JPH04271794A - デス（６４，６５）−プロインシュリンの製造方法 - Google Patents
デス（６４，６５）−プロインシュリンの製造方法Info
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- JPH04271794A JPH04271794A JP2406317A JP40631790A JPH04271794A JP H04271794 A JPH04271794 A JP H04271794A JP 2406317 A JP2406317 A JP 2406317A JP 40631790 A JP40631790 A JP 40631790A JP H04271794 A JPH04271794 A JP H04271794A
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- trypsin
- human proinsulin
- hpi
- des
- proinsulin
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
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- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
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- Biophysics (AREA)
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- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】米国特許第４，５６９，７９２号は、ヒト
プロインシュリンからの変換によって入手し得る新規な
化合物群に関するものである。デス（６４，６５）−ヒ
トプロインシュリン［デス（６４，６５）ＨＰＩ］と呼
ばれる、これらの化合物の１つは以下の構造を有してい
る：
プロインシュリンからの変換によって入手し得る新規な
化合物群に関するものである。デス（６４，６５）−ヒ
トプロインシュリン［デス（６４，６５）ＨＰＩ］と呼
ばれる、これらの化合物の１つは以下の構造を有してい
る：
【０００２】
【化１】
【０００３】上記化合物は、アミノ酸６４と６５が除去
され、生じた２本鎖分子がヒトインシュリンのそれと同
様にジスルフィド結合によって連結されている点で、ヒ
トプロインシュリンと異なっている。この分子はインシ
ュリン様の活性を示し、従って、糖尿病の治療に有用で
ある。
され、生じた２本鎖分子がヒトインシュリンのそれと同
様にジスルフィド結合によって連結されている点で、ヒ
トプロインシュリンと異なっている。この分子はインシ
ュリン様の活性を示し、従って、糖尿病の治療に有用で
ある。
【０００４】米国特許第４，５６９，７９２号に記載さ
れたデス（６４，６５）ＨＰＩは、ヒトプロインシュリ
ン（ＨＰＩ）から２工程の反応列で製造された。先ず、
ヒトプロインシュリンをトリプシンで処理し、（６５−
Ａ１スプリット）ＨＰＩを製造した。（６５−Ａ１スプ
リット）ＨＰＩを精製してカルボキシペプチダーゼＢで
処理し、所望のデス（６４，６５）ＨＰＩを製造した。
れたデス（６４，６５）ＨＰＩは、ヒトプロインシュリ
ン（ＨＰＩ）から２工程の反応列で製造された。先ず、
ヒトプロインシュリンをトリプシンで処理し、（６５−
Ａ１スプリット）ＨＰＩを製造した。（６５−Ａ１スプ
リット）ＨＰＩを精製してカルボキシペプチダーゼＢで
処理し、所望のデス（６４，６５）ＨＰＩを製造した。
【０００５】ギブン等（Ｇｉｖｅｎ ｅｔ ａｌ．）の
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６，１３９８−１４０
５（１９８５）には、ＨＰＩからデス（６４，６５）Ｈ
ＰＩを製造するための１工程法が記載されている。この
方法は、トリス緩衝液の存在下、ｐＨ７．５および２２
℃にて、トリプシンとカルボキシペプチダーゼＢでＨＰ
Ｉを処理することを含む（１３９９頁、１欄）。この方
法により、デス（６４，６５）ＨＰＩに対して約３：１
の比でデス（３１，３２）ＨＰＩが得られた。
