JPH0427395A - Ｌ―カルニチンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、アクロモバクタ−属またはシュードモナス属
に属し、Ｔ−ブチロベタインからＬ−カルニチンを生産
する能力を有する微生物を、Ｔ−ブチロブタインに接触
させてＬ−カルニチンを製造する方法に関する。

Ｌ−カルニチンは、脂肪酸代謝に関与する物質でビタミ
ンＢｙとも呼ばれており、心臓疾患および脂肪血症の治
療に有用である。また、高カロリー輸液としても使用さ
れる。

従来の技術 り一カルニチンを、Ｔ−ブチロベタインから製造する方
法としては、Ｔ−ブチロベタインを微生物酵素によりヒ
ドロキシル化する方法（特開昭５７−３９７９１号公報
、特開昭６０−２２４４８８号公報、特開昭６１−１９
９７９３号公報）があげられる。

Ｔ−ブチロベタインは、安価に供給されているＬ−グル
タミン酸の酵素的脱炭酸反応によりほぼ１００％の収率
で得られる４−アミノ酪酸をトリメチル化することによ
り安価に供給されている。

そのため安価に得られるＴ−ブチロベタインから酵素的
方法によりＬ−カルニチンを製造する方法が開発されて
いる。

特開昭５７−３９７９１号公報３己載の方法では、高価
な２−ケトグルタル酸と還元剤、第一鉄イオンを必要と
し、かびの胞子を作用させるため、またＬ−カルニチン
の生成量がきわめて微量であるためコスト高となり工業
的に実施し難い。特開昭６０＝２２４４８８号公報およ
び特開昭６１−１９９７９３号公報記載の方法には、Ｔ
−ブチロベタインおよびクロトノベタインからＬ−カル
ニチンを生成し、かつＬ−カルニチンを異化しない微生
物をクロトノベタインまたはＴ−ブチロベタインを含む
培地に培養してＬ−カルニチン生成させる方法が開示さ
れている。この微生物はジャーナル・オブ・バタテリオ
ロジー（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）、　１６８巻
、７８０〜７８４頁、１９８６年によると、アグロバク
テリウム（＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ属に属する菌
と同定されており、本発明で使用する微生物とは異なる
属に属する細菌である。

アクロモバクタ−属またはシュードモナス属に属する微
生物を用い、Ｔ−ブチロベタインからＬカルニチンを製
造する方法は知られていない。

発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、アクロモバクタ−属またはシュードモ
ナス属に属する微生物を用い、Ｔ−ブチロベタインから
工業的にＬ−カルニーチンを製造する方法を提供するこ
とにある。

課題を解決するた杓の手段 本発明によれば、アクロモバクタ−属またはシュードモ
ナス属に属し、Ｔ−ブチロベタインからＬ−カルニチン
を生成する能力を有する微生物の菌体、培養液またはそ
れらの処理物を、水性媒体中でＴ−ブチロベタインに接
触させることにより、水性媒体中にＬ−カルニチンを生
成させ該水性媒体中から生成したＬ−カルニチンを採取
することによりＬ−カルニチンを製造することができる
。

以下に本発すを詳細に説閂する。

本発明に用いられる微生物は、アクロモバクタ（Ａｃｈ
ｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属またはシュードモナス（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属し、Ｔ−ブチロベタインか
らＬ−カルニチンを生成する能力を有する微生物であれ
ばよい。また、具体的な例としては、アクロモバクタ−
・シクロクラステス（＾ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｃｙ
ｃｌｏｃｌａｓｔｅｓ　）　ＡＴＣＣ２に９２１　、シ
ュードモナス菌種の菌株（旺ＲＭ　ＢＰ−１３７９、Ｆ
ＥＲＭ　Ｐ−８９１１＞などがあげられる。

これらの菌株を人工的変異方法、たとえば紫外線照射、
Ｘ線照射、変異誘起剤処理などによって変異させた変異
株も用いることができる。とくにＬ−カルニチン分解能
を欠失または微弱にしか有さない変異株が好ましく、具
体的にはアクロモバクタ−・シクロクラスナス１６−５
株があげられる。

アクロモバクタ−・シクロクラスナス１６−５株の取得
方法を以下に示す。

アクロモバクタ−・シクロクラステス＾ＴＣＣ２１９２
１株にＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグアニ
ジンを用いて常法の変異処理（菌体濃度０２■／−１２
６℃、３０分間）を施し、栄養培地に塗布する。２６℃
で培養し生育してくるコロニーを取得する。親株より、
カルニチン分解能が弱くなり、カルニチン生成能の向上
した菌株をえらぶ（該菌株をγロモバクター・シクロク
ラスナス１６−５株という）。

