JPH04325087A - Ｃｄ４＋ヘルパーｔ細胞の産生方法 - Google Patents
Ｃｄ４＋ヘルパーｔ細胞の産生方法Info
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- JPH04325087A JPH04325087A JP3276127A JP27612791A JPH04325087A JP H04325087 A JPH04325087 A JP H04325087A JP 3276127 A JP3276127 A JP 3276127A JP 27612791 A JP27612791 A JP 27612791A JP H04325087 A JPH04325087 A JP H04325087A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本願発明はＣＤ４＋リンパ球を増
加させそして濃厚化させる新規な方法、濃厚化されたＣ
Ｄ４＋リンパ球を含有する薬剤組成物、並びに濃厚化Ｃ
Ｄ４＋リンパ球を使用して哺乳動物の腫瘍を治療する方
法に関する。 【０００２】 【従来の技術】［クロスレファレンス］本願と同時に出
願された下記出願は参照として本願明細書に組み入れる
： カムエイチ． リュング（Ｋａｍ Ｈ． Ｌｅｕｎ
ｇ）、「Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル処理ヒト
末梢血液細胞からインターロイキン−２（ＩＬ−２）お
よびインターロイキン−４（ＩＬ−４）による付着リン
ホカイン活性化キラー細胞産生の増大化」；米国特許出
願第０７／６４８，６７６号。 【０００３】ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびリン
ホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞は腫瘍細胞に対す
る免疫監視に密接に係わっている［Ｂａｒｌｏｚｚａｎ
ｉ等（１９８３）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３１、
１０２４； Ｒａｙｎｅｒ等（１９８５）、Ｃａｎｃｅ
ｒ、５５： １３２７］。進行した癌患者への自己由来
ＬＡＫの全身投与が有益であることが報告されている［
Ｍｕｌｅ等（１９８６）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４
６： ６７６］。この方法は多数の細胞が各患者に必要
である点で面倒である。更に、ＬＡＫおよびインターロ
イキン−２（ＩＬ−２）を使用して癌患者を治療するこ
ともかなりの毒性を伴っている［Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等
（１９８７）、Ｎ． Ｅｎｇｌ．Ｊ． Ｍｅｄ． ３１
６： ８８９］。 【０００４】単球はＩＬ−２によるＬＡＫ活性の活性化
を妨害することが示されている［Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等
（１９８７）、Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３
１６： ８８９］。Ｌ−ロイシンメチルエステル（ＬＭ
Ｅ）およびＬ−フェニルアラニンメチルエステル（ＰＭ
Ｅ）はヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）から単球を除
去させることが示された［ＴｈｉｅｌｅおよびＬｉｐｓ
ｋｙ（１９８５）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３４：
７８６； Ｈｏｙｅｒ等（１９８６）、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．、４６： ２８３４］。しかし乍ら、ＬＭＥ
はＮＫ活性およびＮＫ細胞も激減させた［Ｔｈｉｅｌｅ
およびＬｉｐｓｋｙ（１９８５）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．、１３４： ７８６； Ｈｏｙｅｒ等（１９８６）
、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４６： ２８３４］。本発
明者はＰＭＥで単球を枯渇させるとＩＬ−２によってＬ
ＡＫ細胞を５×１０６個の細胞／ｍｌまたはそれ以上の
密度で産生できることを示した［Ｌｅｕｎｇ（１９８７
）、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６、Ａ
ｂｓｔｒａｃｔ ＃１７１８； Ｌｅｕｎｇ およびＲ
ｉｎｅｈａｒｔに発行された米国特許４，８４９，３２
９］。 【０００５】付着ＬＡＫ（Ａ−ＬＡＫ）細胞は２４時間
ＩＬ−２で活性化し、単球を枯渇させたＰＢＭＣのプラ
スチックへの付着によって産生されることが報告されて
いる［Ｍｅｌｄｅｒ等（１９８８）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ．、４８、３４６］。これらの細胞は非常に増殖性
で且つ細胞障害性（細胞障害活性）であり、そしてＬＡ
Ｋ細胞（Ｌｅｕ１９＋、ＬＡＫフェノタイプ）が濃厚化
されていてＣＤ４＋（Ｌｅｕ３＋）Ｔリンパ球が少ない
。 【０００６】以前の報告では、Ａ−ＬＡＫ細胞を産生さ
せるために、単球はナイロンウールカラムへの付着によ
ってまたは遠心分離によって除去された［Ｍｅｌｄｅｒ
等、（１９８８）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４８：３
４６］。単球を除去するこれらの方法は時間がかかり複
雑である。ＬＡＫ細胞前駆体にもナイロンウールカラム
に付着するものがある。それ故、本発明者は単球を枯渇
させる単一工程としてＰＭＥ（５ｍＭ）を使用した。本
発明者はＰＭＥ処理細胞からＡ−ＬＡＫを産生させるこ
とができた（係属中で、共同して譲渡された、１９８９
年 ７月２１日に出願された米国特許出願第０７／３８
４，１３４号）。低濃度（１から２．５ｍＭ）のＰＭＥ
を使用する単球の部分的枯渇は高濃度のＰＭＥを使用す
る単球の完全枯渇に比べてＡ−ＬＡＫ細胞の細胞数の増
加をより大きくすることができた。ここでいる、細胞数
の増加とは、細胞集団の拡大を意味する。 【０００７】ＩＬ−２はＮＫ細胞およびＴ細胞の有効な
刺激剤である。他方、ＩＬ−４は初めはＢ細胞増殖因子
として記載された［Ｈｏｗａｒｄ等（１９８２）、Ｊ．
Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１５５： ９１４］。ＩＬ−４
はＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞および単球に対して多数の
影響を有するリンホカインと考えられる［Ｗｉｄｍｅｒ
等（１９８７）、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１６６：
１４４７； Ｍｉｔｃｈｅｌｌ等（１９８９）、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４２： １５４８； Ｓｐｉｔ
ｓ等（１９８７）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３９：
１１４２；Ｎａｇｌｅｒ等、（１９８８）、Ｊ． Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．、１４１： ２３４９； ｔｅ Ｖｅｌ
ｄｅ等（１９８９）、Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ａｃｔｉ
ｏｎｓ、２６： １； Ｓｐｉｔｓ等（１９８８）、Ｊ
． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４１： ２９； Ｓｐｉｔｓ
等（１９８８）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４１：
２９； ＢｒｏｏｋｓおよびＲｅｅｓ（１９８８）、Ｃ
ｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７４： １６
２； Ｋａｗａｋａｍｉ等（１９８９）、Ｊ． Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．、１４２： ３４５２］。ＩＬ−４単独では
ＰＢＭＣからＬＡＫ活性を生じさせることはできないが
、特定のＣＴＬ生成を高めることができる。ＩＬ−４は
ＩＬ−２によるＬＡＫ誘導を阻止したが、ＩＬ−２によ
るＣＴＬ誘導を高めた［Ｓｐｉｔｓ等（１９８８）、Ｊ
． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４１： ２９； Ｂｒｏｏｋ
ｓおよびＲｅｅｓ（１９８８）、Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７４： １６２］。更に最近では
、ＩＬ−４がＩＬ−２活性化細胞の細胞増殖を高めるこ
とが報告された［Ｋａｗａｋａｍｉ等（１９８９）、Ｊ
． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４２： ３４５２］。 【０００８】ＣＤ４抗原に陽性であるＴリンパ球はＴヘ
ルパー／インデューサー細胞と名付けられている。これ
らのＣＤ４＋Ｔ細胞は免疫機能の免疫調節に重要である
。ＩＬ−２はＮＫ細胞およびＴ細胞の有効な刺激剤であ
る。ＩＬ−４はＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞および単球に
対して多数の効果を有するリンホカインと考えられる。 ＩＬ−４はマイトジェンに応答してＣＤ４＋およびＣＤ
８＋Ｔ細胞の両者が増殖するのを高める。それ故、Ｔ細
胞に与えるＩＬ−４の効果は特異的ではない。 【０００９】 【発明が解決しようとする課題】Ｌ−フェニルアラニン
メチルエステル（ＰＭＥ）は末梢血液単核細胞（ＰＢＭ
Ｃ）から単球を枯渇させる。これによってＩＬ−２によ
る高細胞密度ＬＡＫ細胞の活性化が可能になる。他方、
ＩＬ−４はＬＡＫ細胞の活性化には効果を有さないがＩ
Ｌ−２によるＬＡＫ細胞活性化を阻止する。Ａ−ＬＡＫ
細胞はＩＬ−２で２４時間活性化した単球枯渇ＰＢＭＣ
のプラスチックへの付着によって産生される。これらの
細胞は非常に増殖性で且つ細胞障害性であり，そしてＬ
ＡＫ細胞（Ｌｅｕ１９＋、ＬＡＫフェノタイプ）が濃厚
化されている。本願発明によれば、付着過程中にＩＬ−
４がＩＬ−２と共に存在するとき、Ａ−ＬＡＫ細胞の細
胞数の増加、すなわちＡ−ＬＡＫ細胞集団の拡大が抑制
される。その代わりに、ＣＤ４＋（Ｌｅｕ３＋）フェノ
タイプを有する付着Ｔ細胞の集団が拡大化されそして濃
厚化される。集団中の非ＣＤ４＋細胞は主としてＬｅｕ
１９＋ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞であり、これらも
また癌、エイズおよび免疫学的疾病の養子免疫療法に有
用である。本発明ではマイトジェン刺激および抗原刺激
は必要でない。 【００１０】 【課題を解決するための手段】本願発明は付着ＣＤ４＋
Ｔリンパ球が濃厚化された細胞集団を調製する方法を提
供する。この方法は、（ａ）薬剤でＰＢＭＣを処理して
単球を枯渇させ、（ｂ）残余細胞を、該細胞の１部が付
着している容器内でＩＬ−２およびＩＬ−４を含有する
培地中で５×１０６〜１×１０７個細胞／ｍｌで培養し
、（ｃ）非付着細胞を除去し、そして（ｄ）ＩＬ−２お
よびＩＬ−４を含有する培地中で付着細胞を培養してＣ
Ｄ４＋Ｔ細胞数を増加させる、ことからなる。 【００１１】本発明はまた、製薬的に許容される担体中
少なくとも約７０％〜８０％またはそれ以上のＣＤ４＋
Ｔ細胞を含有する組成物、およびこの濃厚化されたＣＤ
４＋細胞を使用して哺乳動物の腫瘍を治療する方法も特
徴とする。 【００１２】要約すると、ＩＬ−４と組み合わせたＩＬ
−２はＣＤ４＋フェノタイプが濃厚化されている付着細
胞の集団を拡大させるために使用することができる。反
対に、ＩＬ−２とＩＬ−４の組み合わせは非付着細胞集
団からはＣＤ４＋細胞集団を容易には拡大させない。 【００１３】末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）または末梢
血液リンパ球（ＰＢＬ）の懸濁液を約４から７％のＣＯ
２の存在下３５℃から３９℃、好ましくは３７℃で約２
〜２１日のインキュベーション期間中培養する。培養は
約１×１０６〜２×１０７、好ましくは５×１０６〜１
×１０７個の細胞／ｍｌの範囲の細胞濃度で約１５０〜
２０００ｐＭ、好ましくは１０００〜２０００ｐＭの濃
度のＩＬ−２を含有する培地中で実施する。培養は慣用
の容器、例えばＴ型フラスコで行うこともできるが、好
ましくは密閉された気体透過性滅菌バッグ、例えばステ
リセル（Ｓｔｅｒｉｃｅｌｌ）（商標）細胞培養バッグ
（デラウエア州ウィルミントンのＥ． Ｉ． Ｄｕ Ｐ
ｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ＆ Ｃｏ．）内で実施
することができる。上記条件下での培養によってリンホ
カイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、即ち天然キラー（
ＮＫ）細胞による溶解に抵抗性の腫瘍細胞を溶解し得る
