JPH043504B2

JPH043504B2 -

Info

Publication number: JPH043504B2
Application number: JP59003965A
Authority: JP
Priority date: 1984-01-12
Filing date: 1984-01-12
Publication date: 1992-01-23
Also published as: JPS60147651A

Description

[Detailed description of the invention]

技術分野本発明は体液中の蛋白、特に、尿蛋白を検出す
る試験紙、およびその製造方法に関する。さらに
詳しくは、本発明は検体溶液に含まれる総蛋白を
検出しうる試験紙、およびその製造方法に関す
る。従来技術尿蛋白を検出するための、従来の沈澱法に代わ
る簡便法として、試験紙による呈色反応がある。
特公昭43−7991号公報には、吸収性担体に緩衝液
を含浸させこれを乾燥して後ハロゲン化炭化水素
に溶解した色素を含浸させる試験紙の製造法が開
示されている。この方法で得られた試験紙を用い
ると蛋白質が0.005％の検出限界で検出される。
しかし、尿に含まれる蛋白質以外の成分によつて
も弱い陽性を示す場合があるうえに、この試験紙
により検出される蛋白質はアルブミンだけであ
る。蛋白尿には、通常アルブミンだけが含まれる
にすぎないため、アルブミンだけが検出されれば
よい。しかし、ある種の高蛋白尿症の場合には、
尿中にはアルブミンではなくγ−グロブリンが含
まれる。γ−グロブリンはこの試験紙によつては
検出されないため、疾病が見のがされることにな
る。特公昭45−1873号公報には、吸収性担体に蛋
白誤差を示す色素と緩衝液とを担持させこれに無
機硫酸塩を含浸させる試験紙の製造法が開示され
ている。この方法で製造された試験紙による蛋白
質の検出限界は、同じく、0.005％という高レベ
ルであり、かつ蛋白質以外の成分による偽陽性反
応が起こらない。しかし、この試験紙によつて検
出される蛋白質も同じくアルブミンだけであり、
γ−グロブリンは検出されない。アミノ酸、アミノ糖、蛋白質などはトリニトロ
ベンゼンスルホン酸（TNBS）と次のような置
換反応を起こし、その生成物は420nｍ付近に吸
収を有することがOKuyamaらによりJ.
Biochem.，47，454（1960）で述べられている。このような方法を検体に含まれる蛋白質を検出
するための試験紙に応用できれば便利である。し
かし、(1)TNBSはアルカリ条件下で不安定であ
るため蛋白質などを定性あるいは定量する場合に
は、アルカリ緩衝液とTNBS溶液とを測定時に
検体サンプルと混合する必要がある；さらに(2)反
応を促進させるため70℃程度に加熱する必要があ
る；などの問題がある。発明の目的本発明の目的は、検体溶液に含まれる蛋白質お
よびアミノ酸を高精度で検出可能な試験紙とその
製造方法を提供することにある。本発明の他の目
的は、検体溶液に含まれるあらゆる種類の蛋白質
を検出しうる試験紙とその製造方法を提供するこ
とにある。発明の要旨本発明の試験紙は上記OKuyamaらの方法の原
理を試験紙に応用したものであり、TNBSを含
むPH８〜10のアルカリ性緩衝溶液に吸収性担体を
含浸させて得られ、そのことにより上記目的が達
成される。さらに本発明の試験紙の製造方法は
TNBSを含むPH８〜10のアルカリ性緩衝溶液を
吸収性担体に含浸させる工程を包含し、そのこと
により上記目的が達成される。本発明に用いられるアルカリ性緩衝液とはPH８
〜10の領域で緩衝能力を有する溶液である。それ
にはリン酸二水素カリウム−水酸化ナトリウム、
ホウ酸−塩化カリウム−水酸化ナトリウム、四ホ
ウ酸ナトリウム−水酸化ナトリウム、リン酸二水
素カリウム−リン酸水素二ナトリウム、リン酸二
水素カリウム−四ホウ酸ナトリウム、四ホウ酸ナ
トリウム−炭酸ナトリウム、ホウ酸−塩化カリウ
ム−炭酸ナトリウム、ホウ酸−塩化ナトリウム−
四ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム−炭酸水素
ナトリウムなどが用いられる。さらにBritton−
Robinsonの広域緩衝液等も用いられうる。これ
らの緩衝液のうち、四ホウ酸ナトリウム−リン酸
二水素カリウムを含有する緩衝液がその安定性の
点で好ましい。これらの緩衝液のイオン強度は、
10〜500ｍＭでありPHは８〜10である。PHが８以
下であると室温での発色が非常におそい。PHが10
以上ではTNBSと混合して試験紙に含浸させた
とき乾燥工程において、TNBSが分解する。こ
のため試験紙自体が発色してしまう。しかし、PH
は高い程発色度が高い。最適のPH領域は8.3〜9.3
である。TNBSは緩衝液に0.3〜10mg／mlの割合
で含まれる。TNBSが0.3mg／ml以下であると発
色度が小さく、10mg／ml以上では、TNBS含有
溶液を含浸し乾燥する過程において、下地が発色
してしまい使用に供されえない。本発明方法に用いられうる吸収性担体には、例
えば、濾紙および架橋ポパールや不織布などの親
水性高分子担体がある。目的とする尿蛋白試験紙は上記の緩衝液に
TNBSを溶解させ、これに上記の吸収性担体を
浸漬して得られる。緩衝液とTNBS溶液とを
別々に調製しておき、これに吸収性担体を順次含
浸させてもよい。TNBSと緩衝液とが含浸され
た吸収性担体は乾燥時に水分を完全に除去するこ
とが試験紙の安定性の観点から望ましい。このた
め含浸された吸収性担体は、好ましくは、凍結乾
燥される。乾燥して得られた試験紙は、すぐに乾
燥剤の入つた褐色瓶、水分や光を遮断しうる容器
などに移しかえて保存することが望ましい。得られた試験紙を例えば尿などの検体溶液に浸
漬すれば蛋白質を検出することができる。蛋白質
のもつアミノ基がTNBSと反応して呈色するた
め、尿中の蛋白質のみならず検体に含まれるアミ
ノ酸や、アミノ糖などアミノ基を持つ化合物の検
出にも有効である。この試験紙を用いて尿蛋白の
検出試験を行うときは、試験紙をそのまま、ある
いは試験紙の小片をポリマーステイツクの先に固
定して用いる。被検尿に本試験片を浸漬した後、
すぐに取り出して余分な尿を濾紙などでとりのぞ
くと40〜80秒で発色が安定する。この試験紙は被
検尿に含まれるアミノ基を持つ化合物の濃度に応
じて橙黄色に発色する。このことにより蛋白質が
検出される。この方法は糖尿性腎症のようにアル
ブミン以外の蛋白が尿中に出現する場合に特に有
効である。さらに一定の条件下で標準比色表を作
成すれば、含有される蛋白質を定量することも可
能であり、半定量用試験紙としての機能を有す
る。実施例以下に本発明を実施例について説明する。実施例 0.1Mリン酸二水素カリウム２容量部と0.05M
四ホウ酸ナトリウム８容量部との混合液に、
TNBSを10mg／dlの濃度となるように加えた。
この溶液に東洋濾紙No.２（８cm×20cm）を浸漬し、
含浸させた。含浸後、ただちに凍結乾燥し５mm×
５mmの小片に切断した。厚さ300μｍのポリスチ
レンフイルムを60mm×５mmの大きさに切断したポ
リマーステイツクを準備し、このポリマーステイ
ツクの先端に上記試験紙小片を両面テープで固定
した。別にヒトアルブミン、α−グロブリン、β
−グロブリンおよびγ−グロブリン30，50，100，
250，1000mg／dlの各濃度に調整した標準溶液を
準備した。上記試験紙を各標準液に浸漬した後す
ぐに引き上げ、余分な水分を濾紙で除去し60秒間
放置した。呈色した色調を標準比色表により読み
とつた。その結果を下表に示す。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a test strip for detecting protein in body fluids, particularly urinary protein, and a method for producing the same. More specifically, the present invention relates to a test strip capable of detecting total protein contained in a sample solution, and a method for producing the same. Prior Art A color reaction using a test strip is a simple method to replace the conventional precipitation method for detecting urinary protein.
