JPH0441597B2 - - Google Patents
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- JPH0441597B2 JPH0441597B2 JP61091332A JP9133286A JPH0441597B2 JP H0441597 B2 JPH0441597 B2 JP H0441597B2 JP 61091332 A JP61091332 A JP 61091332A JP 9133286 A JP9133286 A JP 9133286A JP H0441597 B2 JPH0441597 B2 JP H0441597B2
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- apatite
- glucanase
- protein
- immobilized
- fluoroapatite
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/52—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an inorganic compound, e.g. an inorganic ion that is complexed with the active ingredient
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
- A61K8/66—Enzymes
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q11/00—Preparations for care of the teeth, of the oral cavity or of dentures; Dentifrices, e.g. toothpastes; Mouth rinses
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- A—HUMAN NECESSITIES
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- A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
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- A61K2800/56—Compounds, absorbed onto or entrapped into a solid carrier, e.g. encapsulated perfumes, inclusion compounds, sustained release forms
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- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
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- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
（産業上の利用分野）
本発明はグルカナーゼを固定化したアパタイト
及びアパタイトにグルカナーゼを固定化する方法
に関するものである。グルカナーゼはグルカンを
分解する酵素の総称であり、各種の酵素が含まれ
るが、本願発明に云うグルカナーゼとはレバンを
分解するレバナーゼ、デキストランを分解するデ
キストラナーゼ、ムタンを分解するムタナーゼを
指し、またアパタイトとはハイドロキシアパタイ
トとフルオロアパタイトを意味している。但し酵
素がデキストラナーゼの場合はアパタイトとして
フルオロアパタイトのみを指している。 虫歯が、口腔に存在する種々の細菌の生成する
多糖類、例えばレバン、デキストラン、ムタン、
などにより、歯垢を形成するため発生することは
周知の事実である。従つて、虫歯の予防にこれら
細菌の生成する多糖類を除去し、歯垢の形成を妨
げることが考えられている。本願発明は、これら
虫歯の発生に関係する多糖類の分解酵素を固定化
したアパタイト及びその製造法に関するものであ
る。 （従来の技術） 従来から虫歯予防として、歯垢を除去する方法
が種々実施されている。例えばゼオライト、炭酸
カルシウム、アルミナ、シリカ、その他の研磨剤
で歯垢を削り取る方法、デキストラナーゼを安定