アクロモバクタ−・シクロクラステス１６−５は、ブダ
ペスト条約に基づいて工業技術院生物工業技術研究所に
微工研条寄第：ｚ’／ｘ乙号（Ｒ［ＥＲＭ　ＢＦ−２デ
−Ｊｇ）として寄託されている。シュードモナス属菌種
ＦＥＲＭ　ＥＩＰ−１３７９は本発明者らにより分離さ
れたもので、その分類学的性質は特開昭６３−５６２９
４に記載されたとおりである。

本発明で用いられる微生物の培養においては通常の細菌
の培養法が一般に用いられる。培地としては微生物が資
化可能な炭素源、窒素源、無機物および微生物の生育あ
るいはＬ−カルニチンの生産促進に必要な物質を程よく
含有する培地であれば合成培地、天然培地いずれでも使
用可能である。

炭素源としてはグルコース、澱粉、デキストリン、マン
ノース、フラクトース、シュクロース、ラクトース、キ
シロース、アラビノース、マンニトール、糖蜜などが単
独または組み合わせて用いられる。さらに、微生物の資
化能によっては炭化水素、アルコール類、有機酸なども
用いられる。

窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、
硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、
肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチーブ・
リカー、大豆粉、カザミノ酸などが単独または組み合わ
せて用いられる。

そのほか、必要に応じて食塩、塩化カリウム、硫酸マグ
ネシウム、炭酸カルシウム、リン酸三水素カリウム、リ
ン酸水素二カリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫
酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅などの無機塩類を加える
ことができる。

また、塩酸ベタインやコリン・クロライドも加えること
もできる。

培養は、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件
下、温度４〜４３℃、好ましくは２０〜３５℃、ｐＨ４
〜１０、好ましくは６〜９でおこなわれ、通常１〜１０
日で終了する。培地のｐＨは水酸化ナトリウムなどを用
いて調整するのが好ましい。

このようにして得られる培養液はそのままＬカルニチン
生産のための酵素源として酵素反応に用いられるが、培
養液から分離した菌体、あるいは培養液もしくは菌体の
処理物もＴ−ブチロベタインをＬ−カルニチンに変換す
る酵素源として用いることができる。

培養液もしくは菌体の処理は、菌体中の酵素活性を損な
うことなく酵素反応がより容易に進む方法を適宜選択し
ておこなわれる。

具体的処理物としては、培養物の濃縮物、乾燥物、界面
活性剤および／または有機溶剤処理物もしくは溶菌酵素
処理物、さらに培養物を遠心分離して得られる菌体、菌
体破砕物、菌体の乾燥物、アセトン処理物、界面活性剤
および／または有機溶剤処理物、溶菌酵素処理物、固定
化菌体、あるいは菌体からの抽出酵素標品などがあげら
れる。

界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・ステアリル
アミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製；
以下特記しない限り同社製のものを使用）、セチルトリ
メチルアンモニウム・ブロマイド、カチオンＦＢ、カチ
オンＦ２−４０Ｅなどのカチオン性界面活性剤、ナトリ
ウムオレイルアミド硫酸、ニューレックスＴＡＢ、ラビ
ゾール８０などのアニオン系界面活性剤、ポリオキシエ
チレンソルビタン・モノステアレート（例えばノニオン
ＳＴ２２１）などの両性界面活性剤、その他三級アミン
ＰＢ、ヘキサデシルジメチルアミンなどが用いられる。

有機溶剤としては、トルエン、キシレン、脂肪族アルコ
ール、ベンゼン、酢酸エチルなどが用いられる。

本発明で用いられるＴ−ブチロベタインは、遊離もしく
は塩酸塩のような塩の形で用いられる。

Ｔ−ブチロベタインの濃度にはとくに制限はないが、１
〜１０ｗ／ｖ％が好ましい。

Ｌ−カルニチンを生成させる酵素反応を実施するに際し
ては、酵素源とＴ−ブチロベタインを好適的条件下、温
度１０〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃、ｐＨ４〜１
０、好ましくは６〜９で反応させる。反応は通常１〜１
０日で終了する。ｐＨは水酸化ナトリウムなどを用いて
調整するのが好ましい。

