JPH04370095A - 澱粉加水分解酵素の安定化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、澱粉加水分解酵素の安
定化法、更に詳細には、特にα−アミラーゼ及びプルラ
ナーゼに好適な、澱粉加水分解酵素のキレート剤及び／
又は界面活性剤に対する安定化法に関する。

【０００２】

【従来の技術】澱粉加水分解酵素は、人間の主要なエネ
ルギー源である澱粉の消化に、また澱粉を原料とする水
飴、ブドウ糖、異性化糖、更には酒や酢の製造において
古くから親しまれかつ利用されてきた酵素である。澱粉
加水分解酵素は、各種澱粉質及びその誘導体をグルコー
ス、マルトース又はマルトオリゴ糖にまで分解する酵素
系からなり、その作用機構によりα−アミラーゼ、β−
アミラーゼ、グルコアミラーゼ、あるいは枝切り酵素と
して知られるプルラナーゼ、イソアミラーゼ、ネオプル
ラナーゼなどの酵素の総称と理解されている。

【０００３】α−アミラーゼは、ヒト膵臓、ブタ膵臓、
ヒト唾液等の中に存在するほか、アスペルギルス　　オ
リザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）、ア
スペルギルス　　ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ
ｉｇｅｒ）、バチルス　　アミロリケファシエンス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ
）、バチルス　　リケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスアミロサッカ
リティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｓａｃｃｈ
ａｒｉｔｉｃｕｓ）、バチルス　　セレウス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス　　サーキュラン
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス
　　ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔ
ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、シュウドモナス
　　シュツッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｔｕ
ｔｚｅｒｉ）等の微生物から生産される。

【０００４】β−アミラーゼは、大麦、小麦等の穀類；
ダイズ、インゲンマメ等の豆類；サツマイモ等の各種野
菜などの高等植物より多く見出されてきたが、最近バチ
ルス属、シュウドモナス属、ストレプトマイセス属等の
微生物から相次いで生産菌が見出されている。

【０００５】グルコアミラーゼは、アスペルギルス属、
リゾプス属等のカビ類から多く見出されている〔中村道
徳監修，「アミラーゼ」，学会出版センター，１９８６
年度刊〕。

【０００６】また、枝切り酵素として知られているプル
ラナーゼは、ＢｅｎｄｅｒとＷａｌｌｅｎｆｅｌｓ〔Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．　Ｚ．，　３３４，　７９（１９６１）
〕により、アエロバクター　　アエロゲネス（Ａｅｒｏ
ｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）の一菌株から初め
て発見され、その後、バチルス　　エスピー（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｓｐ．）〔Ｊ．　Ｊｐｎ．　Ｓｏｃ．　Ｓｔ
ａｒｃｈ　Ｓｃｉ．，　３０，　２００（１９８３）〕
、バチルス　　アシドプルリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ）〔Ａｇｒｉ
ｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　５２，２２９３（１
９８４）〕、バチルス　　ステアロサーモフィラス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ）〔Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　１７，　２４（１９
８３）〕、ストレプトコッカス　　ミティス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｉｔｉｓ）〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．
　Ｊ．，　１０８，　３３（１９６８）〕、ラクトバチ
ルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）〔澱粉科学，２８
，７２（１９８７）〕、クロストリジウム　　サーモヒ
ドロスルフリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒ
ｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ）〔Ａｐｐｌ．　
Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　４９，５
（１９８５）；　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．，　２４６，
１９３（１９８７）〕、サーマス　　エスピー（Ｔｈｅ
ｒｍｕｓ　ｓｐ．）〔Ｊ．　Ｊｐｎ．　Ｓｏｃ．　Ｓｔ
ａｒｃｈＳｃｉ．，　３４，　１（１９８７）〕等の微
生物がプルラナーゼを生産することが報告されている。

