JPH04264246A

JPH04264246A - バイオセンサ

Info

Publication number: JPH04264246A
Application number: JP3024601A
Authority: JP
Inventors: Toshihiko Yoshioka; 俊彦吉岡; Shiro Nankai; 史朗南海
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 1991-02-19
Filing date: 1991-02-19
Publication date: 1992-09-21

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、試料中の特定成分と酵
素との反応により還元された電子受容体の還元量を電気
化学的に測定することにより、特定成分を定量するバイ
オセンサに関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、試料中の特定成分について、試料
液の希釈や撹拌などを行なわずに簡易に定量できる方法
として、特願平１−２７４１９４号に下記のようなバイ
オセンサが提案されている。

【０００３】このバイオセンサは、絶縁性の基板上にス
クリーン印刷などの方法で電極系を形成し、上記電極系
上に親水性高分子と酸化還元酵素を含む層、親水性高分
子層および電子受容体を含む層を順に形成したものであ
る。試料液を酵素反応層上へ滴下すると反応層が溶解し
、試料液中の基質との間で酵素反応が進行し、電子受容
体が還元される。酵素反応終了後、この還元された電子
受容体を電気化学的に酸化し、このとき流れる酸化電流
値から試料液中の基質濃度を求めるものである。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】酵素活性および酵素の
安定性は、種々の要因によって影響を受けることが知ら
れているが、水素イオン濃度（ｐＨ）もその一因として
挙げられる。酵素を用いてバイオセンサを構成した場合
に、高い酵素活性が得られるｐＨと安定性が保たれる最
適ｐＨ値は必ずしも一致しない。また、酵素を含む緩衝
液を乾燥させたものは、酵素水溶液を乾燥したものに比
べて保存安定性が低下するといった問題もある。さらに
、試料液中の多成分について同時測定しようとしても、
各酵素の最適ｐＨ値が一致しないために不可能となる場
合がある。

【０００５】本発明はこのような課題を解決するもので
、酵素活性が高くて安定な、多成分の試料を同時に測定
できるバイオセンサを提供することを目的とするもので
ある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】この課題を解決するため
に本発明は、絶縁性の基板上に少くとも測定極と対極か
らなる電極系を複数組設け、前記電極系上にそれぞれ反
応層を設け、さらに、水素イオン濃度制御部を設けたも
のである。

【０００７】

【作用】この構成により、バイオセンサの保存時におい
ては酵素を安定な条件下に保つことができる。また、セ
ンサに供給された試料液が水素イオン濃度制御部に達す
ることによって、試料液のｐＨを最も高い酵素活性が得
られる値にすることができる。試料液を予め緩衝液など
でｐＨ調製する必要がなく、簡易操作が可能となる。

【０００８】さらに、複数組の電極系を用いているため
、試料液中の多成分を同時に測定をする場合には、各酵
素ごとにそれぞれ独立した水素イオン濃度制御部を設け
ることによって、各酵素に応じた最適なｐＨ条件下で酵
素反応を進行させることができ、極めて信頼性の高い多
成分対応のバイオセンサが実現できることとなる。

【０００９】

【実施例】以下に本発明の一実施例のバイオセンサを説
明する。

【００１０】（実施例１）バイオセンサの一実施例とし
て、糖センサについて説明する。糖の種類としては主に
スクロース、グルコース、フルクトースがあり、この３
成分によって果実などの甘味が表現できるため、この３
成分を同時に測定できるバイオセンサを作製した。

【００１１】図１に本発明のバイオセンサの一実施例と
して作製した糖センサのうち反応層および水素イオン濃
度制御部を除いた構成を示す。図２に測定極と対極を除
く糖センサの構成を示す。

【００１２】ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁
性の基板１に、スクリーン印刷により銀ペ−ストを印刷
しリ−ド２、３、４、５を形成した。つぎに、樹脂バイ
ンダーを含む導電性カーボンペーストを印刷し、加熱乾
燥することにより、測定極６、７、８と対極９からなる
電極系を形成した。さらに、電極系を部分的に覆い、電
極の露出部分の面積を一定とし、かつリ−ドの不要部を
覆うように絶縁性ペーストを印刷し、加熱処理をして絶
縁層１０を形成した。

