JPH04503460A

JPH04503460A - Ｄｎａ配列決定

Info

Publication number: JPH04503460A
Application number: JP3-501032A
Authority: JP
Inventors: ツイエン、ロジヤー・ワイ; ロス、ペピ; フアーネストツク、マーガレツト; ジヨンストン、アラン・ジエイ
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1989-10-26
Filing date: 1990-10-26
Publication date: 1992-06-25

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＤＮＡ配列決定１園Ｉ七吏腫」本発明はＤＮＡ配列決定に関する。より詳細には本発明は、ＤＮＡ分子内のデオキシリボヌクレオチドの配列を決定する方法および装置に関するものである。

ｔｔｉ歪夏毀皿ＤＮＡ配列決定は重要な手段である。一般に、生物学界の現在の目標は、人間を含む多数の生物におけるＤＮＡの完全な構造を決定することである。この情報は病気の理解、診断、予防および治療の助けとなる。

現在のＤＮＡ配列決定法は、化学的方法もしくは酵素的方法のいずれかを用いてＤＮＡ分子の標識断片を作成する。化学法においては、末端標識されたＤＮＡに存在する成る種のヌクレオチド塩基を特異的に改変する反応を行なう、これらの反応は部分的にしか完結しないよう行なわれ、したがって分子中に存在する塩基の１部しか反応しない６次いで、これら改変された塩基をピペリジンで処理して、改変塩基におけるＤＮＡ連鎖を切断し、４組のネスト断片を生成させる０次いで、これら断片をポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動により寸法にしたがって互いに分離する０次いで、これら断片を放射性標識によってゲル中で可視化することができる。ゲル中の断片の位置は各断片における最終ヌクレオチドのアイデンティティ−を示し、ゲル上にて各工程で同定された断片の「ラダー」を組立てて全配列を与える。

酵素法においては、配列決定すべきＤＮＡをＤＮＡポリメラーシーのフレノウ断片により或いはたとえばＴａｑポリメラーゼもしくはセクエナーゼ（登録商標）のような同様のポリメラーゼ酵素により酵素的にコピーする。酵素複写は４反復で行なわれる。４つの反応のそれぞれには、低濃度の連鎖停止性ジデオキシヌクレオチドが存在し、４つの反応のそれぞれに異なるジデオキシヌクレオチドが存在する（ｄｄＡＴＰ　、　ｄｄＣＴＰ　、　ｄｄＧＴＰおよびｄｄｔｉｐ　）。

ジデオキシヌクレオチドが組込まれると何時でも、ポリメラーゼ反応が停止して、再びネスト断片の群を生成する。ここでも、ネスト断片を電気泳動により互いに分離して配列を決定せねばならない。

最近、配列決定技術にて新たな進歩は自動化法を導入した。

アプライド・ビオシステムス社は蛍光標識の使用に基づ（装置、並びにレーザーおよびコンピューターに基づく検出装置を開発した〔スミス等、１９８６ｉスミス、１９８７）、Ｅ、Ｅ、デュポン・デ・ニモアス・アンド・カンパニー社〔プロパー等、１９８７）により開発された自動化装置はアプライド、ビオシステムス社の装置と同様であるが、蛍光性プライマーの代りに蛍光標識されたｄｄＮＴＰを用いて反応を停止させる。ヒタチ（日本国）およびＥＭＢＬ（西ドイツ国）は同様なシステムを開発した〔アンソルゲ等、１９８６］。他の方法は複合化技術［チャーチおよびキーファーヒギンス、１９８８〕、すなわち鋭敏なβ−検出器による放射能標識されたＤＮＡ断片の検出（ＥＣ＆Ｇ）　、自動化ゲル解読器（ビオラド社）および自動化液体ハンドラー〔ベックマン・インスツルメンツ社；セイコー社：グッデナウ社、カリフォルニア大学、バークレー〕を含む。

分析方式の１部として電気泳動および寸法による分離に依存する必要性は重大な制限となる。ゲル電気泳動は時間のかかる工程であって、これを正確に実施するには極めて高度に熟練した人員を必要とする。本発明は、その方法の１部として電気泳動または同様な寸法による分離を必要としないＤＮＡ配列の決定方法および装置を提供する。

園迷文歓以下の論文および特許公報はＤＮＡ配列決定の一般的技術分野に関するものであって、背景技術の一般的要約として示される。しばしば合成法、カップリング法および検出法などを教示するためにも、これら文献が引用される。これらの場合、一般に著者および年号によって次のように示される。

Ｗ、Ｂ、アンソルゲ等（１９８７Ｌヌクレイツク・アシッド・リサーチ、第１５巻、第４５９３〜４６０２頁。

Ｗ、Ｂ、アンソルゲ等（１９８６）、ジャーナル・オブ・ノ〈イオケミカル・アンド・バイオフィジカル・メソツズ、第１３巻、第３２５〜３２３頁。

Ｊ、Ｔ、アルンツ・ボビン等（１９７５Ｌ　ヨーロピアン・ジャーナル・オプ・バイオケミストリー、第５４巻、第４１１〜４１３頁。

Ｈ，ブーネマンン等（１９Ｂ２）、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、第１０巻、第７１６３〜７１８０頁。

Ｌ、　Ｄ、カマ等（１９７Ｂ）、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ、第１００巻、第８００６頁。

Ｇ、Ｍ、　チャーチ等（１９８Ｂ）、サイエンス、第２４０巻、第１８５〜１８８頁。

Ｓ、　Ａ、　シュブピロ等（１９８４）、ｒＤＮＡの簡単かつ迅速な配列決定方法Ｊ、ＦＥＢＳ、第１７９巻、第３４〜３６頁。

Ｌ、　Ｆ、クレソン等（１９７９）、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、第６巻、第２４７〜２５８頁。

Ｌ、　Ａ、コーヘン等（１９６６）、ジャーナル・オプ・オーガニック・ケミストリー、第３１巻、第２３３３頁。

Ｂ、　Ａ、コノリー（１９８７）、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、第１５巻、第３１３１〜３１３９頁。

Ｃ，Ｇ、クルース等（１９７Ｂ）、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー、第４３巻、第３５４８〜３５５３頁。

Ｐ、　Ｔ、エングルラド等（１９６９）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２４４巻、第３０３８〜３０４４頁。

Ｂ、Ｃ，フレーシー等（１９８６）、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、第１４巻、第５３９９〜５４０７頁。

Ｒ，ギガ等（１９６Ｂ）、ジャーナル・オブ・ザ・ケミカル・ソサエティ、Ｃ１４巻、第１９０３〜１９１１頁。

Ｐ、　Ｔ、ギルハム（１９６８Ｌバイオケミストリー、第７巻、第２８０９〜２８１３頁。

Ｍ、Ｌ、ゴールドベルブ等（１９７９）、メソソズ・イン・エンチモロジー、第６８巻、第２０６〜２２０頁。

Ｔ、ゴールドコルン等（１９８６Ｌヌクレイツク・アシッド・リサーチ、第１４巻、第９１７１〜９１９１頁。

Ｔ、　Ｗ、グリーン（１９８１）、［有機合成における保護基」、ジッン・ウィリー・アンド・サンズ・インコーポレーション、ニューヨーク、ニューヨーク。

Ｅ、ハンスベリー等（１９７０）、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・アクタ、第１９９巻、第３２２〜３２９頁。

Ｃ，ハンセン等（１９８７Ｌアナリチカル・バイオケミストリー、第１６２巻、第１３０〜１３６頁。

Ｗ、　Ｄ、ヘンナ−等（１９８３）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２５８巻、第１５１１９８〜１５２０５頁。

Ｊ、　Ａ、ヒエ−バーマン等（１９７０）、ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー、第２４５巻、第５３２６〜５３３４頁。

Ｙ、カナ才力（１９７７）、アンゲバゾテ・ヘミ−・インターナショナル・エディシラン・イングリッシュ、第１６巻、第１３７〜１４７頁。

Ａ、コルンベルグ（１９７４）、ＤＮＡ合成、Ｗ、　Ｈ，フリーマン・アンド・カンパニー、サンフランシスコ。

Ａ、Ａ、ケレブスキー等（１９８７）、モレキュラー・バイオロジー、第２１巻、第２５〜２９頁。

Ａ、　Ａ、クレブスキー等（１９８７）、バイオホスフェートおよびその同族体：合成、構造、代謝および活性、Ｋ、Ｓ、プルシックおよびＷ、Ｊ、ステック（編）、エルセビール出版、アムステルダム、第３７９〜３９０頁（およびその参考文献）。

Ｊ、　Ｎ、クレムスキー等（１９８７）、ヌクレイ７り・アシッド・リサーチ、第１５巻、第２８９１〜２９０９頁。

Ｔ、　Ｖ、クタテラゼ等（１９８７）、モレキュラ・バイオロジー、第２０巻、第２２２〜２３１頁。

Ｊ、　Ａ、ダングダレ等（１９８５Ｌジーン、第３６巻、第２０１〜２１０頁。

Ｒ，Ｔ、レッチンガー等（１９６４）、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー、第２９巻、第２６１５〜２６１８頁。

Ｊ、　Ｋ、マツキー等（１９７１Ｌネイチヤー、第２３３巻、第５５１〜５５３頁。

Ｔ、マニアチス等（１９８２）、モレキュラ・クローニング、ラボラトリ−・ハンドブック、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプリング・ハーバ−１二ニーＡ、　Ｍ、マキサム等（１９８０）メソッズ・イン・エンチモロジー、第６５巻、第４９９〜５６０頁。

Ｅ、オーツカ等（１９７Ｂ）、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー、第１０ＯＳ、第８２１Ｏ〜８２１３頁。

Ａ、Ｖ、パブチキン等（１９８５）、バイオオーガニック・ケミストリー、第１１巻、第７１６〜７２７頁。

Ｓ、ボチェット等（１９８７）、テトラヘドロン、第４３巻、第３４８１〜３４９０頁。

Ｒ，ポルスキー・チンキン等（１９８５）、クリニカル・ケミストリー、第３１巻、第１４３８〜１４４３頁。

Ｊ、　Ｍ、プロパー等（１９８７）、サイエンス、第２３８巻、第３３６〜３４１頁。

Ｃ，Ｂ、リーゼ等（１９６８）、テトラヘドロン、レタース、第４０ｔｌ、第４２７３〜４２７６頁。

Ｔ、　Ａ、レゾブスカヤ等（１９７７）、モレキュラ・バイオロジー、第１１巻、第４５５〜第４６６頁。

Ｆ、サンガー等（１９７７）、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエンスＵＳＡ、第７４巻、第５４６３〜５４６７頁。