【０００７】更に、アミラーゼ活性及びプルラナーゼ活
性の双方を有する酵素が、バチルスズブチリス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴＵ〔Ａｇｒｉｃ．　
Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　５１，　９（１９８７）；
特公平１−１８７１７号公報〕の生産するプルラナーゼ
−アミラーゼ複合酵素、バチルス　　サーキュランス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）Ｆ−２〔Ｂｉ
ｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，９９１，
　ｌ８８（１９８９）；特開昭６４−６０３７６号公報
〕の生産するプルラナーゼ活性を有するアミラーゼ及び
クロストリジウム　　サーモヒドロスルフリカム（Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆ
ｕｒｉｃｕｍ）Ｅ−１０１〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．，
　２４６，　１９３（１９８７）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．　
Ｊ．，　２５０，８１３（１９８８）；Ｊ．　Ｇｅｎ．
　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　１３６，　４４７（１９９
０）；特公昭６３−１９６２８８号公報〕の生産するプ
ルラナーゼ／アミラーゼ両活性を有する酵素が報告され
ている。

【０００８】しかし、これらいずれの酵素も、一般的に
は不安定であり工業的用途を考えると不利な点が多かっ
た。

【０００９】一方、近年では、澱粉加水分解酵素はアル
カリ洗浄剤組成物の添加成分としての新規用途が注目さ
れており、この目的に適したアルカリ側に至適活性を有
する、いわゆるアルカリアミラーゼも見出されている〔
Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　３５，　１
１（１９７１）；特公昭４８−４５５３号公報；特公昭
５０−５２７２号公報；特公昭５５−３３３０９号公報
；特公昭５６−１００２９号公報；特公昭５１−９０３
３号公報；特公昭５２−３１９４９号公報；特公昭５０
−５２７４号公報；特開昭６２−２０８２７８号公報〕
。

【００１０】アルカリ側に至適活性を有する澱粉加水分
解酵素生産菌として過去に報告されたものは、バチルス
属に属する菌が大半を占め、例えば、バチルス　　エス
ピーＮｏ．Ａ−４０１（ＦＥＲＭ　Ｐ−３５３）、バチ
ルス　　エスピー　　Ｎｏ．Ａ−４０２（ＦＥＲＭ　Ｐ
−３５４）、バチルス　　エスピー　　Ｎｏ．Ａ−５９
（ＦＥＲＭ　Ｐ−３５５）〔特公昭４８−４５５３号公
報〕、バチルスエスピー　　Ｎｏ．１３５１（ＦＥＲＭ
　Ｐ−６１７）、バチルス　　エスピー　　Ｎｏ．１６
９（ＦＥＲＭ　Ｐ−６１８）〔特公昭５０−５２７２号
公報〕、バチルス　　エスピー　　Ｎｏ．Ｐ−２０３（
ＦＥＲＭ　Ｐ−１３６６）〔特公昭５５−３３３０９号
公報〕、バチルス　　ズブチリス　　Ｙ０８（ＡＴＣＣ
　２１５５４）、バチルス　　ズブチリス　　Ｙ１３（
ＡＴＣＣ　２１５５５）〔特公昭５６−１００２９号公
報〕、バチルス　　ズブチリス　　ＡＪ−３２５５（Ｆ
ＥＲＭ　Ｐ−３７６）、バチルス　　ズブチリス　　Ａ
Ｊ−３２９８（ＦＥＲＭ　Ｐ−６６０）、バチルス　　
ズブチリス　　ＡＪ−３２９９（ＦＥＲＭ　Ｐ−６６１
）〔特公昭５１−９０３号公報〕、バチルス　　オーベ
ンシス　　エスピー　　ノブ　　Ｃ−１４００（ＦＥＲ
Ｍ　Ｐ−１９９０）〔特公昭５２−３１９４９号公報〕
、バチルス　　エスピー　　ＫＳＭ−１８７６（ＦＥＲ
Ｍ　Ｐ−１０８８７）〔特開平３−８７１７６号公報；
特開平３−８７１７７号公報〕、バチルス　　エスピー
　　ＫＳＭ−ＡＰ１３７８（ＦＥＲＭＰ−１０８８６）
〔特願平１−２４２６０５号公報〕等が知られている。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの菌が
生産する澱粉加水分解酵素の多くは界面活性剤、キレー
ト剤等の洗浄剤成分により影響を受け、活性が低下する
ことが知られている。従って、澱粉加水分解酵素をアル
カリ洗浄剤の添加成分として用いるには、この活性低下
をできるだけ少なくすることが望まれる。この点に鑑み
、現在まで種々の安定化法が提案されているが、充分な
解決には至っていないのが実情である。

