JPH0427867A - 蛍光標識された物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、血液、体液、尿、あるいは他の生体成分等に
存在する徴Ｉ成分、ならびに遺伝子組み換え技術および
ＤＮＡ診断等において遺伝子等を検知する新しい技術に
関する。

また、本発明は、新しい測定試薬を用いる時間分解蛍光
測定法に関する。

（従来技術および発明が解決しようとする課題） 現在、各種の生物学的親和性に基礎をおいた測定法は、
微量分析、疾病等の診断、遺伝子工学等における物質の
検出その他において欠くべからざる手段となっている。

このような測定方法においては、従来主として１２５工
、ｆｆ２ｐ、　　ｆｆ５３等の放射性同位元素にょる押
識を用いたラジオアッセイが用いられてきた。このラジ
オアッセイにおいては、標識化の際の物質の性質の変化
が比較的少ないこと、測定感度が高いこと、適用範囲が
広いことなどの利点を有しているが、その反面、放射性
に基く人体、環境に及ぼす悪影響等の点で大きな問題を
有すること、標識自体が放射性の壊変物であることから
試薬自体が不安定で長期間の保存ができないこと、使用
に当たっては特別な注意が必要であり雌でもが安心して
使用できるものではないこと、アイソトープ処理施設等
の特別な設備が必要であるためトータルコストがかさむ
ことなど、大きな問題がある。このような欠点を克服す
べく標識剤として酵素を用いたエンザイムアッセイおよ
び蛍光発生物質を用いた蛍光アッセイなどが考案されて
きた。

最近では、特に酵素で押諏する方法が広く用いられてい
るが、この酵素はもともと不安定なものであるため、標
識化に際しての各種の処理、保存及び使用に際する各種
の処理等で容易に変性するなどの問題がある他、酵素標
識した試薬は、温度、ｐＨ１反応時間等の影響を受は易
く、測定結果が必ずしも一定して得られない、あるいは
測定に熟練を要するという問題もある。さらに、酵素自
体も高価であるため費用がかかるという問題もある。

これに対し、蛍光物質で標識する方法は、蛍光物質自体
の安定性及び蛍光物質で標識された試薬自体の安定性と
もに良好で、さらにその試薬を用いての測定自体も簡便
であり費用的に安価に済むという利点も有してｔ＼る。

しかしながら、以下のような理由で、微量物質の測定系
において最も重要な条件となる「測定感度」が前二者に
比べて但いという問題点を有している。

蛍光現象は、ある励起光の照射により、化合物の電子準
位に基く固有の放射光を発する現象であるが、励起光を
必要とするため、　レイリー散乱によりバックグラウン
ドノイズの発生が避けられない、また、血清及び蛋白中
に存在する種々の物質に由来する多くの蛍光が、［１１
物質に由来する蛍光と重なり合い、測定を大きく妨害し
てしまう、　これらの問題を解決するためには、一般に
蛍光物質のストークスシフトを大きくするとか、あるい
は他のバックグラウンド蛍光から標識蛍光を区別するた
めの特別な性質を蛍光物質に付与するなどの手段があげ
られる。

このような性質をある程度有する方法として時間分解蛍
光測定法という手法を利用した蛍光測定法が提案されて
いる０本測定原理に基く方法としては、米国特許第４．
０５８７３２号及び米国特許第４．　３４１．　９５７
号に記載のものがあげられる。　しかし、これらに示さ
れている試薬は、抗体に蛍光物質をり諏化したものであ
るため、特定の抗原物質を測定対象にすることしかでき
ず、　さらに、測定対象ごとに特異的な抗体を用意しな
ければならないという問題がある。ざらに上ｇ己文献に
は、遺伝子組み換えにおけるハイス〜リダイゼーション
アッセイ法あるいはＤ　ＮＡｔｔ断において最近頻繁ｌ
こ用いられる分析試薬である核酸プローブについての記
載は全くない。