また、微生物の培養中にＴ−ブチロブタインを培養液に
添加することによっても酵素反応をおこなうことができ
る。この場合Ｔ−ブチロベタインの添加量は前記酵素反
応と同様の濃度になるように添加すればよい。さらに必
要に応じて微生物の増殖を阻害しない量の前記の界面活
性剤を培養液中に存在させることにより酵素反応を促進
させることができる。

反応終了後、反応液中に生成したＬ−カルニチンは、公
知の方法、たとえばイオン交換樹脂への吸着、脱離、濃
縮、結晶化などの手段により単離される。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例中で用いられた微量元素溶液の組成は次のとおり
である。

微量元素溶液の組成 Ｆｅ５Ｏｓ・７８２Ｇ　　２００ｍｇ／ｊ！、　ＨＪＯ
＋　　２３２ｍｇ／１１０ａｃｉ　　２　・　６Ｈ２０
９５，６ｍｇ／　ｆ　、　　Ｃｕ５Ｏ−・　５Ｈ２０８
，Ｏｍｇ／　ｉ！　。

ＭｎＣ１１’４Ｌ０　　８．０ｍｇ／Ｌ　　ＮａＪｏＬ
−２Ｌ０　　３．Ｏｍｇ／Ｉ、ＺｎＳ０４７Ｈｚ０　１
７４ｍｇ／ｆなお、実施例中、Ｌ−カルニチン生成量は
塩酸塩の量で示した。

実施例Ｉ ＫＨ，Ｐｏ、　　０．１％、Ｍｇ５Ｌ・７Ｈ２００，０
５％、チアミン塩酸塩　１０■／Ｉｌ、　ｗｌ量元素溶
液　５−／ｌ、γ−ブチロベタイン塩酸塩１％、コリン
・クロライド１％の組成からなる滅菌培地（ｐＨ７，０
＞　１０　ｏｆを含む大型試験管に、アクロモバクタ−
・シクロクラステス＾ＴＣＣ２１９２１を植菌し、２６
℃で７２時間振盪培養した。

培養物を遠心分離にかけ、上清を取得した。

上清を強酸性陽イオン交換樹脂（す）　ＩＪウム型）カ
ラムに通塔して、カルニチンを吸着させた。ついで酢酸
アンモニウムの希薄溶液（１０％）をカラムに通塔し、
溶出液を得た。溶出液を濃縮し、アルコールを添加冷却
することにより、Ｌ−カルニチンを回収した。

上清中から、１．７９■／１のＬ−カルニチンが得られ
た。

実施例２ グルコース１％、ＮＨ４Ｃｆ　０．１％、にＨ，ＰＯ，
０，２５％、ＭｇＳＯ４・７１１．０　０．００１％、
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２００，００１％、Ｎａ１Ｊ　Ｏ，５
％、肉エキス０．５％、ポリペプトン０．５％、γ−ブ
チロベタイン塩酸塩１％の組成からなる滅菌培地（ｐＨ
７，０）　１０ｍを含む大型試験管に、アクロモバクタ
−・シクロクラステス＾ＴＣＣ２１９２１を植菌し、２
６℃で９６時間振盪培養した。

培養物を遠心分離にかけ、上清を取得した。上清中から
、実施例１と同様にして１．１１■／ｍｌのＬ−カルニ
チンが得られた。

実施例３ 実施例１で用いた培地と同じ組成からなる培地１０ｍ１
を含む大型試験管にシュードモナス属菌株ＦＥＲＭＢＰ
−１３７９を植菌し、２６℃で６日間振盪培養した。

培養物を遠心分離にかけ、上清を取得した。上清中から
、実施例１と同様にして０．３７■／ｍｌのし−カルニ
チンが得られた。

実施例４ 実施例１で用いた培地組成からＴ−ブチロベタイン塩酸
塩を除いた培地１０ｍ１を含む大型試験管に、シュード
モナス属菌株ＦＥＲＭ　ＢＰ−１３７９を植菌して、２
６℃、９６時間振盪培養後、培養物を遠心分離にかけ、
菌体を取得した。

菌体を水で洗った後、１％のＴ−ブチロベタイン塩酸塩
を含むリン酸緩衝液（ｐｌ（７，０）に菌体を生育培養
時と同濃度になるよう懸濁して振盪しながら７２時間反
応させた。