Ｓ、Ｒ，サルファチ等（１９８７）、テトラヘドロン・レタース、第４３巻、第３４９１〜３４９７頁。

Ｂ、シード（１９８２）、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、第１０巻、第１７９９〜１８１０頁。

Ａ、　Ｊ、　Ｈ，スミス（１９８０）、メソツズ・イン・エンチモロジー、第６５巻、第５６０〜５８０頁。

Ｌ、　Ｍ、スミス等（１９８６）、ネイチャー、第３２１ｊｉ！、第６７４〜６７９頁。

Ｌ、　Ｍ、スミス（１９８７）、サイエンス、第２３５巻、第９８９頁。

Ｅ、　Ｍ、サウザン（１９７５）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、第９８ｔＩ、第５０３〜５１７頁。

Ｓ、タバー等（１９８７）、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８４巻、第４７６７〜４７７１頁。

Ｒ，１，ザダノフ等（１９７５Ｌシンセシス、第１９７５巻、第２２２〜２４５頁。

興味ある刊行物は、さらに次の通りである：Ｎ、ダソクグプタ米国特許第４，６７０，３８０号、１９８７年６月２日イ寸け。

Ｗ、Ｊ、マーチン、ヨーロッパ特許出願第０１８７６９９号、１９８６年７月１６日公開。

特公昭（東京コーホ）ＪＰ５８／８７，４５２号（１９８３年５月２５日）；ケミカル・アブストラクト、第９９巻、第１７２３７６ｎ項。

Ｒ，ルイス、［遺伝子分析のコンピユータ化」ハイ・テクノロジー、１９８６年１２月、第４６頁以降。

Ｃ，コネル等、「自動化ＤＮＡ配列分析」、バイオテクニークス、第５巻、第４号、第３４２頁以降（１９８７）。

Ｊ、Ｆ、　Ｍ、デ・ルーイズ等、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー、第１７７巻、第３８０〜３８４頁（１９８７）。

登里汝脱所本発明は、ＤＮＡ分子におけるデオキシリボヌクレオチドの配列を決定するための方法および装置を提供する。本発明の重要な特徴は、電気泳動または他の寸法に基づく分離技術に頼ることなくＤＮＡ配列を決定する点にある。

他面において本発明は、生−重鎖ＤＮＡ分子のデオキシリボヌクレオチド配列を決定する方法を提供する。この方法は、主ＤＮＡの複数同一コピーの存在下に、これに相補的であるＤＮＡ分子を合成することを含む、この合成はデオキシリボヌクレオチド三燐酸（ｄＮＴＰ）を用いて段階的にシリーズで行なわれ、ｄＮＴＰ毎に相補分子の多数コピーを同時に構築する。各ｄＮＴＰが成長相補分子に付加されると、これは適当な標ｉ１（すなわちリポータ基）によって同定される。

この相補分子に存在する塩基のアイデンティティ−を記録すると共にＤＮＡ相補性の標準的規則を用いて、相補分子から対応の最初の主分子まで翻訳することができ、したがって主分子のデオキシリボヌクレオチド配列を得ることができる。

他面において本発明は、上記方法を実施するための装置を提以下の本発明の詳細な説明に見られるように、この方法およびそれを実施する装置は多くの異なる構成を用いることができる。しかしながら、これら全ての重要点は、寸法により分離せねばならない一連のネスト断片を発生させるのでなく、寧ろ成長する相補ＤＮＡ連鎖中に組込まれる際にｄＮＴＰを直接同定することによりＤＮＡ配列を決定するという事実にある。

本発明は、複数の区別しうるリポータを用いて単一の反応帯域で或いは各帯域に単一の各リポータを用いて複数の反応帯域で行なうことができる。これは、リポータの付加の後に増大する信号変化を検出することにより或いは各付加リポータを別々に記録して行なうことができる。各リポータを反応帯域中で増大分子に付着する間に測定し、或いは分子から分離した後に測定することもできる。

本発明は、増大する相補ＤＮＡ連鎖を中断なしに作成するよう実施することができ、或いは相補連鎖の１部を作成し、その配列を決定し；この連鎖の部分を次いで除去し；除去された連鎖の領域に対応する配列を別途に合成すると共に、これを使用して後の連鎖成長のため雛型連鎖を作成する数段階で実施することもできる。後者の方法は、完全な相補連鎖を少しづつ増大させるべく必要に応じ反復することができる。

ＩＬ！ｌ！！１１すｔｍ肌辺　（７）１１【ｌ咀以下、添付図面を参照しながら本発明をさらに説明する：第１Ａおよび１８図は、分子レベルにて本発明の方法を示す略図である。

第２図は本発明を実施する装置の１具体例の略図であり、この具体例においてＤＮＡ成長は単一の反応帯域で行なわれ、この具体例は増大する分子に組込まれた４種のヌクレオチドのそれぞれと結合した別々の区別しうるリポータを使用し、４種の異なるリポータは各付加後に測定されてどの塩基が相補連鎖のその位置に付加されたかを検出する。

第３図は本発明を実施する他の装置の具体例の略図であり、この具体例は分子成長が４反復で行なわれる４つの反応帯域を使用し、これら４つの帯域のそれぞれにおいて４種のヌクレオチドの異なる１種がリポータに結合しく残余の３種は未標識である）、各段階で組込まれたヌクレオチド−のアイデンティティ−を決定することができる。

第４図は本発明を実施する装置を採用する略図であり、この装置は特に単一の連続相補分子でなく一連の相補分子でな（一連の相補分子の部分を増大させるべく本発明を実施するのに通する。

第５図〜第８図は本発明の実施に使用する代表的な標識ヌクレオチド構築ブロックを合成するため使用しうる化学反応順序の略図である。

−のセ　シ　ンの本発明のこの詳細な説明は次のように構成される：最初に、数種の用語を命名のセクションで規定する。

第２に、本発明を実施するための一連の代表的装置、配置および方法の具体例を説明する。

第３に、本発明の方法に使用される材料および試薬、並びに使用方法を示し、次のことを包含するニーム・　お　°　゛封１ｊ口ＩＬ− １ボー　入　１　ｌ　にＬＬＬＡのその後、一連の非限定的な実施例を示す。

會−ム本明細書および請求の範囲には、多くの関連する一般的に横用された記号および特定用語が見られる。４種のヌクレオチドはしばしば簡略してそのヌクレオチド塩基、すなわちアデノシン、シチジン、グアノシンおよびチミジンにより、すなわち「Ａ」、ｒ（、Ｊ、「Ｇ」および「Ｔ」と称する。これら物質のデオキシヌクレオチド三燐酸ｒｄＮＴＰＪはｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ。

ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰとして略記される。これら物質がその３°−ＯＨ位置で封鎖される場合、これらは３”−ブロックトｄＡＴＰ。

３゛−ブロックトｄＣＴＰ、３’−ブロックトｄＧＴＰおよび３゛−ブロツクドｄＴＴＰとして示される。同様に、これらがそれぞれ共通のリポータ基、たとえば単一の蛍光性基で標識される場合、これらはｄＡ’　ＴＰ、ｄＣ’　ＴＰ、ｄＧ’　ＴＰおよびｄＴ”ＴＰとして示される。これらがそれぞれ異なるリポータ基、たとえば異なる蛍光性基で標識される場合、これらはｄＡ’　ＴＰ、ｄＣ” ＴＰ、ｄＧ’”’ＴＰおよびｄＴ””ＴＰとして示される。以下、一層詳細に説明するように、これら記号の「ヌクレオチド塩基部分」に関連して標識の表示が示されるが、これは標識が生じうる唯一の場所であることを意味しなし）。

標識は分子の他の部分にも行なうことができる。

゛　、　お　゛　の本明細書および請求の範囲においては、配列が所望されるＤＮＡを規定するため、「主、ＤＮＡもしくは「雛型、ＤＮＡという用語を用いる。実際には、この物質は既知配列のベクター内に含まれる。ベクターの既知配列に相補的であるプライマーを用いて、未知の相補連鎖の成長を開始させる。この方法の２つの具体例を第１Ａおよび１８図に分子レベルで示す。

第１Ａ図には固体の支持体１が示され、反応性基Ａがテザー２を介しその表面に付着される。この付着は共有、イオン性などとすることができる。同じく共有、非イオン性などの結合を介し基Ａに結合しうる第２の反応性基ＸがＤＮＡプライマー４の５゛末端に付着する。このプライマーは既知のＤＮＡ配列を有する。Ａ −Ｘ結合を介し基質にカップリングすると、これは固定化プライマー５を形成する０次いで、プライマー５は、領域８と８°との間に挿入された未知領域７で構成される雛型ＤＮＡストランド６にハイブリダイズする。領域８および８“は未知領域の５゛および３°末端に位置すると共に、既知配列を有する。８゛碩域の既知配列はプライマー４の配列に対し相補的であって、これらの領域は固定化雛型ＤＮＡ９を形成すべくハイブリダイズする。したがって、個々のｄＮＴＰがシリーズで付加されて、雛型の未知領域に対し相補的なりＮＡ配列を形成する。１１および１２は増大する分子に組込まれた最初の２個のこの種のｄＮＴＰを示す。次いで、これらはそれぞれその補体１１′および１２゛のアイデンティティ− を与える。この成長は、全相補ＤＮＡ分子が作成されるまで持続する。完成は、雛型６の８゛領域に対応する配列を同定して認めることができる。

次に第１Ｂ図を参照してこの化学の変法が示され、ここでは雛型６′″が反応性基Ｘを支持し、この反応性基はＡ−Ｘ結合を介し基質に結合して固定化雛型５″ を形成する。次いで、これはプライマー３１とハイブリダイズして固定化した処理雛型９°を与え、これに所望のｄＮＴＰの付加が生じて単位１１および１２を付加し、かくして単位１１’および１２′の配列およびアイデンティティ−を同定する。第１Ｂ図に示した化学においては、基質上のＡ基に対するその３′末端におけるＸ基を介する雛型ＤＮＡ６”の結合につき説明するが、雛型ＤＮＡ６″ は同様にその５゛末端を介し結合しうることも了解されよう。この種の結合に関する化学は当業界で公知である。

次に第２図を参照すれば、本発明を実施するための装置１３が図示されている。

この略図および第２図に示した図面においては、たとえばミキサー、弁など多くの部品を省略して、本発明に関する明瞭な理解を容易化させる。装置１３は、その内側に表面１５を支持した反応帯域１４を備える。処理された主−末鎖ＤＮＡの複数コピーが、この表面１５上に固定化される。