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６，１３９８−１４０
５（１９８５）には、ＨＰＩからデス（６４，６５）Ｈ
ＰＩを製造するための１工程法が記載されている。この
方法は、トリス緩衝液の存在下、ｐＨ７．５および２２
℃にて、トリプシンとカルボキシペプチダーゼＢでＨＰ
Ｉを処理することを含む（１３９９頁、１欄）。この方
法により、デス（６４，６５）ＨＰＩに対して約３：１
の比でデス（３１，３２）ＨＰＩが得られた。
【０００６】本発明者らは、デス（６４，６５）ＨＰＩ
を製造するための非常に効率的かつ容易な方法を見いだ
した。この方法によって、ヒトプロインシュリンを高収
率でデス（６４，６５）ＨＰＩに変換することができる
。本発明の方法を行う場合、多数のパラメーターのいず
れかまたは全てを使用する。
を製造するための非常に効率的かつ容易な方法を見いだ
した。この方法によって、ヒトプロインシュリンを高収
率でデス（６４，６５）ＨＰＩに変換することができる
。本発明の方法を行う場合、多数のパラメーターのいず
れかまたは全てを使用する。
【０００７】本発明は、
ａ）アルキル化またはアシル化トリプシンの使用ｂ）約
０℃から約１０℃の温度 ｃ）約８から約１０のｐＨ、および ｄ）重炭酸アンモニウムおよびグリシンからなる群から
選択される緩衝剤の使用 の１またはそれ以上を含む条件下、トリプシンおよびカ
ルボキシペプチダーゼＢの存在下でヒトプロインシュリ
ンを消化することによるデス（６４，６５）−ヒトプロ
インシュリンの製造方法を提供するものである。
０℃から約１０℃の温度 ｃ）約８から約１０のｐＨ、および ｄ）重炭酸アンモニウムおよびグリシンからなる群から
選択される緩衝剤の使用 の１またはそれ以上を含む条件下、トリプシンおよびカ
ルボキシペプチダーゼＢの存在下でヒトプロインシュリ
ンを消化することによるデス（６４，６５）−ヒトプロ
インシュリンの製造方法を提供するものである。
【０００８】本発明の方法によって製造された化合物は
、アミノ酸のための通常の３文字短縮表記を使用して前
に示した様な構造を有している。アミノ酸を、その承認
された１文字表記によって記載することもできる。
、アミノ酸のための通常の３文字短縮表記を使用して前
に示した様な構造を有している。アミノ酸を、その承認
された１文字表記によって記載することもできる。
【０００９】これらの表示は、以下の通りである：
【０
０１０】本発明の方法によれば、ヒトプロインシュリン
からデス（６４，６５）ＨＰＩを製造する。ヒトプロイ
ンシュリンは、常法による有機合成、ヒトの膵臓からの
単離、およびより最近は組換えＤＮＡ法を包含する種々
の経路によって入手可能である。
０１０】本発明の方法によれば、ヒトプロインシュリン
からデス（６４，６５）ＨＰＩを製造する。ヒトプロイ
ンシュリンは、常法による有機合成、ヒトの膵臓からの
単離、およびより最近は組換えＤＮＡ法を包含する種々
の経路によって入手可能である。
【００１１】大要を述べると、組換えＤＮＡ法を使用す
るプロインシュリンの製造は、現在では全て常法となっ
ている単離、構築、または両者の組合わせによって、ヒ
トプロインシュリンのアミノ酸配列をコードしているＤ
ＮＡの配列を得ることを含む。次に、ヒトプロインシュ
リンをコードしているＤＮＡを適当なクローニングビヒ
クルに挿入する。このビヒクルを使用して適当な微生物
を形質転換し、その後、この形質転換微生物を、ヒトプ
ロインシュリン遺伝子含有ベクターのコピーを更に産生
させる発酵条件に付す。次いで、ヒトプロインシュリン
をコードしているＤＮＡをクローニングビヒクルから切
り取り、発現ビヒクルの適当な解読相に挿入する。この
発現ビヒクルを使用して適当な微生物を形質転換した後
、形質転換された微生物を、ヒトプロインシュリンのア
ミノ酸配列に対応するか、またはヒトプロインシュリン
のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含有するアミ
ノ酸配列の発現を導く発酵条件に付す。
るプロインシュリンの製造は、現在では全て常法となっ
ている単離、構築、または両者の組合わせによって、ヒ
トプロインシュリンのアミノ酸配列をコードしているＤ
ＮＡの配列を得ることを含む。次に、ヒトプロインシュ
リンをコードしているＤＮＡを適当なクローニングビヒ
クルに挿入する。このビヒクルを使用して適当な微生物
