JPH04501208A - Ｄ―リンゴ酸または誘導体の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 旦：リンゴ　または誘　の１１ユ 鼓歪分互 本発明はＤ−リンゴ酸、特にり、Ｌ−リンゴ酸からのＤ−リンゴ酸の製法に関す る。好ましい一実施態様において、本発明の方法はり、Ｌ−リンゴ酸を、■、− リンゴ酸は同化するがＤ−異性体は同化しない生きている微生物（またはその産 生物）と接触させることを含んでなる。従って、本発明は、ラセミ体中に存在す る２つの異性体の一方のみを同化できる微生物の使用によるリンゴ酸のラセミ混 合物の分割に関する。

Ｄ−リンゴ酸は化学中間体として、または塩基のラセミ混合物を分割するために 使用できる。Ｄ−リンゴ酸誘導体は本発明の方法によって製造できる。

宜量韮皿 ラセミ体が光学活性化合物を反応して、分離可能なジアステレオマーを形成でき ることは公知である。たとえば、ラセミ体をキニンのような光学活性塩基と反応 させてから、それによって製造されるジアステレオマーを分別結晶のような手法 によって分離することを含んでなる方法によって、酸のラセミ混合物が分離でき ることは知られている。この型の分離法は時間がかかり、高価である。

本発明者はＤ−リンゴ酸またはその誘導体の製造に微生物を使用する先行技術の 方法を知らない。

Ｄｅｇｅｎらの米国特許第３．９８０．５２０号は、酵素フマラーゼを用いる発 酵技術によるフマル酸からのし一リンゴ酸の生成に関する。開示された方法は、 それまではフマラーゼ源として使用されていない微生物を使用することを伴う。

この特許中で述べられているように、反応は両方向に進行でき、従って、フマル 酸からリンゴ酸を製造するためにも、またはリンゴ酸からフマル酸を製造するた めにも、フマラーゼを使用できることが知られている。Ｌ−リンゴ酸は、天然に 見いだされる光学異性体である。

米国特許第３．６００．２７９号はり、Ｌ−バントイン酸からのＤ−バントイン 酸の製造方法に関する。ラセミ体を含む培地に、Ｌ−バントイン酸を同化するが Ｄ−バントイン酸は同化しない酵素を接種する。次いで、Ｌ−バントイン酸が実 質的に消費されるまで培養菌をインキュベートする。然る後に、同化されないＤ −バントイン酸を反応混合物から回収する。

米国特許第３，９０７，３６８号は、Ｎ−アシル−Ｄ、Ｌ−アミノ酸の選択的脱 アシル化に有用な、有機相及び水相を含んでなる溶媒系に関する。ラセミ体を、 一方の鏡像体のみを脱アシル化するが他方は脱アシル化しないアシラーゼと接触 させ、生成されたアミノ酸を水相から回収する。アシル基から生成されたカルボ ン酸及び非加水分解アシルアミノ酸が有機相から回収される。

米国特許第４．１４８．６８８号はＬ−メチオニンの製造方法を開示している。

この方法は、ＤＬ−Ｎ−カルバモイルメチオニンを、ｌ、−Ｎ−カルバモイルメ チオニンを加水分解できる微生物にさらすことを含んでなる。

米国特許第４，６２９，７０１号は、所定のラセミ酸のエステルを、エステル結 合を非対称的に加水分解できる酵素または微生物と接触させることを含んでなる 光学活性カルボン酸の製造方法を開示している。

米国特許第４．１３６．４７０号はアミノ酸のラセミ体の分割における２相溶媒 系の使用に関する。この方法においては、ラセミ体の光学異性体の一方は酵素に よって対応するアミノ酸に加水分解され、回収される。

米国特許第４．７５１．１８２号はＤＬ−カルニチンの分割方法に関する。この 方法は、化合物の非天然のＤ−型を優先的に代謝させるラセミ体を接触させ、そ れによって天然の異性体、Ｌ−力ルニチンを反応媒体中に蓄積させることを含ん でなる。