化剤と共に使用する方法などが存在するが、本願
発明のように、レバナーゼ、ムタナーゼ、デキス
トラナーゼのような虫歯の原因となる多糖類を分
解する酵素を、研磨剤として歯磨に使用されるア
パタイトへ固定化する方法及びそれら酵素を固定
化したアパタイトはいままで存在しなかつた。 （発明が解決しようとする問題点） グルカナーゼは酵素であるから比較的不安定で
あり、歯磨きにそのまゝ混合すると、時間ととも
にその活性を低下し、遂には活性を示さなくな
る。現在デキストラナーゼは歯磨きに使用されて
いるが、その失活を妨げるため各種の安定化剤が
提案されている。例えば、特開昭56−63915号公
報はデキストタナーゼと酸化アルミニウムとの配
合を、特開昭56−110609号公報はデキストラナー
ゼとカルボン、ｌ−メントールとの混合を、特公
昭52−49055号明細書はデキストラナーゼとゼラ
チンまたはペフトンとの配合を提案している。然
るに、歯磨きは口腔内で使用するため、人体に対
する影響を考慮する必要があり、また使用後の清
涼感を要求されるなど、種々の制約をうけてい
る。安定化剤も当然かかる制約下におかれるた
め、安定化剤の選択は困難な問題を含んでいる。
デキストラナーゼ以外の酵素を使用する場合にも
デキストラナーゼ使用の場合と全く同じ問題を生
じる。そこでグルカナーゼの安定化法について
種々検討した結果、研磨剤として使用されるアパ
タイトにグルカナーゼを固定化することにより、
安定剤を必要とせず、長期間安定に活性を示すグ
ルカナーゼをえる方法を開発することができた。
本願発明はグルカナーゼを固定化したアパタイト
及びその製造法を提供するものである。 （問題を解決するための手段） ハイドロキシアパタイト、活性炭、カオリナイ
ト、白土などに酵素を物理的に吸着させて固定化
させる酵素固定化法が存在することは周知の事実
であり、又固定化された酵素は安定化し、酵素単
体より経時活性の変化が少く、取扱いが便利であ
ることも一般に知られている。このようにアパタ
イトがある種の蛋白質を強固に吸着結合すること
が古くから知られているので、グルカナーゼを固
定化してその経時活性の変化を少くするとの考え
にもとずき、歯磨きで研磨剤として使用されてい
るアパタイトに物理的吸着法によりグルカナーズ
を固定化することができれば、簡単な操作で固定
化酵素がえられ、それを歯磨きに使用すれば研磨
性と多糖質分解性の両作用を有することに加え、
酵素の安定化剤の選択を必要とせず、好ましい研
磨素材になるのであろうと考え、グルカナーゼの
アパタイトによる固定化を検討した。その結果グ
ルカナーゼのアパタイトへの吸着力が極めて弱い
ため、直接グルカナーゼをアパタイトに吸着固定
化することは無理があると認めた。そこで、我々
はアパタイトに強固に吸着結合する蛋白質を介し
てグルカナーゼを固定化したアパタイトをえるこ
とができた。本願発明はグルカナーゼを固定化し
たアパタイト、及びアパタイトに強く吸着するあ
る種の蛋白質とともにグルカナーゼをアパタイト
に固定化させる方法を提供するものである。本願
発明にいうグルカナーゼとは前記のように、デキ
ストラナーゼ、レバナーゼ、ムタナーゼを含み、
アパタイトとはハドロキシアパタイト、フルオロ
アパタイトとを意味しているが酵素がデキストラ
ナーゼの場合はアパタイトとしてフルオロアパタ
イトを意味している。 アパタイトに強く吸着し、かつ人体に悪影響を
及ぼさない蛋白質、及びグルカナーゼを溶解した
水溶液、又は0.01から0.05モル濃度のリン酸塩緩
衝溶液にアパタイトを懸濁させ、激しく撹拌しな
がら２官能性アルデヒドを滴下する。使用する蛋
白質としては、アルブミン、カゼイン、リゾチー
ム、チトクロムＣ、プロタミンなどより選択され
る。蛋白質の種類により生成する固定化酵素の力
価、アパタイトへの結合力に生じるが、それらの
なかでリゾチーム、チトクロムＣなどが好適であ
る。グルカナーゼは前記したように、レバナー
ゼ、デキストラナーゼ、ムタナーゼより任意にえ
らぶことができ、場合によつてはこれら酵素の混
合物を用いることができる。アパタイトとしては
ハイドロキシアパタイト、フルオロアパタイトよ
り選択する。反応はアパタイトを分解しないPH、
即ちPH5.6以上のPHで行われるがPHが高くなると
吸着に悪影響を及ぼすのでPH9.0以上は好ましく
なく、PH7.0付近が好ましい。使用するアパタイ
トの粒度は出来るだけ均一であることが望まれる
が、一般に歯磨きに研磨剤として使用されている
粒子で充分使用可能であり、粒径2μから200μの
ものが使用し易く、蛋白質に対し10から100倍量
を使用する。撹拌が効率よく行なわれるように、