細胞溶解細胞の集団が産生される。 【００１４】本発明によって調製されたＬＡＫ細胞はリ
ュングおよびラインハート（Ｒｉｎｅｈａｒｔ）に対し
て１９８９年２月３日に発行された米国特許４，８４９
，３２９（これは参照として本願明細書に組み入れる）
に記載された方法で養子免疫療法で使用される。 【００１５】好ましいＬ−アミノ酸はフェニルアラニン
またはチロシンであり、そして最も好ましいものはフェ
ニルアラニンである。エステルの低級アルキル基はメチ
ル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブ
チルまたはｔ−ブチルであるが、好ましくはメチルまた
はエチルであり、そして最も好ましくはメチルである。 製薬的に許容される好ましい塩は塩酸塩および臭化水素
酸塩である。 【００１６】ＬＡＫ細胞を調製する方法にＰＭＥおよび
他の低級アルキルアミノ酸エステルを使用することは米
国特許４，８４９，３２９に開示されている。更に、１
９８９年２月２１日に出願した米国特許出願第０７／３
１３，４２１号も参照として本願明細書に組み入れる。 【００１７】本発明者は以前に、Ａ−ＬＡＫ細胞を産生
させる方法で単球枯渇の単一工程として約１から５ｍＭ
の濃度のＰＭＥを使用した。この方法は１９８９年７月
２１日に出願され共同して譲渡された米国特許出願第０
７／３８４１３４号（これは参照として本願明細書に組
み入れる）に開示されている。ＰＭＥ処理ＰＢＭＣから
Ａ−ＬＡＫを産生させることが可能でありそしてＡ−Ｌ
ＡＫ細胞をプラスチック容器内で培養する前にＰＢＭＣ
をＰＭＥで処理すると、ＰＭＥ処理をしないで得られた
細胞数の増加に比べて、Ａ−ＬＡＫ細胞数の増加値がか
なり上昇することが見いだされた。ＰＭＥで処理した後
、Ａ−ＬＡＫ細胞数の増加中においてはＬＡＫ細胞の機
能的な細胞溶解活性は高いまま維持される。 【００１８】 【発明の効果】本願発明はＣＤ４＋リンパ球の増加およ
び濃厚化の新規方法に係わるものである。ＰＢＭＣは先
ずＰＭＥで処理して単球および他のＰＭＥ感受性細胞を
枯渇させる。 得られたリンパ球はプラスチックフラスコ内でＩＬ−２
およびＩＬ−４と共に１乃至２日間インキュベートする
。次いで、付着細胞をＩＬ−２およびＩＬ−４と共に８
乃至２１日間培養すると細胞数の増加が得られる。調製
方法中に使用した細胞密度は、単球枯渇段階を含めて、
好ましくは約５×１０６〜２×１０７個の細胞／ｍｌ、
更に好ましくは約１×１０７個の細胞／ｍｌである。付
着細胞は約４〜７％のＣＯ２の存在下で３５℃〜３９℃
、好ましくは３７℃で培養する。培地は約１５０〜１５
００ｐＭ、好ましくは１０００〜２０００ｐＭの濃度の
ＩＬ−２および約１０〜１０００ Ｕ／ｍｌの濃度のＩ
Ｌ−４を含有する。 培養はＴフラスコのような慣用の容器内で実施すること
ができる。これらの条件下で培養すると、免疫応答を調
節することができる細胞集団のＣＤ４＋Ｔ細胞が濃厚化
された細胞集団が産生する。 【００１９】以下の実施例では、標的腫瘍細胞に対する
ＬＡＫ細胞の細胞障害活性を測定するために３時間の５
１Ｃｒ放出アッセイを使用した。約２×１０６〜１０×
１０６の濃度の標的腫瘍細胞は０．４ｍｌのトリス−リ
ン酸緩衝生理食塩液中５０μＣｉのＮａ２５１ＣｒＯ４
と共に３７℃で１時間インキュベートした。細胞は１０
％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ １６
４０で４回洗浄し、そしてＲＰＭＩ １０％ＦＣＳ中で
１０５個の細胞／ｍｌに再懸濁した。エフェクター細胞
（ＬＡＫ細胞）は種々の濃度に懸濁し、そして０．１ｍ
ｌを丸底微量滴定プレート内のウエルに加えた。５１Ｃ
ｒで標識した標的細胞（０．１ｍｌ）を全てのウエルに
加え、プレートは２００×ｇで５分間遠心分離した。３
７℃でのインキュベーション４時間後に、プレートを再
び遠心分離し、そして得られた上清液０．１ｍｌを各ウ
エルから取り出してガンマカウンターで計数した。細胞
障害活性％は次式から計算した： 細胞障害活性（％）＝｛（実験ｃｐｍ−自然発生ｃｐｍ
）／（総ｃｐｍ−自然発生ｃｐｍ）｝×１００各変数は
３回重複して試験し、得られたデータを細胞障害活性ま
たは溶解パーセント％として示した。この細胞障害活性
試験はセレクテッド メソッズ インセルラー イムノ
ロジー（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｃｅ
ｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、ミッシェル（
Ｍｉｓｈｅｌｌ）およびシ−ギ（Ｓｈｉｉｇｉ）編、１
２４〜１３７、サンフランシスコのダブリュ．エム．フ
リーマン アンド コ．（Ｗ． Ｍ． Ｆｒｅｅｍａｎ
ａｎｄ Ｃｏ．）（１９８０）に更に詳細に記載され
ている。 【００２０】細胞表面マーカー分析用に、冷却した染色
緩衝溶液（ＰＢＳ、１５％のＢＳＡおよび０．１％のア
ジ化ナトリウム）０．１ｍｌ中２×１０５個の細胞を９
６ウエルの丸底プレートに入れた。種々の蛍光標識抗体
を４℃で３０分間上記細胞に加えた。細胞は２回洗浄し
、フローサイトメーター（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅ
ｒ）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォル
ニア州マウンテンビュー）で蛍光を分析する前に１％の
パラホルムアルデヒドに再懸濁した。表１はこの試験で
使用した抗体の反応性／特異性を要約して示す。 【００２１】 【表１】 この試験のモノクローナル抗体（ｍＡ
ｂ）で同定される分化抗原 ＣＤクラスター
ｍＡｂ 細胞の反応性／特異性 ＣＤ
３ Ｌｅｕ４
Ｔ細胞 ＣＤ４ Ｌｅ
ｕ３ ヘルパー／インデューサーＴ細胞サブセ
ット ＣＤ８ Ｌｅｕ
２ サプレッサー／細胞障害性Ｔ細胞 ＣＤ
５６ Ｌｅｕ１９
ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞 【００２２】 【実施例】 《実施例１》［Ａ−ＬＡＫ細胞産生に与えるＩＬ−４の
影響］ＰＢＭＣは５ｍＭのＰＭＥで処理して単球を枯渇
させ、そして１０ Ｕ／ｍｌのＩＬ−２またはＩＬ−２
およびＩＬ−４と共にプラスチックフラスコ内で２０時
間５×１０６個の細胞／ｍｌで培養した。非付着（ＮＡ
）細胞は除去し、そしてフラスコに付着した細胞はＩＬ
−２またはＩＬ−２およびＩＬ−４を含有する培地を用
いて培養した。ＩＬ−４（Ｇｅｎｚｙｍｅ、マサチュー
セッツ州ボストン）を、ＩＬ−２だけを有する培地中で
産生した付着細胞に加えた。ＮＡ細胞を同様にして培養
した。表２に示されるようにＩＬ−２だけを用いて１４
日間培養したとき、Ａ−ＬＡＫ細胞は１２３倍増加した
。 【００２３】 【表２】 Ａ−ＬＡＫ細胞数の増加、細胞障害活性及びフェ