米国特許第４，７４５，０６１号はＤ−異性体を攻撃して対応するケト酸を生成 せしめることによってＤＬ−アミノ酸を分割するのに有用なトランスアミナーゼ に関する。

米国特許第４，７５８．９１８号は２−ハロアルカン酸のＤ及びＬ異性体の混合 物中のし一鏡像体の濃度を増加させるのに使用されるヒドロラーゼに関する。

ヨーロッパ特許出願第２０７．６３６号は、ラセミ体中の不所望な鏡像体を同化 するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの一菌株を培養することを含んでなる、ラセミ混合 物からの光学的に濃縮された２、３−ジクロロ−１−プロパツールの製造方法を 教示している。

日本６３　１４１．５９７号公報は、Ｄ−乳酸を使用する能力を有する微生物で ラセミ混合物を処理することによる、光学的に純粋なＩ、−乳酸の製造を教示し ている。

日本５０　０４０．７８７号公報は、Ｌ一対掌体を酸化または同化する生物を用 いるラセミ混合物からのＤ−フェニルグリシンの製造を開示している。

日本５０　０２４．４９０号公報は、Ｌ−タルトレートが完全に同化されるまで 微生物をラセミ体と共に培養することによるＤＬ−酒石酸からのＤ−酒石酸の製 造を開示している。

前記参考文献はどれも、Ｄ−及びＬ−リンゴ酸のラセミ混合物、またはＤ−及び Ｌ−リンゴ酸エステル、アミドもしくはリンゴ酸の同様な誘導体のラセミ混合物 を分割する方法は開示していない。

λ班ｑ回玉 本発明者の発明は、Ｌ−リンゴ酸を同化してＤ−リンゴ酸を同化しない微生物の 発見を含む。さらに、本発明は、リンゴ酸の一方の鏡像体を他方の鏡像体から分 離するのにこの発見を適用することを含んでなる。本発明者の方法の研究におい て、Ｄ−リンゴ酸の存在がＬ−リンゴ酸の同化を抑制できることが発見され、ま た、Ｄ−リンゴ酸の濃度を許容される程度に低い濃度に保持することによってそ の抑制効果が有効に抑えられることが発見された。本発明者の研究はまた、方法 に使用される生物が、Ｌ−リンゴ酸の同化によって引き起こされる酸度の低下に よって抑制され得ることを証明した。

従って、比較的高純度でＤ−リンゴ酸を製造するための好ましい一実施態様にお いて、本発明者はｐｕが抑制値未満に保たれるように酸度の低下を補充する工程 を提供する。

本発明は、Ｄ−リンゴ酸の製法に関する。本発明の方法において、Ｄ−リンゴ酸 は、Ｄ−リンゴ酸とその鏡像体Ｌ−リンゴ酸との混合物から分離される。好まし い一実施態様において、光学対掌体のラセミ混合物が分割される。

この方法は、Ｌ−リンゴ酸は同化できるがＤ−リンゴ酸は同化できない微生物の 使用を伴う。これらの性質を有する微生物のうち、細菌が好ましい。好ましい細 菌の例は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　匹旦岨及びＡｃ１ｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　 ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓである。これらの細菌はエネルギー源及び単独炭素 源としてＬ−リンゴ酸を同化でき、ビタミン類のような添加物（又は補充物）の 存在を必要としない。

本発明は、前に挙げた細菌のような微生物がＤ−リンゴ酸の存在によって抑制さ れ得るという発見からなる。このような場合において、方法がきびしく抑制され る濃度未満のＤ−リンゴ酸濃度において本発明の方法を実施するのが好ましい。

従って、好ましい実施態様において、約５．０重量％より低い、より好ましくは 約２．５重量％より低いＤ−リンゴ酸濃度において実施するのが好ましい。

また、Ｌ−リンゴ酸の同化によって引き起こされる酸度の低下は反応に悪影響を 及ぼすことも見出された。より具体的には、酸度の低下はＬ−リンゴ酸の同化を 抑制し、それによってＤ−及びＬ−リンゴ酸の分離をより完全でないものにする 可能性がある。従って、好ましくは、この方法は、Ｌ−リンゴ酸の同化によって 失われる酸を補充することによって実施するのが好ましい。添加された酸は、ｐ ＦＩを約９．０より低く保持する：このｐＨより高くでは方法の抑制は有意でな い可能性がある。