反応液中から０．２１■／−のし−カルニチンが得られ
た。反応を静置でおこなったとき、Ｌ−力ルシチンは生
成しなかった。

実施例５ ＫＨ，ＰＯ，０１１％、Ｍｇ５Ｏ＜・７Ｈ，ＯＯ，０５
％、ＮＨ，（１！０．５％、ペプトン０．１％、塩酸ベ
タイン１．０％、γ−ブチロベタイン塩酸塩１．０％の
組成からなる滅菌培地（ｐＨ７，０）　　１０ｍｆ＋を
含む大型試験管にアクロモバクタ−・シクロクラスナス
１６−５株を植菌し、２６℃で９６時間振盪培養した。

培養物を遠心分離にかけ、上清を取得した。上清中から
、実施例１と同様にして１０．０ｍｇ／−のＬカルニチ
ンが得られた。

上北の培地組成中、Ｔ−ブチロベタイン塩酸塩の濃度を
２％にした培地を用いて同様に操作をおこなったところ
、培養上清中から、１５．５■／ｍｌのＬ−カルニチン
が得られた。この培地を用い、７日間培養をおこなった
ところ、培養上清中から２５、６１Ｑｇ／　ｒｍのＬ−
カルニチンが得られた。

実施例６ Ｋｌ（２Ｐ０．０．１％、Ｍｇ５Ｏａ・７Ｈ２［］　　
００．０５％ＮＨ，ＣＡ’０．５％、ペプトン０．１％
、コリン・クロライド１．０％、塩酸ベタイン０．５％
、Ｔ−ブチロベタイン塩酸塩１．０％の組成からなる滅
菌培地（ｐＨ７，０）　１０ｍを含む大型試験管に、ア
クロモバクタ−・シクロクラスナス１６−５株を植菌し
、２６℃で７２時間振盪培養後、培養物を遠心分離にか
け、菌体を取得した。

菌体を水で洗った後、菌体をグルコース１％、ペプトン
０．５％、肉エキス０．３％、酵母エキス０．３％、Ｎ
ａｉ　　Ｏ，２５％、塩酸ベタイン１．０％、Ｔ−ブチ
ロベタイン塩酸塩０．５％の組成の培地１〇−分を５．
５ｍｌの溶液になるように溶かして滅菌した培地（ｐＨ
７，０）５．５ｍｌを含む大型試験管に加えて２６℃で
振盪培養した。

培養開始時、培養開始後２４時間目および培養開始後４
８時間目に添加濃度がそれぞれ０，５％、３，０％およ
び１．５％となるようにＴ−ブチロベタイン塩酸塩を１
．５ｍｌづつ添加した。

全体で７日間培養したとき、３４．１■／−１８日間培
養したとき３６．６■／−のＬ−カルニチンが上清中か
ら得られた。γ−ブチロベタイン塩酸塩を分割添加しな
いで培養開始時に５％の濃度になるように加えた場合は
、培養７日で１５．２■／ｍｌ、８日で１６．２■／ｍ
ｌのＬ−カルニチンが得られた。

実施例７ グルコース１％、ペプトン０．３％、肉エキス０．３％
、酵母エキス０．２５％、Ｔ−ブチロベタイン（遊離型
）０．５％の組成からなる滅菌培地（ｐＨ７，０）３０
ｍを含む３００　ｄ容三角フラスコに、アクロモバクタ
−・シクロクラスデス１６−５株を植菌し、２６℃で振
盪培養した。

培養開始後２４時間目および４８時間目に、添加濃度が
それぞれ３．０％および１．５％になるようにＴ−ブチ
ロベタインを添加した。さらに培養開始後７２時時間間
添加濃度が２％になるようにグルコースを添加した。

培養７２時間で４６．３ｍｇ／　ｄ、１２０時間で５５
．０ｍｇ／　ｒｍ、１９２時間で６３．８ｍｇ／ｍｆ！
のＬ−カルニチンが得られた。

発明の効果 本発明により、Ｌ−グルタミン酸から安価に導けるＴ−
ブチロベタインを原料として、Ｌ−カルニチンを収率よ
く製造することができる。

特許出願人（１０２＞協和醗酵工業株式会社パイ オ ル株 式

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）アクロモバクター属またはシュードモナス属に属
   し、γ−ブチロベタインからＬ−カルニチンを生成する
   能力を有する微生物の菌体、培養液またはそれらの処理
   物を、水性媒体中でγ−ブチロベタインに接触させてＬ
   −カルニチンを生成させ、該水性媒体中から生成したＬ
   −カルニチンを採取することを特徴とするＬ−カルニチ
   ンの製造法。
2. （２）微生物が、Ｌ−カルニチン分解能を欠失するか微
   弱にしか有していない変異株である請求項（１）記載の
   Ｌ−カルニチンの製造法。