使用アパタイト量に対し、多量の水又は緩衝溶液
を使用することが望まれ、反応相固形分が４から
20パーセントになるよう水量をを調整する。使用
する蛋白質とグルカナーゼは等量程度が好まし
く、両者の極端な相違、特にグルカナーゼが蛋白
質に対し少量であることは生成する固定化酵素の
力価を下げるので避けるべきである。使用する２
官能性アルデヒドとしては一般に使用されている
グルタルアルデヒドが好ましい。この使用量は固
定化酵素の力価に最も影響を及ぼす因子である。
一般にグルタルアルデヒドの添加量が少なすぎる
とえられた固定化酵素のアパタイトへの結合力が
弱く、経時失活が著しい。又添加量が多いと、え
られる固定化酵素の力価を低下させ、更に添加量
を増加させと遂には活性を示さなくなる。使用す
るグルタルアルデヒド量は酵素、蛋白質の種類に
より幾分異なるが、使用蛋白質ｇ当り３から60mg
の範囲にあり、好ましくは６から20mgの範囲にあ
る。反応は室温以下、好ましくは５℃付近で行わ
れる。 蛋白質、グルカナーゼ、アパタイトの共存する
懸濁駅を室温以下、好ましくは５℃付近に冷却
し、激しく撹拌しながらこの液にグルタルアルデ
ヒド水溶液を徐々に滴下し、滴下終了後同温で撹
拌を数時間行つて反応を終了する。反応終了後
過してえられたアパタイトは水又は使用した緩衝
溶液で充分洗浄して随伴している蛋白質、酵素を
除いたのち、そのまゝ低温に保持するか、凍結乾
燥して固体となし室温に保持する。 本願発明の固定化酵素は又以下のようにしても
生成されることができる。まず蛋白質を溶かした
水溶液又は緩衝溶液にアパタイトを添加して充分
撹拌してアパタイトに蛋白質を吸着飽和させ、し
かる後吸着アパタイトを採取し、グルカナーゼを
溶かした水又は緩衝溶液に吸着アパタイトを添加
し、激しく撹拌しながらグルタルアルデヒド水溶
液を徐々に滴下し、滴板終了後撹拌をつづける。
この場合反応温度、その他の条件は前記の条件に
準ずればよい。 このようにしてえられた固定化酵素は安定で、
経時変化が少く、取扱いが容易である。 （作用） アパタイト類がある種の蛋白質をよく吸着する
ことはすでに明らかにされており、酵素の固定化
に架橋剤としてグルタルアルデヒドが使用されて
いることも公知である。本願方法によるグルカナ
ーゼのアパタイトへの固定化が、如何なる機構に
より生成しているか明らかでないが、アパタイト
に吸着し易い蛋白質のアパタイトへの吸着、蛋白
質、グルカナーゼの架橋が同時に生じ、固定化酵
素をこえているものと推定される。 以下に実施例をあげて具体的に本願発明を説明
する。 例 １ レバナーゼのハイドロキシアパタイトへの固定
化 リゾチーム100mg、レバナーゼ100mg、を純水50
mlにとかし、この溶液に研磨剤ハイドロキシアパ
タイト２ｇを添加し４℃に冷却する。４℃を保ち
激しく撹拌しながらグルタルアルデヒド水溶液
（グルタルアルデヒド28mg／100ml）２mlを徐々に
滴下した。滴下終了後その温度を保持したまま２
時間撹拌した。その後遠心分離により固体を採取
し、50mlの純水で３回撹拌洗浄して固体を採取
し、未乾燥固定化ハイドロキシアパタイトをえた
（場合によつてはこのまゝ使用してもよい）。これ
を凍結乾燥して粉対約2.05ｇをえた。この粉体１
ｇを秤量し、PH6.8、１モル濃度のリン酸カリ緩
衝溶液10mlを添加し、室温で１時間撹拌後遠心分
離して液を採取し、残査に同じ操作を２回繰返
し、液を合せてローリー法により蛋白質量を測
定し、残査は水洗後乾燥して重量を測定した。そ
の結果ハイドロキシアパタイトｇ当たり、蛋白質
11.7mgを結合していることを確認した。未乾燥固
定化ハイドロキシアパタイトを以下に述べる方法
により、そのレバナーゼ活性を測定したところ、
ハイドロキシアパタイト結合蛋白質ｇ当り0.47ｇ
をレバンを分解することを認めた。 例 ２ レバナーゼのフルオロアパタイトへの固定化 実施例１のハイドロキシアパタイトの代りにフ
ルオロアパタイトを用いた以外は実施例１と全く
同じ条件で操作し、凍結乾燥品2.05ｇをえた。例
１と同様に結合蛋白を測定し、フルオロアパタイ
トｇ当り13.4mgの蛋白質を結合していることを確
認した。例１と同様にレバナーゼ活性測定結果は
結合蛋白ｇ当り、0.54ｇのレバンを分解すること
を知つた。 例 ３ ムタナーゼのハイドロキシアパタイトヘの固
定化 例１のレバナーゼの代りにムタナーゼを用いた
以外は例１と同じ条件で実験し、固定化ハイドロ
キシアパタイトをえた。例１と同様に試験した結
果、ハイドロキシアパタイトｇ当り蛋白質15.0mg
を結合していることを認めた。又ムタナーゼ活性