（課題を解決するための手段） このような従来の方法の問題点を解決すべく鋭意研究の
結果、抗原または核酸から選ばれた生物学的反応体と該
生物学的反応体と結合した蛍光希土類金属キレートとよ
りなり、かつ該蛍光希土類金属キレートは競合する未ｙ
！識の周囲物質の最長蛍光崩壊寿命に比較して長い蛍光
崩壊寿命を有するものであることをＨ徴とする蛍光生物
学的反応体と、該蛍光生物学的反応体の応用範囲が広い
こととを見い出し、本発明を完成するに至った。

本発明は、蛍光標識剤として時間分解蛍光測定に適した
蛍光希土類金属キレートを使用すると共に、蛍光′ａＡ
ｍ剤でｍｓされる生物学的反応体として抗原またはＤＮ
Ａ、　ＲＮＡ等の核酸から選ばれたものを使用するにあ
る。

したがって、本発明の目的は、抗原、および核酸から選
ばれた生物学的反応体と該蛍光生物学的反応体に結合し
た蛍光希土類金属キレートとよりなり、該蛍光希土類金
属キレートが、競合する未標識の周囲物質の最長蛍光崩
壊寿命に比較して長い蛍光崩壊寿命を有する蛍光生物学
的反応体を提供するにある。さらに本発明は、抗原また
は核酸から選ばれた生物学的反応体と、該生物学的反応
体とを結合した蛍光希土類金属キレートとよりなり、該
蛍光希土類金属キレートが、競合する未標識の周囲物質
の最長蛍光崩壊寿命に比較して長い蛍光崩壊寿命を有す
る蛍光生物学的反応体で標的物質を！！し、次いでこう
して得られた蛍光生物学的反応体と測定対象である標的
物質との結合物からの蛍光を検知することにより、標的
物質の量を測定することからなる。

本発明で使用できる抗原としては、完全抗原、ハブテン
およびそれらの類縁体があげられるが、　このようなも
のとしては、例えばコルチゾール、　コルチゾールアミ
ン、　チロキシン、　ジゴキシン、　ビオチン、　α−
フェトプロティン、　ヒト絨毛膜ゴナドトロピン、フェ
リチン、チロトロピン、フオリトロビン、ルトロビン、
チロキシン結合性グロブリン、成長ホルモン、プロラク
チン、アビジン、ストレプトアビジン、ヘモシアニン、
　ミオシン、カタラーゼ等の各種ホルモン、血液凝固因
子、酵素阻害剤、酵素、細胞表面抗原、特異的な結合性
を有する蛋白質、そのサブユニットあるいはフラグメン
ト、さらにはそれらの変異体、各種アレルギー起因物質
等があげられる。

本発明で用いることのできる核酸としては、ＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ、及びその類縁体が含まれ、それらは染色体遺伝子
から採取されたものであっても、あるいは遺伝子工学的
手法でメツセンジャーＲＮＡから合成されたものであっ
てもよく、さらには蛋白質のアミノ酸配列に基づいて化
学合成されたものであってもよい。

これらの核酸は、通常の核酸成分以外にアミノメチル化
されたり、ホルミル化された廖基等を含んでいてもよい
。

本発明で使用することのできる蛍光希土類金属キレート
としては、有機化合物分子が希土類金属イオンに配位し
た有機金属キレートをあげることができ、この希土類金
属キレートは好適な波長域における効率的な励起蛍光を
示ずと共に、高い量子収率が得られる。さらにそれは長
寿命でかつ特徴的な蛍光スペクトルを示す。

このような蛍光希土類金屑キレートとしては、　　Ｓ、
１．Ｗｅｉｓｍａｎｎ、　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｊｏｕｒ
ｎａｌ　　ｏｆ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈｙｓｉｃｓ
、　　ｖｏｌ、１０．ｐ２１４−２１７（１９４２）、
ＲｏＡ、Ｇｕｄｍｕｎｄｓｅｎ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｆ　ＣｈｅｍｉｃａｌＰｈｙｓｉｃｓ　ｖ
ｏｌ、３９　ｐ、２７２−２７４（１９６３）、及びＯ
ｐｔ　。