Japanese Patent Publication No. 43-7991 discloses a method for producing a test paper in which an absorbent carrier is impregnated with a buffer solution, dried, and then impregnated with a dye dissolved in a halogenated hydrocarbon. Using test strips obtained by this method, proteins can be detected with a detection limit of 0.005%.
However, components other than protein contained in urine may also give a weak positive result, and albumin is the only protein detected by this test strip. Proteinuria usually only contains albumin, so only albumin needs to be detected. However, in some cases of hyperproteinuria,
Urine contains γ-globulin rather than albumin. Since γ-globulin is not detected by this test strip, the disease may be overlooked. Japanese Patent Publication No. 45-1873 discloses a method for producing a test strip in which an absorbent carrier is loaded with a dye indicating a protein error and a buffer solution, and the carrier is impregnated with an inorganic sulfate. The detection limit for protein using test strips manufactured using this method is also at a high level of 0.005%, and false positive reactions due to components other than protein do not occur. However, the only protein detected by this test strip is albumin.
γ-globulin is not detected. OKuyama et al. reported that amino acids, amino sugars, proteins, etc. undergo the following substitution reaction with trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS), and that the product has absorption at around 420 nm.
Biochem., 47 , 454 (1960). It would be convenient if such a method could be applied to test strips for detecting proteins contained in specimens. However, (1) TNBS is unstable under alkaline conditions, so when qualitatively or quantitatively measuring proteins, etc., it is necessary to mix an alkaline buffer and a TNBS solution with the specimen sample during measurement; and (2) There are problems such as the need to heat to about 70°C to accelerate the reaction. OBJECT OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a test strip that can detect proteins and amino acids contained in a sample solution with high precision, and a method for producing the same. Another object of the present invention is to provide a test strip that can detect all kinds of proteins contained in a sample solution and a method for manufacturing the same. Summary of the Invention The test strip of the present invention applies the principle of the method of OKuyama et al. to the test strip, and is obtained by impregnating an absorbent carrier in an alkaline buffer solution containing TNBS with a pH of 8 to 10. The above objectives are achieved. Furthermore, the method for manufacturing the test strip of the present invention is
The method includes a step of impregnating an absorbent carrier with an alkaline buffer solution of pH 8 to 10 containing TNBS, thereby achieving the above object. The alkaline buffer used in the present invention has a pH of 8
It is a solution with buffering capacity in the region of ~10. It includes potassium dihydrogen phosphate-sodium hydroxide,
Boric acid-potassium chloride-sodium hydroxide, sodium tetraborate-sodium hydroxide, potassium dihydrogen phosphate-disodium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate-sodium tetraborate, sodium tetraborate-sodium carbonate, Boric acid - potassium chloride - sodium carbonate, boric acid - sodium chloride -
Sodium tetraborate, sodium carbonate-sodium hydrogen carbonate, etc. are used. Furthermore, Britton−
Robinson's broad spectrum buffer and the like may also be used. Among these buffers, a buffer containing sodium tetraborate-potassium dihydrogen phosphate is preferred in terms of stability. The ionic strength of these buffers is