ノタイプに与えるＩＬ−４の影響
ＩＬ−４ 増加
溶解 Ｌｅｕ ２ Ｌｅｕ
３ Ｌｅｕ ４ Ｌｅｕ １９ （ｍｌ
） 倍率 （％） （％
） （％） （％）
（％） 付着後 ０ １２３ ８０
５８ ４
８ ９９ １０
１４６ ７８ ５７
３ ５
９９ ５０ ４１２
７６ ５７ ２
７ ９９ ２００
５４７ ８２
５０ ２ ４
９９ 付着中 ０ １２３ ８０
５８ ４
８ ９９ １０
４６ ６９ ４９
２１ ２７
７６ ５０ ４０
５６ ３５ ６５
７７ ２７ ２００
３０ ４３
３０ ７７ ８８
１７
【００２４】ＰＢＭＣは５ｍＭのＰＭＥで処理して単球
を枯渇させ、そして１０ Ｕ／ｍｌのＩＬ−２またはＩ
Ｌ−２およびＩＬ−４と共に５×１０６個の細胞／ｍｌ
でプラスチックフラスコ内で２０時間培養した。非付着
細胞を除きフラスコに付着した細胞はＩＬ−２またはＩ
Ｌ−２およびＩＬ−４を含有する培地で培養した。ＩＬ
−４を、ＩＬ−２だけを有する培地中で産生させた付着
細胞に加えた。示したデータは１４日間培養したときの
ものであった。示した細胞障害活性は３時間アッセイに
おける５１Ｃｒで標識したラジ（Ｒａｊｉ）標的細胞に
対し５：１のＥ：Ｔ比のものであった。 【００２５】細胞が付着した後にＩＬ−４を加えるとＩ
Ｌ−２単独より４倍多い細胞数の増加が得られた。他方
、ＩＬ−４が付着段階で存在すると、依然として３０倍
〜４６倍の細胞数の増加はあったけれども、細胞数の増
加はＩＬ−４によって抑制された。 【００２６】ＩＬ−２で産生したＡ−ＬＡＫ細胞は３時
間の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて５：１のエフェクタ
ー対標的比で８０％のラジ標的細胞の特異的溶解を有し
ていた。ＩＬ−４は付着段階後に加えられると、ＬＡＫ
活性に対し阻止効果を有していなかった。しかし乍ら、
ＩＬ−４が付着段階中に存在すると、表２に示されるよ
うにＩＬ−２で誘導されるＬＡＫ活性を阻止した。 【００２７】ＩＬ−２およびＩＬ−４を含有する培地中
で増殖させた細胞の表現型発現によってＩＬ−４が表２
に示されるようにＬｅｕ１９＋細胞のパーセントを９８
％から１８％に阻止したことが明らかにされた。同時に
、Ｌｅｕ３およびＬｅｕ４細胞はＩＬ−４不存在下、即
ちＩＬ−２単独での約１０％から７５〜８５％に増加し
た。それ故、ＩＬ−４が本方法の付着段階中に存在する
と、ＩＬ−２で誘導されるＬｅｕ１９＋細胞の活性化お
よび増殖が優先的に阻止された。Ｌｅｕ１９＋細胞はＬ
ｅｕ３＋細胞の増殖にマイナスの効果を有しており、そ
の結果ＩＬ−４によってＬｅｕ１９＋細胞が阻止される
とＬｅｕ３＋細胞がＩＬ−２および／またはＩＬ−４に
応答して増殖できたとも考えられる。付着段階後にＩＬ
−４を添加すると、表２に示されるようにＬｅｕ１９＋
細胞パーセントに対する阻止効果は有さなかった。 【００２８】要約すると、ＩＬ−４が本方法の付着段階
中に存在するとき、ＩＬ−４はＡ−ＬＡＫ産生を阻止し
、ＣＤ４（Ｌｅｕ４＋）が濃厚化した細胞集団を増加さ
せた。他方、ＩＬ−４がＡ−ＬＡＫ産生法の付着段階後
に存在するとき、ＩＬ−４はＡ−ＬＡＫ細胞の細胞数の
増加および細胞障害活性を高めた。 【００２９】《実施例２》Ａ−ＬＡＫ細胞は上記のよう
にしてＩＬ−４の存在下で産生させた。８日目に、対照
のＡ−ＬＡＫ細胞は９５％がＬｅｕ１９＋であり、一方
ＩＬ−４の存在下で産生させた細胞は（表３）に示され
るように僅か６５％しか陽性でなかった。１５日目に、
ＩＬ−４培養細胞はＬｅｕ１９に僅か１７％しか陽性で
なく、ＣＤ４に対しては７７％が陽性であった。２１日
目に、ＣＤ４陽性細胞のパーセントは７５％のままであ
った。要約すると、ＣＤ４＋が濃厚化した細胞集団は培
養８日後に産生され、最適拡大およびＣＤ４＋細胞の濃
厚化には約２週間を要した。 【００３０】 【表３】 付着ＣＤ４＋細胞およびＡ−ＬＡＫ細胞の産生
に与える付着段階中のＩＬ−４の影響
溶解％
総細胞 Ｌｅｕ３％
Ｌｅｕ１９％ Ｅ：Ｔ比
（×１０６）
（ＣＤ４） （ＣＤ５６） ２．５：１
１．２５：１ ０日 対照
１．９ ＩＬ−４ １．８
８日 対照 ４２
８ ９５
８５ ７５ ＩＬ−４
１０．８ ３４
６５ ２９
１５ １５日 対照 ２５２
４ ９８
７０ ３８ ＩＬ
−４ １５０ ７７
１７ ２９
１６ ２１日 対照 ６３５
３ ９８
５８ ３８
ＩＬ−４ ２４０ ７５
１４ １８
８
【００３１】付着細胞は１０ Ｕ／ｍｌのＩＬ−２、ま
たは１０ Ｕ／ｍｌのＩＬ−２プラス２００ Ｕ／ｍｌ
のＩＬ−４の存在下で１日間５×１０５個の細胞／ｍｌ
のＰＭＥ処理ＰＢＭＣから産生させた。次いで、この付
着細胞をＩＬ−２単独またはＩＬ−２およびＩＬ−４と
共に種々の期間培養した。 【００３２】《実施例３》表４に示されるように、ＩＬ
−２活性化後でＡ−ＬＡＫ集団の付着後にＩＬ−４を添
加したとき、非付着ＬＡＫ（ＮＡ−ＬＡＫ）細胞数の増
加はＩＬ−４によって幾らか高められた。本方法は、Ｎ
Ａ−ＬＡＫ細胞を使用した以外は実施例１と実質的に同
一であった。ＬＡＫ活性はＩＬ−２だけを使用したとき
と比較して同一のままであった。しかし乍ら、ＩＬ−４
がＩＬ−２と同時に（Ａ−ＬＡＫ細胞の付着段階中に）
存在したとき、ＬＡＫ活性は表４に示されるように阻止
された。 【００３３】 【表４】 ＮＡ−ＬＡＫ細胞集団の拡大、細胞障害活性及び
フェノタイプに与えるＩＬ−４の影響
ＩＬ−４
増加 溶解 Ｌｅｕ２
Ｌｅｕ３ Ｌｅｕ４ Ｌｅｕ１
９ （ｍｌ） 倍率
（％） （％） （％）
（％） （％） 付着後 ０ ２．８
７３ ５８ ２３
３２ ７２ １０
４．２ ７８
５４ １８ ２９
７６ ５０
５．２ ７１ ４９
１８ ２５ ７８
２００ ５．２
６８ ５６ １７
２４ ８２ 付着中
０ ２．
８ ７３ ５８
２３ ３２ ７２
１０ ２．３ ６４
６２ ２２
３４ ７０ ５０
２．１ ５４ ５９
３２ ４６
５６ ２００ ２．０
５６ ５３ ３４
４７ ５５
【００３４】細胞集団の拡大は、ＩＬ−４が付着段階中
に存在したとき、ＩＬ−２単独ではＩＬ−２プラスＩＬ
−４と比べてほぼ同じであった。細胞の表面マーカーの
分析によって、表４に示されるようにＩＬ−４がＩＬ−
２活性化中に存在したとき、ＣＤ４＋細胞は僅かしか増
加しないことが示された。それ故、ＬＡＫ増加またはＣ
Ｄ４＋増加に与えるＩＬ−４の影響はＮＡ−ＬＡＫ細胞
培養物でも観察できたけれども、細胞増殖の増加は付着
細胞（Ａ−ＬＡＫ）培養物に比べてかなり低下した。
加させそして濃厚化させる新規な方法、濃厚化されたＣ
Ｄ４＋リンパ球を含有する薬剤組成物、並びに濃厚化Ｃ
Ｄ４＋リンパ球を使用して哺乳動物の腫瘍を治療する方
法に関する。 【０００２】 【従来の技術】［クロスレファレンス］本願と同時に出
願された下記出願は参照として本願明細書に組み入れる