これは、配列が所望されるＤＮＡのストランドである。固定化したＤＮＡを、一連の別々に見える付着ストランドとして存在するかのように、表面１５上に空想的に図示する。了解されるように、これは実際の場合でなく、ＤＮＡストランドの位置に関し読者を案内すべく行なっただけである０反応帯域１４は、内部から発するリポータ信号を直接解読しうるような配置とすることができる。この配置の例は、１個もしくはそれ以上の透明壁部を介し蛍光もしくは化学発光を測定しうるよう或いは放射性核の減衰を検出しうるよう反応帯域を装着することを含む。

反応帯域１４には、ヌクレオチドの相対的な雛型指向性結合を調整しろるポリメラーゼまたは他の適する酵素を添加するだめの入口１６を装着する。さらに、反応帯域は４種の種々異なって標識されたブロックトｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐ、すなわち３ ′−ブロックトｄＡ’　ＴＰ、３°−ブロックトｄ　Ｃ”ＴＰ、３’−ブロックトｄＧ”’　ＴＰおよび３゛−ブロックトｄ　Ｔ””　Ｔ　Ｐのための入口経過１８ａ〜１８ｄをも設ける。これら物質は図示したように４個の別々の経過で添加することができ、或いは所望ならば予備混合して単一経過で添加することもできる。１１衝剤および他の適する反応媒体成分は経路２０を介して添加される。

実際には、ポリメラーゼおよび４種の標識されたｄＮＴＰは、酵素が４種の標識されたブロックトｄＮＴＰのうちプライマーの後の第１の使用可能な雛型ヌクレオチドに相補的である１個（すなわち１個のみ）の付加をもたらすのに充分な条件下で、反応帯域１４に添加される。付加されたｄＮＴＰの３゛−ヒドロキシル位置に存在する封鎖基は、不都合な複数の付加を防止する。この最初の付加反応が完結した後、反応帯域１４における液体を経路２２を介し廃棄物まで排出するか、或いは所望ならば再使用するため貯蔵する。反応帯域と表面１５とを必要に応じ濯いで、未反応の結合してない標識されたブロックトｄＮＴＰを除去する。

この時点で、相補的連鎖の第１の要素が、かくして表面１５に付着した主連鎖に結合して所定位置に存在する。この第１ヌクレオチドのアイデンティティ−は、これに付着した標識を検出しかつ同定して決定することができる。

この検出および同定は、蛍光標識の場合には、表面に光源２４からの蛍光励起ビームを照射すると共に、得られた蛍光を検出器２６で検出して行なうことができる。次いで、検出された蛍光を４種の異なるデオキシヌクレオチド三燐酸に存在する４種の異なる標識の蛍光特性に相関させて、４種の物質のうちどの１種が相補連鎖の第１位置に組込まれたかを正確に同定する。

次いでこのアイデンティティ−を記録する。

次の工程にて、第１デオキシヌクレオチド三燐酸の３”−位置から封鎖基および標識を除去すべく反応を行なう、この反応は、反応帯域１４で行なわれる。封鎖解除用の溶液を経過２８を介し添加して、３°−ヒドロキシル標識された封鎖基を除去する。

次いで、これは相補連鎖に存在する第１ヌークレオチドに活性３゜−ヒドロキシル位置を発生すると共に、これを第２ヌクレオチドの５゛位置に対する結合に使用することができる。封鎖解除の完了、経過２２を介する封鎖解除用溶液の除去、および必要に応じ濯ぎの後、４種の封鎖された標識デオキシヌクレオチド三燐酸と緩衝剤とポリメラーゼとを再び添加し、次いで適する第２要素を増大する相補連鎖に結合させる。濯ぎの後、連鎖の第２要素をその標識に基づいて同定することができる。

次いでこの工程を、相補連鎖が完成するまで必要に応じ反復する。相補連鎖の構成が完成した際、組込まれたデオキシヌクレオチドの配列は既知となり、したがって主連鎖である補体の配列も既知となる。

この方法は容易に自動化されることが了解されよう。これは、一連の流体添加と反応帯域からの除去とである。これは、一連の時間制御弁などによって容易に行なうことができる。この技術は、オリゴヌクレオチド合成装置、ペプチド合成装置などの分野で充分開発されている。この種の自動化システムにおいて、調時はマイクロプロセッサにより、或いは大抵の場合には簡単なプログラミングしうるタイマーによって制御することができる０反応の速度および程度は、種々の段階でリポータ濃度を測定して監視することができる。

ブロックトｄＮＴＰに存在する標識は、数種の方法の１つで組込むことができる。１つの場合、これらはデオキシヌクレオチド三燐酸単位自身に直接かつ不可逆的に組込むことができる。

かくして、相補的連鎖が増大するにつれ信号の総和が存在し、各ヌクレオチドが付加された後に観察された信号の変化を記録することにより各付加されたヌクレオチドを同定する。

或いは多くの場合、好ましくは標識を封Ｍ基内に組込み、或いは各付加の間にこれを除去しうるよう組込まれる。これは検出を実質的に一層簡単にし、リポータ基の群の総和における変化でなく、各付加の後に４個のりポータ基の１つの存在を記録する。

第２図に示した具体例において、リポータ信号の存在は、電源２４および検出器２６として示した分析システムにより反応帯域１４内で直接に記録される。しかしながら、各サイクルの間にリポータ基が除去される具体例においては、反応帯域１４につき行なわれた後に遠隔部位にてリポータを解読し、或いは検出しうることも了解されよう。たとえば、排液経路２２を試料収集器（図示せず）に対し弁を介在させて設け、その後の解読のため個々の標識解除生成物の溶液を分離しかつ貯蔵することができる。或いは、標識の性質が許せば、各種の除去された標識を反応帯域から流出する際に経路２２に、たとえば電源２４”および検出器２６′などの経路内測定セルを装着して解読することもできる。

本発明の第２具体例は４つの別々の平行反応帯域を用いる。

この方法は、１種類の標識しか必要とせず、しかもこれを４種全てのｄＮＴＰと共に使用しうるという利点を有する。第３図は、４個の反応帯域配置を有する装置３０の図面である。この配置には４つの反応帯域３２ａ〜３２ｄが存在し、そのそれぞれは第２図における反応帯域１４と類似する。これらの場合、４個の反応帯域のそれぞれは、処理された生−末鎖ＤＮＡの多数のコピーが固定化された表面３４ａ〜３４ｄを備える。各反応帯域には、経路３６ａ〜３６ｄを介しポリメラーゼが供給される。各帯域には、経路３８ａ〜３８ｄを介し適する反応媒体が供給される。４種のｄＮＴＰを封鎖型にて各帯域に供給する。

帯域３２ａにおいては、ブロックトｄＮＴＰの１種を標識し、（たとえば「Ａ” 」）；帯域３２ｂにおいては第２ｄＮＴＰを標識しくたとえばｒｃ’　」）；帯域３２ｃにおいては第３　ｄＮＴＰを標識しくたとえば’Ｇ’　Ｊ　）　；さらに帯域３２ｄにおいて第４標識ｄＮＴＰ　（ｒＴ’　Ｊ　）が存在する。これら標識された物質をそれぞれ経路４０ａ〜４０ｄを介して供給する。未標識のブロックトｄＮＴＰを経路４２ａ〜４２ｄを介し供給して、４つの反応帯域のそれぞれが３種の未標識ブロックトｄＮＴＰおよび１種の標識ブロックトｄＮＴＰを含有するようにする。この場合も第２図を参照して認められるように、各種の標識および未標識ｄＮＴＰを予備混合することができる。これら予備混合された物質を、単一の添加経路を介して種々の反応帯域に添加することができる。

第２図を参照して記載したと同じ一般的方法を用いて、プライマーに対しハイブリダイズされかつ、表面３４ａ〜３４ｄのそれぞれに付着された一本鎖ＤＮＡをポリメラーゼ（経路３６ａ〜３６ｄを介し供給）と緩衝剤（経路３８ａ〜３８ｄを介し供給）と４種の塩基とに４つの反応帯域のそれぞれにて接触させる。主連鎖上の第１塩基に相補するブロックトｄＮＴＰが結合する。４つの反応帯域の１つにて、この塩基が標識される。これら４つの帯域のうち、どこでこの標識が増大する連鎖中に組込まれたかを記録することにより、第１位置にて組込まれたｄＮＴＰのアイデンティティ−を決定することができる。連鎖の第１単位のアイデンティティ−に関するこの決定は、それぞれたとえば４４ａ〜４４ｄおよび４６ａ〜４６ｄのような信号源と検出器とを用いて行なうことができる。封鎖解除は、封鎖解除用の溶液を経路４８ａ〜４８ｄを介し反応帯域に添加して行なわれる。経路５０ａ〜５０ｄは、各工程後に反応帯域から物質を除去するための排液経路である。

この第２の配置において、第２図に記載した装置を参照して示した改変（たとえばリポータ信号の蓄積および順次の各結合の１部としてリポータ基を除去することによる反応帯域からのリポータ信号の発生を含む改変の全て）を用いることもできる。

明らかに、この具体例も容易に自動化することができる。

本発明の１つの明瞭な潜在的欠点は、長い一連の反応を用いることである。これら各反応の効率および収率が比較的高いとしても全収率は多数の数値の積となり、これは１．００よりも若干低く、したがって許容しえない程低くなりうる。たとえば所定の付加工程の収率が９８％でありかつ封鎖解除も９８％であれば、１５回の付加の後の全収率は４８％となり、３０回の付加の後には２３％となり、６０回の付加の後には５．３％となる。

この限界は、ＤＮＡ分子成長を定期的に阻止すると共に成長を阻止する前に得られた配列データを用いて分子の１部を外部的に再形成することにより軽減することができ、次いでこれを新たなりＮＡ作成のためのプライマーとして使用することができる。

この過程を第４図に示す、第４図は、本発明を用いる自動化された配列決定装置５２の図面である。配列決定装置５２は、たとえば表面１５上に固定化された主プライムＤＮＡを組合せる単一の反応帯域１４を備える。好適には脱着自在に標識された４種の３−ブロックトｄＮＴＰを経路１８を介し反応帯域に供給する。

ポリメラーゼおよび緩衝剤は、それぞれ経路１６および２０を介して添加される。さらに、ｄＮＴＰとポリメラーゼと緩衝剤とを工程から工程へ経路５４および５６、ならびに保持槽５８を介して循環することができる６反応帯域１４に対し流体を流入させかつ除去する弁は全て、弁制御クロックとして機能する中央コンピュータ６０により制御することができる。