It is 10-500mM and PH is 8-10. If the pH is 8 or less, color development at room temperature is very slow. PH is 10
In the above, when mixed with TNBS and impregnated into a test paper, TNBS decomposes in the drying process. As a result, the test paper itself develops color. However, P.H.
The higher the value, the higher the degree of color development. Optimal PH range is 8.3-9.3
It is. TNBS is included in the buffer at a ratio of 0.3 to 10 mg/ml. If TNBS is less than 0.3 mg/ml, the degree of color development will be low, and if it is more than 10 mg/ml, the base color will develop during the process of impregnating with the TNBS-containing solution and drying, making it unusable. Absorbent carriers that can be used in the method of the invention include, for example, filter paper and hydrophilic polymeric carriers such as crosslinked popal and nonwoven fabrics. The target urine protein test strip is added to the above buffer solution.
It is obtained by dissolving TNBS and immersing the above-mentioned absorbent carrier in it. The buffer solution and the TNBS solution may be prepared separately, and the absorbent carrier may be impregnated with these in sequence. From the viewpoint of the stability of the test strip, it is desirable to completely remove moisture from the absorbent carrier impregnated with TNBS and buffer solution during drying. For this purpose, the impregnated absorbent carrier is preferably lyophilized. It is advisable to immediately transfer the dried test strip to a brown bottle containing a desiccant or a container that can block moisture and light for storage. Protein can be detected by immersing the obtained test strip in a sample solution such as urine. Since the amino groups of proteins react with TNBS to produce a color, it is effective for detecting not only proteins in urine but also amino acids contained in samples and compounds with amino groups such as amino sugars. When performing a urine protein detection test using this test paper, use the test paper as it is, or use a small piece of the test paper fixed to the end of a polymer stick. After immersing this test piece in the test urine,
If you take it out immediately and remove excess urine with a filter paper, the color will stabilize in 40 to 80 seconds. This test paper develops an orange-yellow color depending on the concentration of compounds with amino groups contained in the urine sample. This allows the protein to be detected. This method is particularly effective in cases where proteins other than albumin appear in the urine, such as in diabetic nephropathy. Furthermore, if a standard colorimetric table is prepared under certain conditions, it is possible to quantify the protein contained, and it functions as a semi-quantitative test paper. Examples The present invention will be described below with reference to examples. Example 2 parts by volume of 0.1M potassium dihydrogen phosphate and 0.05M
In a mixed solution with 8 parts by volume of sodium tetraborate,
TNBS was added to a concentration of 10 mg/dl.
Soak Toyo Roshi No. 2 (8cm x 20cm) in this solution,
Impregnated. After impregnating, immediately freeze-dry to 5mm×
Cut into 5 mm pieces. A polymer stick was prepared by cutting a polystyrene film with a thickness of 300 μm into a size of 60 mm×5 mm, and the above test paper piece was fixed to the tip of the polymer stick with double-sided tape. In addition, human albumin, α-globulin, β
- globulin and γ-globulin 30, 50, 100,
Standard solutions adjusted to concentrations of 250 and 1000 mg/dl were prepared. Immediately after the test paper was immersed in each standard solution, it was pulled out, excess water was removed with a filter paper, and it was left for 60 seconds. The developed color tone was read using a standard colorimetric table. The results are shown in the table below.

