JPH04159252A - ホスホリパーゼａ↓２阻害物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、新規なホスホリパーセＡ、阻害物質に関し、
さらに詳しくは、チェラビア属に属する菌株、例えばチ
ェラビア・テリコーラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ　ｔｅｒｒ
ｉｃｏｌａ）ＲＦ−１４３株またはその変異体を液中好
気性条件下に培養することにより産生されるホスホリバ
ーセＡ、阻害作用を有する生理活性物質に関するもので
ある。また、本発明は、該化合物を産生ずるチェラビア
属に属する菌株、例えばチェラビア・テリコーラＲＦ−
１４３株またはその変異体を培養し、培養液から該化合
物を採取することを特徴とする該化合物の製造方法に関
するものである。

［従来技術および発明か解決しようとする課題３ホスホ
リパーゼＡ、は多くの生物の細胞や分ｄ・液に含有され
ており、リン脂質に特異的に作用するエステラーゼであ
って、１，２−ジアンルグリセロールリン脂質のＣ−２
位の脂肪酸エステルを特異的に加水分解し、リゾグリセ
ロリン脂質と脂肪酸とを生成することが知られている。

その酵素活性に関連して、神経、筋肉、心臓への毒性作
用、抗凝固作用を有し、痙彎、低血圧、溶血、出血、浮
腫などを誘発し得ることか指摘されており、その他の疾
患にも直接または間接的に関与している可能性がある。

したかって、ホスホリパーゼＡ２の酵素活性に対する阻
害物質か得られれば、該酵素の作用に起因または関連す
る様々な病態を制限し、治療することができると考えら
れる。従来知られているホスホリパーゼＡ、阻害物質に
は、メバクリン、ｐ−プロモフェナンルブロミトなどか
あるが、新たな有効物質が待たれている。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、先に、チェラビア・テリコーラＲＦ−１
４３株が産生ずるチエロジンαおよびβが優れたホスホ
リパーゼＡ、阻害活性を有することを見い出し、これを
特許出願したが（特願平１−１０９９３９）、更に研究
を続けた結果、上記菌株かチエロジンとは構造を異にす
る新規なホスホリパーゼＡ、阻害物質を生産しているこ
とを見い出し、かつ、その構造を決定することにより、
本発明を完成したものである。

即ち、本発明は、チェラビア・テリコーラＲＦ−１４３
株を培養することにより産生され得る、ホスホリパーゼ
Ａ、阻害作用を有する生理活性物質である化合物および
その製造方法を提供するものである。

本発明の化合物の構造式および物理化学的性状を以下に
列挙する。

構造式 （式中、Ｒ１およびＲ２は、互いに異なってＨまたはＣ
Ｈ，を表わす）。

上記の一般式で示される化合物は、具体的には以下の化
合物（Ｉ）および（ＩＩ）を包含する。

（以下余白） 化合物（１） 化合物（Ｉｆ） （以下余白） 化合物（１）および（ＩＩ）の物理化学的性状ａ・ンリ
カケル（メルク）；酢酸エチル・ＭｅＯＨ（２：Ｉ）ｂ
：ガスクロマトグラフィに於ける保持容量５カラム・ヌ
クレオンル５Ｃ，，（４，６φＸ　１５０ｘｍ）、流速
：１．８ｘｇ／分、検出：２３０ｒ＋ｍ］ 本発明化合物の塩としては、Ｎａ、になどアルカリ金属
、Ｍｇ、Ｃａなとアルカリ土類金属、アンモニアなどの
好機塩基なと本発明化合物のカルホキシ基と塩を形成し
得るすべての塩基との塩か例示され、製薬上許容し得る
塩が好ましい。

ホスホリパーゼＡ、阻害物質である本発明化合物を産生
ずるチェラビア・テリコーラＲＦ−１４３株は、通商産
業省工業技術院微生物工業技術研究所に、受託番号微工
研条寄第２１９６号の下で寄託されている（寄託日：昭
和６３年１２月１９日）。

本発明で使用されるチェラビア・テリコーラＲＦ−１４
３の菌学的性状は以下の通りである。

ＲＦ−１４３株の栄養菌糸はコーンミール寒天上で肉眼
的に白色を呈する。子のう果（ａｓｃｏｃａｒｐ）は寒
天培地の表面に形成され、その形は球形で茶黒色を呈す
る。その大きさは直径１００〜３００μＲで、外壁の表
面組織（ｔｅｘｕｔｒａ　ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄｅａ）
は茶色である。子のうは３０〜３５Ｘ１５〜１７μｌの
大きさで、洋ナシ形を示し、その中に８個の子のう胞子
を有する。子のうは成熟時には溶解する。子のう胞子は
幅の広い紡錘形をしており、オリーブ色から茶灰色を呈
し、その一端に１個の発芽孔を有する。子のう胞子の大
きさは１２〜１８Ｘ６〜８μｌである。本菌の不完全世
代は認められない。