： カムエイチ． リュング（Ｋａｍ Ｈ． Ｌｅｕｎ
ｇ）、「Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル処理ヒト
末梢血液細胞からインターロイキン−２（ＩＬ−２）お
よびインターロイキン−４（ＩＬ−４）による付着リン
ホカイン活性化キラー細胞産生の増大化」；米国特許出
願第０７／６４８，６７６号。 【０００３】ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびリン
ホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞は腫瘍細胞に対す
る免疫監視に密接に係わっている［Ｂａｒｌｏｚｚａｎ
ｉ等（１９８３）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３１、
１０２４； Ｒａｙｎｅｒ等（１９８５）、Ｃａｎｃｅ
ｒ、５５： １３２７］。進行した癌患者への自己由来
ＬＡＫの全身投与が有益であることが報告されている［
Ｍｕｌｅ等（１９８６）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４
６： ６７６］。この方法は多数の細胞が各患者に必要
である点で面倒である。更に、ＬＡＫおよびインターロ
イキン−２（ＩＬ−２）を使用して癌患者を治療するこ
ともかなりの毒性を伴っている［Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等
（１９８７）、Ｎ． Ｅｎｇｌ．Ｊ． Ｍｅｄ． ３１
６： ８８９］。 【０００４】単球はＩＬ−２によるＬＡＫ活性の活性化
を妨害することが示されている［Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等
（１９８７）、Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３
１６： ８８９］。Ｌ−ロイシンメチルエステル（ＬＭ
Ｅ）およびＬ−フェニルアラニンメチルエステル（ＰＭ
Ｅ）はヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）から単球を除
去させることが示された［ＴｈｉｅｌｅおよびＬｉｐｓ
ｋｙ（１９８５）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３４：
７８６； Ｈｏｙｅｒ等（１９８６）、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．、４６： ２８３４］。しかし乍ら、ＬＭＥ
はＮＫ活性およびＮＫ細胞も激減させた［Ｔｈｉｅｌｅ
およびＬｉｐｓｋｙ（１９８５）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．、１３４： ７８６； Ｈｏｙｅｒ等（１９８６）
、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４６： ２８３４］。本発
明者はＰＭＥで単球を枯渇させるとＩＬ−２によってＬ
ＡＫ細胞を５×１０６個の細胞／ｍｌまたはそれ以上の
密度で産生できることを示した［Ｌｅｕｎｇ（１９８７
）、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６、Ａ
ｂｓｔｒａｃｔ ＃１７１８； Ｌｅｕｎｇ およびＲ
ｉｎｅｈａｒｔに発行された米国特許４，８４９，３２
９］。 【０００５】付着ＬＡＫ（Ａ−ＬＡＫ）細胞は２４時間
ＩＬ−２で活性化し、単球を枯渇させたＰＢＭＣのプラ
スチックへの付着によって産生されることが報告されて
いる［Ｍｅｌｄｅｒ等（１９８８）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ．、４８、３４６］。これらの細胞は非常に増殖性
で且つ細胞障害性（細胞障害活性）であり、そしてＬＡ
Ｋ細胞（Ｌｅｕ１９＋、ＬＡＫフェノタイプ）が濃厚化
されていてＣＤ４＋（Ｌｅｕ３＋）Ｔリンパ球が少ない
。 【０００６】以前の報告では、Ａ−ＬＡＫ細胞を産生さ
せるために、単球はナイロンウールカラムへの付着によ
ってまたは遠心分離によって除去された［Ｍｅｌｄｅｒ
等、（１９８８）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４８：３
４６］。単球を除去するこれらの方法は時間がかかり複
雑である。ＬＡＫ細胞前駆体にもナイロンウールカラム
に付着するものがある。それ故、本発明者は単球を枯渇
させる単一工程としてＰＭＥ（５ｍＭ）を使用した。本
発明者はＰＭＥ処理細胞からＡ−ＬＡＫを産生させるこ
とができた（係属中で、共同して譲渡された、１９８９
年 ７月２１日に出願された米国特許出願第０７／３８
４，１３４号）。低濃度（１から２．５ｍＭ）のＰＭＥ
を使用する単球の部分的枯渇は高濃度のＰＭＥを使用す
る単球の完全枯渇に比べてＡ−ＬＡＫ細胞の細胞数の増
加をより大きくすることができた。ここでいる、細胞数
の増加とは、細胞集団の拡大を意味する。 【０００７】ＩＬ−２はＮＫ細胞およびＴ細胞の有効な
刺激剤である。他方、ＩＬ−４は初めはＢ細胞増殖因子
として記載された［Ｈｏｗａｒｄ等（１９８２）、Ｊ．
Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１５５： ９１４］。ＩＬ−４
はＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞および単球に対して多数の
影響を有するリンホカインと考えられる［Ｗｉｄｍｅｒ
等（１９８７）、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１６６：
１４４７； Ｍｉｔｃｈｅｌｌ等（１９８９）、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４２： １５４８； Ｓｐｉｔ
ｓ等（１９８７）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３９：
１１４２；Ｎａｇｌｅｒ等、（１９８８）、Ｊ． Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．、１４１： ２３４９； ｔｅ Ｖｅｌ
ｄｅ等（１９８９）、Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ａｃｔｉ
ｏｎｓ、２６： １； Ｓｐｉｔｓ等（１９８８）、Ｊ
． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４１： ２９； Ｓｐｉｔｓ