を測定した結果、ハイドロキシアパタイト結合蛋
白質ｇ当り0.48ｇのムタンを分解することを確め
た。 例 ４ ムタナーゼのフルオロアパタイトへの固定化 例３におけるハイドロキシアパタイトの代りに
フルオロアパタイトを用いた以外は、例３と全く
同じ条件で操作し、固定化フロオロアパタイトを
えた。例３と同様に分析、その力価を測定した結
果、フルオロアパタイトｇ当り蛋白質17mgを結合
し、結合蛋白質ｇ当り0.45ｇのムタンを分解する
ことを認めた。 例 ５ デキストラナーゼのフルオロアパタイトへの固
定化 リゾチーム50mg、デキストラナーゼ50mgを混合
し、これにフルオロアパタイト５ｇ、0.05モル濃
度、PH6.8のリン酸カリ緩衝溶液50mlを添加し、
４℃に冷却し激しく撹拌する。この温度を保ちな
がら、さらにグルタルアルデヒド0.2％水溶液
125μを撹拌下に滴下し、滴下後５時間撹拌を
続行した。反応物を取し、上記緩衝溶液100ml
で３回洗浄後水洗し未乾燥固定化フルオロアパタ
イトをえた。凍結乾燥によりデキストラナーゼ固
定化フルオロアパタイト5.08ｇをえた。未乾燥固
定化フルオロアパタイト１mlを遠心分離してえた
沈殿物に１モル濃度PH6.8のリン酸カリ緩衝溶液
２mlを加えて３時間撹拌して結合蛋白質を脱着
し、遠心分離し、沈殿は同じ操作を繰返し、液
は合せてローリー法により蛋白質を測定し、沈殿
は水洗後乾燥して重量を秤量した。その結果フル
オロアパタイトｇ当り15.24mgの蛋白を結合して
いた。デキストラナーゼ活性測定結果は結合蛋白
ｇ当り0.43ｇのデキストランを分解した。 各種実験結果を表−１に示した処理条件は実施
例と同一である。 各酵素力価の測定 各１％基質溶液10mlに実験でえられた未乾燥固
定化酵素１mlを加え、37℃、２時間撹拌後溶液に
生成した単量体を夫々定量し、一方未乾燥固定化
酵素１mlに結合している蛋白質を前記した方法に
より測定し、アパタイトに結合した蛋白質ｇ当り
が分解した単量体の量を、各固定化酵素の力価と
した。 基質としてデキストラナーゼはデキストラン、
ムタナーゼはムタン、レバナーゼはレバンを使用
し、デキストラナーゼとムタナーゼは分解して主
成したグルコースをグルコースオキシダーゼ法に
より、レバナーゼは分解生成したフルクトースを
常法により高感度液体クロマトグラフイ（カラ
ム：シユガーパツク１、溶離液：水）により定量
した。 固定化酵素の経時活性 本方法によりえられた固定化酵素の数種につい
て、その活性の経時変化を検した。使用した試料
は何れも未乾燥固定化酵素で、夫々の活性は前記
の方法で測定した。 得られた固定化酵素は時間とともに活性を増加
し、ある期間後最高の活性を示すとともに以後
徐々に活性を低下することを知つた。 （発明の効果） 本願方法によれば、極めて簡単な操作でグルカ
ナーゼをアパタイトに固定化できるとともに得ら
れた固定化酵素は取扱いが容易な上、安定で経時
変化もすくなく、多糖類を分解する能力と、アパ
タイトの研磨性を有するため、その歯磨への使用
は虫歯予防に好ましく、口腔衛生上極めて有用で
ある。
及びアパタイトにグルカナーゼを固定化する方法
に関するものである。グルカナーゼはグルカンを
分解する酵素の総称であり、各種の酵素が含まれ
るが、本願発明に云うグルカナーゼとはレバンを
分解するレバナーゼ、デキストランを分解するデ
キストラナーゼ、ムタンを分解するムタナーゼを
指し、またアパタイトとはハイドロキシアパタイ
トとフルオロアパタイトを意味している。但し酵
素がデキストラナーゼの場合はアパタイトとして
フルオロアパタイトのみを指している。 虫歯が、口腔に存在する種々の細菌の生成する
多糖類、例えばレバン、デキストラン、ムタン、
などにより、歯垢を形成するため発生することは
周知の事実である。従つて、虫歯の予防にこれら
細菌の生成する多糖類を除去し、歯垢の形成を妨
げることが考えられている。本願発明は、これら
虫歯の発生に関係する多糖類の分解酵素を固定化
したアパタイト及びその製造法に関するものであ
る。 （従来の技術） 従来から虫歯予防として、歯垢を除去する方法
が種々実施されている。例えばゼオライト、炭酸
カルシウム、アルミナ、シリカ、その他の研磨剤
で歯垢を削り取る方法、デキストラナーゼを安定
化剤と共に使用する方法などが存在するが、本願
発明のように、レバナーゼ、ムタナーゼ、デキス
トラナーゼのような虫歯の原因となる多糖類を分
解する酵素を、研磨剤として歯磨に使用されるア
パタイトへ固定化する方法及びそれら酵素を固定
化したアパタイトはいままで存在しなかつた。 （発明が解決しようとする問題点） グルカナーゼは酵素であるから比較的不安定で
