスプリントプローブＣ４ｂｐ、　９およびＣ４ｂｐ−１０とハ イブリダイズさせることにより同定した。スプリントプローブは挿入部分とベク ターとの間の融合点を超えてハイブリダイズする、３０塩基の長さの合成オリゴ ヌクレオチドである。得られたプラスミドをｐＪＯＤ、　Ｃ４ｂｐ、と呼んだ。

我々はこのプラスミドの一株、ｐＪＯＤ、　Ｃ４ｂｌ）、　３．を寄託した。

Ｘ施ヨー■−匹独二乙１虹二及里 組み換えヒＩ−Ｃ４ｂｐ（ｒｈＣ４ｂｐ）の発現を試験するため、我々は５株の ｐＪＯＤ、　Ｃ４ｂｐからのスーパーコイルプラスミドＤＮＡを電気搾孔法によ りＣＯ５−７細胞に導入した。電気搾孔法を２０μｇのスーパーコイルプラスミ ドおよび３８０μｇの鮭精子ＤＮＡとともに、８ｏｏμｌの２０ｍＭ　ＨＥＰＥ Ｓ、　ｐＨ７，０５，１３７ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＫＣｌ、　０．７ｍＭＮ ａ２ＨＰＯａおよび６ｍＭデキストロース中の１ｘｌｏ７個の細胞を用いて、２ ８０Ｖおよび９６０μＩ’Ｄで行った。コントロールとして、ベクターに逆方向 に挿入されたＣ４　ｂｐ断片を有するプラスミドを用いた。

従って、それらはＣ４ｂｐを全（産生じない。

形質転換された細胞を、１０％ＦＢＳ、４ｎ＋Ｍグルタミン、２ＱｔａＭＨＥＰ ＥＳ（ｐ）Ｉ　６．ａ＞を含むＤＭＥＭ培養液で、３７°Ｃおよび５％ＣＯａで 、１００ＩＩｌｉｌデイツシニあるいは７７５組轍培養フラスコに撒いた。次に 、７２時間後に培養上清中のｒｈＣ４ｂｐをアッセイし、３つの方法を用いて生 産物を特定した：免疫沈降、ゲル濾過およびウェスタンプロットによる免疫検出 。これらのアッセイでは産生されたｒｈｃ４ｂｌ）をヒト血清中の天然型ｈＣ４ ｂｐと比較した。我々の結果は、トランスフェクションされたＣＱＳ−７細胞が 天然型のｈｃ４ｂｐに分子量の点で類似し、そして抗ｈＣ４ｂｐ抗血清に認識さ れるエピトープを有している、適正に折りたたまれたＳＣＲを有する、７量体の Ｃ４ｂｐタンパク質を産生じたことを示した。組み換えヒトＣ４ｂｐは、タンパ ク質Ｓ結合サブユニットを欠く点において、血清型と異なる。

Ａ、　ｒｈり迩」地糺史裏！ 最初のアッセイで、我々は２つの異なるｈ　Ｃ４ｂｐ特異的抗血清を用いて、ｒ ｈＣ４ｂｐおよびｈＣ４ｂｐの両方を免疫沈降し、沈降したタンパク質のサイズ をジスルフィド結合の還元前後に、標準ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア ミドゲル電気泳動法（５ＤＳ−ＰＡＧＥ）で比較した。

免疫沈降で分離されたｒｈＣ４ｂｐおよびｈＣ４ｂｐの比較により、ＣＯ３−７ 細胞で産生されたｒｈＣ４ｂｐがジスルフィド結合を介して７量体ｒｈＣ４ｂｐ タンパク質に適正に集合したことを示した。

ヒト血清（Ｇｉｂｃｏ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）お よびＣＯ５−７培養土清の免疫沈降を次のように行った。固定化プロテインＧ（ Ｇｉｂｃｏ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　１１１ｉｎｏｉｓ）懸濁液０．０５ｍ１を １ｍ＋１の血清に加え、混合液を室温で３０分間攪拌することにより試料を前処 置した。次にプロティンＧ粒子を遠心機で沈降し、その上清を免疫沈降に使用し た。上清を、０．０５ａ＋１のポリクローナルウサギ抗ｈＣ４ｂｐ抗血清（Ｃａ ｌｂｉｏｃｈｅＩＩ＋　Ｃｏｒｐ、、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ／Ｌａ　Ｊｏｌｌａ 。

Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）またはポリクローナルヒツジ抗ｈＣ４ｂｐ抗血清（旧ｏ ｄｅｓｉｇｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、　Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋｐｏｒｔ、 　Ｍａｉｎｅ）のどちらかと共に、室温で１時間、インキュベートした。その後 Ｏ，０５ｍ１のプロティンＧ懸濁液を加え、室温で１時間インキュベートした。

ペレットを遠心分離し、ｌｏＯｍＭ　ＮａＣ１および１％ツイン（Ｐｉｅｒｃｅ ）を含む、５０ｍＭ　トリスヒドロキシアミノメタン（ｐＨ８゜０）（Ｔｒｉｓ 、　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　Ｍ ｉｓｓｏｕｒｉ）に再懸濁した。溶液を再度遠心分離し上清を除した。この過程 を、同緩衝液およびｌｏｍＭ　）リス、ｐＨ７，４で２回繰り返した。最後にペ レットをＯ，１５ａ＋１の標準レムリ試料に再懸濁し、その溶液を沸騰水浴槽で ５分間加熱した。その後、沈降したタンパク質の分子量を５％または１２％の５ ＤＳ−ＰＡＧＥで決定した。

ヒト血清Ｃ４ｂｐは、４５ｋＤのタンパク質Ｓ結合サブユニットに結合した７量 体Ｃ４ｂｐを表す、約５３０ｋＤのバンドを生成した。ｒｈＣ４ｂｐは、タンパ ク質Ｓ結合サブユニットを含まない７量体ｒｈＣ４ｂｐの予想された分子量であ る、約４９０ｋＤのバンドを生成した。発現しない方向の挿入ＤＮＡを有する、 コントロール試料はバンドを生成しなかった。

沈降したｒｈＣ４ｂｐが７量体であったことを証明するために、ジスルフィド結 合したタンパク質をそのポリペプチドサブユニットに分ける還元剤２−メルカプ トエタノールを用いて、免疫沈降したタンパク質を５ＤＳ−ＰＡＧＥに流した。

我々は、Ｃ４ｂｐポリペプチドのサイズである７０ｋＤの／＜ンドをｈＣ４ｂｐ およびｒｈＣ４ｂｐの両方が生成することを見い出した。

５ｔｏｎ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）の存在下にＣＯ５−７細胞で発現さ れたｒｈＣ４ｂｐの免疫沈降を行った。３５でラベルされたタンノくり質を前述 のウサギ抗ｈＣ４ｂｐ抗血清で沈降し、４ト２０％の濃度傾配の５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅで分析した。非還元条件下で、上述の４９０ｋＤタンパク質に等しい高分子量 のバンドをオートラジオグラフで検出した。

還元後、このバンドは消失し、約７０ｋＤのバンドが出現した。

どちらのバンドもネガティブコントロールには無かった。このことは、Ｃ４ｂｐ ポリペプチドが集合して７量体になることを確認した。

（以下余白） Ｂ、ウェスタンプロットによるｒＣ４ｂ　の　島、次に我々は、トリクロロ酢酸 （ＴＣＡ）を用いて非選択的にｒｈｃ４ｂｐおよびｈＣ４ｂｐを免疫沈澱し、３ つの異なるｈＣ４ｂｐ特異的抗血清を用いたウェスタンプロットによりタンパク 質を同定した。非還元および還元条件下でのウェスタンプロットでのｒｈＣ４ｂ ｐおよびｈＣ４ｂｐの免疫学的検出は、ＣＯ５−７細胞がｒｈＣ４ｂｐを、ジス ルフィド結合が適切に折畳まれたかたちで産生ずることを示した。

我々は１０倍に濃縮された（ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ　３０　（登録商標）。

Ａｍ１ｃｏｎでの限外濾過によって濃縮）細胞培養液からｒｈＣ４ｂｐを沈澱さ せ、および１２％ｗ／ｖＴＣＡを加えることにより血清からｈＣ４ｂｐを沈澱さ せた。水中で１時間放置の後、タンパク質をＥＰＰＥＮＤＯＲＦ　（登録商標） 遠心管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中で、４℃、１０．０００ｇで１０分間遠心分離 してペレット化した。ペレットを１ｍｌの水冷アセトン（−２０℃）に再懸濁し 、直後に上記条件下で再ペレット化した。我々はこの洗浄工程を一回反復した。

最後に、我々はタンパク質ペレットを標準レムリ試料緩衝液に溶解し、溶液を沸 騰水中で５分間加熱した。

次に我々は、非還元および還元条件下（２−メルカプトエタノールを使用）に、 ５％アクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上でタンパク質を分離した。我々 はこれらのタン１＜りｉを、ｍ準免疫プロッティング法を用いてニトロセルロー ス上に移した。次いで我々は、プロットを免疫学的検出により調べた。

我々は、５％脱脂粉乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ、　Ｌｏｓ　Ａｎｇｅｌｓ、　Ｃａ １ｉｆｏｒｎｉａ）を含むダルベツコのＰＢＳ中でインキュベートすることによ り、これらのプロットの非特異的結合をブロックした。次に、我々はプロットを 、１：　５００に希釈した一次抗体を含む５％粉乳溶液中でインキュベートした 。−次抗体として、我々は、ポリクローナルウサギ抗ｈＣ４ｂｐ抗血清（Ｃａｌ ｂｉｏｃｈ　ｅｍ）、ポリクローナルヒツジ抗ｈＣ４ｂｐ抗血清（Ｂｉｏｄｅｓ ｉｇｎ）またはモノクローナルネズミ抗ｈＣ４ｂｐ抗体（Ｑｕｉｄｅｌ、　Ｓａ ｎ　Ｄｉｅｇｏ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を用いた。室温で１時間放置の後、 我々はプロットをＰＢＳ中の０．０５％ツイン−２０で３回洗浄した。次にプロ ットを、５％粉乳溶液中の１：　１０００希釈の二次抗体と共にインキュベート した。二次抗体として、我々は、それぞれウサギＩｇＧ、ヒツジＩｇＧまたはマ ウスＩｇＧに対する抗体に結合させたホースラディッシュパーオキシダーゼ市販 品（Ａ＋＋ｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、、　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ 、　１１１ｉｎｏｉｓ　ｏｒ　Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用した。室温で１時 間のインキュベージ１ンの後、上記洗浄工程を反復した。我々は抗原抗体複合体 を、ホースラディッシュパーオキシダーゼの基質４−クｏｏ−１−ナフトール（ ０，０２％、　ｖ／ｖ、　Ｓｉｇｍａ）およびＰＢＳ中の過酸化水素（０，０３ ％、　Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートすることにより可視化した。

ｒｈＣ４ｂｐの場合、分子量約４９０ｋＤの単一バンドを検出した。ヒト血清の 場合、バンドは僅かに高分子量（約５３０ｋＤ）に移行し、このことは、さらに ４５ｋＤのタンパク質Ｓに結合するサブユニットの存在することを反映し得る。

我々は陰性コントロール中にはタンパク質を検出しなかった。

これらの結果は、再度、ｒｈＣ４ｂｐの組換え型が、抗ｈｃ４ｂｐ抗血清によっ て認識されて天然型からタンパク質Ｓに結合するサブユニットを引いた分子量に 類似する７量体に集合することを示した。１２％アクリルアミドゲル（ＳＤＳ− ＰＡＧＥ）によるタンパク質の還元と分離の後、我々は上記抗血清を用いた如何 なる場合にも、なんらタンパク質を検出できなかった。このように、使用した抗 血清は、単に正確に折畳まれたジスルフィド結合を有するｈＣ４ｂｐのみを認識 した。このことは、非還元条件下で抗血清により検出されたｈＣ４ｂｐの組換え 型が、タンパク質Ｓに結合するサブユニットの無いそのタンパク質の天然に存在 する形態に同一または類似することの新たな証拠を提供する。