を形質転換し、その後、この形質転換微生物を、ヒトプ
ロインシュリン遺伝子含有ベクターのコピーを更に産生
させる発酵条件に付す。次いで、ヒトプロインシュリン
をコードしているＤＮＡをクローニングビヒクルから切
り取り、発現ビヒクルの適当な解読相に挿入する。この
発現ビヒクルを使用して適当な微生物を形質転換した後
、形質転換された微生物を、ヒトプロインシュリンのア
ミノ酸配列に対応するか、またはヒトプロインシュリン
のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含有するアミ
ノ酸配列の発現を導く発酵条件に付す。
【００１２】発現産物がヒトプロインシュリンのアミノ
酸配列を含有している場合、これは通常、そのアミノ末
端で、外来、またはヒトプロインシュリン遺伝子が挿入
された遺伝子配列によって正常に発現された他のペプチ
ドまたはタンパクに結合しているヒトプロインシュリン
アミノ酸配列を含有するであろう。他の配列に連結して
いる場合、ヒトプロインシュリンのアミノ酸配列は、通
常メチオニンである特異的に切断し得る部位を介してこ
の様な配列に連結するであろう。この生成物は通常、融
合遺伝子産物と呼ばれる。
酸配列を含有している場合、これは通常、そのアミノ末
端で、外来、またはヒトプロインシュリン遺伝子が挿入
された遺伝子配列によって正常に発現された他のペプチ
ドまたはタンパクに結合しているヒトプロインシュリン
アミノ酸配列を含有するであろう。他の配列に連結して
いる場合、ヒトプロインシュリンのアミノ酸配列は、通
常メチオニンである特異的に切断し得る部位を介してこ
の様な配列に連結するであろう。この生成物は通常、融
合遺伝子産物と呼ばれる。
【００１３】メチオニンが切断部位である場合、臭化シ
アンを使用して融合遺伝子産物からヒトプロインシュリ
ンアミノ酸配列を切断し、その後、ヒトプロインシュリ
ンアミノ酸配列のシステインスルフヒドリル部分を、そ
の対応するＳ−スルホネートに変換することによって安
定化させる。
アンを使用して融合遺伝子産物からヒトプロインシュリ
ンアミノ酸配列を切断し、その後、ヒトプロインシュリ
ンアミノ酸配列のシステインスルフヒドリル部分を、そ
の対応するＳ−スルホネートに変換することによって安
定化させる。
【００１４】得られたヒトプロインシュリンＳ−スルホ
ネートを精製し、次いで、この精製ヒトプロインシュリ
ンＳ−スルホネートを、例えば米国特許第４，４３０，
２６６号の方法を使用し、３個の適切に位置したジスル
フィド結合を形成させることによってヒトプロインシュ
リンに変換する。次に、得られたヒトプロインシュリン
産物を、既知の方法を使用して精製する。
ネートを精製し、次いで、この精製ヒトプロインシュリ
ンＳ−スルホネートを、例えば米国特許第４，４３０，
２６６号の方法を使用し、３個の適切に位置したジスル
フィド結合を形成させることによってヒトプロインシュ
リンに変換する。次に、得られたヒトプロインシュリン
産物を、既知の方法を使用して精製する。
【００１５】前記の様に、本発明の方法は、トリプシン
およびカルボキシペプチダーゼＢの存在下でヒトプロイ
ンシュリンを消化することを含む。本発明者らは、この
消化を行う際、ある種の物質および／または条件を個別
にまたは組み合わせて使用すると、得られるデス（６４
，６５）ＨＰＩの量、または望ましくない副産物の低減
の点で、改善された結果が得られることを見いだした。 代表的な望ましくない副産物は、予想される、その他の
切断部位でＨＰＩが切断されること、即ち、デス（３１
，３２）ＨＰＩの生成に至る、アミノ酸残基３１および
３２の除去を伴う切断に起因する。
およびカルボキシペプチダーゼＢの存在下でヒトプロイ
ンシュリンを消化することを含む。本発明者らは、この
消化を行う際、ある種の物質および／または条件を個別
にまたは組み合わせて使用すると、得られるデス（６４
，６５）ＨＰＩの量、または望ましくない副産物の低減
の点で、改善された結果が得られることを見いだした。 代表的な望ましくない副産物は、予想される、その他の
切断部位でＨＰＩが切断されること、即ち、デス（３１
，３２）ＨＰＩの生成に至る、アミノ酸残基３１および
３２の除去を伴う切断に起因する。
【００１６】パラメーターの１つは、使用するトリプシ
ンの種類に関するものである。本発明者らは、予め処理