あり、歯磨きにそのまゝ混合すると、時間ととも
にその活性を低下し、遂には活性を示さなくな
る。現在デキストラナーゼは歯磨きに使用されて
いるが、その失活を妨げるため各種の安定化剤が
提案されている。例えば、特開昭56−63915号公
報はデキストタナーゼと酸化アルミニウムとの配
合を、特開昭56−110609号公報はデキストラナー
ゼとカルボン、ｌ−メントールとの混合を、特公
昭52−49055号明細書はデキストラナーゼとゼラ
チンまたはペフトンとの配合を提案している。然
るに、歯磨きは口腔内で使用するため、人体に対
する影響を考慮する必要があり、また使用後の清
涼感を要求されるなど、種々の制約をうけてい
る。安定化剤も当然かかる制約下におかれるた
め、安定化剤の選択は困難な問題を含んでいる。
デキストラナーゼ以外の酵素を使用する場合にも
デキストラナーゼ使用の場合と全く同じ問題を生
じる。そこでグルカナーゼの安定化法について
種々検討した結果、研磨剤として使用されるアパ
タイトにグルカナーゼを固定化することにより、
安定剤を必要とせず、長期間安定に活性を示すグ
ルカナーゼをえる方法を開発することができた。
本願発明はグルカナーゼを固定化したアパタイト
及びその製造法を提供するものである。 （問題を解決するための手段） ハイドロキシアパタイト、活性炭、カオリナイ
ト、白土などに酵素を物理的に吸着させて固定化
させる酵素固定化法が存在することは周知の事実
であり、又固定化された酵素は安定化し、酵素単
体より経時活性の変化が少く、取扱いが便利であ
ることも一般に知られている。このようにアパタ
イトがある種の蛋白質を強固に吸着結合すること
が古くから知られているので、グルカナーゼを固
定化してその経時活性の変化を少くするとの考え
にもとずき、歯磨きで研磨剤として使用されてい
るアパタイトに物理的吸着法によりグルカナーズ
を固定化することができれば、簡単な操作で固定
化酵素がえられ、それを歯磨きに使用すれば研磨
性と多糖質分解性の両作用を有することに加え、
酵素の安定化剤の選択を必要とせず、好ましい研
磨素材になるのであろうと考え、グルカナーゼの
アパタイトによる固定化を検討した。その結果グ
ルカナーゼのアパタイトへの吸着力が極めて弱い
ため、直接グルカナーゼをアパタイトに吸着固定
化することは無理があると認めた。そこで、我々
はアパタイトに強固に吸着結合する蛋白質を介し
てグルカナーゼを固定化したアパタイトをえるこ
とができた。本願発明はグルカナーゼを固定化し
たアパタイト、及びアパタイトに強く吸着するあ
る種の蛋白質とともにグルカナーゼをアパタイト
に固定化させる方法を提供するものである。本願
発明にいうグルカナーゼとは前記のように、デキ
ストラナーゼ、レバナーゼ、ムタナーゼを含み、
アパタイトとはハドロキシアパタイト、フルオロ
アパタイトとを意味しているが酵素がデキストラ
ナーゼの場合はアパタイトとしてフルオロアパタ
イトを意味している。 アパタイトに強く吸着し、かつ人体に悪影響を
及ぼさない蛋白質、及びグルカナーゼを溶解した
水溶液、又は0.01から0.05モル濃度のリン酸塩緩
衝溶液にアパタイトを懸濁させ、激しく撹拌しな
がら２官能性アルデヒドを滴下する。使用する蛋
白質としては、アルブミン、カゼイン、リゾチー
ム、チトクロムＣ、プロタミンなどより選択され
る。蛋白質の種類により生成する固定化酵素の力
価、アパタイトへの結合力に生じるが、それらの
なかでリゾチーム、チトクロムＣなどが好適であ
る。グルカナーゼは前記したように、レバナー
ゼ、デキストラナーゼ、ムタナーゼより任意にえ
らぶことができ、場合によつてはこれら酵素の混
合物を用いることができる。アパタイトとしては
ハイドロキシアパタイト、フルオロアパタイトよ
り選択する。反応はアパタイトを分解しないPH、
即ちPH5.6以上のPHで行われるがPHが高くなると
吸着に悪影響を及ぼすのでPH9.0以上は好ましく
なく、PH7.0付近が好ましい。使用するアパタイ
トの粒度は出来るだけ均一であることが望まれる
が、一般に歯磨きに研磨剤として使用されている
粒子で充分使用可能であり、粒径2μから200μの
ものが使用し易く、蛋白質に対し10から100倍量
を使用する。撹拌が効率よく行なわれるように、
使用アパタイト量に対し、多量の水又は緩衝溶液
を使用することが望まれ、反応相固形分が４から
20パーセントになるよう水量をを調整する。使用
する蛋白質とグルカナーゼは等量程度が好まし
く、両者の極端な相違、特にグルカナーゼが蛋白
質に対し少量であることは生成する固定化酵素の
力価を下げるので避けるべきである。使用する２