Ｃ，ｈＣ４ｂｐ特異的ＥＬＩＳＡによるｈＣ４ｂｐおよびｒｈＣ４ｂｐ含有画分 のゲル透過クロマトグラフィーおよびδ 我々はさらに、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ゲル透過法を用いて、 タンパク質の天然構造を保持する条件下でｒｈＣ４ｂｐとｈＣ４ｂｐとを分離し た。続いて、我々はピーク位置を同定し、そして分画についてｈＣ４ｂｐＣ４ｂ ｐ特異的酵素膜着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行うことによりおよその分子量を同 定した。

ｒＣ４ｂｐおよびｈＣ４ｂｐのＨＰＬＣは我々の前の結果を支持し、ＣＯ３−７ 細胞が７量体の形態でｒＣ４ｂｐを産生ずることを示した。さらに、ｈＣ４ｂｐ はタンパクｉｓまたはＣ４ｂ（Ｃ４の断片）のような天然のりガントに結合して 存在することも示唆した 我々はＴＳＫ−４０００ＳＷＸＬ　（登録商標）ＨＰＬＣケル透過カラム（３０ ０ｘ７．８ｍｍ、Ｔｏｙｏ　５ｏｄａ、７０８０Ｍ　Ｃｏｒｐ、、Ｊａｐａｎ） を、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７゜０．１００ｍＭ塩化ナトリウム中に平衡化 した。我々はカラムを、分子量マーカーであるチログロブリン（約６７０ｋＤ） 、フェリチン（約４４０ｋＤ）およびカタラーゼ（約２３０ｋＤ）（すべてＰｈ ａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ製）を用いてキヤリプレートシ、溶出したピークをＵＶ 検出器を用いて２８０ｎｍで検出した。

我々はヒト血清（０，０５ｍ１をＰＢＳでｏ、ｓｍｔに希釈）または発現された ｒｈｃａｂｐを含有する１０倍濃度の細胞培養物上清（０，５ｍ１）を、このカ ラムに負荷した。カラムからタンパク質を、１ｍｌ／分の一定の流速の平衡用緩 衝液で溶出し、０．５ｍ１分画を集めた。

集めた分画を我々は、ｈＣ４ｂｐ特具的サンドイッチＥＬＩ　ＳＡ　（ＥＬ　Ｉ 　５Ａ９）を用いてアッセイした。（本明細書中に記載のＥＬＩＳＡアッセイの 要約については図１０を参照。）詳細には、我々は９６ウエル標準ＥＬ　Ｉ　Ｓ Ａプレート（イミｘ　ロン［［、Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 製）を、０．０５Ｍ重炭酸緩衝液、ｐＨ９，０中の０．００５μｇ／ｍｌのタン パク質濃度のポリクローナルヒツジ抗ｈＣ４ｂｐでコートした。我々はプレート を４°Ｃで一晩インキユベートした。我々はウェルの非特異的部位を、ＰＢＳ中 の２％牛乳を添加して室温で少なくとも３０分間インキコベートすることにより ブロックした。我々はＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中の０．０５％ツイン２０で ３回洗浄し、ＨＰＬＣカラムからの分画を２％脱脂粉乳を含むＰＢＳでｌ：２ま たは１：１０で希釈して各々０．０５ｍ１ずつ加えた。次に我々はプレートを室 温で３時間インキュベートし、それらを上記のように洗浄した。

我々は各ウェルに、２％粉乳を含有するＰＢＳで最適に希釈した（１：　３００ ０）０．０５ｍ１のポリクローナ／Ｌ／　ウーｆギ抗ｈＣ４ｂｐ血清（Ｃａ　ｌ ｂｉｏｃｈｅｍ）を加えた。我々はプレートを室温で１時間インキュベートした 後、上記のように洗浄した。

最後に、我々は、２％粉乳を含有するＰＢＳで適当に希釈した０、０５ｍ１のホ ースラディッシニバーオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合したヤギ抗ウサギＩ　ｇ　 Ｇ　（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ　Ｃｏｒｐ、、　Ｗｅｓｔ　Ｃｈｅｓｔ ｅｒ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ）を加え、プレートを室温で１時間インキュ ベートした。洗浄後、プレートにＯＰＤ★（０−フェニレンジアミン）　（Ｃａ ｌｂｉｏｃｈｅｍ）をＨＲＰの基質として加え、ＨＲＰ抗体結合量を比色検出し た。我々は４９０ｎｍでの各ウェルの吸光度を読んで結果を定量した。

（★これは強力な発ガン性物質であり、処分する前に５０ｇＫ２Ｃｒ○７．２５ ｍ１　ＩＯＮ　Ｈ２Ｓ０ａ、１４５ｍ１　Ｈ２Ｏの溶液を用いて無毒化するべき である。）次に我々は、図８に示すように分画番号に対して結果をプロットした 。図に示したように、ｒ　ｈＣ４ｂ　ｐの溶出プロフィールは４９０ｋＤにピー クを有しており、このことは、ＣＯ５−７細胞に発現されたｒｈＣ４ｂｐが、正 確に折り畳まれた免疫エピトープを示す７量体として存在することを示す別個の 結果に一致した。しかし、ｈＣ４ｂｐの溶出プロフィールのピークは、予想され る５３０ｋＤとは対照的に、７００ｋＤより幾分高かった。このことは、この分 子の、Ｃ４およびタンパク質Ｓのような天然のりガントへの非共有結合の結果で あり得る。我々はまた、これらの分画中にタンパク質Ｓの存在を観察したくデー タは示さない）。

案ＪＪＬ！Ｌ　−−ｒ　ｓ　ＣＤ　４　１８７　を　るベク　一次に我々は、ｒ ｓＣＤ４　（１８７）をコードするＤＮＡ配列を特徴とするプラスミドである、 ｐＪＯＤ、３ＣＤ４．Ｙ１８７．５ｎａＢ１を作成した。我々はＰＣＴ出願公開 第ＷＯ３９１０１９４９号に記載（７）ｐＪＯＤＳＣＤ４から開始した。これは 以下のように調製される（図６Ｇ参照）。プラスミドｐＢＧ３９１　（ＩＶＩ　 １０１４９）をＢ　ａ　ｍＨＩおよびＢｇｌｌＩで消化し、フレノウ酵素とｄＸ ＴＰで満たした。

配列５’　ＣＣＴＣＧＡＧＧを有する二本鎖Ｘｈｏ　Ｉリンカ−を、末端にＴ４ ＤＮＡリガーゼでライゲートした。混合物はｘｈｏ　Ｉで消化し、ｒ　ｓ　ＣＤ ４をコードする１４０７ｂｐ断片を単離した。次に実施例！に記載のｐＪＯＤ− Ｓを５ａｌｌで消化し、アルカリホスファターゼでリン酸化した。得られた１４ ０７ｔ）ｐ断片は、５ａＩＩ消化したｐＪＯＤ−ＳにＴ４ＤＮＡリガーゼでライ ゲートした。こうしてｐＪＯＤｓＣＤ４が作られた。

次に我々は、ｐＪＯＤｓＣＤ４を修飾して５ｎａＢＩクロ一ニング部位（図６Ｈ 参％、）を創り出した。我々は以下のように、ＣＤ４の１８７位のチロシン残基 をコードする配列の直後に、５ｎａＢＩ開裂部位を導入した。我々は、リン酸化 Ｃ４ｂｐ、７をリン酸化Ｃ４ｂｐ、８にハイブリダイズすることにより、単一の ５ｎａＢ１部位を含有するＮ　ｈ　ｅ　Ｉ　／　Ｂｇｌｎを創造した。次に我々 は、ｐ　ＪＯＤｓ　ＣＤ４をＮｈｅＩで完全に、またＢｇｌｆｆで部分的に消化 した。我々はリンカ−をこの消化混合物の中に加え、断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ でライゲートした。次に我々は、実施例Ｉの方法を用いて、ライゲート混合物を Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩに電気注入した。我々は、３２ｐ標識した添えプロー ブＣ４ｂｐ、１１を用いたハイブリダイゼーションにより、正確に大きな消化断 片のＢｇｌ■部位に隣接した合成断片を含むプラスミドを同定した。我々はこの ようなプラスミドをｐＪＯＤ、５ＣＤ４゜Ｙ１８７．５ｎａＢ１と名付けた。

！　−−ＣＤ　４−　Ｃ４ｂ　ｐ融合ポリペプチドのクローニング 次に我々は、ＣＤ４−Ｃ４ｂｐ融合ポリペプチドを発現する３つのクローンを構 築した（図７参照）。これには、Ｃ４ｂｐまたはその断片をコードするＤＮＡ配 列を、ｐ　Ｊ　ＯＤ。

５ＣＤ４．Ｙ１８７．５ｎａＢ１の５ｎａＢＩ部位に挿入することか含まれる。

我々は、それぞれ５ＣＲ８−ＳＣＲＩとＣ４ｂｐコア、５ＣＲ４−ＳＣＲＩとＣ ４ｂ−コア、または５ＣＲＩとＣ４ｂｐコアをコードする、３つのＤＮＡ配列を 使用した。以下のようにＰＣＲによってそのＤＮＡ配列を得た。

我々は、Ｎｏｔｌで線状にしたｐＪＯＤ、Ｃ４ｂｐ、３を用いてＰＣＲを行うこ とにより、５ＣＲ８−ＳＣＲＩとＣ４ｂｐコアとをコードするＣ４ｂｐの１６４ ８ｂｐ断片を製造した。我々はプレリン酸化センスプライマーＳＣＲ，８および プレリン酸化アンチセンスプライマーＣ４ｂｐ、２を用いた（図５Ａ−５Ｂ）。

次に我々は、ＰＣＲ産物の末端をフレノウ酵素およびｄＸＴＰで対にした。我々 は得られた断片を、予め５ｎａＢＩで線状にしたｐＪＯＤ、５ｃＤ４Ｙ１８７゜ ５ｎａＢ１にライゲートした。我々はライゲート混合物をＥ。

ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩに電気穿孔注入した。次に我々は、３２Ｐ標識したオリゴ ヌクレオチド添えプローブＣ４ｂｐ、１２にハイブリダイズさせることにより、 チロシンをコードする配列が５ＣＲ８に隣接しているプラスミドを同定した。の ようなブ５７．ミドをｐＪＯＤ、５ＣＤ４．Ｙ１８７．５ＣＲ８と名付けた。我 々は、このようなプラスミドにより発現される融合ポリペプチドを、ＣＤ４　（ １８７）　−Ｃ４ｂｐ　（ＳＣＲ８）と名付けた。我々はｐＪＯＤ、５ＣＤ４． Ｙ１８７゜５ＣＲ８，２およびｐＪＯＤ、５ＣＤ４．Ｙ１８７．５ＣＲ８，３の プラスミドの単離物を得た。

我々はＳＣＲ，８の代わりにセンスプライマー３１２．２１を用いたこと以外は 、上記のように５ＣＲ５−５ＣＲＩとＣ４ｂｐコアとをコードするＣ４ｂｐの１ ０８９ｂＩ）断片を製造した。次に我々は、予め５ｎａＢＩで線状にしたｐＪＯ Ｄ、５ＣＤ４．Ｙ１８７．５ｎａＢ１に断片をライゲートした。我々はライゲー ト混合物をＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩに電気穿孔注入した。次に我々は、３２ｐ 標識したオリゴヌクレオチド添えプローブ３１２．３６に対するハイブリダイゼ ーションにより、チロシンをコードする配列が５ＣＲ５に隣接したプラスミドを 同定した。我々はこのようなプラスミドをｐＪＯＤ、５ＣＤ４．Ｙ１８７．５Ｃ Ｒ５と名付けた。我々は、このようなプラスミドによって発現される融合ポリペ プチドを、ＣＤ４　（１８７）−Ｃ４ｂｐ　（ＳＣＲ５）　と呼んだ。

我々は、ｐＪＯＤ、５ＣＤ４．Ｙ１８７．５ＣＲ５，ｌおよびｐＪＯＤ、５ＣＤ ４．Ｙ１８７．５ＣＲ５，２（Ｄプラスミドの２つの単離物を得た。

我々はＳＣＲ，８の代わりにセンスプライマーＳ　ＣＲ。

４を用いたこと以外は、上記のように５ＣＲ４−ＳＣＲＩとＣ４ｂｐコアとをコ ードするＣ４ｂｐの９０８ｂｐ断片を製造した。次に我々は、予め５ｎａＢ　Ｉ で線状にしたｐ　Ｊ　ＯＤ。