本発明の方法は単独の代謝メカニズムに依存しているのではない。すなわち、微 生物は特定の方法でＬ−リンゴ酸を同化する必要はない。従って、たとえば、本 発明に使用するのに適当な微生物はクエン酸サイクルにおいてＬ−リンゴ酸を使 用できるが；そうする必要はない。必要なことは、生物がＬ−リンゴ酸を利用す るが、Ｄ−リンゴ酸を不所望な程度までは決して転換しないことである。

本発明は特に、エネルギー源及び単一炭素源としてＬ−リンゴ酸を利用するであ ろう微生物の使用を目ざすものである。

このような生物によって方法はより高価でなく且つ実施がより容易になる。前記 のように、好ましい微生物は細菌である。

真菌（酵母及びカビを含む）も使用できる。

Ｄ−リンゴ酸誘導体は、本発明の方法によって製造できる。

計−夫１Ｌりひ薫り１９且旦“ 本発明は、Ｄ−リンゴ酸とＬ−リンゴ酸との混合物またはＤ−リンゴ酸誘導体と Ｌ−リンゴ酸の相当する誘導体との混合物を、Ｉ７−リンゴ酸または誘導体を同 化できるがＤ−リンゴ酸または誘導体を同化できない生きている微生物（または その産生物）を含んでなる分割剤で処理し；（ｉｉ）Ｌ−リンゴ酸または誘導体 が実質的に全て同化されるまで該分割剤及び混合物をインキュベートし；そして （ｉｉｉ）然る後に、それによって生成された反応プロスからＤ−リンゴ酸また は誘導体を回収することによる、該混合物からのＤ−リンゴ酸またはＤ　−リン ゴ酸誘導体の製造方法を提供する。

好ましい一実施態様において、本発明はＤ−リンゴ酸とＬ−リンゴ酸との混合物 からＤ−リンゴ酸を分離する方法であって、該方法がＬ−リンゴ酸の実質的に全 てが同化されるまで、Ｌ−リンゴ酸を同化できるがＤ−リンゴ酸を同化できない 細菌の作用に該混合物を暴露することを含んでなり、該方法をＬ−リンゴ酸の同 化による酸度の低下を補充し且つそれによってｐｎを約９．０より低く保持する ように添加される酸の存在下において実施する方法を含んでなる。添加される酸 は、Ｌ−リンゴ酸が同化されている間、断続的または連続的に添加することがで きる。

極めて好ましい一実施態様において、本発明は、Ｄ−リンゴ酸とＬ−リンゴ酸と のラセミ混合物から少なくとも約９０％の鏡像体過剰においてＤ−リンゴ酸を製 造する方法であって、該方法が、Ｌ−リンゴ酸の実質的に全てが消費されるまで 、（ａ）添加物が添加されない状態で単一のエネルギー及び炭素源としてＬ−リ ンゴ酸を同化でき且つ（ｂ）Ｄ−リンゴ酸を同化できない細菌の作用に該ラセミ 混合物を暴露することを含んでなり、該方法を、（ｉ）該細菌を含んでなる反応 混合物中のＤ−リンゴ酸の濃度が約５．０重量％を越えず、より好ましくは約２ ．５重量％より低（、且つ（ｉｉ）Ｌ−リンゴ酸の同化によネ酸度の低下を補充 し且つ反応混合物のｐＨを約４．５〜約９．０に保持するために該方法の間に酸 を加えるようにして実施する方法を提供する。

本発明は、Ｌ−リンゴ酸またはアミドのエステルのようなその誘導体を同化でき るがＤ−リンゴ酸またはＤ−リンゴ酸の誘導体を同化できない任意の微生物を用 いて実施できる。

このような微生物は野生の単離株、公的機関に寄託された菌株及びこのような菌 株の変異によって得られた菌株から選ばれる。試験法としては、スクリーニング のための代表的な基礎寒天平板培地は、ＨＣ１！、でｐＨ７，０に調整されてか ら滅菌された水１２中、硫酸アンモニウム０゜２％、Ｋ２ＨＰＯ４０，２％、酵 母抽出物０．００２％及び塩溶液Ｃ１０ｄならびに寒天１５ｇを含む。