以上の性状からＲＦ−１４３株はチェラビア・テリコー
ラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ　ｔｅｒｒｉｃｏｌａ”）と同
定された。

参考文献 ｌ）　シー・ダブりニー・エモンズ（Ｃ，Ｉｔ、　Ｅｍ
ｍ。

ｎｓ）、Ｂｕｌｌ、　Ｔｏｒｒｅｙ　Ｂｏｔ、　Ｃ１ｕ
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ｒａｎｓ。

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、　Ａ、　ｖｏｎＡｒｘ）、　５ｔｕｄ、　Ｍｙｃｏｌ
、　　８．　８（１９７５）チェラビア・テリコーラも
菌類の特徴として、突然変異を起こす可能性がある。そ
のような突然変異体は、自然発生的にも出現するが、当
業者周知の物理的または化学的な方法で容易に誘導する
ことができる。従って、充分量の本発明化合物を産生ず
る能力を保持しているチェラビア・テリコーラＲＦ−１
４３の変異体もまた本発明の範囲に包含されるというこ
とが当業者には理解されるであろう。

チェラビア・テリコーラＲＦ−１４３の培養には、通常
の培養法を利用することができる。適当な炭素源、窒素
源、無機塩、および微量金属等の存在下、好気性条件下
で液中培養することが好ましい。通常、チェラビア・テ
リコーラＲＦ−１４３を温度約２０〜４０℃、好ましく
は２８°Ｃで通気しながら振盪フラスコ培養すると、約
°１〜１０日間培養すればよい。次いで、培養物からの
生成物の分離における当業者既知の方法で本発明化合物
を分離すればよい。即ち、培養物を濾過して濾液および
沈殿（菌体成分）をそれぞれ適当な溶媒で抽出し、得ら
れた抽出液を濃縮して溶媒抽出、クロマトグラフィー処
理等によって活性物質を単離する。

本発明に係る化合物のホスホリパーゼＡ、５０％阻害濃
度（ホスホリパーゼＡ、活性を５０％阻害する濃度）は
、ヘビ毒由来のホスホリパーゼＡ、に対しては、化合物
（ｒ）に於いて１．５μｙ／ｘ（ｌであり、ラット血小
板由来のホスホリパーゼＡ、に対し士は、化合物（１）
が０．５９μ９／ｘ（１、化合物（ｎ）が０．３μ９／
ｙ（ｌである。従って、本発明の化合物は、ホスホリパ
ーゼＡ、の酵素活性に起因する様々な疾患の予防および
治療に有用と考えられる。

以下に実施例を挙げ、本発明の詳細な説明する。

実施例１ １）発酵 チェラビア・テリコーラＲＦ−１４３株（微工研条寄第
２１９６号）をバレインヨブドウ糖寒天斜面で７〜１０
日間、２８°Ｃで培養し、−斜面の全菌体および胞子を
２Ｌ容量のエルシンマイヤーフラスコ中の培地８００Ｊ
ｒＩ２（培地組成ニブドウ糖２．０％、ポリペプトン１
．０％、肉エキス０．３％、酵母エキス０．２％、食塩
０．１％、ｐＨ７，０）に植菌した。植菌されたフラス
コを２８℃で２日間振盪培養した。上記培養液（８００
＋ｖのを２ＯＬの上記組成の培地を含む３０Ｌのシャー
・ファーメンタ−に加え、２８℃で１日間、通気撹拌培
養を行った（通気量２０Ｌ／分、撹拌１５０　ｒｐｍ）
。

次に上記の培養液６Ｌをバレイショ浸出液（２００９／
　Ｌ　）およびショ糖（２０ｇ／Ｌ）組成の培地（ｐＨ
無修正Ｈ５０Ｌを含む２５０Ｌ発酵タンクに移した。発
酵は、２８℃で、開始時から１６時間までは１２Ｏｒｐ
ｍ、その後は３７０　ｒｐｍで撹拌し、通気量は１５０
Ｌ／分（１，ＯＶＶＭ）で７日間通気撹拌培養を行った
。

２）単離 上記１）で得た発酵液３５６Ｌを希塩酸でｐＨ２５に調
整味ろ過した。菌体部分をアセトノ１０８して抽出、抽
出液（ｐＨ３，８）を減圧下で濃縮した。水層（’３０
Ｌ）をｐＨ２，５に調整し、酢酸エチル（２５Ｌ）で抽
出した。抽出液を減圧下で濃縮し、石油エーテル（２Ｌ
）を加えて沈澱を生じさせた。