５ＣＤ４．Ｙ１８７．５ｎａＢ１に断片をライゲートした。

我々はライゲート混合物をＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩに電気穿孔注入した。次に 我々は、３２ｐ標識したオリゴヌクレオチド添えプローブＣ４ｂｐ、１３に対す る／１イブリダイゼーションにより、チロノンをコードする配列が５ＣＲ４に隣 接したプラスミドを同定した。我々はこのようなプラスミドをｐＪＯＤ、５ＣＤ ４．Ｙ１８７．５ＣＲ４と名付けた。我々は、このようなプラスミドによって発 現される融合ポリペプチドを、ＣＤ４　（１８７）−Ｃ４ｂｐ　（ＳＣＲ４）と 呼んだ。我々は、ｐＪＯＤ、５ＣＤ４．Ｙ１８７．５ＣＲ４，２およびｐＪＯＤ 、５ＣＤ４．Ｙ１８７．５ＣＲ４，３のプラスミドの２つの単離物を得た。

我々はＳＣＲ，８の代わりにセンスプライマー３１２．２０を用いたこと以外は 、上記のように５ＣＲ３−３ＣＲＩとＣ４ｂｐコアとをコードするＣ４ｂｐの７ １１ｂｐ断片を製造した。次に我々は、予め５ｎａＢＩで線状にしたｐ　Ｊ　Ｏ Ｄ。

５ＣＤ４．Ｙ１８７．５ｎａＢ１に断片をライゲートした。

我々はライゲート混合物をＥ、ｃｏｌｔ　ＨＢＩＯＩに電気穿孔注入した。次に 我々は、３２ｐ標識したオリゴヌクレオチド添えプローブ３１２．３５に対する ハイブリダイゼーションにより、チロシンをコードする配列が５ＣＲ３に隣接し たプラスミドを同定した。我々はこのようなプラスミドをｐＪＯＤ、５ＣＤ４． Ｙ１８７．５ＣＲ３と名付けた。我々は、このようなプラスミドによって発現さ れる融合ポリペプチドを、ＣＤ４　（１８７）−Ｃ４ｂｐ　（ＳＣＲ３）と呼ん だ。我々は、ｐＪＯＤ、５ＣＤ４．Ｙ１８７．５ＣＲ３，２およびｐＪＯＤ、５ ＣＤ４．Ｙ１８７．５ＣＲ３，３（１）プラスミドの２つの単離物を得た。

我々はＳＣＲ，８の代わりにセンスプライマーＳＣＲ，１を用いたこと以外は、 上記のように５ＣＲＩとＣ４ｂｐフアとをフードするＣ４ｂｐの３５３ｂｐ断片 を製造した。次に我々は、予め５ｎａＢＩで線状にしたｐＪＯＤ、５ＣＤ４゜Ｙ １８７．５ｎａＢ１に断片をライゲートした。我々はライゲート混合物をＥ、ｃ ｏｌｔ　ＨＢＩＯＩに電気穿孔注入した。次に我々は、３２ｐ標識したオリゴヌ クレオチド添えプローブｃ４ｂｐ、ｔ７に対するハイブリダイゼーションにより 、チロシンをコードする配列が５ＣＲＩに隣接したプラスミドを同定した。我々 はこのようなプラスミドをｐＪＯＤ、５ｃＤ４．Ｙ１８７．５ＣＲＩと名付けた 。我々は、このようなプラスミドによって発現される融合ポリペプチドを、ＣＤ ４（１８７）−Ｃ４ｂｐ　（ＳＣＲＩ）　と呼んだ。我々は、ｐＪＯＤ、５ＣＤ ４．Ｙ１８７．５ＣＲ１，１、ｐＪＯＤ、５ＣＤ４．Ｙ１８７．５ＣＲ１，２お よびｐＪＯＤ、５ＣＤ４゜Ｙ１８７．５ＣＲ１，３のプラスミドの３つの単離物 を得た。

支血匠呈−−ＣＤ４−Ｃ４ｂｐ多量体融合タンパク質のおよび 我々は、前述のようにして、実施例■に記載の全ての単離物を用いてＣＯ５−７ 細胞を形質転換し、培養物をＣＤ４−Ｃ４ｂｐ多量体融合タンパク質の発現につ いて試験した。詳細には、我々は各単離物からのスーパーコイルになったプラス ミドＤＮＡを、ＣＯ３−７細胞に電気穿孔注入した。７２時間させた後、培養液 を幾つかの異なるＥＬＩＳＡでアッセイした。我々の結果は、細胞がＣＤ４−Ｃ ４ｂｐ多量体融合タンパク質を発現したことを示した。

Ａ、ＣＤ４　１８７　−Ｃ４ｂ　５ＣＲ４の発我々は、ウェスタンプロットでの 免疫学的検出およびＥＬ■ＳＡアッセイの両者により、ＣＤ４　（１８７）−Ｃ ４ｂり（ＳＣＲ４）の発現について、形質転換した細胞の馴化培地を試験した。

結果は、これらの細胞がＣＤ４　（１８７）　−Ｃ４ｂｐ（ＳＣＲ４）を発現す ること、および発現されたポリが７量体に集合することを示した。

１、ＥＬＩＳＡアッセイ 我々は２つのＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイを行い、これらを組み合わせると、多量体 ＣＤ４　（１８７）−Ｃ４ｂｐ（ＳＣＲ４）ポリペプチドの産生が示された。こ こに記載の全てのＥＬＩＳＡアッセイにおいて、我々は工程の間でプレートを、 ＰＢＳ中の０．０５％ツイン２０で洗浄した。

２つのＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイは以下のように行った。我々はイムロン■プレー トを、ウサギ抗ｈＣ４ｂｐ　（ＥＬＩＳＡＩ）または抗ＣＤ４モノクローナル６ 　Ｃ６（Ｂｉｏｇｅｎ、Ｉｎｃ、、　Ｃａ＋ｍｂｒｉｄｇ、　ｙａｓｓａｃｈｕ ｓｅｔｔｓから贈呈）（ＥＬ　Ｉ　５Ａ２）を用いて、炭酸ナトリウム緩衝液ｐ Ｈ９，０中の各抗体の５μｇ　／　ｍ　１溶液を５０μＩ／ウェル加え、プレー トを４℃で一晩インキュベートすることによりコートした。コート用溶液を除い た後、我々はＰＢＳ中の２％脱脂粉乳を２００μｌ／ウェル加え室温で少なくと も３０分間インキュベートすることにより、非特異的結合をブロックした。次に 、我々はブロック用溶液を除去し、ＰＢＳ中の試料（馴化培地または２％脱脂粉 乳に希釈した馴化培地）を５０μｌ／ウエル添加して室温で３時間インキュベー トした。我々はこの液体を除去し、適切に希釈した（１：　１０００）ＨＲＰ− 結合６Ｃ６の検出用抗体を５０μｌ／ウエル添加した。６Ｃ６は抗ヒトＣＤ４ネ ズミモノクローナル抗体であり、ＣＤ４−ｇｐ１２０の結合を遮断する。（ＣＤ ４のｇｐ１２０への結合をブロックし、６Ｃ６の代わりに使用し得る他の抗体に は、Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、　Ｍ。

ｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａから入手可能な抗Ｌｅｕ−３ ａがある。）我々はプレートを室温で１時間インキュベートした。

我々は溶液を除去しＯＰＤを添加した。再び我々は、プレートを室温で２０〜３ ０分インキュベートし、ｌＮ硫酸により星光反応を停止した。次に我々は、４９ ０ｎｍで０．Ｄ、を測定した。

両アブセイは陽性の結果を示した。抗ｈＣ４ｂｐ抗体でプレートをコートして行 ったアッセイでは、ｈＣ４ｂｐおよびＣＤ４の両者のエピトープを含有するポリ ペプチドの存在が検出された。６Ｃ６モノクローナルでプレートをコートしたア ッセイでは、多量体の存在のみが確認された。多量体は、６Ｃ６の１つを越える コピーに同時に結合可能な、多重結合部位のみを有するからである。

２、ウェス　ンプロット　の　・ ウェスタンプロットによる馴化培地の免疫学的検出は、形質転換された細胞がＣ Ｄ４　（１８７）−ｃａｂｐ　（ＳＣＲ４）を生産したことを確立し、さらにポ リペプチドが７量体に組み立てられたことを示した。我々は、実施例■に記載し たように馴化培地の２つの試料について免疫沈降を行った。初めの試料について 、我々はポリクローナルウサギ抗ｈＣ４ｂｐ抗血清（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅ＋＋＋ ）を用いた。二番目の試料について、我々は６Ｃ６抗体を用いた。我々は各試料 中の免疫沈澱したタンパク質を５％５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、次にタンパク質 を、標準的電気プロッティング条件下でニトロセルロース上に移した。我々は得 られたウェスタンプロットを、２つの抗血清の各々を用いてプローブした。第一 はポリクローナルなヒツジ抗ｈＣ４ｂｐ抗血清（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）である。

第二はポリクローナル抗ｈＣＤ４抗血清（Ｂｉｏｇｅｎ、　Ｉｎｃ、からの贈与 ）である。我々は免疫学的検出を上記実施例■の記載に従い行った。抗ｈＣ４ｂ ｐ抗血清および抗ｈＣＤ４モノクローナル抗体の両者は、ＣＤ４　（１８７）− ｃ４ｂｐ　（ＳＣＲ４）の７量体の推定分子量、即ち４００ｋＤ〜５００ｋＤを 有する両プロット上のタンパク質を検出した。

我々はコンドロールー−ｒｈＣ４ｂｐおよびヒト血清を用いて同一の免疫学的検 出を行った。この場合もまた、抗ｈｃ４ｂｐはタンパク質の高分子量の形態を検 出した。しかし、かなるタンパク質も検出することができなかった。

同一のタンパク質が、抗ｈＣＤ４および抗ｈＣ４ｂｐ抗血清の両者が馴化培地か ら沈澱されたという事実は、ＣＤ４　（１８７）−Ｃ４ｂｐ　（ＳＣＲ４）が実 際に融合ポリペプチドとして発現し、７量体の形態に集合されたことを示した。

我々はまた、３ＳＳ標識化システイン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａ ｒ）の存在下で、ＣＯ５−７細胞中に発現したＣＤ４　（１８７）−Ｃ４ｂｐ　 （ＳＣＲ４）の免疫学的沈澱を行った。我々は上述のウサギ抗ｈＣ４ｂｐ血清を 用いて、得られた３５３標識化タンパク質を沈澱させ、４％〜２０％の濃度勾配 の５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。非還元条件下で、我々は４００ｋＤから５００ ｋＤの高分子量のバンドをオートラジオグラフ上に検出した。還元の後、このバ ンドは見えなくなり、５３．５ｋＤのバンドが生じた。両方のバンドは陰性コン トロール試料中には存在しなかった。このことは、ＣＤ４　（１８７）−ｃ４ｂ ｐ　（ＳＣＲ４）が発現して７量体に集合したという我々の前の結果を確立した 。

Ｂ、カラムクロマトグラフィーによる多量体ＣＤ４　（１８７）−Ｃ４ｂｐ（Ｓ ＣＲ４）の 我々は通常のカラムクロマトグラフィ法を用いてＣＤ４　（１８７）−Ｃ４ｂｐ 　（ＳＣＲ４）を精製した。我々は、ＣＤ４　（１８７）−ｃ４ｂｐ　（ＳＣＲ ４）を安定に発現する形質転換ＣＨＯ細胞系から得られた馴化培地２０１を採取 した。