一方はＤ−リンゴ酸を含み且つ他方はＬ−リンゴ酸を含む２種の試験培地を調製 するために、主な炭素源として基礎培地にＤ−リンゴ酸またはＬ−リンゴ酸０． ５〜１．０重量％を加える（ｐＨが７．００に調整された２０％無菌濾過溶液と して）。各型の培地を含む寒天平板を調製する。

スクリーニングすべき微生物を両型の寒天平板上に接種し、光学増殖温度におい て数日間までインキュベートする。そのような温度は典型的には２８〜３５°Ｃ の範囲とすることができる。

いくつかの生物については、最適成長温度はこの範囲外であることもある。本発 明に使用する微生物は、Ｌ−リンゴ酸を含む平板上で成長するがＤ−リンゴ酸を 含む平板上では増殖しないものから選ばれる。

いくつかの場合には、Ｄ−リンゴ酸を同化できない微生物は、エネルギー及び炭 素源としてその物質が供給される平板上で増殖できる。最小量の成長は増殖培地 中に混合された酵母抽出物または他の栄養源の利用の結果である。

望ましくは、炭素源としてＬ−及びＤ−リンゴ酸の代わりにそれぞれ、Ｌ−リン ゴ酸エチルエステルもしくはＬ−リンゴ酸アミド及びＤ−リンゴ酸エチルエステ ルもしくはＤ−リンゴ酸アミドのようなリンゴ酸誘導体を使用することによって 同様なスクリーニング法を適用できる。

本発明の実施においては、Ｌ−リンゴ酸または誘導体は同化するが、Ｄ−リンゴ 酸または誘導体は同化せず、且つ単一のエネルギー源及び炭素源としてＬ−リン ゴ酸または誘導体を使用できる生物が好ましい。このような生物は、生きている 生物をその培地中で使用することによってリンゴ酸または誘導体の混合物と相互 作用させることができる。あるいは、生物は基質に堅く固定させるかまたは結合 させることができる。さらに、酵素製剤を細胞非含有抽出物、粗製酵素または精 製酵素の形態で使用できる。酵素製剤は常法に従って細胞または培地から製造で きる。所望ならば、酵素は、基質に結合させることによって固定し、本発明に使 用できる。

本発明の実施に使用する微生物の量は、処理されるリンゴ酸または誘導体の混合 物中において全てのまたは実質的に全てのし一リンゴ酸または誘導体を同化する のに必要な量である。一般に、微生物の使用量はリンゴ酸（または誘導体）混合 物の重量に比較した細胞の乾燥重量に換算して、重量比的０．００５〜約５．０ である。固定された生物または酵素製剤を用いるこれらの例において、使用量は 、使用される物質が由来する細胞の重量を基準として用いることによって決定で きる。

固定された酵素または微生物を本発明の実施に使用する場合には、生物または酵 素が結合する培地として常用の担体を使用できる。発明に使用できる担体の例と してはアルギン酸、カラギーナン、コラーゲン、セルロース、アセチルセルロー ス、寒天セロファン及びコロジオンのような天然生成物ならびにポリアクリルア ミド、ポリウレタン及びポリブタジェンのような合成ポリマー物質が挙げられる 。担体上への細胞または酵素の固定は、生物触媒の活性が損なわれないように適 度の条件下で常法で実施できる。

使用するプロセス温度は、微生物またはその抽出物に依存する。いくつかの場合 においては約２０°Ｃ〜約５０°Ｃの範囲であることができる。一般に、温度は 長時間約３５°Ｃを越えることは許されない。好ましい温度範囲は約２８°Ｃ〜 約３５°Ｃである。

本発明方法は好気条件下で実施する。当業界では通例のように、反応帯域と酸素 の接触の増加は、振盪によって、または方法を実施する容器を揺動することによ って、または容器内容物を攪拌することによって実施できる。空気または酸素混 合空気は、細流または発酵液に導入される気泡の流れとして発酵容器に入れるこ とができる。