【表】表に示されるように、本発明方法による試験紙
は0.03％の濃度の蛋白質の検出が可能であり、か
つ、総蛋白質の定性試験紙として充分な感度を各
種の蛋白質について有していることが判明した。発明の効果本発明によれば、このように、尿などの検体溶
液に含有される蛋白質を、その種類い関係なく高
精度で検出可能な試験紙を提供することができ
る。この試験紙を用いると従来検出することので
きなかつたγ−グロブリンをはじめあらゆる種類
の蛋白質の検出が短時間のうちに正確になされ得
るため、尿検査における蛋白質のチエツクが完全
になされうる。[Table] As shown in the table, the test strip according to the present invention can detect proteins at a concentration of 0.03%, and has sufficient sensitivity for various proteins as a qualitative test strip for total protein. It turned out that there was. Effects of the Invention According to the present invention, it is possible to provide a test strip that can detect proteins contained in a sample solution such as urine with high precision regardless of the type thereof. By using this test strip, all kinds of proteins, including γ-globulin, which could not be detected conventionally, can be detected accurately in a short time, so that a complete check for proteins in urine tests can be performed.

Claims

[Claims] 1. PH8~ containing trinitrobenzenesulfonic acid
A test strip for detecting total protein and amino acids in body fluids impregnated with 10 alkaline buffer solutions. 2 PH8~ containing trinitrobenzenesulfonic acid
1. A method for producing a test strip for detecting total protein and amino acids in body fluids, which comprises impregnating an absorbent carrier with an alkaline buffer solution.