Ｓｏｃ、Ａｍｅｒ、ｖｏｌ、５４．ｐ１２１１（１９６
４）　　等に記載のユウロピウム、テルビウムのベンゾ
イルアセトネート、ベンゾイルトリフルオロアセトネー
ト、ヘキサフルオロアセチルアセトネート、アセチルア
セトネート、テノイルトリフルオロアセトネート等があ
げられる。ざら（豪また、特開昭６１−２００９８８号
に記載の配位子との蛍光希土類金属キレートがあげられ
る。

また希土類金属としては、上記の他にジスプロシウム、
サマリウム等のランタニドに属する元素から選ばれるも
のがあげられる。

蛍光希土類金属キレートを抗原または核酸から選ばれた
生物学的反応体に結合させる方法としては、　イオン結
合による方法、吸着反応による方法あるいは共有結合に
よる方法があげられる。　このような結合としては、上
記蛍光希土類金属キレートが安定に抗原および核酸から
選ばれた生物学的反応体を標識できるものであれば特に
限定されないが、そのような結合方法としては共有結合
による方法が特に安定性の点で好ましい、このような共
有結合による結合法としては、従来公知の方法を広く適
用することができるが、例えば、グルタルアルデヒド法
、過ヨウ１ｇ酸法、　マレイミド法、　イソチオシアネ
ート法、　ｐ−ニトロベンゾイルクロライド法、　トリ
アジン法、　ビリジンジスルフィド法、　ジアゾ法、　
カルボジイミド法、混合酸無水物法等の方法及びこれら
の方法を適宜組み合わせた方法があげられる。このよう
な結合法を適用するにあたっては、様々な修飾方法を適
用して上記発明の生物学的反応体を事前に修飾しておく
ことかできる。　ここで利用できる方法としては、有機
合成化生協会誌、第４２巻、第４号、　ｐ２８３−２９
２、１９８４年に記載の方法などがあげられる０例えば
、生物学的反応体が遊離アミン基を有する場合、スルホ
ニルクロライド基を有するように修飾した蛍光希土類金
属キレートを反応させるか、あるいはアミノ基を有する
キレート化剤の該アミン基をさらにイソチオシアネート
基に置換し、このイソチオシアネート基で置換されたキ
レート化剤と生物学的反応体を反応させる方法がある。

ここで使用し得るアミノ基を有するキレート化剤の例は
、例えば米国特許第４．　３４１９５７号に言己載があ
る。

本発明によれば、生物学的反応体として、複数の遊離の
アミノ基をもつなどして複数の標識部位をもつものが望
ましい、複数の標識部位を有する生物学的反応体は、予
想外に良好な蛍光特性を有すると共ｌこ良好な測定感度
を与える試薬であることが判明した。

このようにして得られた蛍光希土類金属キレートで標識
された抗原及び核酸から選ばれた生物学的反応体は、標
的物質の検知あるいは分析に用いられる。このような検
知分析方法としては、免疫分析法あるいはハイブリダイ
ゼーシゴン分析法があげられ、従来知られた原理をその
まま、あるいは適当に改変して適用することができる０
代表的な方法としてはサンドイツチ法、二抗体法、第−
抗体固相法等があげられる。

本発明で対象とする標的物質としてはまず第一に抗体が
あげられる。生体中の抗体量は、各種疾患あるいは生体
の状態を反映しており、その存否を含めて抗体を検知す
ることには大きな意義がある５本発明で対象とする標的
物質として第二には、酵素とその特異的な阻害剤、ビオ
チンとアビジン又はストレプトアビジン、　コレラトキ
シンとその受容体などの高度に生物学的に親和性を有す
る組合せの一方のものがあげられる。第三に本発明で対
象とする標的物質としては、ガン遺伝子、あるいはウィ
ルスの核酸、あるいは特定の疾患の起因となるような遺
伝子、遺伝子組み換えで用いられるＲＮＡ、ＤＮＡ等が
あげられる。