【００１３】つぎに、６、７、８、９の露出部分を研磨
後、空気中で１００℃にて４時間熱処理を施した。この
ようにして電極部分を構成した後、親水性高分子として
カルボキシメチルセルロ−ス（以下ＣＭＣと略す）、酵
素としてグルコースオキシダーゼ（シグマ：ＥＣ１．１
．３．４、以後ＧＯＤと略す）、電子受容体としてフェ
リシアン化カリウムの混合水溶液を、対極９の一部分と
測定極６を覆うようにして展開、４０℃の温風乾燥器中
で１０分間乾燥させて反応層１７を形成した。

【００１４】このように親水性高分子、酵素および電子
受容体の混合溶液を一度に滴下、乾燥させることによっ
て製造工程を簡略化させることができる。また、乾燥時
の温度範囲としては、酵素の失活がみられず、かつ短時
間で乾燥可能な温度ということで２０℃から８０℃まで
が適している。

【００１５】また、反応層１７に用いたＧＯＤのように
ある程度広いｐＨ値域で酵素活性が維持できる酵素を用
い、かつ試料液のｐＨがそれから大きく違わない場合に
は、上記のように水素イオン濃度制御部２０を省くこと
ができる。

【００１６】つぎに、ＣＭＣ、酵素としてフルクトース
デヒドロゲナーゼ（東洋紡：ＥＣ１．１．９９．１１）
、フェリシアン化カリウムの混合水溶液を、対極９の一
部分と測定極７を覆うようにして展開、乾燥させて反応
層１８を形成した。つぎに、図２に示すように、スペー
サー１１の枝分かれした空間部に相当し、かつ反応層１
８より試料供給孔に近い部分にリン酸緩衝液（ｐＨ＝４
．５）を滴下、乾燥して水素イオン濃度制御部２１を形
成した。反応層１８に用いたフルクトースデヒドロゲナ
ーゼはｐＨ＝４．５で酵素活性がほぼ最大値を示す（３
７℃）。この水素イオン濃度制御部２１によって、反応
層１８に達した試料液のｐＨは４．５付近となり、酵素
活性を最大限に引き出すことが可能となる。また、使用
直前まで緩衝液成分と酵素を分離することでセンサの保
存特性を向上させることができる。

【００１７】つぎに、ＧＯＤ（シグマ：ＥＣ１．１．３
．４）、ムタロターゼ（ベーリンガーマンハイム：ＥＣ
５．１．３．３）、インベルターゼ（シグマ：ＥＣ３．
２．１．２６）をＣＭＣ、フェリシアン化カリウムと共
に溶解させた水溶液を対極９の一部分と測定極８を覆う
ようにして展開、乾燥させて反応層１９を形成した。次
に、図２に示すように、スペーサー１１の枝分かれした
空間部に相当し、かつ反応層１９より試料供給孔に近い
部分にリン酸緩衝液（ｐＨ＝４．５）を滴下、乾燥して
水素イオン濃度制御部２２を形成した。ｐＨ＝４．５の
条件下では反応層１９に用いた３種の酵素は共に効率よ
く働くことができる。

【００１８】この場合、水素イオン濃度制御部２１およ
び２２の設定ｐＨ値が同じため、上記の方法の他に、水
素イオン濃度制御部２１、２２を除去し、その代わりに
スペーサー１１の枝分かれしている分岐点のうち反応層
１８および１９への分岐点に相当する部分の基板上にリ
ン酸緩衝液（ｐＨ＝４．５）を滴下、乾燥して水素イオ
ン濃度制御部を形成することもできる。

【００１９】上記のようにして複数の反応層および水素
イオン濃度制御部を形成した後、カバー１２およびスペ
ーサー１１を図１あるいは図２中、破線で示すような位
置関係をもって接着した。試料液の供給量はカバーとス
ペーサーによって生じる空間容積に依存するため、予め
定量する必要がない。さらに、測定中の試料液の蒸発を
最小限に抑えることができ、精度の高い測定が可能とな
る。