してそのリシン残基のε−アミノ基を保護したトリプシ
ンが、優れた結果を与えることを見いだした。好適な保
護基は、アシル基、アルキル基、アルコキシ基等である
。従って、例えば、トリプシンを修飾して、アセチルト
リプシン、トリクロロアセチルトリプシン、クロロアセ
チルトリプシン、トリフルオロアセチルトリプシン、ホ
ルミルトリプシン、カルバモイルトリプシン、ｔ−ブチ
ルオキシカルボニルトリプシン、カルボベンジルオキシ
トリプシン、フェニルカルバモイルトリプシン、スクシ
ニルトリプシン、フタロイルトリプシン、プロピオニル
トリプシン等とすることができる。また、トリプシンの
ε−アミノ基をメチル、エチル、プロピル等によってア
ルキル化することができる。更に、トリプシンのε−ア
ミノ基を保護するのに有用なその他の薬物を使用しても
よい。この種の修飾トリプシンは容易に製造される。 例えば、アシル化トリプシンは、非修飾トリプシンを対
応するアシル無水物で処理することによって製造される
。アセチル化ビーフトリプシンは最も一般的であり、市
販品として入手可能である。これは、ビーフトリプシン
を約ｐＨ６．７にて無水酢酸で処理することによって製
造される。
ンの種類に関するものである。本発明者らは、予め処理
してそのリシン残基のε−アミノ基を保護したトリプシ
ンが、優れた結果を与えることを見いだした。好適な保
護基は、アシル基、アルキル基、アルコキシ基等である
。従って、例えば、トリプシンを修飾して、アセチルト
リプシン、トリクロロアセチルトリプシン、クロロアセ
チルトリプシン、トリフルオロアセチルトリプシン、ホ
ルミルトリプシン、カルバモイルトリプシン、ｔ−ブチ
ルオキシカルボニルトリプシン、カルボベンジルオキシ
トリプシン、フェニルカルバモイルトリプシン、スクシ
ニルトリプシン、フタロイルトリプシン、プロピオニル
トリプシン等とすることができる。また、トリプシンの
ε−アミノ基をメチル、エチル、プロピル等によってア
ルキル化することができる。更に、トリプシンのε−ア
ミノ基を保護するのに有用なその他の薬物を使用しても
よい。この種の修飾トリプシンは容易に製造される。 例えば、アシル化トリプシンは、非修飾トリプシンを対
応するアシル無水物で処理することによって製造される
。アセチル化ビーフトリプシンは最も一般的であり、市
販品として入手可能である。これは、ビーフトリプシン
を約ｐＨ６．７にて無水酢酸で処理することによって製
造される。
【００１７】使用するトリプシンはビーフまたはポーク
トリプシンであるのが好ましく、修飾する場合、アセチ
ル化によって修飾するのが好ましい。トリプシンはアセ
チル化ビーフトリプシンであるのが最も好ましい。
トリプシンであるのが好ましく、修飾する場合、アセチ
ル化によって修飾するのが好ましい。トリプシンはアセ
チル化ビーフトリプシンであるのが最も好ましい。
【００１８】ＨＰＩからデス（６４，６５）ＨＰＩを製
造するに当たり、重要であることがわかった第２のパラ
メーターは、温度である。米国特許第４，５６９，７９
２号で報告された様に、ＨＰＩの消化のための典型的な
温度は、略室温またはそれ以上の温度である。本発明者
らは、ＨＰＩからデス（６４，６５）ＨＰＩを高収率で
製造するには、反応の温度が重要であることを見いだし
た。 反応温度は、好ましくは約０℃から約１０℃、最も好ま
しくはこの範囲の下方端、即ち約０℃から約５℃にする
べきである。
造するに当たり、重要であることがわかった第２のパラ
メーターは、温度である。米国特許第４，５６９，７９
２号で報告された様に、ＨＰＩの消化のための典型的な
温度は、略室温またはそれ以上の温度である。本発明者
らは、ＨＰＩからデス（６４，６５）ＨＰＩを高収率で
製造するには、反応の温度が重要であることを見いだし
た。 反応温度は、好ましくは約０℃から約１０℃、最も好ま
しくはこの範囲の下方端、即ち約０℃から約５℃にする
べきである。
【００１９】重要であることがわかった第３のパラメー
ターは、消化が行われるｐＨである。米国特許第４，５
６９，７９２号に記載されたｐＨは、約７から約７．５
の範囲である。本発明者らは、デス（６４，６５）ＨＰ
Ｉの生成を伴ったＨＰＩ消化をコントロールするために
は、ｐＨをより高く、即ち約８から約１０にするべきで
あることを見いだした。好ましいｐＨ範囲は約８．５か
ら約９．５である。
ターは、消化が行われるｐＨである。米国特許第４，５