等（１９８８）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４１：
２９； ＢｒｏｏｋｓおよびＲｅｅｓ（１９８８）、Ｃ
ｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７４： １６
２； Ｋａｗａｋａｍｉ等（１９８９）、Ｊ． Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．、１４２： ３４５２］。ＩＬ−４単独では
ＰＢＭＣからＬＡＫ活性を生じさせることはできないが
、特定のＣＴＬ生成を高めることができる。ＩＬ−４は
ＩＬ−２によるＬＡＫ誘導を阻止したが、ＩＬ−２によ
るＣＴＬ誘導を高めた［Ｓｐｉｔｓ等（１９８８）、Ｊ
． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４１： ２９； Ｂｒｏｏｋ
ｓおよびＲｅｅｓ（１９８８）、Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７４： １６２］。更に最近では
、ＩＬ−４がＩＬ−２活性化細胞の細胞増殖を高めるこ
とが報告された［Ｋａｗａｋａｍｉ等（１９８９）、Ｊ
． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４２： ３４５２］。 【０００８】ＣＤ４抗原に陽性であるＴリンパ球はＴヘ
ルパー／インデューサー細胞と名付けられている。これ
らのＣＤ４＋Ｔ細胞は免疫機能の免疫調節に重要である
。ＩＬ−２はＮＫ細胞およびＴ細胞の有効な刺激剤であ
る。ＩＬ−４はＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞および単球に
対して多数の効果を有するリンホカインと考えられる。 ＩＬ−４はマイトジェンに応答してＣＤ４＋およびＣＤ
８＋Ｔ細胞の両者が増殖するのを高める。それ故、Ｔ細
胞に与えるＩＬ−４の効果は特異的ではない。 【０００９】 【発明が解決しようとする課題】Ｌ−フェニルアラニン
メチルエステル（ＰＭＥ）は末梢血液単核細胞（ＰＢＭ
Ｃ）から単球を枯渇させる。これによってＩＬ−２によ
る高細胞密度ＬＡＫ細胞の活性化が可能になる。他方、
ＩＬ−４はＬＡＫ細胞の活性化には効果を有さないがＩ
Ｌ−２によるＬＡＫ細胞活性化を阻止する。Ａ−ＬＡＫ
細胞はＩＬ−２で２４時間活性化した単球枯渇ＰＢＭＣ
のプラスチックへの付着によって産生される。これらの
細胞は非常に増殖性で且つ細胞障害性であり，そしてＬ
ＡＫ細胞（Ｌｅｕ１９＋、ＬＡＫフェノタイプ）が濃厚
化されている。本願発明によれば、付着過程中にＩＬ−
４がＩＬ−２と共に存在するとき、Ａ−ＬＡＫ細胞の細
胞数の増加、すなわちＡ−ＬＡＫ細胞集団の拡大が抑制
される。その代わりに、ＣＤ４＋（Ｌｅｕ３＋）フェノ
タイプを有する付着Ｔ細胞の集団が拡大化されそして濃
厚化される。集団中の非ＣＤ４＋細胞は主としてＬｅｕ
１９＋ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞であり、これらも
また癌、エイズおよび免疫学的疾病の養子免疫療法に有
用である。本発明ではマイトジェン刺激および抗原刺激
は必要でない。 【００１０】 【課題を解決するための手段】本願発明は付着ＣＤ４＋
Ｔリンパ球が濃厚化された細胞集団を調製する方法を提
供する。この方法は、（ａ）薬剤でＰＢＭＣを処理して
単球を枯渇させ、（ｂ）残余細胞を、該細胞の１部が付
着している容器内でＩＬ−２およびＩＬ−４を含有する
培地中で５×１０６〜１×１０７個細胞／ｍｌで培養し
、（ｃ）非付着細胞を除去し、そして（ｄ）ＩＬ−２お
よびＩＬ−４を含有する培地中で付着細胞を培養してＣ
Ｄ４＋Ｔ細胞数を増加させる、ことからなる。 【００１１】本発明はまた、製薬的に許容される担体中
少なくとも約７０％〜８０％またはそれ以上のＣＤ４＋
Ｔ細胞を含有する組成物、およびこの濃厚化されたＣＤ
４＋細胞を使用して哺乳動物の腫瘍を治療する方法も特
徴とする。 【００１２】要約すると、ＩＬ−４と組み合わせたＩＬ
−２はＣＤ４＋フェノタイプが濃厚化されている付着細
胞の集団を拡大させるために使用することができる。反
対に、ＩＬ−２とＩＬ−４の組み合わせは非付着細胞集
団からはＣＤ４＋細胞集団を容易には拡大させない。 【００１３】末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）または末梢
血液リンパ球（ＰＢＬ）の懸濁液を約４から７％のＣＯ
２の存在下３５℃から３９℃、好ましくは３７℃で約２
〜２１日のインキュベーション期間中培養する。培養は
約１×１０６〜２×１０７、好ましくは５×１０６〜１
×１０７個の細胞／ｍｌの範囲の細胞濃度で約１５０〜
２０００ｐＭ、好ましくは１０００〜２０００ｐＭの濃
度のＩＬ−２を含有する培地中で実施する。培養は慣用
の容器、例えばＴ型フラスコで行うこともできるが、好
ましくは密閉された気体透過性滅菌バッグ、例えばステ
リセル（Ｓｔｅｒｉｃｅｌｌ）（商標）細胞培養バッグ
（デラウエア州ウィルミントンのＥ． Ｉ． Ｄｕ Ｐ
ｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ＆ Ｃｏ．）内で実施
することができる。上記条件下での培養によってリンホ
カイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、即ち天然キラー（
ＮＫ）細胞による溶解に抵抗性の腫瘍細胞を溶解し得る
細胞溶解細胞の集団が産生される。 【００１４】本発明によって調製されたＬＡＫ細胞はリ
ュングおよびラインハート（Ｒｉｎｅｈａｒｔ）に対し
て１９８９年２月３日に発行された米国特許４，８４９
，３２９（これは参照として本願明細書に組み入れる）
に記載された方法で養子免疫療法で使用される。 【００１５】好ましいＬ−アミノ酸はフェニルアラニン
またはチロシンであり、そして最も好ましいものはフェ
ニルアラニンである。エステルの低級アルキル基はメチ
ル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブ
チルまたはｔ−ブチルであるが、好ましくはメチルまた
はエチルであり、そして最も好ましくはメチルである。 製薬的に許容される好ましい塩は塩酸塩および臭化水素
酸塩である。 【００１６】ＬＡＫ細胞を調製する方法にＰＭＥおよび
他の低級アルキルアミノ酸エステルを使用することは米
国特許４，８４９，３２９に開示されている。更に、１
９８９年２月２１日に出願した米国特許出願第０７／３
１３，４２１号も参照として本願明細書に組み入れる。 【００１７】本発明者は以前に、Ａ−ＬＡＫ細胞を産生
させる方法で単球枯渇の単一工程として約１から５ｍＭ
の濃度のＰＭＥを使用した。この方法は１９８９年７月