官能性アルデヒドとしては一般に使用されている
グルタルアルデヒドが好ましい。この使用量は固
定化酵素の力価に最も影響を及ぼす因子である。
一般にグルタルアルデヒドの添加量が少なすぎる
とえられた固定化酵素のアパタイトへの結合力が
弱く、経時失活が著しい。又添加量が多いと、え
られる固定化酵素の力価を低下させ、更に添加量
を増加させと遂には活性を示さなくなる。使用す
るグルタルアルデヒド量は酵素、蛋白質の種類に
より幾分異なるが、使用蛋白質ｇ当り３から60mg
の範囲にあり、好ましくは６から20mgの範囲にあ
る。反応は室温以下、好ましくは５℃付近で行わ
れる。 蛋白質、グルカナーゼ、アパタイトの共存する
懸濁駅を室温以下、好ましくは５℃付近に冷却
し、激しく撹拌しながらこの液にグルタルアルデ
ヒド水溶液を徐々に滴下し、滴下終了後同温で撹
拌を数時間行つて反応を終了する。反応終了後
過してえられたアパタイトは水又は使用した緩衝
溶液で充分洗浄して随伴している蛋白質、酵素を
除いたのち、そのまゝ低温に保持するか、凍結乾
燥して固体となし室温に保持する。 本願発明の固定化酵素は又以下のようにしても
生成されることができる。まず蛋白質を溶かした
水溶液又は緩衝溶液にアパタイトを添加して充分
撹拌してアパタイトに蛋白質を吸着飽和させ、し
かる後吸着アパタイトを採取し、グルカナーゼを
溶かした水又は緩衝溶液に吸着アパタイトを添加
し、激しく撹拌しながらグルタルアルデヒド水溶
液を徐々に滴下し、滴板終了後撹拌をつづける。
この場合反応温度、その他の条件は前記の条件に
準ずればよい。 このようにしてえられた固定化酵素は安定で、
経時変化が少く、取扱いが容易である。 （作用） アパタイト類がある種の蛋白質をよく吸着する
ことはすでに明らかにされており、酵素の固定化
に架橋剤としてグルタルアルデヒドが使用されて
いることも公知である。本願方法によるグルカナ
ーゼのアパタイトへの固定化が、如何なる機構に
より生成しているか明らかでないが、アパタイト
に吸着し易い蛋白質のアパタイトへの吸着、蛋白
質、グルカナーゼの架橋が同時に生じ、固定化酵
素をこえているものと推定される。 以下に実施例をあげて具体的に本願発明を説明
する。 例 １ レバナーゼのハイドロキシアパタイトへの固定
化 リゾチーム100mg、レバナーゼ100mg、を純水50
mlにとかし、この溶液に研磨剤ハイドロキシアパ
タイト２ｇを添加し４℃に冷却する。４℃を保ち
激しく撹拌しながらグルタルアルデヒド水溶液
（グルタルアルデヒド28mg／100ml）２mlを徐々に
滴下した。滴下終了後その温度を保持したまま２
時間撹拌した。その後遠心分離により固体を採取
し、50mlの純水で３回撹拌洗浄して固体を採取
し、未乾燥固定化ハイドロキシアパタイトをえた
（場合によつてはこのまゝ使用してもよい）。これ
を凍結乾燥して粉対約2.05ｇをえた。この粉体１
ｇを秤量し、PH6.8、１モル濃度のリン酸カリ緩
衝溶液10mlを添加し、室温で１時間撹拌後遠心分
離して液を採取し、残査に同じ操作を２回繰返
し、液を合せてローリー法により蛋白質量を測
定し、残査は水洗後乾燥して重量を測定した。そ
の結果ハイドロキシアパタイトｇ当たり、蛋白質
11.7mgを結合していることを確認した。未乾燥固
定化ハイドロキシアパタイトを以下に述べる方法
により、そのレバナーゼ活性を測定したところ、
ハイドロキシアパタイト結合蛋白質ｇ当り0.47ｇ
をレバンを分解することを認めた。 例 ２ レバナーゼのフルオロアパタイトへの固定化 実施例１のハイドロキシアパタイトの代りにフ
ルオロアパタイトを用いた以外は実施例１と全く
同じ条件で操作し、凍結乾燥品2.05ｇをえた。例
１と同様に結合蛋白を測定し、フルオロアパタイ
トｇ当り13.4mgの蛋白質を結合していることを確
認した。例１と同様にレバナーゼ活性測定結果は
結合蛋白ｇ当り、0.54ｇのレバンを分解すること
を知つた。 例 ３ ムタナーゼのハイドロキシアパタイトヘの固
定化 例１のレバナーゼの代りにムタナーゼを用いた
以外は例１と同じ条件で実験し、固定化ハイドロ
キシアパタイトをえた。例１と同様に試験した結
果、ハイドロキシアパタイトｇ当り蛋白質15.0mg
を結合していることを認めた。又ムタナーゼ活性
を測定した結果、ハイドロキシアパタイト結合蛋
白質ｇ当り0.48ｇのムタンを分解することを確め
た。 例 ４ ムタナーゼのフルオロアパタイトへの固定化 例３におけるハイドロキシアパタイトの代りに
フルオロアパタイトを用いた以外は、例３と全く
同じ条件で操作し、固定化フロオロアパタイトを
えた。例３と同様に分析、その力価を測定した結