発酵時間は全く独立した変数ではなく、プロセス温度、微であるほど反応時間は 短い方が好都合である。

この方法は、最初にリンゴ酸混合物（またはリンゴ酸誘導体の混合物）全てに微 生物（または酵素製剤）全てを添加することによって実施できる。あるいは、分 割剤及び／またはリンゴ酸（または誘導体）混合物は連続的に添加もできるし、 発酵の間に時々添加することもできる。

前述のように、Ｄ−リンゴ酸は、発酵培地中におけるその濃度が高すぎる場合に は反応を抑制するであろう。抑制が起こるメカニズムは現時点では確実には知ら れていない。

いかなる理論にも拘束されないが、いくつかの場合において活性酵素部位に関し てリンゴ酸異性体の間には競合によるいくらかの競合的抑制があり得ると考えら れる。抑制と戦うために、オペレーターはＤ−リンゴ酸の濃度を適当なレベルに 保持する任意の都合のよい手段を用いることができる。たとえば、ある細菌の場 合には、Ｄ−リンゴ酸のレベルを約５．０重量％未満に、より好ましくは約２． ５重量％未満に保持すれば、よりよい結果が得られる。

好ましくは、少なくともほぼ中性、すなわち、７．０のｐＨにおいて本プロセス を実施する。このレベルを達成するためには緩衝剤を使用する。この範囲外のｐ ｌ（において本プロセスを実施する場合には、緩慢すぎて実用的ではないであろ う。

Ｌ−リンゴ酸が同化されるにつれてｐＨは上昇する傾向がある。緩衝剤の能力の 限界を越える場合には、ｐｉは９．０を越え、反応を抑制するであろう。従って 、Ｌ−リンゴ酸を用いて方法の間に酸度の低下を補充することが望ましい。ｐＨ レベルの連続的監視に呼応して反応混合物に酸を導入する装置に酸源を連結する ことによって、補充を自動的に起こさせることができる。添加される酸は生物学 的に許容され得る好都合な任意の酸、たとえば、希塩酸もしくは硫酸またはリン ゴ酸であることができる。

１隻■ （１）　Ｉ、−リンゴ酸（Ｉ）溶液１００ａｄを含む５０〇−振盪フラスコに１ ループのＰｓｅｕｄｏＩＩｌｏｎａｓ　匹旦ハＡＴＣＣ２１２４４（エネルギー 及び炭素源としてＬ−リンゴ酸を含む寒天平板から）を接種した。接種された溶 液を３０゛Ｃにおいて２００ｒｐＩＩ＋で振盪しながらインキュベートした。６ ６０ナノメーターにおける最終光学濃度（０，０，）は１．４７５であった。リ ンゴ酸溶液は以下の組成を有していたニ ーし二里詠二勾良安液」ユ１ （ＮＨ４）　ｚｓＯａ　２　ｇ ＸｚＨＰＯａ　２　ｇ 塩溶液Ｃ（ＩＩ）　１０ｄ Ｌ−リンゴ酸　４ｇ ＋ｐ）１７．０溶液１２とするためのＨ，Ｏ及びＮａＯＨ＊溶液は濾過によって 滅菌した（０．２ｍμフィルター）。

塩産腹旦（ユＬ（前記）は以下の組成を有していた：Ｍｇ５０ｍ　’　７Ｈｚ０ 　２５　ｇ ＦｅＳＯ４−７Ｈｚ０　２．８　ｇ ＦｉｎＳＯａ　−ＨｚＯ１，７ｇ ＮａＣｆ　０．６ｇ ＣａＣ１ｚ　’　２Ｈｚ０　０．１　ｇＮａＭｏＯｎ　・２Ｈｚ０　０．１　ｇ ＺｎＳＯｎ　・ＩＨｚｏ　０．０６ｇ （ＩＩ）溶液（Ｉ［［）を含む１１発酵フラスコを滅菌した。

主辰ユｌＹ ダウ発泡防止剤（Ｄｏｗ　Ａｎｔｉｆｏａｗ）　７０ｍｇＨＣ２及びＨｌＱを加 えて、濾過（０，２−フィルター）によって滅菌されたｐＨ７，０溶液７５０ｄ を調製した。