２１日に出願され共同して譲渡された米国特許出願第０
７／３８４１３４号（これは参照として本願明細書に組
み入れる）に開示されている。ＰＭＥ処理ＰＢＭＣから
Ａ−ＬＡＫを産生させることが可能でありそしてＡ−Ｌ
ＡＫ細胞をプラスチック容器内で培養する前にＰＢＭＣ
をＰＭＥで処理すると、ＰＭＥ処理をしないで得られた
細胞数の増加に比べて、Ａ−ＬＡＫ細胞数の増加値がか
なり上昇することが見いだされた。ＰＭＥで処理した後
、Ａ−ＬＡＫ細胞数の増加中においてはＬＡＫ細胞の機
能的な細胞溶解活性は高いまま維持される。 【００１８】 【発明の効果】本願発明はＣＤ４＋リンパ球の増加およ
び濃厚化の新規方法に係わるものである。ＰＢＭＣは先
ずＰＭＥで処理して単球および他のＰＭＥ感受性細胞を
枯渇させる。 得られたリンパ球はプラスチックフラスコ内でＩＬ−２
およびＩＬ−４と共に１乃至２日間インキュベートする
。次いで、付着細胞をＩＬ−２およびＩＬ−４と共に８
乃至２１日間培養すると細胞数の増加が得られる。調製
方法中に使用した細胞密度は、単球枯渇段階を含めて、
好ましくは約５×１０６〜２×１０７個の細胞／ｍｌ、
更に好ましくは約１×１０７個の細胞／ｍｌである。付
着細胞は約４〜７％のＣＯ２の存在下で３５℃〜３９℃
、好ましくは３７℃で培養する。培地は約１５０〜１５
００ｐＭ、好ましくは１０００〜２０００ｐＭの濃度の
ＩＬ−２および約１０〜１０００ Ｕ／ｍｌの濃度のＩ
Ｌ−４を含有する。 培養はＴフラスコのような慣用の容器内で実施すること
ができる。これらの条件下で培養すると、免疫応答を調
節することができる細胞集団のＣＤ４＋Ｔ細胞が濃厚化
された細胞集団が産生する。 【００１９】以下の実施例では、標的腫瘍細胞に対する
ＬＡＫ細胞の細胞障害活性を測定するために３時間の５
１Ｃｒ放出アッセイを使用した。約２×１０６〜１０×
１０６の濃度の標的腫瘍細胞は０．４ｍｌのトリス−リ
ン酸緩衝生理食塩液中５０μＣｉのＮａ２５１ＣｒＯ４
と共に３７℃で１時間インキュベートした。細胞は１０
％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ １６
４０で４回洗浄し、そしてＲＰＭＩ １０％ＦＣＳ中で
１０５個の細胞／ｍｌに再懸濁した。エフェクター細胞
（ＬＡＫ細胞）は種々の濃度に懸濁し、そして０．１ｍ
ｌを丸底微量滴定プレート内のウエルに加えた。５１Ｃ
ｒで標識した標的細胞（０．１ｍｌ）を全てのウエルに
加え、プレートは２００×ｇで５分間遠心分離した。３
７℃でのインキュベーション４時間後に、プレートを再
び遠心分離し、そして得られた上清液０．１ｍｌを各ウ
エルから取り出してガンマカウンターで計数した。細胞
障害活性％は次式から計算した： 細胞障害活性（％）＝｛（実験ｃｐｍ−自然発生ｃｐｍ
）／（総ｃｐｍ−自然発生ｃｐｍ）｝×１００各変数は
３回重複して試験し、得られたデータを細胞障害活性ま
たは溶解パーセント％として示した。この細胞障害活性
試験はセレクテッド メソッズ インセルラー イムノ
ロジー（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｃｅ
ｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、ミッシェル（
Ｍｉｓｈｅｌｌ）およびシ−ギ（Ｓｈｉｉｇｉ）編、１
２４〜１３７、サンフランシスコのダブリュ．エム．フ
リーマン アンド コ．（Ｗ． Ｍ． Ｆｒｅｅｍａｎ
ａｎｄ Ｃｏ．）（１９８０）に更に詳細に記載され
ている。 【００２０】細胞表面マーカー分析用に、冷却した染色
緩衝溶液（ＰＢＳ、１５％のＢＳＡおよび０．１％のア
ジ化ナトリウム）０．１ｍｌ中２×１０５個の細胞を９
６ウエルの丸底プレートに入れた。種々の蛍光標識抗体
を４℃で３０分間上記細胞に加えた。細胞は２回洗浄し
、フローサイトメーター（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅ
ｒ）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォル
ニア州マウンテンビュー）で蛍光を分析する前に１％の
パラホルムアルデヒドに再懸濁した。表１はこの試験で
使用した抗体の反応性／特異性を要約して示す。 【００２１】 【表１】 この試験のモノクローナル抗体（ｍＡ
ｂ）で同定される分化抗原 ＣＤクラスター
ｍＡｂ 細胞の反応性／特異性 ＣＤ
３ Ｌｅｕ４
Ｔ細胞 ＣＤ４ Ｌｅ
ｕ３ ヘルパー／インデューサーＴ細胞サブセ
ット ＣＤ８ Ｌｅｕ
２ サプレッサー／細胞障害性Ｔ細胞 ＣＤ
５６ Ｌｅｕ１９
ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞 【００２２】 【実施例】 《実施例１》［Ａ−ＬＡＫ細胞産生に与えるＩＬ−４の
影響］ＰＢＭＣは５ｍＭのＰＭＥで処理して単球を枯渇
させ、そして１０ Ｕ／ｍｌのＩＬ−２またはＩＬ−２
およびＩＬ−４と共にプラスチックフラスコ内で２０時
間５×１０６個の細胞／ｍｌで培養した。非付着（ＮＡ
）細胞は除去し、そしてフラスコに付着した細胞はＩＬ
−２またはＩＬ−２およびＩＬ−４を含有する培地を用
いて培養した。ＩＬ−４（Ｇｅｎｚｙｍｅ、マサチュー
セッツ州ボストン）を、ＩＬ−２だけを有する培地中で
産生した付着細胞に加えた。ＮＡ細胞を同様にして培養
した。表２に示されるようにＩＬ−２だけを用いて１４
日間培養したとき、Ａ−ＬＡＫ細胞は１２３倍増加した
。 【００２３】 【表２】 Ａ−ＬＡＫ細胞数の増加、細胞障害活性及びフェ
ノタイプに与えるＩＬ−４の影響
ＩＬ−４ 増加
溶解 Ｌｅｕ ２ Ｌｅｕ
３ Ｌｅｕ ４ Ｌｅｕ １９ （ｍｌ
） 倍率 （％） （％
） （％） （％）
（％） 付着後 ０ １２３ ８０
５８ ４
８ ９９ １０
１４６ ７８ ５７
３ ５
９９ ５０ ４１２
７６ ５７ ２
７ ９９ ２００
５４７ ８２
５０ ２ ４
９９ 付着中 ０ １２３ ８０
５８ ４
８ ９９ １０
４６ ６９ ４９
２１ ２７
７６ ５０ ４０
５６ ３５ ６５
７７ ２７ ２００
３０ ４３
３０ ７７ ８８
１７
【００２４】ＰＢＭＣは５ｍＭのＰＭＥで処理して単球
を枯渇させ、そして１０ Ｕ／ｍｌのＩＬ−２またはＩ
Ｌ−２およびＩＬ−４と共に５×１０６個の細胞／ｍｌ
でプラスチックフラスコ内で２０時間培養した。非付着
細胞を除きフラスコに付着した細胞はＩＬ−２またはＩ
Ｌ−２およびＩＬ−４を含有する培地で培養した。ＩＬ
−４を、ＩＬ−２だけを有する培地中で産生させた付着
細胞に加えた。示したデータは１４日間培養したときの
ものであった。示した細胞障害活性は３時間アッセイに
おける５１Ｃｒで標識したラジ（Ｒａｊｉ）標的細胞に
対し５：１のＥ：Ｔ比のものであった。 【００２５】細胞が付着した後にＩＬ−４を加えるとＩ