本発明に従って標的物質を検知するにあたっては、　ま
ず標的物質を含む検体を、　ウェル、ディスク、マイク
ロビーズ等に固定化しである、標的物質と反応性の生物
学的反応体等と反応せしめ、次にこうして固定化された
標的物質を、それが固定化されたままの条件下に洗浄処
理後、本発明の蛍光標識化した生物学的反応体を反応さ
せる。なお、必要に応じて、蛍光り識化した生物学的反
応体を直接標的物質と反応させる代わりに、例えば標的
物質にビオチンあるいは他の物質で［Ｊした標的物質に
特異的な抗体を反応させ、次に適当な洗浄処理後、　ビ
オチンあるいは他の物質を特異的に認識することにでき
る本発明に基づく蛍光生物学的反応体を反応させてもよ
い、このようにして生成したコンプレックスが遊離しな
い条件下に洗浄処理後、その生成フンブレックスの有す
る蛍光を時間分解的に測定して、標的物質の量を検知す
る。

なお、標的物質がＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸である場合に
は、本発明の蛍光希土類全屈キレートでｆｆｍ化された
生物学的反応体としては、　蛍光希土類全屈キレ−）・
で欅識化されている核酸が好ましい、ここで用いられる
繰作条件は、通常の核酸をプローブとして用いる条件を
用いることができるし、また使用される核酸がフィルタ
ー等に固定された状態で用いることもできる。

以下、上記一般的に説明した測定方法を具体的な例を上
げて説明する。

（１）アレルギーの起因物質としてのＩｇＥ抗体を測定
する方法について説明する。まずアレルゲンを公知の方
法でマイクロビーズ上に固定化する０次にアレルゲン特
異的ＩｇＥが含まれる血清を反応させる。この反応は、
適当な緩衝液中で数分間保温することによりなされる。

ついで固定化されたアレルゲンとアレルゲン特異的Ｉｇ
Ｅ抗体との結合物が解離しない条件下に適当なｍ衝液で
２〜３回程度洗浄する０次に蛍光希土類金屑キレートで
標識したヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体を緩衝液に懸濁したもの
を反応させ、数分間反応させる。

次に得られたマイクロビーズを適当な緩衝液で２〜３回
程度洗浄し、余剰の標識抗体を除く、こうして得られた
蛍光性反応体を通常の時間分解蛍光測定装置でもってそ
の蛍光を測定する。別に作製した標準曲線と比較してそ
の量を算出する。

（２）次にＤＮＡを検出する方法を説明する。ＤＮＡを
含有する検体をその役声中ｌこ存在する標的ＤＮＡ配列
と相補的なりＮＡが固定化されているディスクあるいは
セルロースヘ−）＜−と接触反応させる。この反応は、
ハイブリダイゼーションしたＤＮＡが遊離しない条件で
２回程度洗浄する１次に固定化されたＤＮＡに相補性を
有する蛍光希土類金属キレートで！脆化されたＤＮＡプ
ローブを反応させる。この反応中、適切なハイブリダイ
ゼーション条件下に行われる０反応体をハイブリダイズ
した反応物が遊離しない条件で洗浄する。こうして得ら
れた蛍光性反応体の蛍光を時間分解蛍光測定の手法で検
知する。なお、上記の方法においては、二次プローブを
用いてその二次プローブを蛍光希土類金属キレートで標
識化したＤＮＡプローブ等を用いて検知してもよい。