６９，７９２号に記載されたｐＨは、約７から約７．５
の範囲である。本発明者らは、デス（６４，６５）ＨＰ
Ｉの生成を伴ったＨＰＩ消化をコントロールするために
は、ｐＨをより高く、即ち約８から約１０にするべきで
あることを見いだした。好ましいｐＨ範囲は約８．５か
ら約９．５である。
【００２０】ｐＨコントロールのためには緩衝化された
媒質を使用するのが通常であるが、本発明者らは更に、
所望のｐＨを維持するその能力だけでなく、緩衝剤の種
類も、デス（６４，６５）ＨＰＩの製造の至適化に重要
であることを見いだした。ＨＰＩ消化で使用するために
は広範な緩衝剤が有用であるが、重炭酸アンモニウムお
よびグリシンの２種類の緩衝剤が、ＨＰＩ消化の優れた
コントロールを与え、所望のデス（６４，６５）ＨＰＩ
の生成することがわかった。この２種類の内、重炭酸ア
ンモニウムが好ましい。
媒質を使用するのが通常であるが、本発明者らは更に、
所望のｐＨを維持するその能力だけでなく、緩衝剤の種
類も、デス（６４，６５）ＨＰＩの製造の至適化に重要
であることを見いだした。ＨＰＩ消化で使用するために
は広範な緩衝剤が有用であるが、重炭酸アンモニウムお
よびグリシンの２種類の緩衝剤が、ＨＰＩ消化の優れた
コントロールを与え、所望のデス（６４，６５）ＨＰＩ
の生成することがわかった。この２種類の内、重炭酸ア
ンモニウムが好ましい。
【００２１】前記の如く、本発明は、前記のパラメータ
ーの全てを組み合わせて使用する必要はない。１種類だ
けが必要である。しかしながら、パラメーターを組み合
わせて使用すると、１またはそれ以上の使用に比較して
至適結果が得られるが、全てのパラメーターを使用する
より、低い結果である。
ーの全てを組み合わせて使用する必要はない。１種類だ
けが必要である。しかしながら、パラメーターを組み合
わせて使用すると、１またはそれ以上の使用に比較して
至適結果が得られるが、全てのパラメーターを使用する
より、低い結果である。
【００２２】本発明の方法によって製造された化合物、
デス（６４，６５）ＨＰＩは、ヒトプロインシュリンに
ついて認められているより実質上大きいインシュリン様
抗−糖尿病効果を示す。例えば、ピーベイ等（Ｐｅａｖ
ｅｙ ｅｔ ａｌ．）， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６０，１３９８９−１３９９４（１９８５）参照。その
インシュリン様活性のために、デス（６４，６５）ＨＰ
Ｉは糖尿病の治療に有用である。従って、これは、種々
の医薬組成物および製剤に使用し得、筋肉内、静脈内、
皮下および腹腔内の様な種々の通常の経路によって投与
することができる。
デス（６４，６５）ＨＰＩは、ヒトプロインシュリンに
ついて認められているより実質上大きいインシュリン様
抗−糖尿病効果を示す。例えば、ピーベイ等（Ｐｅａｖ
ｅｙ ｅｔ ａｌ．）， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６０，１３９８９−１３９９４（１９８５）参照。その
インシュリン様活性のために、デス（６４，６５）ＨＰ
Ｉは糖尿病の治療に有用である。従って、これは、種々
の医薬組成物および製剤に使用し得、筋肉内、静脈内、
皮下および腹腔内の様な種々の通常の経路によって投与
することができる。
【００２３】デス（６４，６５）ＨＰＩを投与する場合
、注射に好適な医薬剤形には、滅菌水性溶液剤または分
散剤、および滅菌注射溶液または分散液に再構成するた
めの滅菌粉剤がある。
、注射に好適な医薬剤形には、滅菌水性溶液剤または分
散剤、および滅菌注射溶液または分散液に再構成するた
めの滅菌粉剤がある。
【００２４】滅菌注射溶液は、計算された量の適当な溶
媒および所望により種々のその他の成分にデス（６４，
６５）ＨＰＩを混合することによって製造することがで
きる。
媒および所望により種々のその他の成分にデス（６４，
６５）ＨＰＩを混合することによって製造することがで
きる。
【００２５】以下に実施例を挙げ、本発明の方法を詳細
に説明するが、これらは、本発明の範囲を限定すること
を意図するものではない。
に説明するが、これらは、本発明の範囲を限定すること
を意図するものではない。
【００２６】実施例
ヒトプロインシュリン（５ｇｍ；組換ＤＮＡ法によ
ってＥ．コリ中で製造）を周囲温度で０．０５Ｍ重炭酸