このコンピュータ６０は、さらに経路２８からの封鎖解除剤の添加をも制御して、溶出液を封鎖解除すると共に切断された標識（標識が封鎖基に存在する場合に得られる）を経路２２を介して除去し、検出器システム２４／２６を介して検出し、検出槽６２にて標識値を解読する。

この具体例は、蛍光標識システムの使用を示し、経路６４を介し蛍光検出帯域６２に対する蛍光増感剤（フラング−）の添加を示す。

槽６２における標識の検出の後、封鎖解除用の溶液と検出された標識とを経路６６を介して捨てる。

検出器２６により同定された標識により与えられる信号をアナログ／デジタル変換器６８に移送し、さらに中央コンピュータ６０における記憶部に移送してここに記憶させる。多数の反復の後、コンピュータ６０における記憶部は、反応器１４内に含まれる主もしくは標的ＤＮＡ分子と関連して作成された相補ＤＮＡ分子の初期部分の配列を含む、所定数の単位が集成された後（典型的には２５〜３００、より好ましくは５０〜３００、一層好ましくは１００〜３００個の単位が集成された後）、増大する相補ＤＮＡ分子を固定化された主ＤＮＡ分子から切断して捨てる。この切断（変性）は、当業界で知られた方法により、たとえば反応帯域を７５°Ｃもしくはそれ以上（好ましくは９０〜９５°Ｃ）まで数分間（１〜１５分間）にわたり加温して行なうことができる。他の同等な方法も使用することができる。コンピュータ６０に記憶された配列情報を用いてＤＮＡ合成装置７０を駆動させることにより、捨てられたＤＮＡ分子の少なくとも１部に対応する新たなりＮＡプライマーを外部で形成する。

〔さらに、この配列は所望ならばプリンタ７２で解読することもできる〕、この新たに作成されたＤＮＡプライマー分子を経路７４を介し反応帯域１４までハイプリント化条件下で供給して、主ＤＮＡ分子の相補領域に対し新たなプライマーとして結合させる。

プライマーの長さは、主ＤＮＡの単一領域に対し明確かつ強力にハイブリダイズするのに充分でなければならない、ハイブリダイズ技術で知られているように、これはたとえば配列、環境条件および主ＤＮＡの長さのような諸因子に依存することができる。操作の効率のため、プライマーは理想的にはできるだけ短くすべきである。プライマーの長さは典型的には約１０個の塩基〜約３０個の塩基の範囲であるが、上記基準を満たせばそれより短いプライマーも確かに魅力的であり、またコストおよび時間が増大してもよければそれより長いプライマーも使用することができる。一般に、１２〜２０個の塩基の長さを有するプライマーにより良好な結果が達成される。これは分子成長反応に多数の適切に処理された同一分子での「新たな開始部」を与える。これは、次のｄＮＴＰを結合させる際に強力な信号を発生させることができる。

この成長の再出発は、強力な一貫した標識信号を確保するのに要する頻度で行なうことができる。

Ｓお　び　１１びに　゛おびＡ増大する相補連鎖中に封鎖デオキシヌクレオチド三燐酸のそれぞれを組込むべく本発明で用いる結合法は酵素調整法である。

相補ＤＮＡ連鎖の各要素を適当な雛型依存性酵素によって付加する。使用しうる１種の酵素はセクエナーゼ（登録商標）酵素［その配列決定特性を向上すべく改変されたバクテリオファージＴ、ＤＮＡポリメラーゼから得られる酵素：テーバ −およびリチャーソン、プロシーディング・ナシッナル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第８４巻、第４７６７〜４７７１頁（１９８７）、ユナイテッド・ステーク・バイオケミカル・コーポレーシッン社、クリーブランド、オハイオ州により販売〕である。セクエナーゼ（登録商標）の代りに使用しうる他のポリメラーゼは、限定はしないがＤＮＡポリメラーシーのフレノウ断片、ＡＭＶ逆転写酵素およびＴａｑポリメラーゼを包含する。

典型的には、用いられる結合条件はこれら酵素につき当業者で知られた条件である。セクエナーゼ（登録商標）の場合、これらはほぼ室温〜約４５℃の範囲の温度；ｐ８７〜８、好ましくはＰＨ７，３〜７．７の緩衝剤；１μ２当り約０．０１単位〜１μｌ当り約１単位の酵素濃度；および約１〜約２０分間、好ましくは１〜５分間の反応時間を包含する。セクエナーゼ（登録商標）と共に使用するための典型的な緩衝剤は次のもので構成される：０．０４０ＭのトリスＨＣｊ！（ｐＨ７，５）０、０５０　Ｍの塩化ナトリウム０．０１０Ｍの塩化マグネシウム０．０１０Ｍのジチオスレイトール。

ＤＮＡポリメダーゼ■のフレノウ断片の場合、これら典型的な条件は約１０〜約４５℃、好ましくは約１５〜約４０゛Ｃの範囲の温度；ｐｎｓ、ａ〜７．４、好ましくはｐＨ７，０〜７．４の緩衝剤；ＩμＥ当り約０．０１単位〜１μｌ当り約１単位、好ましくは１μ！当り約０．０２〜約０．１５単位の酵素濃度薔および約１〜約４０分間の反応時間を包含する。ＤＮＡポリメラーシーのフレノウ断片と共に使用するのに典型的な緩衝剤は、次のもので構成される：０．０５Ｍのトリスクロライド（ｐｔ１７．５　）０．０５Ｍの塩化マグネシウム０．０５Ｍの塩化ナトリウム０．０１０Ｍのジチオスレイトール。

これらの条件は代表的なものである。他の酵素を使用する場合は、一般に付加反応をできるだけ迅速に行なうことが望ましいため、これらに最適な条件を用いるべきである。この目的で、しばしば逆転写酵素については４２℃の温度；クレノウボリメラーゼについては２４℃；セクエナーゼ（登録商標）については３７℃ 、Ｔａｑポリメラーゼについては７２℃の温度を使用することが望ましい、さらに、誘導化されたｄＮＴＰに対し特に反応を促進するには、しばしば相当過剰量（化学量論より多量）のｄＮＴＰを使用し、或いはたとえば塩濃度のような他の条件を改変することが役立つであろう。

・　入“ 結合反応は一般に、不都合な余分の付加を防止するため、３゛ヒドロキシル封鎖されたｄＮＴＰを用いる。

３°−封鎖基の好適使用に関する基準は次のことを包含する：（１）３”−封鎖基を支持するｄＮＴＰをｃＤＮＡ連鎖中に正確かつ効率的に組込むポリメラーゼ酵素の能力、（２）迅速かつ定量的な封鎖解除のための緩和な条件の利用性、および（３）封鎖解除工程の後にｃＤＮＡ合成を再開させるポリメラーゼ酵素の能力。

さらに、３゛−封鎖基がリポータ基を持てば、ｃＤＮＡの１部が反応溶出剤にて封鎖解除する前または封鎖解除した後のいずれかにリポータが鋭敏な検出を可能にすることが望ましい。

本発明の場合、３゛−ブロックトｄＮＴＰを用い、これを雛型依存の方式で組込むと共に容易に封鎖解除して可使３’　−ＯＨ末端を得ることができる。最も一般的な３°−ヒドロキシル封ｉｌｌ蟇はエステルおよびエーテルである。ｄＮＴＰの３’　−ＯＨ位置に対する他の封鎖用改変は、たとえば−Ｆ、　−ＮＨ！　、　−０ＣＨ３。

−Ｎｓ、　０ＰＯ３”、　ＮＨＣＯＣＨｓ、２　：）Ｏべ７ゼンカーポネート、２．４−ジニトロベンゼンスルフェニルおよびテトラヒドロフラニルエーテルのような基の導入を包含する。

組込みおよび連鎖停止は、多くのこれら封鎖基を有するｄＮＴＰによって示されている〔タレブスキー等、１９８７）。

現在、好適な具体例は、たとえば低級（１〜４炭素）アルカン酸および置換低級アルカン酸エステル、たとえばホルミル、アセチル、イソプロパノイル、α−フルオロ−およびα−クロルアセチルエステルなどのエステル封鎖基；たとえばアルキルエーテルのようなエーテル封鎖基；ホスフェート封鎖基；たとえば２−ニトロベンジルのようなカーボネート封鎖基；　２，４−ジニトロベンゼン−スルフェニルおよびテトラヒドロチオフラニルエーテル封鎖基に集中している。封鎖基は、所望ならば放射性標識（たとえばトリチウム、Ｃ”もしくはｐ３り、酵素、蛍光発生団、発色団を含むリポータ成分を組込むよう改変することができる。

これら封鎖材料はその基本的形態において全て、化学ＤＮＡ合成技術で封鎖剤として使用するように文献中に記載されている。２種の代表的な封鎖剤、すなわちエステルおよびホスフェートを次のようにｄＮＴＰ中に組込むことができる：３゛−０−アシルｄＮＴＰを合成するための一般的手順を、３′−〇−アセチルＴＴＰに関する第５図に示した反応式１に要約する。５゛−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）チミジンＩをピリジン中でのＤＭＴクロライドとの反応によりチミジン上から作成し、次いでピリジン中で無水酢酸を用いて３”−ＯＨ基をアセチル化して化合物まを生成させる〔ツダノフおよびツェノダロバ、１９７５）、２％ベンゼンスルホン酸による５’−ＤＭＴｉの処理は化合物上を生成し、これを燐酸トリメチル中におけるＰＯＣ１３との反応によりホスホモ／エステルｌまで変換させ〔パブチキン等、１９８５）、かつクロマトグラフィーを用いて精製する。

５′−モノホスフェートをＮ、　Ｎ’−力ルボニルジイミダゾールでの活性化により５゛−トリホスフェートまで変換し、次いでトリ（ｎ−ブチルアンモニウム）ピロホスフェートでピロホスホリル化し〔パブチキン等、１９８５Ｌさらにクロマトグラフィーによって精製する。　。

ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰの３゛−０−アセチル誘導体の作成も同じ一般的方式にしたがうが、追加工程を用いて主アミノ基を保護しかつ保護解除する（下記参照）、ヌクレオチドの５°−トリホスフェート誘導体はしばしば不安定であるため、上記最終製造工程は必要に応じｄＮＴＰを反応セル中に導入する直前に行なうことができる。放射能標識した無水酢酸を用いれば、これは標識をエステル封鎖基中に導入するよう作用する。