本発明によれば、生物学的反応体として各種アレルゲン
等の比較的安定な物質を標識するため、試薬の長期間の
保存が可能であること、また、本発明の試薬自体の安定
性がラジオアイソトープ標識した試薬に比べて高いこと
から、本発明による試薬を用いた場合の測定結果の再現
性及び感度が良好である。

また、本発明の方法によれば、標識可能な部位を多く有
するものを試薬として使用することができ、その結果測
定感度を高めることができる。さらにアビジンまたはス
トレプトアビジンといったビオチンと特異的に反応する
蛋白質を標識化した場合には標的物質に応じて標識する
生物学的反応体を変える必要がなく、広く応用されてい
るビオチンｍ！された生物学的反応体を利用できるとい
う利点もある。　また、ハブテン等の担体物質であるア
ルブミン、チログロブリン、ポリリジン、その僧の合成
あるいは天然あるいはまた半合成のポリペプチドを標識
化した場合には、多くの標識化部位が得られると共に各
種ハブテンと組み合わせるのみで多種類の試薬を用意す
ることができるという利点もある。

さらに本発明によれば、安定かつ安、価な蛍光標識化核
酸プローブが提供でき、　ＤＮＡ、ＲＮＡの検出効果を
高めることができる。

次に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本
発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１：　ユウロピウム（ｍ）キレート標識ハブテン
の作製 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　５ｐｅｃ
ｔｒｏｓｃｏｐｙ、　　第８巻、３１５−３２７頁、　
１９６２年に開示されている方法に従い調製したｐ−ア
ミノメチルベンゾイルトリフルオロアセトネートナトリ
ウム０．８１ｇを蒸留水２０−に溶解した。この溶液を
、７．４Ｂ／−塩化ユウロピウム（Ｉｎ）水溶液５０−
に静かに滴下し撹拌した。析出した沈澱物を回収して、
少量の冷蒸留水にて洗浄し、その後、室温にて減圧下１
０時間乾燥し、　トリス（ｐ−アミノベンゾイルトリフ
ルオロ７セトネート）ユウロピウム（ｍ）とした。

プロゲステロン力ルボキシメチルオ夫シム２ｏＢをジオ
キサン５−に溶解し、水冷下、　撹拌しなからＮ−メチ
ルモルホリン５−１およびイソブチルクロルホルメート
１４−を滴下した。

次に、予め氷冷しておいた前述のトリス（ｐ−ベンゾイ
ルトリフルオロアセトネート）ユウロピウム（［１１＞
を含むジオキサン溶液５−を滴下し、水冷下でそのまま
３０分間撹拌し、さらに室温にて１時間撹拌を続けた６
反応終了後、減圧下溶媒を除去し、少量のアセトニトリ
ル／水（５５／４５）液に再溶解し、Ｖｙｄａｃ　Ｃｚ
カラム（φ２．２　ｘ　２５　ｃｍ）を用いた分取ＨＰ
ＬＣにより、ユウロピウム（Ｉｎ　）キレート襟識プロ
ゲステロンを単耐した。単敲後、溶媒を減圧下除去し、
０．１％塩化ナトリウム、および　　０．０５％アジ化
ナトリウム含有５０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，
７５）に溶解し、冷暗所に保存した。

実施例２：　競合法によるプロゲステロン測定抗プロゲ
ステロンモノクローナル抗体をプラスチック製キュベツ
トに固相化した。すなわち、抗体溶液１００Ｊをキュベ
ツトに添加し、４℃にて一晩インキユベーションした。