【００２０】このようにして作製した糖センサに試料液
としてグルコース、フルクトース、スクロースを含む水
溶液１０μｌを試料供給孔１３より供給し、２分後に対
極を基準にしてそれぞれの測定極にアノード方向へ＋０
．５Ｖのパルス電圧を印加し、５秒後の電流値をそれぞ
れ測定した。測定極１７においてはグルコース濃度に対
応した電流値が得られ、測定極１８においてはフルクト
ース濃度に対応した電流値が、測定極１９においてはグ
ルコースとスクロースの合計濃度に対応した電流値が得
られた。測定極１９と測定極１７から得られた電流値の
差よりスクロース濃度を得ることができた。

【００２１】水素イオン濃度制御部を通過して予め設定
されたｐＨになった試料液がそれぞれの反応層へ到達し
、溶解すると、試料液中の基質は最終的に酵素によって
酸化される。そこで移動した電子によってフェリシアン
化カリウムがフェロシアン化カリウムに還元される。つぎに、上記のパルス電圧の印加により、生成したフェ
ロシアン化カリウムの濃度に基づく酸化電流が得られ、
この電流値は試料液中の基質濃度に対応した。

【００２２】センサ応答電流値は上記糖センサのうち水
素イオン濃度制御部を除いて作製した糖センサに比べて
約２０％の向上が認められた。これより、水素イオン濃
度制御部を設けることで高感度なバイオセンサが得られ
ることがわかる。

【００２３】（実施例２）ポリエチレンテレフタレート
からなる絶縁性の基板上に、実施例１と同様にしてスク
リーン印刷により第１図に示した電極部分と同じものを
形成し、研磨、熱処理を行った。つぎに、図２に示すよ
うに、スペーサー１１の枝分かれした空間部に相当し、
かつ反応層１７に相当する部分より試料供給孔に近い部
分に、フェリシアン化カリウムをリン酸緩衝液（ｐＨ＝
５．６）を滴下、加熱乾燥してフェリシアン化カリウム
を含む水素イオン濃度制御部２０を形成した。さらに、
フェリシアン化カリウムを含むリン酸緩衝液（ｐＨ＝４
．５）を滴下、加熱乾燥してフェリシアン化カリウムを
含む水素イオン濃度制御部２１、２２を形成した。この
場合においても、実施例１と同様に水素イオン濃度制御
部２１、２２を一つにまとめることが可能である。

【００２４】このフェリシアン化カリウムを含む水素イ
オン濃度制御部を作製する際の加熱温度によって乾燥に
要する時間が変化し、その結果フェリシアン化カリウム
の結晶粒径をコントロールすることができる。乾燥時間
を短くすると結晶粒径は小さくなり、試料液への溶解速
度が高められる。よってセンサ応答速度を速くすること
が可能である。フェリシアン化カリウムが反応層中で酵
素と共存している場合には、加熱によって酵素活性が低
下するため、自由に加熱乾燥することはできない。さら
に、水素イオン濃度制御部にフェリシアン化カリウムを
含ませることによって、センサ作製後、使用直前まで酵
素とフェリシアン化カリウムを分離することができ、セ
ンサの保存特性を著しく向上させることができる。

【００２５】つぎに、ＧＯＤを０．５ｗｔ％ＣＭＣ水溶
液に溶かしたものを、対極９の一部分と測定極６を覆う
ようにして展開し、乾燥させて反応層１７を形成した。つぎに、フルクトースデヒドロゲナーゼを０．５ｗｔ％
ＣＭＣ水溶液に溶かしたものを、対極９の一部分と測定
極７を覆うようにして展開、乾燥させて反応層１８を形
成した。さらに、ＧＯＤ、ムタロターゼ、インベルター
ゼを０．５ｗｔ％ＣＭＣ水溶液に溶解させたものを対極
９の一部分と測定極８を覆うようにして展開、乾燥させ
て反応層１９を形成した。最後に実施例１と同様にスペ
ーサー、カバーと共に一体化して糖センサを作製した。