３“−０）（基のこのエステル封鎖を行なう場合、シトシン、アデニンおよびグアニンにおける第一アミノ基もたとえば無水酢酸のような電性試薬による攻撃を受け易く、有利に保護しうろことに留意すべきである。化学的なオリゴヌクレオチド合成（ホスホトリエステルもしくはホスホルアミダイド法）の場合、第一アミンの保護には各種のＮ−アシル基が一般に使用される〔パブチキン等、１９８５）、Ｎ−アシルは酸性溶液および中性溶液にて安定であるため、典型的には除去はアンモノリシスによって行なわれる。これら条件は３゛−０−アシル封鎖基および塩基性条件下で加水分解しうる他の封鎖基を切断すると思われ、したがってアミノ基保護を選択的に除去することが望ましければ代案のＮ−保護を使用すべきである。幾つかの選択除去しうるアミン保護基は、酸加水分解によって切断しろるカルバメート〔ｔ−ブチル、２−（ビフェニル）イソプロピル〕および酸切断を受け易い成る種のアミド（ホルムアミド、トリクロルアセタミド）を包含する〔グリーン、１９８１）。

３′−モノホスフェ−）ｄＮＴＰの合成をＴＴＰにつき第６図に示した反応式２に要約し、これはＨ−ホスホネート法を用いる化学的オリゴヌクレオチド合成につき報告された手順の変法である〔フレーシー等、１９８６１．５°−ＤＭＴ− ３’−チミジンビーホスホネート１を５°−〇ＭＴチミジンＩと三塩化燐、１．２．４−　）リアゾールおよびＮ−メチルモルホリンとの反応により作成する。

５′−保護基の踪去を５″−トリホスフェート部分の形成（１〜上よ）が、反応式１に示したように達成される。３゛−０Ｈ−ホスホネートＴＴＰ上上を、塩基性溶液中にて沃素での酸化により３゛−０−モノホスフエートユまで変換する。

他のヌクレオチド誘導体については、第一アミノ基の保護をホスホネート化の前に行なう。この作成においては、アンモノリシスにより切断しうる標準的保護基を使用することができる。

封１」口釦汰ＤＮＡ１ｉ中への３゛−封鎖されたヌクレオチドの組込みに成功した後、配列決定法は封鎖基を除去して連続した連鎖合成につき可使３’　−ＯＨを生成させる必要がある。封鎖解除法は（ａ）　迅速に行ない、（ｂ）　高収率で可使３°−０）１基を生成させ、さらに（Ｃ）　将来の酵素機能を阻害したり或いはＤＮＡストランドを変性しないことを必要とする。

（ｄ）　勿論、選択される正確な封鎖解除化学は用いる封鎖基に大きく依存する。たとえば、３−ヒドロキシル基からのエステル封ａ基の除去は一般に塩基加水分解によって達成される。除去の容易さは広範に変化し、一般にカルボニル炭素における置換基の電気陰性度が高いほど、除去の容易さも大となる。たとえば、高度に電気陰性の基トリフルオロアセテートはメタノール中でｐＨ（７にて３゛ −ヒドロキシルから〕、速に切断され〔クラマー等、１９６３］、したがってこのｐＨにて結合に際し安定でない。フェノキシアセテート基は１分間以内に切断されるが、たとえばＮＨ，／メタノールで達成されるような実質的に高いｐｌ（を必要とする〔リースおよびスチュワード、１９６Ｂ）、極めて尚早な封鎖解除およびＤＮＡ減成を防止するには、有利には組込みに際し１０″３Ｓ−１未満の封鎖解除速度と封鎖解除階段に際し少なくとも１Ｏ−３Ｓの封鎖解除速度とを示すようにエステル封鎖解除速度が選択される。理想的には、この速度変化は緩衝剤ｐＨを７から約１０まで変化させて達成されるが、ＤＮＡを変性させないよう注意を払わねばならない。

塩基加水分解以外の化学的方法を用いて、広範な種類のヒドロキシル封鎖基が選択的に切断される。２．４−ジニトロベンゼンスルフェニル基は、たとえばチオフェノールおよびチオサルフェートのような核性物質での処理によって２、速に切断される（レンチンガー等、１９６４）。アリルエーテル／水中における）Ｉｇ（ＩＩ）での処理により切断される〔ギングおよびワレン、１９６Ｂ）。テトラヒドロチオフラニルエーテルは、中性条件下でＡｇ（Ｉ）もしくは口ｇ（ＩＩ）を用いて除去される〔コーヘンおよびスチール、１９６６；クルース等、１９７８）。

ｄＮＴＰ同族体の合成および順次の組込み工程に使用される条件に対し安定であるこれら保護基は、塩基加水分解により切断しうる基よりも幾つかの利点を有する。封鎖解除は特定の封鎖解除試薬が存在する場合にのみ生じ、組込みの際の尚早な封鎖解除が最小化される。

光化学的に切断しうる封鎖基を用いて、光化学封鎖解除を使用することができる。この積の方法につき、数種の封鎖基を利用することができる。リボヌクレオシドの２゛−ヒドロキシル基に対する保１基として０−ニトロベンジルエーテルを使用することが知られており、かつ例示されている〔オーツカ等、１９７８）、２６０ｎｍでの照射によって除去が生ずる。アルキル０−ニトロベンジルカーボネート保護基もｐＨ７での照射により切断される［カマおよびクリステンセン、１９７８）。

３′−ＯＨ封鎖基の酵素的封鎖解除も可能である。Ｔ、ポリヌクレオチドキナーゼは３′−ホスフェート末端を３′−ヒドロキシル末端まで変換させ、次いでこれをＤＮＡポリメラーゼｌ用のプライマーとして作用させうることか示されている〔ヘンナ−等、１９８３）。この３′−ホスファターゼ活性を用いて、ホスフェートを封鎖基として含有するようなｄＮＴＰ同族体の３°−封鎖基を除去する。放射能標識はヌクレオチド同族体の組込みとホスフェート基の除去とを容易に行なうことを可能にする。

放射性同位元素の使用が大き過ぎる欠点を示せば、切断しうる蛍光性標識を持った未標識のホスフェートモノエステルを使用することができる（下記参照）。

この方法は、各工程の効率および速度を増大させて改善される。＆Ｉｌ込みおよび封鎖解除につき最適な方法を選択するに際し、他の非化学的補助を用いて化学的封鎖解除を促進することもできる。これは、たとえば物質移動限界が顕著であれば反応室に対する制御された超音波照射を加えて封鎖解除工程の速度を増大させると共に、反応温度を約５０°Ｃまで短時間にわたり上昇させることを含む。

ｌ　ボー　の　；入　・本発明の１部として、相補連鎖中への各ｄＮＴＰの組込みは、組込まれたｄＮＴＰに存在する或いはそれと結合した標識もしくはリポート基を検出することにより認められる。標識またはマーカーは「無害」である。「無害なマーカーもしくは標識またはリポータ」は放射性、蛍光性などのマーカーもしくはりボークを意味し、ｃＤＮＡに対する標識ヌクレオチドの酵素的付加または可使３’　−ＯＨ末端を生成させるその後の封鎖解除のいずれをも阻害しない物理的および化学的性質を有する。

１つの簡単な標識法は、放射性物質を封ｌｊ基内に組込み或いはｄＮＴＰ単位の他の個所に組込むことである。これは、Ｃ１４標識もしくはＰ０槓識によって容易に行なうことができる。

他の標識法は蛍光性標識を用いる。これらは、３’　−ＯＨ封鎖基を介しｄＮＴＰに付着することができ、或いは他の位１に付着することができる。蛍光性１ｍを用いて２つの一般的経路が可能である：（１）それ自身蛍光性であり、封鎖解除の前もしくは後のいずれかに検出される標識基の使用、および（２）非蛍光性プローブもしくは他の成分との蛍光性相互作用によって検出される非蛍光性標識基の使用。

第１の経路はかなり簡明であり、たとえばローダミン、フルオレシンなど、典型的にはｄＮＴＰなどを標識する際に有用であることが知られた蛍光発生面などを含む範囲の公知の蛍光発生面を使用することができる。しかしながら、一つの注意は標識されたｄＮＴＰがポリメラーゼまたは同様に機能する酵素により増大するＤＮＡ連鎖中に容易には組込まれないほど大きくない蛍光発生面を選択するよう試みることである。第２の経路は、断片のみがｄＮＴＰに付着する蛍光発生面を用いることができる。これは、寸法を減少させると共に立体障害を最小化することができる。第２の経路において、標識断片にのみ存在する特定官能基との通常非蛍光性のプローブもしくは分子の急速な反応は、蛍光性付加生成物の形成をもたらす。これは、特定の標識基が存在する場合にのみ信号をもたらす。

この方式に適用しうる１つのシステムは下記のチオール／マレイミドの相互作用である：非蛍光性　蛍光性一般に非蛍光性である成る種のＮ−置換マレイミドは、各種のチオールと容易に反応して蛍光性生成物を形成する〔カナ才力、１９７７）、たとえば−ＣＯＣＨ２Ｓｔ（のような遊離チオル基を有する封鎖基または他の標識断片基をこの方法に使用することができる。或いは、封鎖基または他の標識断片は金属結合性リガンド（たとえばヨーロビウムもしくはテルビウムイオンのような付加稀土類金属イオンと反応するカルボン酸基）を含有して蛍光性物質を生成することもできる。

Ｉ諏に対する上記方法は３”−ヒドロキシル封鎖基中への標識の組込みに集中するが、多くの代案、特にたとえば塩基のような遠隔位置に結合した蛍光性基のような標識を有する３”−ブロックトｄＮＴＰ同族体の形成も存在する。このｄＮＴＰを組込むと共に蛍光度を測定しかつ下記する方法にしたがって除去することができる。

１つの方法は、塩基部分に付着した蛍光性タグの使用を含む。

このタグは化学的に切断することができ（封鎖解除工程とは別途に或いはそれと同時に）かつ封鎖解除の前に反応帯域にて或いは切断後の反応溶出物にて測定することができる。この方法が含まれる理由は、多数の塩基部分誘導化ｄＮＴＰ同族体が酵素競合性を示すと報告されているからである。サルファチ等（１９８７）は、ニック翻訳におけるビオチニル化ｄＡＴＰの組込みを示し、たとえば５− ビオチン（１９）−ｄＵＴＰ　（カルビオケム社）がポリメラーゼおよび逆転写酵素によって組込まれる。プローバー等（１９８７）は、逆転写酵素およびセクエナーゼ（登録商標）による蛍光性ｄｄＮＴＰの酵素的組込みを示している。