アンモニウム緩衝剤（ｐＨ９）１６５ｍｌに溶解し、氷
浴で冷却した。カルボキシペプチダーゼＢ（８．５５ｍ
ｇ／ｍｌ水を５８５μｌ）、次いでアセチル化ビーフト
リプシン（０．３ｍｇ／ｍｌ水を９３３μｌ）を加えた
。得られた酵素：基質の重量比は、カルボキシペプチダ
ーゼＢについて１：１０００であり、アセチル化ビーフ
トリプシンについて１：１８，０００であった。この溶
液を氷浴中で穏やかに撹拌した。
ってＥ．コリ中で製造）を周囲温度で０．０５Ｍ重炭酸
アンモニウム緩衝剤（ｐＨ９）１６５ｍｌに溶解し、氷
浴で冷却した。カルボキシペプチダーゼＢ（８．５５ｍ
ｇ／ｍｌ水を５８５μｌ）、次いでアセチル化ビーフト
リプシン（０．３ｍｇ／ｍｌ水を９３３μｌ）を加えた
。得られた酵素：基質の重量比は、カルボキシペプチダ
ーゼＢについて１：１０００であり、アセチル化ビーフ
トリプシンについて１：１８，０００であった。この溶
液を氷浴中で穏やかに撹拌した。
【００２７】２９時間後、１Ｎ ＨＣｌ（２１ｍｌ）を
加えて（最終ｐＨ＝２．７）、反応を停止させた。得ら
れた透明な溶液を全て、５．５×３０ｃｍ Ｃ−１８
Ｖｙｄａｃ ＨＰＬＣカラムに注いだ。水で洗浄した後
、タンパクを、０．５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）緩
衝液中２０−３８％アセトニトリルグラジエントにて８
ｍｌ／分で３２時間、溶離した。２７６ｎｍにおける吸
収によって溶出液をモニターし、数フラクションを、０
．１Ｍ一塩基性リン酸ナトリウム（ｐＨ２．２）緩衝液
中アセトニトリルグラジエントにて、ＨＰＬＣ（Ｃ−８
Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ カラム）によって分析的に
試験した。中程度の純度のデス（６４，６５）プロイン
シュリンを含有している適当なフラクションを集め、凍
結乾燥させて、２．０ｇｍの物質を得た。
加えて（最終ｐＨ＝２．７）、反応を停止させた。得ら
れた透明な溶液を全て、５．５×３０ｃｍ Ｃ−１８
Ｖｙｄａｃ ＨＰＬＣカラムに注いだ。水で洗浄した後
、タンパクを、０．５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）緩
衝液中２０−３８％アセトニトリルグラジエントにて８
ｍｌ／分で３２時間、溶離した。２７６ｎｍにおける吸
収によって溶出液をモニターし、数フラクションを、０
．１Ｍ一塩基性リン酸ナトリウム（ｐＨ２．２）緩衝液
中アセトニトリルグラジエントにて、ＨＰＬＣ（Ｃ−８
Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ カラム）によって分析的に
試験した。中程度の純度のデス（６４，６５）プロイン
シュリンを含有している適当なフラクションを集め、凍
結乾燥させて、２．０ｇｍの物質を得た。
【００２８】この物質を１Ｍ酢酸２００ｍｌに溶解した
。 この溶液の２分の１を５℃にて、１Ｍ酢酸中で平衡化し
た２個の５×２００ｃｍ Ｇ５０−ＳＦセファデックス
カラムそれぞれに入れた。カラムを１Ｍ酢酸中、５℃に
て重力流で流した。溶出フラクションを集め、２７６ｎ
ｍにおける吸収および分析用ＨＰＬＣによって調べた。 適当なフラクションを集め、凍結乾燥させて、ＨＰＬＣ
純度９８％の生成物１．５６ｇｍを得た。この生成物の
構造をアミノ酸組成、Ｎ−末端配列分析、ファースアト
アトムボンバードメント（ＦＡＢ）質量スペクトル、お
よび純粋な標準物質とＨＰＬＣで一緒に溶離することに
よって調べ、デス（６４，６５）−ヒトプロインシュリ
ンであることを確認した。
。 この溶液の２分の１を５℃にて、１Ｍ酢酸中で平衡化し
た２個の５×２００ｃｍ Ｇ５０−ＳＦセファデックス
カラムそれぞれに入れた。カラムを１Ｍ酢酸中、５℃に
て重力流で流した。溶出フラクションを集め、２７６ｎ
ｍにおける吸収および分析用ＨＰＬＣによって調べた。 適当なフラクションを集め、凍結乾燥させて、ＨＰＬＣ
純度９８％の生成物１．５６ｇｍを得た。この生成物の
構造をアミノ酸組成、Ｎ−末端配列分析、ファースアト
アトムボンバードメント（ＦＡＢ）質量スペクトル、お
よび純粋な標準物質とＨＰＬＣで一緒に溶離することに
よって調べ、デス（６４，６５）−ヒトプロインシュリ
ンであることを確認した。
【００２９】以下の表は、上記実施例に記載の方法を使