形質転換ＣＨＯ細胞系は、Ｂａｒｓｏｕｍの米国特許第４，９５６゜２８８号に 記載された電気穿孔法により、ｐＪＯＤ、５ＣＤ４、Ｙ１８７．５ＣＲ４，２を 用いてＣＨＯ細胞を形質転換して調製した。好ましくは、我々はＣＤ４−Ｃ４ｂ ｐ融合タンパク質を３つのカラム：最初にＦＡＳＴ　Ｓ（登録商標）（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ製）イオン交換カラム；二番目にＣｕキレート５ＥＰＨＡＲＯ８Ｅ　 （登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）カラム；および三番目にＺｎキレートＳ 　Ｅ　ＰＨＡＲＯＳＥ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）カラムを順次用いて、ＣＤ４ −Ｃ４ｂｐ融合タンパク質を精製した。しかし、融合タンパク質は部分的にＦＡ ＳＴ　Ｓ（登録商標）で精製され得る。

ＦＡＳＴ　Ｓ（登録商標）クロマトグラフィを行うため、我々は水酸化ナトリウ ムを用いて馴化培地をｐＨ８，０に調製し、それを５μｍプレフィルタ−および ０．４５μｍフィルターで濾過した。我々は培地を、３ｍｌ／ｃｍ２時間で３０ ０ｍ１　（ＩＤ５０ｍｍ）のＦＡＳＴ　Ｑ（登録商標）イオン交換カラムに負荷 した。カラムを、２００ｍＭ　ＮａＣ１を含有する５力ラム体積の５０ｍＭ　Ｈ ＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ８、０で洗浄した。次に、２５０ｍＭ　ＮａＣ１を含有す る５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ％　ｐＨ８，０によりＣＤ４−Ｃ４ｂｐ融合タンパク質 を溶出した。

我々はさらに、ＣｕおよびＺｎキレートカラム（４０ｍｌ。

Ｉ　Ｄ　２５　ｍｍ）を順次用いて、溶出物を精製した。我々はこれらコラムに よる全ての工程を、４℃で流速０．４ｍｌ／ｃｍ２時間で行った。上記のような 各々の洗浄は、ａｏｍｔの緩衝液で行った。

我々は、Ｃｕキレートカラムを、５０ｍＭの水性ＣｕＣｌ２を用いて、Ｃｕイオ ンによるキレート化セファロースに負荷して調製した。我々はカラムを２回、最 初に５００ｍＭ）リス、５００ｍＭ　ＮａＣｌ５　ｐＨ８，０で、次に１０ｍＭ ）リス、５００ｍＭ　ＮａＣ１、ｐＨ８，０で洗浄した。

次に我々は、ＦＡＳＴ　Ｑ（登録商標）カラムからの溶出物をＣｕキレートカラ ムに負荷した。我々はカラムを３回、最初に５００ｍＭトリス、５００ｍＭＮａ Ｃ１、ｐＨ８，０；二番目に１０ｍＭトリス、ｐＨ８，ｏ；および三番目に１０ ｍＭ）リス、１００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８，０で洗浄した。次に我々は、Ｃ Ｄ４−Ｃ４ｂｐ融合タン／−ｅり質を１０ｍＭ）リス、５０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ ８，０で溶出した。溶出物は、１０ｍＭ）リス５００ｍＭＮａＣ１，ｐＨ８，０ １ご透析した。次に我々は、ＣｕＣｌ２の代わりにＺｎ５Ｏａに代えた以外はＣ ｕキレートカラムと同様にＺｎキレ−）ＳＥＰＨＡＲＯ８Ｅ　（登録商標）カラ ムを調製した。

次に我々は、Ｃｕキレートカラムからの透析された溶出物を、Ｚｎキレートカラ ムに負荷した。試料を負荷した後、我々は前と同じようにカラムを３回、最初に ５００ｍＭ）リス、５００ｍＭ　ＮａＣ１，ｐＨ８，０？二番目に１０ｍＭ！− リスｐＨ８，Ｏ：および三番目に１０ｍＭ１’リス、１００ｍＭイミダゾール、 ｐＨ８，０で洗浄した。次に我々６よ、ＣＤ４−Ｃ４ｂ　ｐ融合タンパク質を１ ０ｍＭ１−リス、２５ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ　ＮａＣ１、ｐＨ８，０で 溶出した。

我々はタンパク質を、５００ｍＭ　ＮａＣ１を含有する２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳＳ 　ｐＨ８，Ｏ中に保存した。この工程で、５ＤＳ−ＰＡＧＥで測定したところＣ Ｄ４　（１８７）−ＣＡＭ（ＳＣＲ４）の有意な濃度と精製とが得られた。

我々は次に、精製されたＣＤ４　（１８７）−ＣＡＭ　（ＳＣＲ４）を電子顕微 鏡で調べた。これを行うために、我々１よ常法によりＣＤ４−Ｃ４ｂｐ融合タン ノずり質にグリセロールを混合し、炭素コートしたグリ・ノド上に噴霧し、プラ チナで回転シャドーイングした。高拡大率で、分子は、中心から伸びる多数の棒 状アームを有する「クモ様」形態を有するように見えた。

Ｃ，ＣＤ４　（１８７）−Ｃ４ｂｐ　（４ＳＣＲ）のアフィニティー　１ 上記カラムクロマトグラフィーによる精製に代えて、我々はＣＤ４　（１８７） −Ｃ４ｔ＋ｐ（ＳＣＲ４）を以下のように精製した。我々はＣＤ４　（１８７） −Ｃ４ｂｐ　（ＳＣＲ４）多量体タンパク質を産生ずるＣＨＯ細胞の馴化培地を 、５ＩＯＹ３０（登録商標）スパイラルカートリッジ（Ａ＋ａｉｃｏｎ、　Ｄａ ｎｖｅｒｓ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて４℃で５０〜６０倍に濃 縮した。我々は濃縮した培地を、カルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢ Ｓで平衡化したＩＤ７−ＣＮＢｒ５ＥＰＨＡＲＯ８Ｅ（登録商標）アフィニティ ーカラムに、４℃で約１カラム体積／時間で通した。ＩＤ７はＣＤ４の第二免疫 グロブリン関連ドメインに結合するモノクローナル抗体である（　Ｉ　Ｄ　７　 Ｇ＊Ｐａｔｒｉｃｉａ　Ｃｈｉｓｈｏｌｍ　ｏｆ　Ｂｉｏｇｅｎ、　ｌｉｅ、か ら贈呈）ｏ　ＣＤ４タンパク質の全長を発現したトランスフェクトされたＣＨＯ によってマウスを免疫することによって産生された。我々は、ＩＤ７を産生じ、 モノクローナル抗体ＩＤ７．Ｇ１１と名付けられたハイブリドーマ系を、インビ トロインターナショナルインコーホレーテッドカルチャーコレクションに寄託し た。

ＣＮＢｒ５ＥＰＨＡＲＯＳＥ　（登録商標）はＳｉｇ＋＊ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｔｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、から購入した。ＩＤ７は、 本質的に製造業者の指示に従い、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で樹脂に結合させた。

一般に、樹脂上の抗体濃度は、融合タンパク質の最大の結合および溶出を達成す るために０．５ｍｇ／ｍｌにできるだけ近付けておかなければならない。

我々は負荷したカラムを３〜５力ラム体積のＰＢＳで洗浄した後、０．５Ｍ　Ｎ ａＣ１およびＰＢＳで再度洗浄した。

我々は結合タンパク質を、２０ｍＭ）リエチルアミンｐＨ１１、５（Ｐｉｅｒｃ ｅ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓ）、０．５Ｍ　ＮａＣ１で溶出した 。直ちに分画を、１１５０体積のＬＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６，８で中性にし、４ ℃で保存した。５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、実質的に純粋なＣＤ４　（１８７ ）−Ｃ４ｂ１）（ＳＣＲ４）タンパク質が明らかになった。緩衝液をＰＢＳに交 換し残存の不純物を取り除くため、我々はＹＭ３０（登録商標）膜（Ａ＋＋１ｃ ｏｎ、　Ｄａｎｖｅｒｓ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）上の限外濾過により 、調製物を約２　ｍ　ｇ　／　ｍ　１にまで濃縮した。濃縮物を、ＰＢＳで平衡 化した１、６ｘ５０ｃｍＳＵＰＥＲＯ３Ｅ−６（登録商標）サイズ除外カラム（ 分取用の等級、Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＩＪＢ、　Ｐｉｓｃａｔａｖａｙ、　Ｎｅ ｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）にかけた。融合タンパク質を含むタンパク質を５ＤＳ−ＰＡ ＧＥで同定し、クーマシーブルーで染色し、プールして０．２２μ　Ｍｉｌｌｅ ｘ−ＧＶ（登録商標）フィルター（ＭＨｌｉｐｏｒｅ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　Ｍ ａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）により滅菌濾過した。アミノ酸分析から、ＣＤ４　 （１８７）−Ｃ４ｂｐ　（ＳＣＲ４）の２８０ｎｍでの吸光係数を、１．４４Ａ ２６ａ単位／ｍｇ−１ｃｍ光路キニベットｍｌであると決定した。我々は最終物 質を、使用まで４℃で貯蔵した。最大活性のため、融合タンパク質は精製の後３ 〜５日間以内に使用するべきである。

２つのタイプのアッセイ、ＥＬＩＳＡア１セイおよびシンジチア遮断アッセイに よって、ＣＤ４　（１Ｂ？）−Ｃ４ｂｐ（ＳＣＲ４）　（７）　ＨＩＶ　ウィル ７゜のｇｐ１２０への結合能力を示した。

１、ｇｌユ」１−ム土Δ− ＣＤ４　（１Ｂ？）−Ｃ４ｂｐ（ＳＣＲ４）のｇｐ１２０への結合能力を示すＥ ＬＩＳＡアフセイ　（ＥＬＩＳＡ　３）を行ったｏ　ＰＢＳ中５μｇ／ＩＩｌの ｇｐ１２０　（Ａ＋ｓｅｒｉｃａｎＢｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ 、、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから商業的に入手可 能な）溶液を５０μｌ／ウェル加えることによって、ｇｉ）１２０でイムロン■ プレートをコートし、このプレートを４℃で一晩インキュベートした。コーティ ング溶液を除去した後、ＰＢＳ中２％の脱脂粉乳を２００μｌ／ウェル加えるこ とによって、非特異的結合をブロックし、プレートを室温で少なくとも３０分間 インキュベートした。ついで、ブロック溶液を除去し、試料（馴化培地すなわち ＰＢＳ中２％の脱脂粉乳において希釈した馴化培地）を５０μｌ／ウェル加え、 プレートを室温で３時間インキュベートした。ついで、液体を除去し、検出抗体 である、最適に希釈（１：３３３３）　したウサギ抗−ｈＣ４ｂｐ　（Ｃａｌｂ ｉｏｃｈｅｍ）を加えた。再び、プレートを室温で一時間インキュベートした。

ついで、この溶液を除去し、最適に希釈（１：１０ＧＧ）　Ｌ、ＨＲＰが結合し たヤギ抗ウサギ−１ｇＧ　（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ）を５０μｌ／ウ ェル加えた。プレートを室温で１時間インキュベートし、ついで溶液を除去し、 ＯＰＤを加え、再びプレートを室温で２０から３０分間インキュベートした。Ｉ Ｎの硫酸を用いて呈色反応を停止した。４９０ｎｍにおけるＯ、　Ｄ、を測定し た。このアッセイでは、陽性の結果が得られ、ＣＤ４（１８７）−Ｃ４ｂｐ（Ｓ ＣＲ４）融合ポリペプチドがｇｐ１２０に結合しているのが示された。

これらの結果を確認するために他のアッセイ（ＥＬＩＳＡ　４）を行ったところ 、ＣＤ４（１８７）−Ｃ４ｂｐ（ＳＣＲ４）があつまって多量体となっているの が示された。ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌのｇｐ１２０の溶液を５０μｌ／ウェル加え ることによって、イムロン１１プレートをｇｐ１２０でコートし、このプレート を４℃で一晩インキユベートしたＯコーティング溶液を除去した後、ＰＢＳ中２ ％の脱脂粉乳を２００μｌ／ウェル加えることによって、非特異的結合をブロッ クし、室温で少なくとも３０分間インキュベートした。ついで、ブロック溶液を 除去し、試料（馴化培地すなわちＰＢＳ中２％の脱脂粉乳において希釈された馴 化培地）を５０μｌ／ウェル加え、室温で３時間インキュベートした。この液体 を除去し、最適に希釈（１：１０００）　Ｌ、ＨＲＰが結合した６Ｃ６を５０μ ｌ／ウェル加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。この溶液を除去 し、ＯＰＤを加えた。室温で２０から３０分間インキュベートし、ＩＮの硫酸を 用いて呈色反応を停止した。４９Ｏｎ＋＊におけるＯ、Ｄ、を測定した。この二 番目のアッセイによって多量体の存在が確認された。なぜなら、多量体のみが、 ｇｌ）１２０と６Ｃ６モノクローナルに、同時に結合し得る多数の結合部位を有 しているか表面上でｇｐ１２０を発現する、ＨＩＶで感染した細胞を、ＣＤ４を 発現する細胞と融合して、多核細胞（シンジチア）を形成する。