発酵槽溶液の温度が３０°Ｃに達した後、溶液（ＩＶ）を加えた。

溶液（ＩＶ）は以下のようにして調製した：皇辰ユＬＬ ＤＬ−リンゴ酸　１０ｇ 塩溶液Ｃ（ＩＩ）　１０ＩＩＩ ＮａＯＨ及びＨ，０を加えてｐＨ７，０の溶液１５０ｄを調製し、それを０．２ 趨フイルターを用いて濾過によって滅菌した。

然る後に、工程ＣＩ）において調製した細菌懸濁液を発酵槽に加えた。発酵槽に １２／分の速度で空気を導入した。温度を３０°Ｃに保持し、発酵槽の内容物を １１００Ｏｒｐでおいて攪拌して、溶解酸素量を６０〜７０％飽和より高く保持 した。

自動ｐＨ監視装置を用いてＩ　Ｎ　Ｈ２ＳＯ，（理論量、１７４．６ｄ）の連続 添加によってｐＨを制御し、同一速度で供給溶液（Ｖ）を加えた。

供負１μＬ℃！ル ＤＬ−リンゴ酸　１３．４　ｇ （ＮＨ４）　ｔｓｏａ　２．７　ｇ Ｋ２ＨＰＯ４２，７ｇ 塩溶液Ｃ（ＩＩ）　１３．４ｄ 水及びＮａＯＨを加えてｐＨ７，０の溶液１０Ｍ！を調製し、０．２μフイルタ ーを用いる濾過によって滅菌した。

４時間後、酸素を許容される空気と混合して、溶存酸素の量を６０〜７０％に保 持した。９０分後、酸素量が増加し始めたので酸素の添加を停止した。以下の表 に示すように、約６．５時間後に静止増殖期に達した： ＤＩ　ンゴ　の言。１ 静止増殖期に達した後、細胞を遠心分離によって除去し、上清を１００−に減圧 濃縮した。濃ＨＣｆｉの添加によってｐＨを２にした。酸性化された溶液は、ジ エチルエーテルで２４時間絶えず抽出した。抽出物を減圧濃縮し、得られた油状 残渣を減圧乾燥し、（０，０５ｔｏｒｒ）、淡黄色の結晶４．６４　ｇを得た。

水相を濃縮乾固し、固形分の有機部分を熱アセトン中に溶解させた。無機塩を濾 過によって分離した。濾液を減圧濃縮して、油を生成し、それを高真空において 乾燥後に結晶化させた。淡黄色の固体がさらに６．８１　ｇ得られ、全収量は１ １．４５ｇ、約９８％であった。化学純度はＨＮＭＲによって〉９５％であり、 光学純度はガスクロマトグラフィーによって＞９９．８％であり、これらは下記 の手法を用いて得られた。

前記Ｄ−リンゴ酸の光学純度は、公知の手法によって測定した。ビス−メチルエ ステルを標準条件下で形成後、遊離ヒドロキシルが、Ｓ−α−メトキシ−α−ト リフルオロメチル−フェニルアセチルクロリド（ＭＴＰＡ−ＣＩ）によって誘導 されて、対応するＭＴＰＡエステルが得られた。細管ガスクロマトグラフイー分 析によってジアステレオマー比、従って、親り−リンゴ酸の鏡像体純度が得られ た。

前記例によって記載し且つ説明したような方法を用いてＤ−リンゴ酸が９０％以 上の鏡像体過剰において製造できる。

前記例の方法はＡｃ１ｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ　Ａ ＴＣＣ５３９２７を用いて繰り返して同様な結果が得られる。

本発明者の方法は、産業界において容易に適合させることができるいくつかの利 点を提供する。第一に、この方法は光学純度の高い状態でＤ−リンゴ酸を製造す る手段を提供する。

また、この方法はＬ−鏡像体の相当の消費によってＤ−リンゴ酸とＬ−リンゴ酸 とのラセミ混合物を分割する手段を提供する。この方法は経済的であって、過度 に時間がかかることはない。さらに、キニンのような高価な化合物の時間のかか る使用を伴わない。この方法は商業的量においてＤ−リンゴ酸を製造する基礎と して使用できる。