Ｌ−２単独より４倍多い細胞数の増加が得られた。他方
、ＩＬ−４が付着段階で存在すると、依然として３０倍
〜４６倍の細胞数の増加はあったけれども、細胞数の増
加はＩＬ−４によって抑制された。 【００２６】ＩＬ−２で産生したＡ−ＬＡＫ細胞は３時
間の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて５：１のエフェクタ
ー対標的比で８０％のラジ標的細胞の特異的溶解を有し
ていた。ＩＬ−４は付着段階後に加えられると、ＬＡＫ
活性に対し阻止効果を有していなかった。しかし乍ら、
ＩＬ−４が付着段階中に存在すると、表２に示されるよ
うにＩＬ−２で誘導されるＬＡＫ活性を阻止した。 【００２７】ＩＬ−２およびＩＬ−４を含有する培地中
で増殖させた細胞の表現型発現によってＩＬ−４が表２
に示されるようにＬｅｕ１９＋細胞のパーセントを９８
％から１８％に阻止したことが明らかにされた。同時に
、Ｌｅｕ３およびＬｅｕ４細胞はＩＬ−４不存在下、即
ちＩＬ−２単独での約１０％から７５〜８５％に増加し
た。それ故、ＩＬ−４が本方法の付着段階中に存在する
と、ＩＬ−２で誘導されるＬｅｕ１９＋細胞の活性化お
よび増殖が優先的に阻止された。Ｌｅｕ１９＋細胞はＬ
ｅｕ３＋細胞の増殖にマイナスの効果を有しており、そ
の結果ＩＬ−４によってＬｅｕ１９＋細胞が阻止される
とＬｅｕ３＋細胞がＩＬ−２および／またはＩＬ−４に
応答して増殖できたとも考えられる。付着段階後にＩＬ
−４を添加すると、表２に示されるようにＬｅｕ１９＋
細胞パーセントに対する阻止効果は有さなかった。 【００２８】要約すると、ＩＬ−４が本方法の付着段階
中に存在するとき、ＩＬ−４はＡ−ＬＡＫ産生を阻止し
、ＣＤ４（Ｌｅｕ４＋）が濃厚化した細胞集団を増加さ
せた。他方、ＩＬ−４がＡ−ＬＡＫ産生法の付着段階後
に存在するとき、ＩＬ−４はＡ−ＬＡＫ細胞の細胞数の
増加および細胞障害活性を高めた。 【００２９】《実施例２》Ａ−ＬＡＫ細胞は上記のよう
にしてＩＬ−４の存在下で産生させた。８日目に、対照
のＡ−ＬＡＫ細胞は９５％がＬｅｕ１９＋であり、一方
ＩＬ−４の存在下で産生させた細胞は（表３）に示され
るように僅か６５％しか陽性でなかった。１５日目に、
ＩＬ−４培養細胞はＬｅｕ１９に僅か１７％しか陽性で
なく、ＣＤ４に対しては７７％が陽性であった。２１日
目に、ＣＤ４陽性細胞のパーセントは７５％のままであ
った。要約すると、ＣＤ４＋が濃厚化した細胞集団は培
養８日後に産生され、最適拡大およびＣＤ４＋細胞の濃
厚化には約２週間を要した。 【００３０】 【表３】 付着ＣＤ４＋細胞およびＡ−ＬＡＫ細胞の産生
に与える付着段階中のＩＬ−４の影響
溶解％
総細胞 Ｌｅｕ３％
Ｌｅｕ１９％ Ｅ：Ｔ比
（×１０６）
（ＣＤ４） （ＣＤ５６） ２．５：１
１．２５：１ ０日 対照
１．９ ＩＬ−４ １．８
８日 対照 ４２
８ ９５
８５ ７５ ＩＬ−４
１０．８ ３４
６５ ２９
１５ １５日 対照 ２５２
４ ９８
７０ ３８ ＩＬ
−４ １５０ ７７
１７ ２９
１６ ２１日 対照 ６３５
３ ９８
５８ ３８
ＩＬ−４ ２４０ ７５
１４ １８
８
【００３１】付着細胞は１０ Ｕ／ｍｌのＩＬ−２、ま
たは１０ Ｕ／ｍｌのＩＬ−２プラス２００ Ｕ／ｍｌ
のＩＬ−４の存在下で１日間５×１０５個の細胞／ｍｌ
のＰＭＥ処理ＰＢＭＣから産生させた。次いで、この付
着細胞をＩＬ−２単独またはＩＬ−２およびＩＬ−４と
共に種々の期間培養した。 【００３２】《実施例３》表４に示されるように、ＩＬ
−２活性化後でＡ−ＬＡＫ集団の付着後にＩＬ−４を添
加したとき、非付着ＬＡＫ（ＮＡ−ＬＡＫ）細胞数の増
加はＩＬ−４によって幾らか高められた。本方法は、Ｎ
Ａ−ＬＡＫ細胞を使用した以外は実施例１と実質的に同
一であった。ＬＡＫ活性はＩＬ−２だけを使用したとき
と比較して同一のままであった。しかし乍ら、ＩＬ−４
がＩＬ−２と同時に（Ａ−ＬＡＫ細胞の付着段階中に）
存在したとき、ＬＡＫ活性は表４に示されるように阻止
された。 【００３３】 【表４】 ＮＡ−ＬＡＫ細胞集団の拡大、細胞障害活性及び
フェノタイプに与えるＩＬ−４の影響
ＩＬ−４
増加 溶解 Ｌｅｕ２
Ｌｅｕ３ Ｌｅｕ４ Ｌｅｕ１
９ （ｍｌ） 倍率
（％） （％） （％）
（％） （％） 付着後 ０ ２．８
７３ ５８ ２３
３２ ７２ １０
４．２ ７８
５４ １８ ２９
７６ ５０
５．２ ７１ ４９
１８ ２５ ７８
２００ ５．２
６８ ５６ １７
２４ ８２ 付着中
０ ２．
８ ７３ ５８
２３ ３２ ７２
１０ ２．３ ６４
６２ ２２
３４ ７０ ５０
２．１ ５４ ５９
３２ ４６
５６ ２００ ２．０
５６ ５３ ３４
４７ ５５
【００３４】細胞集団の拡大は、ＩＬ−４が付着段階中
に存在したとき、ＩＬ−２単独ではＩＬ−２プラスＩＬ
−４と比べてほぼ同じであった。細胞の表面マーカーの
分析によって、表４に示されるようにＩＬ−４がＩＬ−
２活性化中に存在したとき、ＣＤ４＋細胞は僅かしか増
加しないことが示された。それ故、ＬＡＫ増加またはＣ
Ｄ４＋増加に与えるＩＬ−４の影響はＮＡ−ＬＡＫ細胞
培養物でも観察できたけれども、細胞増殖の増加は付着
細胞（Ａ−ＬＡＫ）培養物に比べてかなり低下した。
Claims (3)
- 【請求項１】 ａ）末梢血液単核細胞を薬剤で処理し
て単球を枯渇させ、ｂ）残余細胞を、該細胞の１部が付
着している容器内でインターロイキン−２およびインタ
ーロイキン−４を含有する培地中５×１０６〜１×１０
７個細胞／ｍｌで培養し、 ｃ）非付着細胞を除去し、そして ｄ）インターロイキン−２およびインターロイキン−４
を含有する培地中で付着細胞を培養してＣＤ４＋Ｔ細胞
を数を増加させる、ことを特徴とする付着ＣＤ４＋Ｔリ
ンパ球が濃厚化された細胞集団を調製する方法。 - 【請求項２】 請求項１に記載の方法によって調製さ
れ濃厚化されたＣＤ４＋細胞を含有する組成物であって
、その際該細胞は製薬的に受容可能な担体中に存在しそ
して腫瘍に苦しんでいる哺乳動物にインターロイキン−
２と共に投与するとき該腫瘍に反応性である組成物。 - 【請求項３】 インターロイキン−２および請求項２
に記載の組成物の腫瘍阻止量を哺乳動物に投与すること
からなる該哺乳動物の腫瘍を治療する方法。
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- 1992-01-29 CA CA002060270A patent/CA2060270A1/en not_active Abandoned
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Also Published As
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