ｇｌ）１２０に結合する分子は、シンジチアの形成をブロックする傾向がある。

Ｂ、Ｄ、Ｗａｌｋｅｒら、−Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｉ＋ａ ＋ａｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙＶｉｒｕｓ　５ｙｎｃｙｔｉｔｖ　Ｆｏｒｍａ ｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｖｔｒｕｓ　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｃａ５ｔａｎ ｏｓｐｅｒ＋ｍ１ｎｅ−１Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　ＳｃムＵＳＡ 　８４．ｐｐ、　８１２０−２４　（１９８７）に記載されるように、Ｃ８１６ ６細胞融合アッセイを行った。ＨＴＬＶ−ｒ　Ｉ　ＩＢで慢性的に感染した５Ｘ １０３のＨ９細胞を、ｐＨを６．８に調整したｌＯ■ＭのＨＥＰＥＳと２　ｍＭ のグルタミンとを含み、様々な濃度のＣＤ４（１８７）−Ｃ４ｂｐ（ＳＣＲ４＞ を用いて、５％のＣＯ２の存在下に３７℃で３０分間、２０％の胎児ウシ血清を 補給した１００μｌのＲＰＭｌ　１６４０培地中でインキュベートしたＯ　（Ｈ ９細胞は、ＡＩＤＳ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｒｅａ ｇｅｎｔ　Ｐｒｏｇｒａｍ、　ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ から商業的に入手できる）。ついで、１５Ｘ１０３のＣ８１６６細胞（ＣＤ４＋ を形質転換したヒトの謄帯血リンパ球系）［Ｊ。

５ｏｄｒｏｓｋｆら、”Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ＨＴＬｖ−１１１／ＬＡＹ　Ｅｎｖｅ ｌｏｐｅ　ｉｎ　Ｓｙｎｃｙｔｉｕｍ　Ｆｏｒｍｕｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｙ ｔｏｐａｔｈｔｃｉｔｙ”、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２２．　ｐｐ、　４７０−７ ４　（１９８６）］を、１００μｍの培地に加え、各ウェルの、最終容量を２０ ０μｍにし、５％のＣＯ２の存在下に３７℃でインキュベートした。（Ｃ８１６ ６細胞は、Ｄｒ、Ｒｏｂｅｒｔ　５ｃｈｏｏｌｅｙ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔ ｓＧｅｎｅｒａｌ　Ｈｏ５ｐｉｔａ１．　Ｂｏｓｔｏｎ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓ ｅｔｔｓから提供されたものであった）。ついで、Ｃ８１６６細胞を加えてから ２時間後および４時間後に、ウェル毎のシンジチアの総数を数えた。対比して行 った共培養では、ｐＪＯＤ、　Ｃ４ｂｐ、　３でトランスフェクトされたＣＯ５ −７細胞（負のコントロール）または２５　μｇ／＋ａｌで０ＫＴ４Ａでトラン スフェクトされたＣＯ５−７細胞（正のコントロール）からの培養上清を使用し た。（ＯＫＴ４Ａは、０ｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　５ｙｓｔｅｒｎｓ 、　Ｒａｒｉｔａｎ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙから入手可能である）。対照と比 較して、シンジチアが５０％減少しているのを陽性の結果とみなした。ｐＪＯＤ 、　Ｃ４ｂｐ、　３でトランスフェクトした細胞の培養上清が、シンジチアの形 成を阻害しなかったのに対して、０にＴ４ＡおよびＣＤ４（１８７）−Ｃ４ｂｐ （ＳＣＲ４）でトランスフェクトした細胞の培養上清は、シンジチアの形成を著 しく阻害していた。このことは、融合タンパク質が、Ｈ９９細胞面において、ｇ ｐＬ２０／１６０に結合していることを示した。

Ｂ、ＣＤ４１８７−Ｃ４ｂ　（ＳＣＲ４ハ、インヒトロニおける旧Ｖ−１（７） １をブロックする 実質的に、Ｍ、　Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ、　３１６．　 ｐｐ、　７２−７４（１９８５）ニ記載されるように、ＣＤ４（１８７＞−Ｃ４ ｂｐ（ＳＣＲ４）　（７）、ミクロ複製アッセイにおけるインビトロでの旧Ｖ− １？１１ｆＥｌのブロック能力を試験した。しかし、本願で記載されるように、 ４°Ｃではなく３７℃でインキュベーションを行った。

特に、段階的に希釈しり２０　ｔｔ　ｌ７７）ＣＤ４（１８７）−Ｃ４ｂｌ）（ ＳＣＲ４）または組換え可溶性ＣＤ４タンパク質（ＲＥＣＥＰＴＩＮ＠商標名ｒ ｓＣＤ４は、Ｂｉｏｇｅｎ、Ｉｎｃ、から提供された）を用い”Ｃまたは用いな いで、ＨＩＶ−１（２０μｌ；　１００　ＴＣＩＤｓｌｌ）　（以下の項目Ｃに おいて記載されるように調製した）およびＣ８１６６細胞（１０μｍ；　４０， ０００個の細胞）をあらかじめインキュベートした。使用したｒｓＣＤ４は、ｐ ＢＧ３９１　（上記、実施例ｍ）で形質転換したチャイニーズハムスター卵巣細 胞系からの由来であった。これらのアッセイにおいて、ＣＤ４（１８７）−Ｃ４ ｂｐ（ＳＣＲ４）の２つの異なる調製物を使用した。１つの調製物は、ＣＤ４（ １ｇ７ンーＣ４ｂｐ（ＳＣＲ４）を合成し、分泌する安定ＣＨＯ細胞系（以下、 実施例■、セクションＢ）からの馴化細胞培養液であった。他の調製物は、ＦＡ ＳＴ　Ｓ＠カラム上で、形質転換されたＣＨＯ細胞系からの馴化培養液から部分 的に精製されたＣＤ４（１８７＞−Ｃ４ｂｐ（ＳＣＲ４）であった。３７℃で３ ０分間感染した後、ミクロタイタープレート中の３つの２００μｌのＲＰＭＩ− ２０％ＦＣＳに１５μｌずつＣＤ４（１８７）−Ｃ４ｂｐ（ＳＣＲ４）を加えた 。５％のＣＯ２存在下において３７℃でプレートをインキュベートし、４から８ 日後に、感染の証拠であるシンジチアの形成を調べた。

ソノ結果、多量体ノＣＤ４（１８７）−Ｃ４ｂｐ（ＳＣＲ４）は、ＨＩＶ−１感 染をブロックするのに必要な組換え可溶性ＣＤ４の濃度よりモルベースで、１０ ０倍低い濃度で、ＨＩＶ−１感染をブロックしたのが示された。例えば、３０（ ｌ　ｐＭのＣＤ４（１８７）−Ｃ４ｂｐ（ＳＣＲ４）　（部分的に精製されたも の、および細胞培養物培地由来のもの）は、シンジチアの形成を完全にブロック した。同一の結果を得るためには、約３０　ｎＭの組換え可溶性ＣＤ４が必要で あったＯ　ＣＤ４（１８７）−Ｃ４ｂｐ（ＳＣＲ４）では約１００　ｐＭおよび 組換え可溶性ＣＤ４では約１０　ｎＭで、Ｃ８１６６細胞のＨＩＶ−１感染に対 する保護が衰えたのであった。

Ｃ，ＣＤ４１８７−Ｃ４ｂ　５ＣＲ４は、インヒトロニおけル１’ｌｌＶ−１ｍ ＲＮＡのスプライシングをプロ・・り　るつぎに、ＣＤ４（１８７）−Ｃ４ｂｐ （ＳＣＲ４）が細胞ノＨＩＶ−１感染を阻害することを示す試験を行った。使用 したアッセイでは、Ｃ８１６６細胞、ＨＩＭ−１および本発明の多量体ＣＤ４− Ｃ４ｂｐ融合タンパク質と共にインキュベートする際に生成されるスプライスさ れた旧Ｖ−１＋ｍＲＮＡの量を測定した。

組換え旧Ｖ−１は、結腸がん腫細胞系５Ｗ４８０を、ＣａＰＯａで沈降したｐＮ Ｌ４−３でトランスフェクトすることによって得られた。（細胞系およびプラス ミドは、ＡＩＤＳ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　ＲｅｆｅｒｅｎｃｅＲｅａｇｅ ｎｔ　Ｐｒｏｇｒａｍ、　ＮＩＢ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　Ｍａｒｙｌａｎｄか ら入手可能である）。１０７のＣ８１６６細胞を、１０３のＴＣＩＤｓ＠組換え 旧Ｖ−１のみと、または段階的に希釈したＣＤ４　（１Ｂ？）−Ｃ４ｂｐ（ＳＣ Ｒ４）と共にインキ二べ一トした。４８時間後、ヌクレアーゼＳ１保護分析によ って、全細胞ＲＮＡにおけるスプライスされたＨＩＶ−１ｍＲＮＡの量を決定し た。

１８０ヌクオチト一本鎖ＤＮＡ断片プローブをＡＭＰＬＩＧＡＳＥ’　（Ｅｐｉ ｃｅｎｔｅｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と合成し、５′末端を３２ｐで標識 した。

プローブは、すべての既知のスプライスされたＨＩＶ−１ｍＲＮＡ分子　［Ｂ、 Ｆｅ１ｂｅｒら、”Ｆｅｅｄｂａｃｋ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａ ｎ　Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｖｉｒｕｓ　Ｔｙｐｅ　ｌ：　Ｅｘｐ ｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｒｅｖ　Ｐｒｏｔｅｉｎ−、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ 、、　６４．　ｐｐ、　３７３４−４１　（１９９０）］のスプライス受容体に 広がった。この１８０ヌクレオチドプローブ（１０”　ｃｐ＋ａ）を、８０％の ホルムアミド、０．４ＭのＮａＣ１，４０ｍＭのＰＩＰＥＳ　ｐＨ６，４、およ びｌ　ｍＭのＥＤＴＡを含む緩衝液１０μｌ中の全細胞ＲＮＡ　１０℃ｇに加え た。ハイブリダイゼーションを４８℃で一晩行った。ハイブリダイゼーションを 行った後、混合物を３１ヌクレアーゼで処理した。Ｓｔは、ハイブリダイズしな かったすべてのプローブを完全に消化し、ハイブリダイズしたすべてのプローブ を部分的に消化し、１０２ヌクレオチドで保護されたＤＮＡ断片を産生じた。１ ８０ヌクレオチドＤＮＡ断片はまた、細胞中のウィルスの複製を通じて生産され た、スプライスされていないゲノムＨＩＭ−Ｉ　ＲＮＡとハイブリダイズするこ とによって消化から保護された。１０２ヌクレオチドＤＮＡ断片および１８０ヌ クレオチド断片の量は両方とも、ブロック剤として加えられたＣ４ｂｐ融合タン パク質の量が増加するにつれて減少した。これらの結果から、ＣＤ４−Ｃ４ｂｐ 融合タンパク質は、ｌからｔｏ　ｎｇ／ｍｌ程度の濃度で、ＨＩＶ−１が細胞に 浸入するのをブロックすることが示唆された。