用して得た結果の分析を示す。本発明方法の有利性を証
明するために、表に記載した様に条件を変更した。これ
らの有利性を、望ましくない副産物であるデス（３１，
３２）ＨＰＩに比較した、得られたデス（６４，６５）
ＨＰＩの量で示す。
用して得た結果の分析を示す。本発明方法の有利性を証
明するために、表に記載した様に条件を変更した。これ
らの有利性を、望ましくない副産物であるデス（３１，
３２）ＨＰＩに比較した、得られたデス（６４，６５）
ＨＰＩの量で示す。
【００３０】
【表１】
Claims (10)
- 【請求項１】 ａ）アルキル化またはアシル化トリプ
シンの使用 ｂ）約０℃から約１０℃の温度 ｃ）約８から約１０のｐＨ、および ｄ）重炭酸アンモニウムおよびグリシンからなる群から
選択される緩衝剤の使用 の１またはそれ以上を含む条件下、トリプシンおよびカ
ルボキシペプチダーゼＢの存在下でヒトプロインシュリ
ンを消化することによるデス（６４，６５）−ヒトプロ
インシュリンの製造方法。 - 【請求項２】 使用するトリプシンがアルキル化また
はアシル化トリプシンである請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 トリプシンが、アセチルトリプシン、
トリクロロアセチルトリプシン、クロロアセチルトリプ
シン、トリフルオロアセチルトリプシン、ホルミルトリ
プシンまたはプロピオニルトリプシンからなる群から選
択される請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 トリプシンがアセチルビーフトリプシ
ンである請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 約０℃から約１０℃、または０℃から
約５℃の温度で消化を行なう請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 約８から約１０のｐＨで消化を行なう
請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 約８．５から約９．５のｐＨで消化を
行なう請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 重炭酸アンモニウムおよびグリシンか
らなる群から選択される緩衝剤の存在下で消化を行なう
請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 アルキル化またはアシル化トリプシン
、および重炭酸アンモニウムおよびグリシンからなる群
から選択される緩衝剤の存在下、約０℃から約１０℃の
温度および約８から約１０のｐＨで消化を行なう請求項
１に記載の方法。 - 【請求項１０】 アセチル化ビーフトリプシンおよび
重炭酸アンモニウムの存在下、約０℃から約５℃の温度
および約８．５から約９．５のｐＨで消化を行なう請求
項１に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/447,486 US5130236A (en) | 1989-12-07 | 1989-12-07 | Process for producing des(64,65)-proinsulin |
| US447,486 | 1989-12-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04271794A true JPH04271794A (ja) | 1992-09-28 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2406317A Withdrawn JPH04271794A (ja) | 1989-12-07 | 1990-12-05 | デス（６４，６５）−プロインシュリンの製造方法 |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5130236A (ja) |
| EP (1) | EP0431926A1 (ja) |
| JP (1) | JPH04271794A (ja) |
| KR (1) | KR910011898A (ja) |
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