本発明者の発明を前記において特に、好ましい実施態様に関して詳細に説明した 。前記詳細な説明に精通している熟練した専門家ならば、以下の請求の範囲の範 囲及び精神から逸脱することなくその多くの修正をすることができることはいう までもない。

国際調査報告 １、ｌＩ＠＋’ｅｊ１＋６＋ｖｌ＾１１１１＋ｃｍい、、　ＰＣＴ／ｕｓ　９０ １０４５２７国際調査報告

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｄ−リンゴ酸とＬ−リンゴ酸との混合物または該鏡像体の誘導体の混合物か らＤ−リンゴ酸またはその誘導体を製造する方法であって、 （ａ）該Ｌ−リンゴ酸またはその誘導体を同化するが該Ｄ−リンゴ酸またはその 誘導体は同化せず且つ単一炭素源としてＬ−リンゴ酸またはその誘導体を利用で きる生きている微生物またはその産生物を含んでなる分割剤を該混合物に接種し 、 （ｂ）該Ｌ−リンゴ酸または誘導体の実質的に全てが同化されるまで該接種混合 物をインキュベートし、そして（ｃ）然る後に、それによって生成された反応プ ロスからＤ−リンゴ酸またはその誘導体を回収することを含んでなる方法。
2. ２．前記混合物がＤ−リンゴ酸とＬ−リンゴ酸とのラセミ混合物である請求の範 囲第１項に係る方法。
3. ３．前記分割剤が、添加物が実質的に加えられない状態でＬ−リンゴ酸またはそ の誘導体を単一炭素源をして同化できる細菌の培養菌である請求の範囲第１項に 係る方法。
4. ４．前記細菌培養菌がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ及びＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ 細菌から選ばれる請求の範囲第３項に係る方法。
5. ５．Ｄ−リンゴ酸とＬ−リンゴ酸とのラセミ混合物からのＤ−リンゴ酸の製造方 法であって、 （ｉ）前記Ｌ−リンゴ酸の実質的に全てが同化されるまで、添加物が実質的に添 加されない状態においてＬ−リンゴ酸を単一炭素源として同化できるが、Ｄ−リ ンゴ酸は同化できない細菌の作用に前記ラセミ体を暴露し、然る後に（ｉｉ）工 程（ｉ）において製造された反応混合物からＤ−リンゴ酸を回収する ことを含んでなる方法。
6. ６．前記Ｄ−リンゴ酸自体を回収する請求の範囲第５項に係る方法。
7. ７．前記Ｄ−リンゴ酸を、Ｄ−リンゴ酸を誘導した後に他の物質との反応によっ て別の化合物として回収する請求の範囲第５項に係る方法。
8. ８．前記Ｄ−リンゴ酸がエステルとして回収される請求の範囲第７項に係る方法 。
9. ９．前記Ｄ−リンゴ酸がジ−イソ−プロピルマレートとして回収される請求の範 囲第８項に係る方法。
10. １０．Ｄ−リンゴ酸とＬ−リンゴ酸とのラセミ混合物から少なくとも９５％の鏡 像体過剰でＤ−リンゴ酸を回収する方法であって、該方法が、該Ｌ−リンゴ酸の 実質的に全てが同化されるまで、添加物が実質的に加えられない状態でＬ−リン ゴ酸を単一炭素源をして同化できるがＤ−リンゴ酸を同化できない細菌の作用に 該ラセミ体を暴露することを含んでなり；該方法を、反応混合物のｐＨを約９． ０より高く上がらないようにするのに充分な、Ｌ−リンゴ酸の同化による酸度低 下を戻すために加えられる酸の存在下において実施する方法。
11. １１．前記細菌を含んでなる反応培地中のＤ−リンゴ酸の濃度が、細胞を含まな い培地の重量に基づき約２．５重量％より低く保持されるようにして実施する請 求の範囲第１０項に係る方法。
12. １２．前記Ｌ−リンゴ酸の実質的に全てが前記細菌によって同化された後に生成 される反応プロスから９５％の鏡像体過剰でＤ−リンゴ酸を分離する請求の範囲 第１０項に係る方法。