Ｋ監五亘−ＣＤ４　（１８７）−Ｃ４ｂｐ　（ＳＣＲ８）、ＣＤ４　（１８７） −Ｃ４ｂｐ　（ＳＣＲ５）、ＣＤ４　（１８７）−Ｃ４ｂｐ　（ＳＣＲ３）およ びＣＤ４　１８７　−Ｃ４ｂ　５ＣＲＩ　の１°６ＣＤ４　（１８７）−Ｃ４ｂ ｐ　（ＳＣＲ８）、ＣＤ４（１８７）　−Ｃ４ｂｐ　（ＳＣＲ５）、ＣＤ４　（ １８７）−Ｃ４ｂｐ（ＳＣＲ３）およびＣＤ４　（１８７）−Ｃ４ｂｐ　（ＳＣ ＲＩ）の製造をテストするために数種のＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイを行った。この 結果はＣＯ５−７細胞が、全て多量体のＣＤ４−Ｃ４ｂｐ融合タンハク質を製造 したｐＪＯＤ、５ＣＤ４．Ｙ１８７．５ＣＲ８、ｐＪＯＤ、５ＣＤ４．Ｙ１８７ ．５ＣＲ５、ｐＪＯＤ、５ＣＤ４．Ｙ１８７．５ＣＲ３およびｐ　Ｊ　ＯＤ。

５ＣＤ４．Ｙ１８７．５ＣＲＩで形質転換されたことを示した。

ｐＪＯＤ、５ＣＤ４．Ｙ１８７．５ＣＲ８，で形質転換されたＣＯ５−７細胞の 馴化培地を用いた以外は、上記実施例において、前に記載された４ｉＭのＥＬＩ ＳＡアッセイ（ＥＬＩＳＡ　１−４）を正確に実施した。ＥＬＩＳＡ　１−３は 強い陽性の結果を表した。ＥＬＩＳＡ　４（プレートはｇｐ１２０でコートされ 、６Ｃ６は検出抗体として用いられた）は、弱い陽性の結果を与えた。

ＣＤ４　（１８７）−Ｃ４ｂｐ　（ＳＣＲＩ）をコードする３種の異なるプラス ミド単離物で形質転換されたＣ０８−７細胞の馴化培地で６種のアッセイを行っ た。この単離物はそれぞれ、５ＣＲ１，１，５ＣＲ１，２および５ＣＲ１，３と 名付けられた。はじめの４種のアッセイは上記のＥＬＩＳＡｌ−４で記載された ように行われた。検出抗体として抗体５Ａ８を用いた以外は、ＥＬＩＳＡ　４と 同様の方法で第５アツセイ（ＥＬＩＳＡ　５）を実施した。抗体５Ａ８はｇｐ１ ２０に結合しているＣＤ４をブロックせず、そしてそれはＣＤ４のドメイン２を 認識する（図４参照）。このような性質を有する他のモノクローナル抗体はまた 、このアッセイにおいて有用である。抗Ｃ４ｂｐモノクローナル０５１−１９８ または０５１−２８　（ＱｕｉｄｅｌＳ　Ｓａｎ　Ｄｌｅｇｏ、（ａｌｔｆｏｒ ｎｉａ）を用いた以外はＥＬＩＳＡ　３においてと同様に第６アソセイ（ＥＬ　 Ｉ　ＳＡ　６）を行った。

ＥＬＩＳＡ　５（プレートはｇｐ１２０でコートされ、５Ａ８が検出抗体として 用いられた）において、３種全ての単離物から陽性の結果が得られた。このこと はこの細胞がＣＤ４（１８７）を含有するタンパク質を製造したことを示してい る。

ＥＬＩＳＡ　１（プレートは抗ｈＣ４ｂｐでコートされ、６Ｃ６モノクローナル が検出抗体として用いられた）において、全ての単離物から陰性の結果が得られ た。ＥＬＩＳＡ３（プレートはｇｐ１２０でコートされ、抗Ｃ４ｂｐが検出抗体 として用いられた）において、５ＣＲ１，１から陰性の結果が得られ、そして５ ＣＲ１，２および５ＣＲ１，３から擬陽性の結果が得られた。ＥＬＩＳＡ　６（ プレートはｇｐ１２０でコートされ、０５１−１９８または０５１−２８が検出 抗体として用いられた）において、５ＣＲ１，２および５ＣＲ１，３から陽性の 結果が得られた。しかし、５ＣＲＩ。

ｌからは陰性の結果が得られた。このことはこの細胞がＣＤ４部位に結合するＣ ４１）Ｉ）（ＳＣＲＩ）とｇｐ１２０の両方を有する分子を製造したことを示し ている。Ｃ４ｂｐ、５ＣＲ１がＥＬＩＳＡ　１およびＥＬＩＳＡ　３において認 識されなかった理由は、おそらく使用したポリクローナル抗血清および抗体の種 類による。これらのポリクローナルは成熟型ヒトＣ４ｂｐにおいてエピトープを 優先的に認識するように思われる。

ＥＬＩＳＡ　２（プレートは６Ｃ６でコートされ、６Ｃ６が検出抗体として用い られた）において、単離物５ＣＲＩ。

１から陰性の結果が得られ、そして単離物５ＣＲ１，２および５ＣＲ１，３から 陽性の結果が得られた。ＥＬＩＳＡ　４（プレートはｇｐ　１２０でコートされ 、６０６が検出抗体として用いられた）において、単離物５ＣＲ１，１から陰性 の結果が得られ、そして単離物５ＣＲ１，２および５ＣＲＩ。

３から陽性の結果が得られた。これらの結果はＣＤ４（１８７）−Ｃ４ｂｐ　（ ＳＣＲ１）が多量体中に集まり得るという確信で一貫している。

他のＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＡ　７　（プレートはＩＤ７でコートされ、５Ａ８が 検出抗体として用いられた）は、ｐＪ。

Ｄ、５ＣＤ４．Ｙ１８７．５ＣＲ５，１、ｐＪＯＤ、５ＣＤ４、Ｙ１８７．５Ｃ Ｒ５，２、ｐＪＯＤ、ＣＤ４．Ｙ１８７゜５ＣＲ３，２およびｐＪＯＤ、５ＣＤ ４．Ｙ１８７，５ＣＲ３，３で形質転換されたＣＯ３−７細胞の馴化培地で行っ た。

全てのアッセイから強い陽性の結果が得られた。

Ｋ施五ニーＨＢｅＡｇ−Ｃ４ｂｐ融合ポリペプチドをコード　るＤＮＡのクロー ニング Ｂ型肝炎つィルスｅ抗原Ｃ４ｂｐ　（”ＨＢｅＡｇ−Ｃ４ｂｐｎ）融合ポリペプ チドをコードするＤＮＡ配列によって特徴付けられるいくつかのプラスミドを構 築した。これらのプラスミドを２つの工程で構築した。第１に、ｐＪＯＤ、Ｃ４ ｂｐ、２、すなわち、Ｃ４ｂｐのシグナル配列をコードするＤＮＡと５ＣＲ８の アミノ末端（図１のアミノ酸＋１位）との間のｐＪＯＤ、Ｃ４ｂｐの単離物（実 施例りに唯一の五ｂａＩ部位を導入した。これはＨＢ　ｅＡｇエピトープをコー ドするＤＮＡ配列を挿入し得る部位を製造した。一方、他方のエピトープをコー ドするＤＮＡ配列を挿入するためにこの部位を使用し得る。第２の工程において 、種々のＨＢｅＡｇ配列をコードするＰＣＲ断片をＸｂａｌに挿入して、ＨＢｅ Ａｇ配列がＣ４ｂｐのシグナル配列をコードするＤＮＡ配列とＣ４ｂｐの５ＣＲ ８をコードするＤＮＡ配列との間で挟まれたポリペプチドを製造した。

さらに詳しくは、この第１の工程において、以下に示すギャップ変異導入によっ てｐＪＯＤ、Ｃ４ｂｐ、２に唯一のよりａＩ部位を導入した。ＡＪｊ−１で第１ のプラスミドのサンプルを直線化した。次いで、Ｘｈｏ　Ｉおよびｍｌで第２の プラスミドのサンプルを切断した。次いで、このサンプルを変性し、そしてそれ ぞれバラバラの状態からハイブリダイズするまで１本鎖ＤＮＡにし、ギヤノブを 作る。このギャップの中に変異オリゴマーをアニールした。このオリゴマーは次 の配列を有する。： ＧＡＧＧＡＣＣＡＣＡＡＴＴＣＴＡＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＡ得られたプラ スミドをフレノウ酵素およびｄＸＰＴで修復し、それをＨＢＩＯＩ中に電気搾孔 法で注入し、そしてこのプラスミド、ｐＪＯＤ、Ｃ４ｂｐ、Ｘｂａｌを単離した 。ソレハ唯一のＸｂａ１部位を有していて、そしてその唯一のＸｂａ１部位によ って、５ＣＲ８の第１番目のアミノ酸をコートスるＡＡＴから分離されたＣ４ｂ ｐシグナル配列の最後のアミノ酸をコードするＧＧＴを伴ってシグナル接合部に 配列ＧＧＴＣＴＡＧＡＡＴを有する。

以下に示すようにこのプラスミドをテストした。ＸｂａＩを用いてｐＪＯＤ、Ｃ ４ｂｐ、Ｘｂａｌを直線化し、そしてマングビーンヌクレアーゼを用いてこの断 片を平滑末端にした。次いで、（いかなるＤＮＡも挿入せずに）このプラスミド を再連結してｐＪＯＤ、Ｃ４ｂｐ、Ｘｂａｌ、０．３を製造した。このシグナル 開裂部位を横切るＤＮＡ配列はもとものＣ４ｂｐにあるＧＩ　Ｙ　（−１）Ａｓ ｎ　（１）をコードして、ＧＧＴ　ＡＡＴになった。ＣＯ８細胞に電気搾孔した とき、このプラスミドはＪＯＤ、Ｃ４ｂｐと同様に効果的にＣ４ｂｐを発現した 。そして、Ｃ４ｂｐＥＬ　Ｉ　ＳＡ　（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ８ニブレートはウサギ抗 ｈＣ４ｂｐでコートされ、ヒツジ抗ｈＣ４ｂｐが検出抗体として用いられた）に おいて測定された。

第２の工程において、Ｘｂａｌを用いてｐＪＯＤ、Ｃ４ｂｐ、Ｘｂａｌを直線化 し、そしてそれをマングビーンヌクレアーゼを用いて平滑末端とした。ＨＢｅＡ ｇ　（２−１４８）、ＨＢｅＡｇ　（２−１３８”）、ＨＢｅＡｇ　（２−１０ ０）およびＨＢｅＡｇ　（２−８９）をコードするＰＣＲ生成物をそれぞれ、得 られたベクターに連結した。ＰＣＲ断片のための鋳型としてプラスミド８．　１ ．　５を用いた。プラスミド８．１゜５はＨＢ　ｅＡｇをコードするＤＮＡ配列 によって特徴付けられた。それはまた、ｐＨＢＶ１３９Ａとして［Ｐａ５ｅｋら 、前記］に引用されている。（プラスミド訳　１．５はスコツトランド、ニシン バラ大学、Ｋｅｎｎｅｔｈ　Ｍｕｒｒａｙ教授から贈られた。）一方、あるもの はＰＣＲ鋳型として、プラスミドｐＡＭＧ、ＡＴＣＣ４５０２０を用い得る。プ ラスミドｐＡＭＧはＨＢＶ継代培養ＡＤＷ由来のＤＮＡ配列によって特徴付けら れ、モしてＨＢｅＡｇをコードする。ｕＩを用いてプラスミド８．　１．　５を 消化し、そして、完全なＰＣＲ標的を含有する断片を製造する。以下に示すプラ イマーを用いてこの断片上でＰＣＲを行った。全ての４種の構築物のために同じ ５′センスプライマーを用ＩＩＡた：５°ＧＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＴＴＡＴＡＡ ＡＧＡＡＴＴＴ。

この３゛　アンチセンスプライマーは以下のとおりである：５’　ＡＡＣＡＡＣ ＡＧＴＡＧＴＣＴＣＣＧＧＡＡＧＣＧＴ［ＨＢｅＡｇ（２−１４８）］５°ＡＧ ＧＧＧＣＡＴＴＴＧＧＴＧＧＴＣＴＡＴＡＡＧＣ［ＨＢｅＡｇ（２−１３８）］ ５’　ＴＡＡＴＴＧＴＣＴＧＡＡＣＴＴＴＡＧＧＣＣＣＡＣ［ＨＢｅＡｇ（２− １００）］および５°ＧＡＣＡＴＡＡＣＴＧＡＣＴＡＣＴＡＧＧＴＣＣＣＴ［Ｈ ＢｅＡｇ（２−８９）］。