他の種類の遠隔標識においては、蛍光性部分または他の無害標識をスペーサもしくはテザーを介しｄＮＴＰに付着させることができる。所望ならば、テザーを切断して蛍光発生団または他の標識を要求に応じ放出させることもできる。次の連続するヌクレオチドが付加される前に蛍光性基を除去しろる数種の切断しうるテザーが存在し、たとえば塩基もしくは弗化物により切断しうるシリルエーテルが適するテザーであり、アリルエーテルは）Ｉｇ（ＩＩ）により切断することができ、或いは２，４−ジニトロフェニルスルフェニルはチオールもしくはチオサルフェートによって切断することができる。酸性条件を用いる切断は、ＤＮＡが塩基におけるよりも酸において一層不安定であるため望ましくない、大きい蛍光性基が塩基およびトリホスフェート部分から充分離間してポリメラーゼに対するｄＮＴＰの結合または相補連鎖の成長に際し適切な塩基対形成を阻害しないよう、長いテザーを使用することができる。典型的なテザーは、長さが約２〜約２０個の原子、好ましくは約３〜約１０個の原子である。

プリン構造のＣ−８位置は、標識を付着させるための理想的な位置を提供する。

サルファチ等（１９８７）は、最終的に８−置換ビオチンアルジルアミノｄＡＴＰを作成するためのプリンのＣ−８におけるデオキシアデノシンの誘導化を記載している。サルファチ等（１９８７）の方法を用いて、ビオチニル化でなく通する蛍光性の同族体を作成することができる。チミジンおよびデオキシシチジンの蛍光性誘導体を製造するには多くの方法が可能である。１つの極めて有能な方式はプロパー等（１９８７）により用いられた方法に基づき、蛍光性タグを持ったｄｄＮＴＰを作成する。以下の構造Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、これら合成法から生ずる種類の蛍光性ｄＮＴＰを示している。

合成経路は、リンカ−を長さもしくは官能性に間し変化させうる点で大きい柔軟性を有する。さらに、末端蛍光性部分も必要に応じ変化させることができる。

このように増大するｃＤＮＡ連鎖中に組込まれた４！識を、積用の分析法により検出する。多くの場合、特に蛍光標識を用いる場合、向上した検出感度が本方法の主たる利点である。蛍光性信号を配列決定用ゲルで検出する場合、信号は低レベルの蛍光発生団に基づき、ゲルおよびガラス板からの分散のバックグランドに重なる。これは感度を低下させ、しばしば現在の方法を感度を最大化させるレーザー照明の使用に拘束する〔スミス等、１９８６；プローバー等、１９８７；アンソルゲ等、１９８６］　。

蛍光発生団の検出は、たとえばパーキン・ニルマー社により販売されるような市販の非励起スペクトロフルオロメーターで容易に達成することができる。これら装！においては、レーザー光源に関する要求が除去され（ただし所望に応し、これを使用しうることは勿論である）、発光ダイオード（ＬＥＤ）または積用のキセノンアークランプの使用を可能にし、その選択は主としてこれが必要とする蛍光発生団および励起周波数により支配される。

典型的ＬＥＤは次のものを包含する：（１）約６５Ｏｎ−にて４０ｍｗ／ｃ＋ｅ”　／ステラジアンのラジ７７スで発光する赤色ＬＥＤ　。

（２）約５４ｏｎ−で発光する緑色ＬＥＤ　。

（３）約４５ｏｎ−で発光する青色ＬＥＤ。

蛍光性および放射性検出法が好適方法の基礎を構成するが、他の検出法も考えられる。検出法としては化学発光法も使用することができる。特定（切断）封鎖基と固定化ルミノール誘導体との相互作用も、分光電気化学的に検出することができる。

他の方法においては質量分光光度検出を用いて、切断された封鎖基またはヌクレオチドを含有する溶液をフィールドイオン化質量分光光度計に直接注入する８組込まれ或いは切断された特定ヌクレオチドの同定は、特定ヌクレオチドまたは封鎖基に対応する分子イオンピークの相対的濃度を監視して達成される。

たとえば、ｌ質量単位だけ相違する４１１の異なるアセチル封鎖基（トイチリウムによる０〜３個の水素の置換）は、小「ウィンドー」を監視して検出することができる。

土り」ノ己凶１Ｌ化本発明においては、−末鎖主ＤＮＡもしくはそのプライマーを固定化する。この固定化を行なう１つの方法は、ＤＮＡを固体基質に付着させることである。近代的分子生物学の技術の多くは、固体支持体に対するＤＮＡの固定化を含む、ＤＮＡおよびＲＮＡは一般に、各種の膜に対するその長さに沿ったイオン相互作用により非共有的に付着する〔サウザン、１９７５；マニアチス、フリッチおよびサムプルツク、１９８２；チェブビロおよびタラプチェンコ、１９８４）。同様に、ポリヌクレオチドはその長さに沿って膜〔ゴールドベルク等、１９７９）、樹脂〔シード、１９８２　；アルンツージョビン等、１９７５］またはプラスチック［ポルスキーチンキン等、１．９８５　］に対し共有付着する。これらの方法は、この多点付着が成る場合には相補ＤＮＡストランドのその後の合成を阻害しうることに注意すれば用いることができる。固体重合体もしくはガラス支持体に対するＤＮＡの単一点共有付着も可能である。この種の単一点法が主ＤＮＡを固定化するのに好適である。何故なら、これはここで用いるポリメラーゼおよび同様な酵素に対する相互作用につき連鎖を遊離させるからである。

ガラスもしくは石英に対するＤＮＡの単一点結合を行なうには、しばしば本発明の方法で実施する反応および濯ぎに際し不活性な結合を確保すると共にＤＮＡの損失を防止するようガラスもしくは石英を処理するのが好適である。ポジエツト等（１９８７）が示したところでは、ＤＮＡの極めて効率的な固定化が、シラン化されたガラス表面上で生じた。したがって、石英もしくはガラスの内表面は、たとえばトリエトキシシリルプロピルアミンもしくはジクロルジメチルシランのようなシラン化用試薬を用いて有利に官能化することができる。これは、これら官能性基に対する長鎖アルキルアミノの共有付着によって行なわれる。生一本ＤＮＡは長鎖アミンに付着する。次いで、付着した一本鎖ＤＮＡは、相補連鎖の形成に対する雛型として作用する。

他の具体例において、固定化は主ＤＮＡをプラスチ・ンク表面に付着させて行なわれる。たとえばｐ３Ｎからのセレンコツ照射を移動させるよう設計された薄いポリプロピレン室壁部をＤＮＡ固定化用の適する基質として作用させることができる。プラスチック表面を用いる場合、クレムスキー等（１９８７）の方法を用いるのが好適であり、ここでは表面をストレプトアビジンで被覆し、これにアルキルビオチニル化されたオリゴヌクレオチドを結合させる。固定化されたオリゴヌクレオチドを雛型ＤＮＡに対しプライマーとしてアニールする。

表面へ固定化することにより生−末鎖ＤＮＡを保持する他に、主ＤＮＡはこれを保持する膜の使用により包封することもできる。この具体例において、反応帯域は、たとえば限外濾過膜（たとえばそれぞれ５０００および１０．０００の公称分子量区分を有するアミコンＰＭ−５もしくはＰＭ−１０膜）のような膜で覆われた１個もしくはそれ以上の開口部を有する。すなわち、これらはそれぞれ５０００および１０．０００未満の分子量を有する物質を通過させうると共に、これら寸法より大きい物質を保持する。たとえばダウ社もしくはアブコール社により市販されているような他の限外濾過膜もしくは透析膜も使用することができる。

この具体例においては、−末鎖ＤＮＡを反応帯域内の液体に懸濁させる。標識および未標識ｄｄＮＴＰおよび他のカップリング試薬を帯域中へ流入させる。物質を、ＤＮＡ連鎖を保持するこの種のフィルターを介して帯域から除去する。この方法においては、カップリングを行なうために使用するポリメラーゼもしくは他の酵素は一般に膜により保持される寸法を有する。この操作方式は化学的であるが酵素的でない封鎖解除につき作用する。何故なら、酵素的封鎖解除においてはポリメラーゼおよびホスファターゼを別々にセル中に循環させねばならないからである。

代案具体例においては、ＤＮＡを樹脂もしくは重合体微小球の粒子に固定化することができ、これら粒子を室内に保持する。

この具体例においては、ＤＮＡがフィルター細孔中に侵入しえない寸法を有する樹脂粒子に付着する限り、フィルター材料は重要でない、５゛末端を介しＤＮＡを樹脂にカップリングさせるには数種の方法が存在する〔ポジエツト、１９８７．ポリスキーチンキン、１９８５）、たとえば、オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドはその５°末端を介しセルロースに結合し［ギルハム、１９６８；クレリシ等、１９７９Ｌセフアクリルに結合し〔ラングダーレおよびマルコルム、１９８５）またはラテックス微小球に結合する〔クレムスキー等、１９８７　）。

これら方法において、ＤＮＡを他の槙酸もしくは蛋白との相互作用につき利用することができる０本発明につき特に興味あるものは、ゴールドコルンおよびプロコンブ（１９８６）のオリゴ（ｄＴ）−セルロースに対するＤＮＡの共有結合の方法である。或いは、ＤＮＡはアルキルビオチニル化オリゴヌクレオチドによりストレプトアビジン−アガロースビーズに共有結合する（クレムスキー等、１９８７）。

さらに他の具体例においては、−末鎖ＤＮＡを保護ストランドの存在下にたとえばフィルターのようなり８Ｍ紙に結合させる。結合の後、保護ストランドを開放して、固定化雛型および処理用部位を順次の酵素反応につき遊離させる〔ハンセン等、１９８７）。この方法および上記した他の単一点法は、ＤＮＡを固定化すると共にこれをＤＮＡ配列決定に使用される酵素との相互作用につき遊離させるのに有用である。

夫−旌一■ 皇−隻一斑一上 ’−ＰＯｒＰ”　チミジン二車　のム７５０＋＊ｌの乾燥塩化メチレン（ＣＨｚＣ１□）における三塩化燐（Ｐ”）（７５ミリモル）とＮ−メチルモルホリン（７５０ミリモル、アルドリッチ社）との攪拌溶液に室温にてＬ２，４−トリアゾール（２５０ミリモル）を添加した。

この反応混合物を１時間攪拌し、０℃まで冷却し、さらに２００ｓ＋１の無水アセトニトリルにおける１５ミリモルの５′−ジメトキシトリチルチミジンＩ　（シグマ社）を３０分間かけて清加した（第７図に示した反応式３参照）、この溶液をさらに３０分間攪拌し、次いで６００１の１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ、ｐＨ８，５）に注ぎ入れた。有機層を分離し、水層を２Ｘ２００＋ｉｌのＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。　ＣＨｚＣｈ抽出物を合して硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ，）で脱水し、濾過し、さらに減圧下で室温にて蒸発乾固させた。