キュベツトをイオン交換水により洗浄した後、０．５％
ウシ血清アルブミン含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
，２）５００μｍ添加し、４℃で一晩インキユベション
してブロッキングを行った。キュベツトを洗浄後、実施
例１に記載のユウロピウムキレート標識プロゲステロン
および標準抗原（プロゲステロン温度：　　Ｏ，ｌ、　
１０．１００゜１０００　ｎｇ／ａＱ　）　５０Ｊ、お
よび０，５％ＢＳＡ、０．０１χ）・ウィーン２０．０
９χ塩化ナトリウム含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
、２）２５０Ｊをキュベツトに添加し、室温で１時間反
応させた。洗浄により、固相に未結合のユーロピウムキ
レート標識プロゲステロン、およびプロゲステロンを除
去したキュベツトにエタノール５００Ｊを添加し４　時
間分解蛍光光度計（堀場製作所、ＨＡＥＳ−１１００、
浜松ホトニクスユニバーサルフォトンカウンティングシ
ステム）で蛍光強度（測定した。標準抗原潅度が高くな
るにつれ、蛍光強度は個下した。

実施例３；　ユウロピウム（ＩＩＩ）キレート５識オリ
ゴヌクレオチドプローブの作製 ｓ　ｃ　ｉ　ｅ　ｎ　ｃｅ、　第２２７巻、　４８４−
４９２頁、　１９８５年に開示されたＨＩＶ遺田子のう
ちのｇａｇ１５９５−１６３５の核酸塩基配列に基き、
ＤＮＡシンセサイザーモデル３８１Ａ＃　（アプライド
バイオシステム）を用いてＨＩＶプローブ用オリゴヌク
レオチドを合成した。その際、オリゴヌクレオチドの　
５−末端に、該オリゴヌクレオチドと［ｍどの結合を目
的として、Ａｍ１ｎｏｌｉｎｋ　２＠（アプライドバイ
オシステム）を用いてアミノ基を導入しておいた１合成
されたオリゴヌクレオチドは、　ｏＰＣカートリッジに
より精製した。

このように調製したオリゴヌクレオチド５゜シを含む２
ｍＭ　ＥＤＴＡ含有０．１８炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）　２５−にジメチルスルホキシドにて調製し
た２、６ｍｇ／−のジススクシンイミジルスベレート（
ＤＳＳ）Ｉ液５〇−添加した。室温にて５分間撹拌した
後、速やかにセファデックスＧ５０カラム（φ０　、５
ｃｍｘ２５ｃｍ　）に供し、イオン交換水にて展開し、
２６０ｎｍに吸収を持つ画分を回収した。

回収後、速やかに凍結乾燥し、これに実施例１にて記載
されたトリス（ベンゾイルトリフルオロアセトネート）
ユウロピウム（［［＋）キレートのアミノメチル化体６
．１４を含有する３Ｈ塩化ナトリウム含有０．１Ｍ炭酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，０）１００Ｊを添加し、室
温にて２０時間撹拌した０反応終了後、反応液を５０ｆ
ｆ１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）にて平衡化され
たＢｉｏ−Ｒａｄ　Ｐ−１００カラム（φ１．０！４０
ｃｍ）を用いたゲル濾過に供し、未反応のトリス（ベン
ゾイルトリフルオロアセトネート）ユウロピウム（ＩＩ
Ｉ）キレートのアミノメチル化体を除去し、ユウロピウ
ム（ＩＩＩ）キレート標識オリゴヌクレオチドプローブ
溶液とした。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗原または核酸から選ばれた生物学的反応体と、
   該生物学的反応体と結合した 蛍光希土類金属キレートとよりなり、該 蛍光希土類金属キレートは競合する未標 識の周囲物質の最長蛍光崩壊寿命に比較 して長い蛍光崩壊寿命を有することを特 徴とする蛍光生物学的反応体。
2. （２）抗原または核酸から選ばれた生物学的反応体と、
   該生物学的反応体と結合した 蛍光希土類金属キレートとよりなり、該 蛍光希土類金属キレートは競合する未標 識の周囲物質最長蛍光崩壊寿命に比較し て長い蛍光崩壊寿命を有することを特徴 とする蛍光生物学的反応体であって、該 蛍光生物学的反応体で標的物質を標識し、 次いで蛍光生物学的反応体−標的物質の 結合物からの蛍光を検知することにより 標的物質を測定する方法。