ｘｂａ　Ｉで消化された、すなわちマングビーンヌクレアーゼで処理されたｐＪ ＯＤ、Ｃ４ｂｐ、Ｘｂａｌを用いて、これらのＰＣＲ断片を連結した。この連結 物は以下に示すプラスミドをそれぞれ、製造した： ｐＪＯＤ、　ＨＢｅＡｇ（２−１４８）、　Ｃ４ｂｐ、　５ＣＲ８ｐＪＯＤ、　 ）ＩＢｅＡｇ（２−１３８＞、　Ｃ４ｂｐ、　５ＣＲ８ｐＪＯＤ、　ＨＢｅＡｇ （２−１００＞、　Ｃ４ｂｐ、　５ＣＲ８およびｐＪＯＤ、　ＨＢｅＡｇ（２− ８９）、　Ｃ４ｂｐ、　５ＣＲ８゜これらのプラスミドは以下に示す融合ポリペ プチドをコードするＤＮＡ配列をそれぞれ含有していた：　ＨＢｅＡｇ（２−− １４８）−Ｃ４ｂｐ　（ＳＣＲ８）；　ＨＢｅＡｇ　（２−１３８）−Ｃ４ｂｐ 　（ＳＣＲ８）；　ＨＢｅＡｇ　（２−Ｚｏｏ）−ｃ４ｂｐ　（ＳＣＲ８）およ びＨＢｅＡｇ　（２−８９）−Ｃ４ｂ　ｐ　（Ｓ　ＣＲ８）。

これらの構築物は、Ｃ４ｂｐシグナル配列をＢ型肝炎ウィルスプレコアシグナル 配列で置換することにより変換され得て、そのことによってもとの翻訳産物を適 切にブロモ・ノシングする。

本発明による微生物および組換えＤＮＡ分子は、１９９０年１月２４日に米国、 メリーランド州、リンチクムのインピトロインターナショナルインコーポレイテ ・ノド、カルチャーコレクション（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ ａｌ、　Ｉｎｃ、　ｃｕｌ　ｔｕｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）ｉこおいて寄託 された培養物によって例示され、そして以下のように示された。： ５ＣＲ１，１；ｐＪＯＤ、５ＣＤ４．ＹｌＢ？、５ＣＲ１，１１ＶＩ−１０２２ １ＳＣＲ１，２；ｐＪＯＤ、５ＣＤ４．Ｙ１Ｂ？、５ＣＲ１，２１ＶＩ−１０２ ２２ＳＣＲ１，３；ｐＪＯＤ、５ＣＤ４．Ｙ１８７．５ＣＲ１，３１ＶＩ−１０ ２２３ＳＣＲ１１，２；ｐＪＯＤ、５ＣＤ４．Ｙ１８７．５ＣＲＩ１．２　１Ｖ Ｉ−１０２２４ＳＣＲ８，３；ｐＪＯＤ、５ＣＤ４．Ｙ１８７．５ＣＲ８，３１ ＶＩ−１０２２５ＳＣＲ４，２；ｐＪＯＤ、５ＣＤ４．Ｙ１８７．５ＣＲ４，２ １ＶＩ−１０２２６ＳＣＲ４，３；ｐＪＯＤ、５ＣＤ４．Ｙ１８７．５ＣＲ４， ３、ＩＶＩ−１０２２７１８７，５ｎａＢ１：ｐＪＯＤ、５ｃＤ４．Ｙ１Ｂ？、 ５ｎａＢ１１ＶＩ−１０２２８ｐ１７０．２：ｐ１７０．２　１ＶＴ−１０２２ ９Ｃ４ｂｐ、　３　：ｐＪＯＤ、　Ｃ４ｂｐ、　３　１Ｖ　ｌ−１０２３０また 、１９９１年１月２６日にインビトロインターナショナルで以下の培養物も寄託 した。： モノクローナル抗体ＩＤ７−Ｇｌｌ　ＩＶＩ−１０２６９また′Ｓ　１９９１年 １月２８日にインビトロインターナショナルで以下の培養物も寄託した。： ５ＣＲ３，２；ｐＪＯＤ、５ＣＤ４．Ｙ１ｇ？、５ＣＲ３，２１ＶＩ−１０２７ ０ＳＣＲ３，３；ｐＪＯＤ、５ＣＤ４．Ｙ１８７．５ＣＲ３，３ＩＶＩ−１０２ ７１ＳＣＲ５，ｌ；ｐＪＯＤ、５ＣＤ４．Ｙ１８７．５ＣＲ５，ｌ　ＩＶＩ−１ ０２７２ＳＣＲ５，２；ｐＪＯＤ、５ＣＤ４．Ｙ１８７．５ＣＲ５，２１ＶＩ− １０２７３本発明の多くの実施態様が上記で記載されたので、基本的な実施態様 は本発明の方法および組成物を用いる他の実施態様を提供するために変換され得 ることは明らかである。それゆえ、本発明の範囲が上記の明細書において、およ び他のものを追加したクレームによって定義される全ての代替えの実施態様およ び変法を包含することが理解されるであろう。；そして、本発明は実施例として ここで示された特定の実施態様によって限定されるものではない。

−１４）　−％Ｊ）　−ψ　−ψ　−ψ口Ｉ＋＋　ψΦ　〜−ロｎ　−い 門　閂　リー　−一　い− ０Ｌｎ　ｅ）Ｌｊ”Ｉ　Ｏ＋７’ｌ　ＯＬｌ’１１Φ　へ−のＭ　ＱＦ　Ｌｎ　 ｏ” ｏト ′−ｏ″　トへ　さヘ　ロへ　の〜 Ｆ／６４ Ｎ ム／Ｇ６Ａ ＦＩＧ、　６Ｂ ＦＩＧ　６８（ｃｏｎ’θ ρＧＡＰｆ、６ ＦＩＧ、６Ｄ ｌ　充１≧′１イし　ＢＳｆＥＸ ｌ　子滑不京１し 番　シシｉｌ　ら真イ６ ＦＩ６．６Ｈ ＋ｊ７′７／ｌｊＪデ ＦＩＧ、　８Ａ　ＦＩＧ、　８Ｂ 要約書 本発明は多量体およびヘテロ多量体のＣ４結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）との融合 タンパク質とその組成物およびそれらを用いる方法に関する。より詳細には、本 発明は機能性部分に連結されたＣ４　ｂｐ単量体の凝集あるいは集合である多量 体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質に関する。本発明はまたＣ４　ｂｐ融合ポリペプチド 、特にＣＤ４−Ｃ４ｂｐ融合ポリペプチドに関する。ここでＣＤ４−Ｃ４ｂｐ融 合ポリペプチドは、好ましくは４つの短いコンセンサス反復領域をもつ、Ｃ４ｂ ｐ単量体と融合した可溶性ヒトＣＤ４タンパク質のアミノ酸配列を含有する。