次いで粗製５°−ジメトキシトリチル−３゛−チミジンビーホスホネート■をｃｎｚｃｌｚ　：メタノール（ＭｅＯ）１）　（７：　３　）（２００Ｔａｌ）中にて２％ベンゼンスルホン酸で１時間処理した。

この溶液を１０％重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯｚ）と水とで洗浄し、１ｉｆＬ酸マグネシウムで脱水し、次いで蒸発乾固させた。粗製３゛−チミジンビーホスホネート■をエタノール／エーテルから再結晶化させた。

０°Ｃのトリエチルホスフェ　）３０ｍｌにおける１ｍｌのオキシ三塩化燐（ＰＯＣｌ２）の溶液に、１０ミリモルの３゛−チミジンビーホスホネートを添加した。この混合物を０“Ｃにて１２時間攪拌し、ＮａＨＣＯ３溶液で中和すると共に１５０＋１の水に添加した。この水溶液をベンゼン（２Ｘ　１０　（１＋１）およびエーテル（２×１００ｍ１）で洗浄し、水により０．８１まで希釈し、さらに２．５×５０ｃｍのＤＥＡＥ−セルロースのカラムに充填した。ｐＨ８，５の重炭酸アンモニウム溶液の直線的濃度勾配（０，０５〜０．２５Ｍ）を用いて生成物を溶出させた。フラクションを集めてＨＰＬＣにより分析し、所望の生成物含有フラクションを決定すると共に、これらを減圧下で蒸発乾固させた。残留物を水と共に反復再蒸発させて塩を除去した。

次いで５′−モノホスフェ−）ＩＶ（１６ミリモル）を３０ｍ１のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させ、Ｎ、Ｎ”−カルボニルジイミダゾール（３０ミリモル）で室温にて１時間処理した。

反応を５１のメタノールの添加によって停止させ、ＤＭＦにおケ！　０．５　Ｍのビス（トリーｎ−ブチル−アンモニウム）ピロホスフェートの溶液６０ｍ１を１０分間かけて°滴加した。２４時間にわたり攪拌した後、溶液を水で１２まで希釈すると共に、５％とりジン／水における０、　１　Ｍ沃素（Ｉ２）の溶液１００謡ｌで処理した。１時間の後、溶液をシグマ社からのＤＥＡＥ−セルロースカラム（５×５０ｃ１１）またはファルマシア社からのセフラデノクスに付着させた。このカラムを水洗し、次いで重炭酸トリエチルアンモニウム溶液（０，０５〜０．５Ｍ）で溶出させた。

回収した過当なフラクションを蒸発させることにより、５゛−トリホスフェート −３゛−ホスフェートチミジン生成物■が得られた。

実−」１−例−」− °−−゛　ミジン三　のＡ１０＋１の乾燥ピリジンにおける５゛−ジメトキシトリナルチミジンＩ　（２，５ミリモル）の溶液を無水コハク酸（８ミリモル）により４°Ｃにて２４時間処理した。冷水（１５０＋ｇｌ）を添加し、さらに３０分間の後に溶液を濾過した。洗浄されかつ乾燥された沈澱物を３０　ｍｌ　（７）Ｃ［１ｚＣｈニ溶解し、水（・２×２５ＩＩｌ）テ抽出し、Ｍｇ５Ｏａで脱水し、次いで蒸発乾固させた（第８図に示した反応式４参照）。

５゛−ジメトキシトリチル−チミジン３°−スクシネート■（２ミリモル）を１５−１の乾燥ＣＨ２Ｃｌ　ｇに溶解し、０℃まで冷却し、次いで５倍過剰量のＮ、Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールで処理した。１時間の後、修飾アミノ基を有する当量の蛍光性標識１＆（すなわちダンジルカダベリン）を添加し、さらに溶液を１０”Ｃにて８時間攪拌した０次いで溶液を水（２Ｘ　１０ｍ１）で洗浄した。ＣｈＣｈ層をＭｇ５Ｏ，で脱水し、蒸発乾固させて生成物■を得た。ジメトキシトリチル保護基の除去および５゛−トリホスフェート■への変換を、３°−ホスフェートチミジン三燐酸■ につき記載したと同様な方法で行なった。

この反応を同様に他の３種のヌクレオシドを用いて行なうことにより、対応の標識された物質を得た。

皇−隻−五−１ＤＮＡの４個の２５μ！容積の石英キュベツト反応室を作成した。これら反応室は第３図に示したと同様なチャンバ３２とし、ただしこれらはその内壁部を表面として使用し、これにＤＮＡを固定した。

内表面を洗浄すると共に乾燥させた。トリエトキシシリルプロピルアミン（２０ｕｆのＣＨＣｌ　ｓにおける５μｌ）を添加し、無水条件下で５°Ｃにて１２０分間保った。これはトリエトキシシリルプロピルアミンを表面に結合させ、表面に対しアミン特性を付与した。

次いで主ＤＮＡをアミン表面に付着させた。これは、先ず最初に、長鎖アルキルアミン（ｎ−オクチルアミン）を主ＤＮＡ分子の５”末端にて塩基に付着させ或いは適する、たとえば１７Ｍ体ｄＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴのＭ１３プライマーのような適するプライマーの５°末端にて塩基に付着させ、次いでアルキルアミンをグルタルアルデヒドとの反応（１，５当量、２５°Ｃ１１２０分間）によりアミノプロピルシラン表面基に結合させて行なった。

塩基部分に対し修飾性または５”位１に付着した他の官能基も、誘導化石英もしくはガラス表面に対する共有固定化のため使用することができる〔たとえばアルデヒドもしくはカルボン酸（クレムスキー等）〕。

実−」１−倒一」よりＮＡへの　−ヌクレオチド口　の　′入２５μｌの反応帯域に、３単位のセクアナーゼ（登録商標）酵素を含有する反応混合物を充填した。この反応混合物は、さらにこの酵素のための適する緩衝剤（２０ｍＭのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、１０ｍＭのＭｇＣｂ　、２５　ｍＭのＮａＣ］、０．０１　Ｍのジチオスレイトール）をも含有し、処理された一本鎖主ＤＮＡを約０．１Ｍの濃度で存在させて、その５“末端にて反応室の表面に付着させ（実施例３参照）、３種の未標識の３′−プロソクドデオキシヌクレオチド三燐酸（ｄＮＴＰ）同族体をそれぞれ１．５μモルの濃度で、さらに実施例２における１種の３′−封鎖された蛍光標識のｄＮＴＰ同族体を３０Ｍモルの濃度でそれぞれ４つの反応帯域のそれぞれに存在させた。各帯域にて、４種のｄＮＴＰの異なる１種を標識した。反応は室温にて１分間行なった。次いで、反応帯域を排液し、次いで緩衝液で濯いだ。

１つの実施例においては、添加ｄＮＴＰのアイデンティティ−をその蛍光標識されたｄＮＴＰを組込んで１個のキュベツト内に存在する蛍光発生団を励起させることにより決定した。代案においては、蛍光性基を測定前に除去した。

！−隻−廻−ｉ上至血且延麗除２．４−ジニトロベンゼンスルフェニル蛍光性封鎖基ヲ、チオ尿素０．０５　Ｍを含有する０、　１　Ｍのピリジン／塩化ピリジニウム緩衝液（ｐＨ７，８）よりなる封鎖解除剤で除去した。封鎖解除反応を４０°Ｃにて１分間進行させた０次いで、反応室を排液すると共に１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐ）１６．５）で２回洗浄した。蛍光性封鎖基の遊離を、流過セルを用いて反応室からの初期溶出液で測定した。蛍光性基が存在するセルに応じ、ＤＮＡ連鎖に付加されたヌクレオチドのアイデンティティ−を決定した。同様に、封鎖基がたとえば反応式４におけるようなダンジルカダベリン型エステルであれば、これは５０％メタノール１５０％水（ｐＨ１０，０）での１分間の処理により除去することができるであろう。

亥−」１−例−Ｊ− 鼠案ｍ封策麗徐封鎖基は酵素的にも除去することができる。

酵素的封鎖解除には、反応室に供給する封鎖解除剤は１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ６，５）と１０ｍＭのＭｇＣ１ｔと５ｍＭの２−メルカプトエタノールと１単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとを含有する０反応を３７℃の温度で１分間進行させた、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼの３“−ホスファターゼ活性は３′−ホスフェート末端を３′−ヒドロキシル末端まで変換させ、これを次いでその後の合成に対するプライマーとして用いた。

これら実施例において、本発明につき各工程を順次に手動で行なって実施するよう示したが、この方法は容易に自動化しうろことが容易に了解されよう、ＰＪ革なりロックメカニズムまたはマイクロプロセッサで駆動されるタイマー回路を用いて複数の電気制御弁を順次に付勢し、種々の試薬を添加することにより構築用ブロックを付加すると共に封鎖解除などを行ない、その結果として標的ＤＮＡ− 末鎖の配列を最小の実験室作業員によって得ることができる。

本発明の極く僅かな実施例につき、ここに図示しかつ説明したが、デオキシリボヌクレオチド連鎖（ＤＮＡ）におけるデオキシリボヌクレオチドの配列を決定する方法につき、本発明の思想および範囲を逸脱することなく配列決定用ゲルの使用なしに、種々の改変および変化を本発明にてなしうろことが当業者には明らかとなろう。

ＦＩＧ、　７ ■ ｘ　− 〇− ！ＦＩＧ、　８ＨＩＮ）ＩＲＮＨＲ五　■ 国際調査報告 −Ｍ拳？＾ｓ＋ｏ＾拳ＩＡ・―ｂ（春ｍ１１〜・ＰＣＴ／ＵＳ９０１０６１７Ｂ国際調査報告ＵＳ　９００６１７８ＳＡ　４２２２２