果、フルオロアパタイトｇ当り蛋白質17mgを結合
し、結合蛋白質ｇ当り0.45ｇのムタンを分解する
ことを認めた。 例 ５ デキストラナーゼのフルオロアパタイトへの固
定化 リゾチーム50mg、デキストラナーゼ50mgを混合
し、これにフルオロアパタイト５ｇ、0.05モル濃
度、PH6.8のリン酸カリ緩衝溶液50mlを添加し、
４℃に冷却し激しく撹拌する。この温度を保ちな
がら、さらにグルタルアルデヒド0.2％水溶液
125μを撹拌下に滴下し、滴下後５時間撹拌を
続行した。反応物を取し、上記緩衝溶液100ml
で３回洗浄後水洗し未乾燥固定化フルオロアパタ
イトをえた。凍結乾燥によりデキストラナーゼ固
定化フルオロアパタイト5.08ｇをえた。未乾燥固
定化フルオロアパタイト１mlを遠心分離してえた
沈殿物に１モル濃度PH6.8のリン酸カリ緩衝溶液
２mlを加えて３時間撹拌して結合蛋白質を脱着
し、遠心分離し、沈殿は同じ操作を繰返し、液
は合せてローリー法により蛋白質を測定し、沈殿
は水洗後乾燥して重量を秤量した。その結果フル
オロアパタイトｇ当り15.24mgの蛋白を結合して
いた。デキストラナーゼ活性測定結果は結合蛋白
ｇ当り0.43ｇのデキストランを分解した。 各種実験結果を表−１に示した処理条件は実施
例と同一である。 各酵素力価の測定 各１％基質溶液10mlに実験でえられた未乾燥固
定化酵素１mlを加え、37℃、２時間撹拌後溶液に
生成した単量体を夫々定量し、一方未乾燥固定化
酵素１mlに結合している蛋白質を前記した方法に
より測定し、アパタイトに結合した蛋白質ｇ当り
が分解した単量体の量を、各固定化酵素の力価と
した。 基質としてデキストラナーゼはデキストラン、
ムタナーゼはムタン、レバナーゼはレバンを使用
し、デキストラナーゼとムタナーゼは分解して主
成したグルコースをグルコースオキシダーゼ法に
より、レバナーゼは分解生成したフルクトースを
常法により高感度液体クロマトグラフイ（カラ
ム：シユガーパツク１、溶離液：水）により定量
した。 固定化酵素の経時活性 本方法によりえられた固定化酵素の数種につい
て、その活性の経時変化を検した。使用した試料
は何れも未乾燥固定化酵素で、夫々の活性は前記
の方法で測定した。 得られた固定化酵素は時間とともに活性を増加
し、ある期間後最高の活性を示すとともに以後
徐々に活性を低下することを知つた。 （発明の効果） 本願方法によれば、極めて簡単な操作でグルカ
ナーゼをアパタイトに固定化できるとともに得ら
れた固定化酵素は取扱いが容易な上、安定で経時
変化もすくなく、多糖類を分解する能力と、アパ
タイトの研磨性を有するため、その歯磨への使用
は虫歯予防に好ましく、口腔衛生上極めて有用で
ある。
【表】
【表】
【表】
トラナーゼいずれも水溶液
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ グルカナーゼ及び蛋白質をグルタルアルデヒ
ドによりアパタイトに固定化したことを特徴とす
るグルカナーゼ固定化アパタイト。 ここでグルカナーゼは、レバナーゼ、ムタナー
ゼ及びデキストラナーゼより選ばれた酵素； 蛋白質はアルブミン、カゼイン、リゾチーム、
チトクロムＣ及びプロタミンより選ばれた蛋白
質； アパタイトはハイドロキシアパタイト及びフル
オロアパタイトより選ばれたアパタイトを意味し
ている。但し、グルカナーゼがデキストラナーゼ
であるとき、アパタイトはフルオロアパタイトで
ある。 ２ グルカナーゼ、蛋白質及びアパタイトを混在
させた水溶液にグルタルアルデヒドを滴下し得ら
れた沈降物を採取することを特徴とするグルカナ
ーゼ固定化アパタイトの製造法。 ここでグルカナーゼはレバナーゼ、ムタナーゼ
及びデキストラナーゼより選ばれた酵素； 蛋白質はアルブミン、カゼイン、リゾチーム、
チトクロムＣ及びプロタミンより選ばれた蛋白
質； アパタイトはハイドロキシアパタイト及びフル
オロアパタイトより選ばれたアパタイトを意味し
ている。但し、グルカナーゼがデキストラナーゼ
であるとき、アパタイトはフルオロアパタイトで
ある。 ３ 蛋白質がリゾチームである特許請求の範囲第
２項記載の製造法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61091332A JPS62248487A (ja) | 1986-04-22 | 1986-04-22 | グルカナーゼを固定化したアパタイトおよびその製造法 |
| AU74601/87A AU602149B2 (en) | 1986-04-22 | 1987-06-23 | Apatite immobilized glucanase and the like, and method of preparing the same |