閑際煩査報失

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｃ４ｂｐ融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子 。 ２．前記ＤＮＡ配列が、Ｃ４ｂｐ単量体をコードするＤＮＡ配列の５′末端に融 合したポリペプチド部分をコードするＤＮＡ配列を含む、請求項１に記載の組換 えＤＮＡ分子。 ３．前記Ｃ４ｂｐ単量体が、多くとも８個のＳＣＲを含む、請求項２に記載の組 換えＤＮＡ分子。 ４．前記Ｃ４ｂＰ単量体が、８個のＳＣＲを有し図１の＋１位から＋５４９位の アミノ酸を含むＣ４ｂｐ単量体、５個のＳＣＲを有し図１の＋１８８位から＋５ ４９位のアミノ酸を含むＣ４ｂＰ単量体、４個のＳＣＲを有し図１の＋２４８位 から＋５４９位のアミノ酸を含むＣ４ｂｐ単量体、３個のＳＣＲを有し図１の＋ ３１４位から＋５４９位のアミノ酸を含むＣ４ｂＰ単量体、および１個のＳＣＲ を有し図１の＋４３３位から＋５４９位のアミノ酸を含むＣ４ｂｐ単量体からな る群から選択される、請求項３に記載の組換えＤＮＡ分子。 ５．前記ポリペプチド部分が、標的分子、酵素、酵素阻害剤、酵素基質、サイト カイン、成長因子、コロニー刺激因子、ホルモンおよび毒素に結合するウイルス のレセプター、細胞のレセプター、細胞のリガンド、細菌の免疫原、寄生生物の 免疫原、ウイルスの免疫原、免疫グロブリンまたはその断片からなる群から選択 される、請求項２に記載の組換えＤＮＡ分子。 ６．前記ポリペプチド部分が可溶性ＣＤ４タンパク質である、請求項５に記載の 組換えＤＮＡ分子。 ７．前記可溶性ＣＤ４タンパク質が、ＣＤ４（１１１）、ＣＤ４（１８１）、Ｃ Ｄ４（１８３）、ＣＤ４（１８７）およびＣＤ４（３７５）からなる群から選択 される、請求項６に記載の組換えＤＮＡ分子。 ８．前記ポリペプチド部分が、Ｂ型肝炎ウイルスｅの抗原性を表すウイルスのポ リペプチドを含む、請求項５に記載の組換えＤＮＡ分子。 ９．前記ウイルスのポリペプチドが、ＨＢｅＡｇ（２〜８９）、ＨＢｅＡｇ（２ 〜１００）、ＨＢｅＡｇ（２〜１３８）およびＨＢｅＡｇ（２〜１４８）からな る群から選択される、請求項８に記載の組換えＤＮＡ分子。 １０．前記ポリペプチド部分が、ＩＣＡＭ１、ＥＬＡＭ１、ＶＣＡＭ１またはＶ ＣＡＭｌｂおよびＬＦＡ３からなる群から選択される細胞のレセプターまたは細 胞のリガンドである、請求項５に記載の組換えＤＮＡ分子。 １１．前記ポリペプチド部分が、ヒルジン、ヒルジンのＣ末端ペプチドおよびヒ ルログからなる群から選択される、請求項５に記載の組換えＤＮＡ分子。 １２．前記Ｃ４ｂＰ融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、発現制御配列 に作動可能に結合している、請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ分子。 １３．前記発現制御配列が、原核細胞または真核細胞またはそのウイルスの遺伝 子の発現を制御をすることが知られているＳＶ４０またはアデノウイルスの初期 および後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、ファー ジλの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御 領域、３−ホスホグリセレートキナーゼまたは他の解糖系酵素のプロモーター、 酸ホスファターゼのプロモーター、酵母α接合因子のプロモーター、バキュロウ イルス系の多角体プロモーターおよび他の配列、ならびにそれらの様々な組合せ からなる群から選択される、請求項１２に記載の組換えＤＮＡ分子。 １４．前記ＤＮＡ分子が、ｐＪＯＤ．ｓＣＤ４．Ｙ１８７．ＳＣＲ１．１、ｐＪ ＯＤ．ｓＣＤ４．Ｙ１８７．ＳＣＲ１．２、ｐＪＯＤ．ｓＣＤ４．Ｙ１８７．Ｓ ＣＲ１．３、ｐＪＯＤ．ｓＣＤ４．Ｙ１８７．ＳＣＲ３．２、ｐＪＯＤ．ｓＣＤ ４．Ｙ１８７．ＳＣＲ３．３、ｐＪＯＤ．ｓＣＤ４．Ｙ１８７．ＳＣＲ４．２、 ｐＪＯＤ．ｓＣＤ４．Ｙ１８７．ＳＣＲ４．３、ｐＪＯＤ．ｓＣＤ４．Ｙ１８７ ．ＳＣＲ５．１、ｐＪＯＤ．ｓＣＤ４．Ｙ１８７．ＳＣＲ５．２、ｐＪＯＤ．ｓ ＣＤ４．Ｙ１８７．ＳＣＲ８．２、およびｐＪＯＤ．ｓＣＤ４．Ｙ１８７．ＳＣ Ｒ８．３からなる群から選択される、請求項１３に記載の組換えＤＮＡ分子。 １５．ｐＪＯＤ．ＨＢｅＡｇ（２〜８９）．Ｃ４ｂＰ．ＳＣＲ８、ｐＪＯＤ．Ｈ ＢｅＡｇ（２〜１００）．Ｃ４ｂＰ．ＳＣＲ８、ｐＪＯＤ．ＨＢｅＡｇ（２〜１ ３８）．Ｃ４ｂｐ．ＳＣＲ８およびｐＪＯＤ．ＨＢｅＡｇ（２〜１４８）．Ｃ４ ｂＰ．ＳＣＲ８からなる群から選択される、請求項１３に記載の組換えＤＮＡ分 子。 １６．請求項１２に記載の組換えＤＮＡ分子を用いて形質転換された単細胞宿主 。 １７．前記宿主がＥ．ｃｏｌ１、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、菌類、酵母、ＣＨＯ細胞、マウス細胞、アフリカミ ドリザル細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細 胞、ＢＭＴ１０細胞、昆虫細胞、および組織培養のヒト細胞および植物細胞から なる群から選択される、請求項１６に記載の単細胞宿主。 １８．前記宿主がＣＯＳ−７細胞またはＣＨＯ細胞である、請求項１７に記載の 単細胞宿主。 １９．前記宿主がｐＪＯＤ．ｓＣＤ４．Ｙ１８７．ＳＣＲ４を用いて形質転換さ れた、請求項１７に記載の単細胞宿主。 ２０．機能性部分およびＣ４ｂＰ単量体を含む、Ｃ４ｂＰ融合ポリペプチド。 ２１．前記Ｃ４ｂＰ単量体が、８個のＳＣＲを有し図１の＋１位から＋５４９位 のアミノ酸を含むＣ４ｂＰ単量体、５個のＳＣＲを有し図１の＋１８８位から＋ ５４９位のアミノ酸を含むＣ４ｂＰ単量体、４個のＳＣＲを有し図１の＋２４８ 位から＋５４９位のアミノ酸を含むＣ４ｂＰ単量体、３個のＳＣＲを有し図１の ＋３１４位から＋５４９位のアミノ酸を含むＣ４ｂＰ単量体、および１個のＳＣ Ｒを有し図１の＋４３３位から＋５４９位のアミノ酸を含むＣ４ｂＰ単量体から なる群から選択される、請求項２０に記載のＣ４ｂＰ融合ポリペプチド。 ２２．前記機能性部分が、標的分子、酵素、酵素阻害剤、酵素基質、サイトカイ ン、成長因子、コロニー刺激因子、ホルモンおよび毒素に結合するウイルスのレ セプター、細胞のレセプター、細胞のリガンド、細菌の免疫原、寄生生物の免疫 原、ウイルスの免疫原、免疫グロブリンまたはその断片からなる群から選択され る、請求項２０に記載のＣ４ｂＰ融合ポリペプチド。 ２３．前記機能性部分が可溶性ＣＤ４タンパク質である、請求項２２に記載のＣ ４ｂＰ融合ポリペプチド。 ２４．可溶性ＣＤ４タンパク質が、ＣＤ４（１１１）、ＣＤ４（１８１）、ＣＤ ４（１８３）、ＣＤ４（１８７）−Ｃ４ｂＰ（ＳＣＲ５）、ＣＤ４（１８７）− Ｃ４ｂＰ（ＳＣＲ３）およびＣＤ４（３７５）からなる群から選択される、請求 項２３に記載のＣ４ｂＰ融合ポリペプチド。 ２５．前記ポリペプチドが、ＣＤ４（１８７）−Ｃ４ｂＰ（ＳＣＲ８）、ＣＤ４ （１８７）−Ｃ４ｂＰ（ＳＣＲ５）、ＣＤ４（１８７）−Ｃ４ｂＰ（ＳＣＲ４） 、ＣＤ４（１８７）−Ｃ４ｂＰ（ＳＣＲ３）およびＣＤ４（１８７）−Ｃ４ｂＰ （ＳＣＲ１）からなる群から選択される、請求項２３に記載のＣ４ｂＰ融合ポリ ペプチド。 ２６．前記機能性部分が、Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原性を表すウイルスのポリペプ チドである、請求項２２に記載のＣ４ｇｂＰ融合ポリペプチド。 ２７．前記ポリペプチドが、ＨＢｅＡｇ（２〜８９）−Ｃ４ｂｐ（ＳＣＲ８）、 ＨＢｅＡｇ（２〜１００）−Ｃ４ｂＰ（ＳＣＲ８）、ＨＢｅＡｇ（２〜１３８） −Ｃ４ｂＰ（ＳＣＲ８）およびＨＢｅＡｇ（２〜１４８）−Ｃ４ｂＰ（ＳＣＲ８ ）からなる群から選択される、請求項２６に記載のＣ４ｂｐ融合ポリペプチド。 ２８．前記機能性部分が、ＩＣＡＭ１、ＥＬＡＭ１、ＶＣＡＭ１またはＶＣＡＭ １ｂ、およびＬＦＡ３からなる群から選択される細胞のレセプターまたは細胞の リガンドである、請求項２２に記載のＣ４ｂＰ融合ポリペプチド。 ２９．前記機能性部分が、ヒルジン、ヒルジンのＣ末端ポリペプチドおよびヒル ログからなる群から選択される、請求項２２に記載のＣ４ｂｐ融合ポリペプチド 。 ３０．前記ポリペプチド部分のＣ末端が、Ｃ４ｂｐ単量体のＮ末端に融合してい る、請求項２０に記載のＣ４ｂＰ融合ポリペプチド。 ３１．前記機能性部分が、毒素、抗レトロウイルス剤、酵素基質および酵素阻害 剤からなる群から選択される、請求項２０に記載のＣ４ｂｐ融合ポリペプチド。 ３２．前記機能性部分がＡＺＴである、請求項３１に記載のＣ４ｂＰ融合ポリペ プチド。 ３３．前記機能性部分が、酵素、放射性核種、蛍光マーカーおよび化学ルミネセ ントマーカーからなる群から選択されるレポーター基を含む、請求項２０に記載 のＣ４ｂＰ融合ポリペプチド。 ３４．多量体のＣ４ｂＰ融合タンパク質。 ３５．前記タンパク質が多量体のＣＤ４−Ｃ４ｂＰ融合タンパク質である、請求 項３４に記載の融合タンパク質。 ３６．前記タンパク質がＣＤ４（１８７）−Ｃ４ｂＰ（ＳＣＲ４）融合タンパク 質である、請求項３５に記載の融合タンパク質。 ３７．前記タンパク質が多量体のＨＢｅＡｇ−Ｃ４ｂＰ融合タンパク質である、 請求項３４に記載の融合タンパク質。 ３８．前記タンパク質が、ＥＬＡＭ１−Ｃ４ｂｐ融合タンパク質、ＶＣＡＭ１− Ｃ４ｂＰ融合タンパク質、ＶＣＡＭ１ｂ−Ｃ４ｂｐ融合タンパク質およびＩＣＡ Ｍ１−Ｃ４ｂｐ融合タンパク質からなる群から選択される、請求項３４に記載の 融合タンパク質。 ３９．前記タンパク質がヒルジンＣ４ｂＰ融合タンパク質、ヒルジンＣ末端ポリ ペプチドＣ４ｂＰ融合タンパク質、およびヒルログＣ４ｂＰ融合タンパク質から なる群から選択される、請求項３４に記載の融合タンパク質。 ４０．発現制御配列に作動可能に結合された、Ｃ４ｂＰ融合ポリペプチドをコー ドするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子によって、単細胞宿主を形質転換する 工程を包含する、Ｃ４ｂＰ融合ポリの製造方法。 ４１．ヘテロ多量体のＣ４ｂＰ融合タンパク質。 ４２．前記融合タンパク質が、ウイルスのレセプター、細胞のレセプターおよび 細胞のリガンドからなる群から選択される第一の機能性部分、ならびに毒素およ び抗レトロイルス剤からなる群から選択される第二の機能性部分を含む、請求項 ４１に記載のヘテロ多量体Ｃ４ｂＰ融合タンパク質。 ４３．前記融合タンパク質が、認識分子およびレポーター分子を含む、請求項４ １に記載のヘテロ多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質。 ４４．前記第一の機能性部分が可溶性ＣＤ４であり、前記第二の機能性部分がＡ ＺＴである、請求項４１に記載のヘテロ多量体Ｃ４ｂＰ融合タンパク質。 ４５．前記融合タンパク質が少なくとも２つの異なる免疫原を含む、請求項４１ に記載のヘテロ多量体Ｃ４ｂＰ融合タンパク質。 ４６．請求項１２の組換えＤＮＡ分子で単細胞宿主を形質転換する工程を包含す る、多量体のＣ４ｂＰ融合タンパク質の製造方法。 ４７．請求項３５の多量体ＣＤ４−Ｃ４ｂＰ融合タンパク質または請求項４２の ヘテロ多量体ＣＤ４−Ｃ４ｂＰ融合タンパク質の治療的有効量を患者に投与する 工程を包含する、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ、ＨＩＶ感染またはＨＩＶに対する抗体を有 する患者の治療方法。 ４８．融合タンパク質がＣＤ４（１８７）−Ｃ４ｂＰ（ＳＣＲ４）を含む、請求 項４７に記載の方法。 ４９．ヘテロ多量体ＣＤ４−Ｃ４ｂＰ融合タンパク質が、請求項４４に記載の融 合タンパク質である、請求項４７に記載の方法。 ５０．請求項４３に記載のヘテロ多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質に試料を接触さ せる工程を含む、試料中の標的分子の存在を確認する方法。 ５１．請求項４１に記載のヘテロ多量体Ｃ４ｂＰ融合タンパク質の有効量を患者 に投与する工程を包含する、インビボで標的分子の存在を確認する方法。 ５２．Ｃ４ｂＰ融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有するレトロウイ ルスを用いて、ヒト体細胞を感染させる工程を包含する、ヒトの病気の治療方法 。 ５３．前記ＤＮＡ配列がＣＤ４−Ｃ４ｂＰ融合ポリペプチドをコードする、請求 項５２に記載の方法。 ５４．組換えヒトＣ４結合タンパク質。 ５５．図１のヌクレオチド４位からヌクレオチド１７４３位のＤＮＡ配列を含む ＤＮＡ配列に、作動可能に結合した発現制御配列を含む組換えＤＮＡ分子を用い て、単細胞宿主を形質転換する工程を包含する、組換えＣ４結合タンパク質の製 造方法。 ５６．非ヒトＣ４ｂＰ融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む、組換え ＤＮＡ分子。 ５７．前記非ヒトがマウスまたはモルモットである、請求項５６に記載の組換え ＤＮＡ分子。 ５８．前記ＤＮＡ配列が非ヒトＣ４ｂＰ融合ポリペプチドである、請求項５６に 記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換された単細胞宿主。 ５９．前記非ヒトがマウスまたはモルモットである、請求項５８に記載の単細胞 宿主。 ６０．機能性部分および非ヒトＣ４ｂＰ単量体を含む、非ヒトＣ４ｂＰ融合ポリ ペプチド。 ６１．前記非ヒトがマウスまたはモルモットである、請求項６０に記載のＣ４ｂ Ｐ融合ポリペプチド。 ６２．多量体の非ヒトＣ４ｂＰ融合タンパク質。 ６３．前記非ヒトがマウスまたはモルモットである、請求項６２に記載の多量体 の非ヒトＣ４ｂＰ融合タンパク質。 ６４．ヘテロ多量体の非ヒトＣ４ｂＰ融合タンパク質。 ６５．前記非ヒトがマウスまたはモルモットである、請求項６４に記載のヘテロ 多量体の非ヒトＣ４ｂＰ融合タンパク質。 ６６．請求項５６に記載の組換えＤＮＡ分子を用いて単細胞生物を形質転換する 工程を包含する、非ヒトＣ４結合タンパク質の製造法。 ６７．前記非ヒトがモルモットまたはマウスである、請求項６６に記載の方法。