【００１２】従って、本発明は澱粉加水分解酵素をこれ
らの洗浄剤成分に対して好適に安定化する方法を開発す
ることを目的とする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】かかる実情において、本
発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結
果、澱粉加水分解酵素を糖アルコールにより処理すると
、界面活性剤、キレート剤等の存在下における強い安定
化効果が得られることを見出し、本発明を完成した。

【００１４】すなわち本発明は、澱粉加水分解酵素に糖
アルコールを添加・混合することを特徴とする澱粉加水
分解酵素の安定化法を提供するものである。

【００１５】本発明の安定化法は、前記のような種々の
澱粉加水分解酵素に適用できるが、特にα−アミラーゼ
及びプルラナーゼに好適に適用することができる。

【００１６】本発明に用いられる糖アルコールとしては
、ラクチトール、アラビトール、ソルビトール、ガラク
チトール、キシリトール、リビトール、マンニトール、
エリスルトール、イノシトール、マルチトール、マルト
トリイトール、マルトテトライトール、イソマルチトー
ル等が挙げられ、特にマルチトール、マルトトリイトー
ル及びマルトテトライトールが好ましいものとして挙げ
られる。

【００１７】糖アルコールの添加量は、適用される澱粉
加水分解酵素及び用いる糖アルコールによって異なるが
、少なくとも澱粉加水分解酵素の活性中心が保護される
のに必要な量があればよい。例えば、澱粉加水分解酵素
を含有する系中に、０．０１〜１０重量％となるように
配合するのがよい。

【００１８】また、本発明の安定化法を、洗浄剤成分と
して用いる酵素に適用する場合は、例えば糖アルコール
を澱粉加水分解酵素及びその他の洗浄剤成分と混合し、
造粒すればよい。

【００１９】

【実施例】以下、実施例を挙げて更に詳細に説明するが
、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００２０】参考例 アルカリα−アミラーゼ活性を有するアルカリプルラナ
ーゼＹ生産菌であるバチルス　　エスピー　　ＫＳＭ−
ＡＰ１３７８（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０８８６）を、可溶化
澱粉１％、ポリペプトン０．２％、酵母エキス０．１％
、ＫＨ２ＰＯ４　０．０３％、（ＮＨ４）２ＰＯ４０．
１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．０２％、ＣａＣｌ２
・２Ｈ２Ｏ　０．０２％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．
００１％及びＭｎＣｌ２・４Ｈ２０　０．０００１％（
ｐＨ６．５〜６．８）を含む培地に接種し、３０℃で２
日間振とう培養した。この種母培養液を、上記と同様の
培地に１％接種し、澱粉加水分解酵素の発酵を行った。 なお、培養液のｐＨをアルカリに保つ目的で、上記培地
に別滅菌したＮａ２ＣＯ３を最終濃度で０．５％になる
ように後添加して培地の調製を行った。培養後、菌体を
遠心分離して除き、得られた上清液を粗酵素液とした。 更に、通常の方法に従ってエタノール沈殿（７５％）を
行い、得られた沈殿物を凍結乾燥し、アルカリα−アミ
ラーゼ活性を有するアルカリプルラナーゼＹ酵素標品を
得た。この酵素について、下記の方法によりα−アミラ
ーゼ活性及びプルラナーゼ活性を測定した。この結果を
表１に示す。 〔α−アミラーゼ活性測定法〕各種緩衝液に可溶化澱粉
（反応系における最終濃度は０．２５％）を溶解させた
基質溶液０．９ｍｌに、酵素液０．１ｍｌを加え、５０
℃で１５分間反応させた。反応後、３，５−ジニトロサ
リチル酸〔３，５−ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ
　ａｃｉｄ（ＤＮＳ）〕法にて還元糖の定量を行った。 すなわち、反応液１．０ｍｌにＤＮＳ試薬１．０ｍｌを
加え、５分間、１００℃で加熱発色させ、冷却後、４．
０ｍｌの脱イオン水を加えて希釈し、波長５３５ｎｍで
比色定量した。酵素の力価は、１分間に１μｍｏｌのグ
ルコースに相当する還元糖を成する酵素量を１単位（１
Ｕ）とした。 〔プルラナーゼ活性測定法〕各種緩衝液中にプルラン（
反応系における最終濃度は０．５％）を溶解させた基質
溶液０．９ｍｌに、酵素液０．１ｍｌを加え、５０℃で
１５分間反応させた。反応後、ＤＮＳ法にて還元糖の定
量を行った。すなわち、反応液１．０ｍｌにＤＮＳ試薬
１．０ｍｌを加え、５分間、１００℃で加熱発色させ、
冷却後、４．０ｍｌの脱イオン水を加えて希釈し、波長
５３５ｎｍで比色定量した。酵素の力価は、１分間に１
μｍｏｌのグルコースに相当する還元糖を成する酵素量
を１単位（１Ｕ）とした。