【００２６】このようにして作製した糖センサに、実施
例１と同様にして、試料液としてグルコース、フルクト
ース、蔗糖を含む水溶液１０μｌを試料供給孔１３より
供給し、２分後のセンサセンサ応答電流を測定したとこ
ろ、実施例１と同様に各電極間の電流値より試料液中の
各成分濃度を得ることができた。

【００２７】センサ応答の時間依存性を調べたところ、
実施例１の構成のものに比べて、フェリシアン化カリウ
ムを水素イオン濃度制御部に含むものの方が、より速い
センサ応答が得られた。これは、フェリシアン化カリウ
ムを含む水素イオン濃度制御部を作製する際、温度を制
御することによってフェリシアン化カリウムの結晶粒径
がより小さくなり、その結果、試料液に対する溶解速度
が高まって、全体の反応速度が高められたことによる。

【００２８】なお、上記実施例１および２では糖センサ
について示したが、本発明は、酵素としてアルコールオ
キシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、コレステロールオキシ
ダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダー
ゼなどの酵素を自由に組み合わせることによって、グル
コース、アルコール、乳酸、コレステロールなど試料液
中の測定対象成分に応じたバイオセンサを構成すること
ができる。

【００２９】また、上記実施例１および２では３成分の
同時測定について述べたが、本発明はこれに限定される
ものではなく、電極系の数を増やすことによってより多
成分の同時測定を行うこともできる。

【００３０】上記実施例１および２では親水性高分子と
してＣＭＣを用いたが、本発明はこれに限定されるもの
ではなく、ビニルアルコール系、セルロース系、ビニル
ピロリドン系、ゼラチン系、アクリル酸塩系、デンプン
系、無水マレイン酸系、アクリルアミド系、メタクリレ
ート樹脂などを用いてもそれぞれ同様の効果が得られた
。

【００３１】また、上記実施例１および２では、各電極
系を測定極と対極の二極電極系としたが、参照極を加え
た三電極方式にすれば、より正確な測定が可能である。

【００３２】さらに、電子受容体としては、上記実施例
１および２に示したフェリシアン化カリウム以外に、ｐ
−ベンゾキノン、フェナジンメトサルフェート、フェロ
センなどのレドックス化合物も使用できる。

【００３３】一方、水素イオン濃度制御部にはリン酸緩
衝液を用いたが、本発明はこれに限定されるものではな
く、用いる酵素の最も高い酵素活性が得られるｐＨを得
る緩衝液を自由に用いることができる。酢酸緩衝液のよ
うな常温で液体のものであっても、保液性の高い高分子
と共に用いることによって水素イオン濃度制御部を構成
することができる。

【００３４】

【発明の効果】以上の実施例の説明からも明らかなよう
にように本発明によれば、試料液中の複数成分について
、試料の水素イオン濃度を予め調整することなく、酵素
の特性に応じた最適な水素イオン濃度を設定することが
できる。その結果、一回の試料供給で複数成分について
、より短い時間で高精度な測定のできるバイオセンサが
得られる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例のバイオセンサの、反応層お
よび水素イオン濃度制御部を除いた糖センサの分解斜視
図。

【図２】同バイオセンサの実施例の糖センサの測定極と
対極を除いた糖センサの分解斜視図。

【符号の説明】

１　　絶縁性の基板２，３，４，５　　リード６，７，８　　測定極９　　対極１０　　絶縁層１１　　スペーサー１２　　カバー１３　　試料供給孔１４，１５，１６　　空気孔１７，１８，１９　　反応層

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　絶縁性の基板上に形成した、測定極と
対極を主体とする複数組の電極系と、前記電極系上に設
けた親水性高分子と酵素と電子受容体を主体とする複数
の反応層と、水素イオン濃度制御部を主体として構成し
たバイオセンサ。
【請求項２】　　絶縁性の基板上に形成した、測定極と
対極を主体とする複数組の電極系と、前記電極系上に設
けた親水性高分子と酵素を主体とする複数の反応層と、
電子受容体を含む水素イオン濃度制御部を主体として構
成したバイオセンサ。