Claims

【特許請求の範囲】

１．主−本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子におけるデオキシリボヌクレオチドの配列を決定するに際し：主ＤＮＡ分子の存在下に相補ＤＮＡ分子を合成し、この合成を段階的にシリーズで行なって、相補ＤＮＡ分子中に組込まれた各デオキシヌクレオチド三燐酸のアイデンティティーをその組込みの後に決定することを特徴とするデオキシリボヌクレオチドの配置の決定方法。
２．相補ＤＮＡ分子の合成を酵素的に行なう請求の範囲第１項記載の方法。
３．相補ＤＮＡ分子の合成を、この相補ＤＮＡ分子の３′−ＯＨ位置にて付加を生ぜしめながら行なう請求の範囲第１項記載の方法。
４．相補ＤＮＡ分子中に組込まれる各デオキシヌクレオチド三燐酸を、その３′ −ＯＨ位置に封鎖基を有するよう改変する請求の範囲第３項記載の方法。
５．封鎖基を各デオキシヌクレオチド三燐酸から、相補ＤＮＡ分子中に組込まれた後に除去する請求の範囲第４項記載の方法。
６．相補ＤＮＡ分子中に組込まれた各デオキシヌクレオチド三燐酸のアイデンティティーを、４種のデオキシヌクレオチド三燐酸の少なくとも１種に結合した少なくとも１個のリポータ基を同定することにより決定する請求の範囲第１項記載の方法。
７．相補ＤＮＡ分子の合成が、主−本領ＤＮＡ分子を４種全てのデオキシヌクレオチド三燐酸と、主ストランド中における次のデオキシヌクレオチドに対し相補的なデオキシヌクレオチド三燐酸が専ら相補ＤＮＡ分子中に組込まれるような条件下で接触させることを含む請求の範囲第１項記載の方法。
８．接触を単一の反応帯域で行なう請求の範囲第７項記載の方法。
９．主−本鎖ＤＮＡを４種全てのデオキシヌクレオチド三燐酸と接触させる請求の範囲第７項記載の方法。
１０．主−本鎖ＤＮＡを４種全てのデオキシヌクレオチド三燐酸と同時に接触させる請求の範囲第７項記載の方法。
１１．接触を単一の反応帯域で行なう請求の範囲第１０項記載の方法。
１２．接触を互いに相違するリポータ基に関連した４種のデオキシヌクレオチド三燐酸のそれぞれに対し行なうと共に、組込まれた特定デオキシヌクレオチド三燐酸の決定をこれに結合した特定リポータ基を同定して行なう請求の範囲第１０項記載の方法。
１３．接触を単一の反応帯域で行なう請求の範囲第１２項記載の方法。
１４．各デオキシヌクレオチド三燐酸が組込まれるにつれ積算リポータ信号が増大するようデオキシヌクレオチド三燐酸が相補ＤＮＡ分子に組込まれた後に、リポータ基をデオキシヌクレオチド三燐酸と結合させ続ける請求の範囲第１３項記載の方法。
１５．相補ＤＮＡ分子の合成を酵素的に行なうと共に付加を相補ＤＮＡ分子の３ ′−ＯＨ位置にて生ぜしめる請求の範囲第１４項記載の方法。
１６．主−本鎖ＤＮＡ分子と増大する相補ＤＮＡ分子とを反応帯域に固定化する請求の範囲第１５項記載の方法。
１７．主−本鎖ＤＮＡ分子と増大する相補ＤＮＡ分子との固定化を、分子が通過するには小さ過ぎる細孔を持った多孔質膜で分子を包封することにより行なう請求の範囲第１６項記載の方法。
１８．主−本鎖ＤＮＡ分子と増大する相補ＤＮＡ分子との固定化を、これら分子を反応帯域内の表面に付着させることにより行なう請求の範囲第１６項記載の方法。
１９．次のデオキシヌクレオチド三燐酸が付加する際に認められたりボータ信号が専ら前記次のデオキシヌクレオチド三燐酸に関連するよう、前記次のデオキシヌクレオチド三燐酸の付加前にリポータ基を相補ＤＮＡ分子から脱着させる請求の範囲第１３項記載の方法。
２０．相補ＤＮＡ分子の合成を酵素的に行なうと共に相補ＤＮＡ分子の３′−ＯＨ位置にて付加を生ぜしめる請求の範囲第１９項記載の方法。
２１．主−本鎖ＤＮＡ分子と増大する相補ＤＮＡ分子とを反応帯域に固定化する請求の範囲第２０項記載の方法。
２２．主−本鎖ＤＮＡ分子と増大する相補ＤＮＡ分子との固定化を、分子が通過するには小さ過ぎる細孔を持った多孔質膜で分子を包封することにより行なう請求の範囲第２１項記載の方法。
２３．主−本鎖ＤＮＡ分子と増大する相補ＤＮＡ分子との固定化を、これら分子を反応帯域内の表面に付着させることにより行なう請求の範囲第２２項記載の方法。
２４．相補ＤＮＡ分子中に組込まれる各デオキシヌクレオチド三燐酸をその３′ −ＯＨ位置に封鎖基を有するよう改変すると共に、封鎖基を相補ＤＮＡ分子中に組込まれた後に各デオキシヌクレオチド三燐酸から除去する請求の範囲第１９項記載の方法。
２５．リポータ基を封鎖基と結合させる請求の範囲第２４項記載の方法。
２６．リポータ基が放射性標識である請求の範囲第２５項記載の方法。
２７．リポータ基が蛍光標識である請求の範囲第２５項記載の方法。
２８．リポータ基を、相補ＤＮＡ分子と結合している間に同定する請求の範囲第２５項記載の方法。
２９．リポータ基を、相補ＤＮＡ分子から脱着した後に同定する請求の範囲第２５項記載の方法。
３０．合成を、それぞれ４種のデオキシヌクレオチド三燐酸を含有すると共にそれぞれリポータ基と結合した４種のデオキシヌクレオチド三燐酸の異なる１種を有する４個の平行反応帯域にて行なう請求の範囲第７項記載の方法。
３１．４種のデオキシヌクレオチド三燐酸が結合するリポータ基が、１〜４個の異なるリポータ基である請求の範囲第３０項記載の方法。
３２．４種のデオキシヌクレオチド三燐酸が結合するリポータ基が単一のリポータ基である請求の範囲第３０項記載の方法。
３３．各デオキシヌクレオチド三燐酸が組込まれるにつれて積算リポータ信号が増大するようデオキシヌクレオチド三燐酸が相補ＤＮＡ分子中に組込まれた後に、リポータ基をデオキシヌクレオチド三燐酸と結合させ続ける請求の範囲第３２項記載の方法。
３４．相補ＤＮＡ分子の合成を酵素的に行なうと共に相補ＤＮＡ分子の３′−ＯＨ位置にて付加を生ぜしめる請求の範囲第３３項記載の方法。
３５．主−本鎖ＤＮＡ分子と増大する相補ＤＮＡ分子とを反応帯域に固定化する請求の範囲第３４項記載の方法。
３６．主−本鎖ＤＮＡ分子と増大する相補ＤＮＡ分子との固定化を、これら分子が通過するには小さ過ぎる細孔を持った多孔質膜で分子を包封することにより行なう請求の範囲第３５項記載の方法。
３７．主−本鎖ＤＮＡと増大する相補ＤＮＡ分子との固定化を、これら分子を反応帯域内の表面に付着させることによう行なう請求の範囲第３５項記載の方法。
３８．次のデオキシヌクレオチド三燐酸が付加される際に認められるリポータ信号が専ら前記次のデオキシヌクレオチド三燐酸に関連するよう、前記次のデオキシヌクレオチド三燐酸の付加前にリポータ基を相補ＤＮＡ分子から脱着させる請求の範囲第３２項記載の方法。
３９．相補ＤＮＡ分子の合成を酵素的に行なうと共に相補ＤＮＡ分子の３′−ＯＨ位置にて付加を生ぜしめる請求の範囲第３８項記載の方法。
４０．主−本鎖ＤＮＡ分子と増大する相補ＤＮＡ分子とを反応帯域に固定化する請求の範囲第３９項記載の方法。
４１．主−本鎖ＤＮＡ分子と増大する相補ＤＮＡ分子との固定化を、これら分子が通過するには小さ過ぎる細孔を持った多孔質膜で分子を包封することにより行なう請求の範囲第４０項記載の方法。
４２．主−本鎖ＤＮＡ分子と増大する相補ＤＮＡ分子との固定化を、これら分子を反応帯域内の表面に付着させることにより行なう請求の範囲第４１項記載の方法。
４３．相補ＤＮＡ分子中に組込まれる各デオキシヌクレオチド三燐酸をその３′ −ＯＨ位置に封鎖基を有するよう改変すると共に、この封鎖基を相補ＤＮＡ分子中に組込まれた後に各デオキシヌクレオチド三燐酸から除去する請求の範囲第３８項記載の方法。
４４．リポータ基を封鎖基と結合させる請求の範囲第４３項記載の方法。
４５．リポータ基が放射性ラベルである請求の範囲第４４項記載の方法。
４６．リポータ基が蛍光標識である請求の範囲第４４項記載の方法。
４７．リポータ基を、相補ＤＮＡ分子と結合している間に同定する請求の範囲第４４項記載の方法。
４８．リポータ基を相補ＤＮＡ分子から脱着された後に同定する請求の範囲第４４項記載の方法。
４９．主−本鎖デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）分子におけるデオキシリボヌクレオチドの配列を決定するに際し：（ａ）主ＤＮＡ分子の存在下に相補ＤＮＡ分子を合成し、この合成を段階的にシリーズで行なって相補ＤＮＡ分子中に組込まれた各デオキシヌクレオチド三燐酸のアイデンティティーをその組込みの後に決定し、（ｂ）相補分子中に組込まれた各デオキシヌクレオチド三燐酸のアイデンティティーを主分子中に存在するその対応補体のアイデンティティーまで翻訳し、（ｃ）これら対応補体のアイデンティティーをタビュレートすることにより主ＤＮＡのデオキシリボヌクレオチド配列を生ぜしめることを特徴とするデオキシリボヌクレオチドの配列の決定方法。
５０．主−本鎖デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）分子におけるデオキシリボヌクレオチドの配列を決定するに際し：（ａ）主ＤＮＡ分子の存在下に相補ＤＮＡ分子の頭領域を合成し、この合成を段階的にシリーズで行なって相補ＤＮＡ分子中に組込まれた各デオキシリボヌクレオチド三燐酸のアイデンティティーをその組込み後に決定し、（ｂ）相補ＤＮＡ分子の頭領域中に組込まれたデオキシリボヌクレオチドのアイデンティティーをタビュレートし、（ｃ）主−本鎖ＤＮＡ分子のための相補ＤＮＡ分子の頭領域を除去し、（ｄ）相補ＤＮＡ分子の頭領域の少なくとも１部に配列上対応するＤＮＡプライマー分子を別途に合成し、（ｅ）このＤＮＡプライマー分子を主−本鎖ＤＮＡ分子にアニールし、（ｆ）ＤＮＡプライマー分子から相補ＤＮＡ分子の次の領域を合成し、（ｇ）相補ＤＮＡ分子の次の領域中に組込まれたデオキシリボヌクレオチドのアイデンティティーをタビュレートし、（ｈ）工程ｃ，ｄ，ｅ，ｆおよびｇを必要に応じ反復して主−本鎖ＤＮＡ分子の全構造を決定することを特徴とするデオキシリボヌクレオチドの配列の決定方法。