得られた粗抽出物４４８ｇをアセトン（３，６Ｌ）に溶
解し、２００ｍＭ　　リン酸バッフｙ　　（ＰＢ）（ｐ
Ｈ７５，８，４Ｌ）を加え、これをＣＨＰ−２０Ｐカラ
ム（２ＯＬ）にかけた。アセトン：３％ＮａＣＱ−２０
ｍＭ　ＰＢ（ｐＨ７，５）−３：　７の混液（１０Ｌ）
で洗浄し、次いてアセトン＝３％ＮａＣ１！−２０ｍＭ
　ＰＨ（ｐＨ７，５）＝３　：　７の混液（３０Ｌ）と
アセトン：　２０ｍＭ　ＰＢ（ｐＨ７，５）−７：　３
の混液（３０Ｌ）とのりニア−グラジェントにより溶出
した。この溶出により下表のごとくＡ分画（２２゜０９
）、Ｂ分画（２４，６９）、Ｃ分画（１０８ｇ）および
Ｂ分画（１７，６９）を得、Ｂ分画を更に次の様に処理
した。

分画　　　Ｆｒ、Ｎｏ　　　　容量（Ｌ）−１〜　７　
　　３．２ Ａ　　　　　　８〜１８　　　　８．１８　　　　１９
〜２６　　　　３．６ Ｃ３０〜３３　　　　４．８ Ｄ　　　　　３４〜３５　　　９０ Ｄ分画（２６５ｍｇ）を調製用シリカゲル薄層クロマト
グラフィー（Ｍｅｒｃｋ）にかけ、酢酸エチル：ＭｅＯ
Ｈ（４：　１）溶媒系で展開し、Ｒｆ値０．２９の画分
を集め、クロロホルム：ＭｅＯＨ（１：　１）で溶出し
、溶媒を留去して１１８ｊ１ｇの残留物を得た。

これを調製用高速液体クロマトグラフィーにかけた［カ
ラム：ヌクレオシルアｃ＋ｓ（２φＸ　２０　ｃｍ）、
溶出液二０．１％　リン酸含有５１％水性ＣＨ３ＣＮ４
０．１％リン酸含有５８６％水性ＣＨ，ＣＮによるリニ
アーグラジェント（２２分）、流速：１８ｘＱ１分、検
出：ＵＶ２５０ｎｍ］。保持時間１５分の画分を集めて
減圧下に濃縮し、残留物を酢酸エチルで抽出した。抽出
液を水洗し、Ｎａ、Ｓｏ。

で乾燥し、減圧下で溶媒を留去し、残留物を酢酸エチル
−石油エーテルで処理して化１１１（１）５３肩９を得
た。

保持時間１８．６分の画分を同様に処理して化合物（Ｉ
Ｉ）８１９を得た。得られた化合物はいずれも、先に示
した物理化学的性状を示した。

以下の実験例に示す方法で本発明化合物のホスホリパー
セＡ、阻害活性を調べた。

実験例１ 方法 基質には、Ｌ−３〜ホスフアチジルエタノールアミン、
■−バルミトイルー２−［１−”Ｃ］リルオイル（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ社、　　５９　ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）を、Ｌ
−α−ホスファチジルエタノールアミン（Ｓ　ｉｇｍａ
社。

卵白由来）により希釈（２、ＯＯＯｄｐｍ／　ｎｍｏｌ
）　Ｌ、これをソニケートしたものを用いた。ＰＬＡ、
には、ヘビ毒由来およびラット血小板由来のものを使用
した。反応は、トリスバッファー（０，１Ｍ。

ｐＨ７，４）、ＣａＣｆｆ、（３ｍＭ）の溶液中にＰＬ
Ａ、および基質調整液を加え、３７°Ｃで２０分間反応
後にドールズ試薬１．２５ｍρを入れ直ちに撹拌し反応
を止めた。これに蒸留水０　５ｘＱとｎ−ヘプタン０．
８ｘＱを加え撹拌後遠心し、上層を別に分取した。さら
にｎ−へブタン０．８ｉ（！とンリカケルを加え撹拌後
、遠心し上清をバイアル瓶に分取し、これにトルエンカ
クテルを加え、液体シンチレーションカウンターにより
ＰＬＡ、によって遊離されてくる脂肪酸量を測定した。

阻害活性を酵素対照（コントロール）の′値に対するパ
ーセント（％）で表し、これより５０％阻害濃度を算出
した。

結釆 ホスホリパーゼＡ、の活性を５０％阻害する濃度は、ヘ
ビ毒由来のホスホリパーセＡ、に対しては、化合物（１
）に於いては１．５μ９／ｄ、ラット血小板由来のホス
ホリパーセＡ、に対しては、化合物（１）が０５９μ９
／ｚρ、化合物（ＩＩ）が０３μ９／度ｇであった。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は、それぞれ本発明化合物（１）お
よび（Ｉ［）の赤外吸収スペクトルを示すグラフである
。 特許出願人　塩野義製薬株式会社 代理人弁理士青山　葆（外１名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＾１およびＲ＾２は、互いに異なってＨまた
   はＣＨ＿３を表わす） で示される化合物またはその塩。 ２、請求項１記載の化合物を産生するチエラビア属に属
   する菌株を培養液中好気性条件下で培養し、該培養液か
   ら該化合物を採取することを特徴とする該化合物の製造
   方法。