【００２１】

【表１】

【００２２】実施例２ 実施例１で得たアルカリα−アミラーゼ活性を有するア
ルカリプルラナーゼＹ溶液に表２に示す糖アルコールを
混合し、２５℃、３０分間保持した。次いで、各反応液
にＥＤＴＡを最終濃度が１０ｍＭになるように加え、４
０℃で６０分間処理した。プルラナーゼ活性及びα−ア
ミラーゼ活性について、未処理時の酵素活性を１００％
としたときの処理後の残存活性を表２に示す。

【００２３】

【表２】

【００２４】実施例３ 市販のα−アミラーゼ（シグマ社製，Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来α−アミラーゼ）０
．５μｇと表３に示す糖アルコールを、１０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７）０．５ｍｌ中で混合し、２５℃
、３０分間保持した。次いで、各反応液に各種界面活性
剤を最終濃度が０．０５％になるように加え、４０℃で
１５分間処理した。α−アミラーゼ活性について、未処
理時の酵素活性を１００％としたときの処理後の残存活
性を表３に示す。

【００２５】

【表３】

【００２６】実施例４ 市販のプルラナーゼ（シグマ社製，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃ
ｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ由来プルラナーゼ）０．０
１ｇと表４に示す糖アルコールを混合し、２５℃、３０
分間保持した。次いで、各反応液に各種界面活性剤を最
終濃度が０．０５％になるように加え、４０℃で１５分
間処理した。プルラナーゼ活性について、未処理時の酵
素活性を１００％としたときの処理後の残存活性を表４
に示す。

【００２７】

【表４】

【００２８】

【発明の効果】以上のように、本発明の安定化法によれ
ば、α−アミラーゼ、プルラナーゼ等の澱粉加水分解酵
素をキレート剤及び／又は界面活性剤等に対して好適に
安定化することができ、洗浄剤中におけるこれらの酵素
の失活を防止することができる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　澱粉加水分解酵素に糖アルコールを添
   加・混合することを特徴とする澱粉加水分解酵素の安定
   化法。
2. 【請求項２】　　澱粉加水分解酵素が、α−アミラーゼ
   及び／又はプルラナーゼである請求項１記載の安定化法
   。
3. 【請求項３】　　プルラナーゼが、α−アミラーゼ活性
   とプルラナーゼ活性の双方を有するものである請求項２
   記載の安定化法。
4. 【請求項４】　　糖アルコールが、ラクチトール、アラ
   ビトール、ソルビトール、ガラクチトール、キシリトー
   ル、リビトール、マンニトール、エリスリトール、イノ
   シトール、マルチトール、マルトトリイトール、マルト
   テトライトール及びイソマルチトールから選ばれる少な
   くとも１種以上である請求項１〜３のいずれかに記載の
   安定化法。