| DE3721441A DE3721441C1 (de) | 1986-04-22 | 1987-06-29 | Verfahren zur Herstellung eines Apatits mit daran immobilisierter Glucanase und nach dem Verfahren hergestellte Apatite |
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| FR878709866A FR2617867B1 (fr) | 1986-04-22 | 1987-07-10 | Glucanase, immobilisee sur apatite et procede pour sa preparation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61091332A JPS62248487A (ja) | 1986-04-22 | 1986-04-22 | グルカナーゼを固定化したアパタイトおよびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62248487A JPS62248487A (ja) | 1987-10-29 |
| JPH0441597B2 true JPH0441597B2 (ja) | 1992-07-08 |
Family
ID=14023487
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61091332A Granted JPS62248487A (ja) | 1986-04-22 | 1986-04-22 | グルカナーゼを固定化したアパタイトおよびその製造法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
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| AU (1) | AU602149B2 (ja) |
| DE (1) | DE3721441C1 (ja) |
| FR (1) | FR2617867B1 (ja) |
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| JPS6140791A (ja) * | 1984-08-02 | 1986-02-27 | スタブラ・アクチエンゲゼルシャフト | グルコースの異性化方法 |
-
1986
- 1986-04-22 JP JP61091332A patent/JPS62248487A/ja active Granted
-
1987
- 1987-06-23 AU AU74601/87A patent/AU602149B2/en not_active Ceased
- 1987-06-29 DE DE3721441A patent/DE3721441C1/de not_active Expired
- 1987-07-01 GB GB08715448A patent/GB2206585A/en not_active Withdrawn
- 1987-07-10 FR FR878709866A patent/FR2617867B1/fr not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6140791A (ja) * | 1984-08-02 | 1986-02-27 | スタブラ・アクチエンゲゼルシャフト | グルコースの異性化方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| GB2206585A (en) | 1989-01-11 |
| GB8715448D0 (en) | 1987-08-05 |
| AU602149B2 (en) | 1990-10-04 |
| AU7460187A (en) | 1989-01-05 |
| DE3721441C1 (de) | 1988-12-29 |
| FR2617867A1 (fr) | 1989-01-13 |
| FR2617867B1 (fr) | 1990-03-09 |
| JPS62248487A (ja) | 1987-10-29 |
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