JPH04158798A - 酵素活性の測定方法 - Google Patents
酵素活性の測定方法Info
- Publication number
- JPH04158798A JPH04158798A JP28134790A JP28134790A JPH04158798A JP H04158798 A JPH04158798 A JP H04158798A JP 28134790 A JP28134790 A JP 28134790A JP 28134790 A JP28134790 A JP 28134790A JP H04158798 A JPH04158798 A JP H04158798A
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- JP
- Japan
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- reaction
- enzyme
- measuring
- substrate
- enzyme activity
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- Pending
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は酵素活性の測定方法に関するものであり、更に
詳しくは酵素反応における反応熱量を測定することによ
り酵素活性の測定を行う方法に関する。
詳しくは酵素反応における反応熱量を測定することによ
り酵素活性の測定を行う方法に関する。
生化学的反応における酵素活性を測定及び評価する方法
としては、従来、例えば、検圧法、酸素電極法、分光光
度法１、蛍光法、滴定法等が知られている。
としては、従来、例えば、検圧法、酸素電極法、分光光
度法１、蛍光法、滴定法等が知られている。
〔発明が解決しようとする課題］
しかし、上記の方法には、測定結果が温度、溶媒、ｐＨ
等の測定条件などの影響を受けるため不安定である、経
時的な連続測定が不可能である、測定の対象となる酵素
の種類が限定される等の欠点がある。
等の測定条件などの影響を受けるため不安定である、経
時的な連続測定が不可能である、測定の対象となる酵素
の種類が限定される等の欠点がある。
そこで、本発明は、反応条件、測定条件等の影響を受け
ず、経時的に連続測定が可能で、しかも再現性の高い測
定結果が得られる酵素活性の測定方法を提供することを
課題とするものである。
ず、経時的に連続測定が可能で、しかも再現性の高い測
定結果が得られる酵素活性の測定方法を提供することを
課題とするものである。
本発明は上記の課題を解決するため、
酵素と基質の反応において発生する反応熱量を測定する
ことからなる酵素活性の測定方法を提供するものである
。
ことからなる酵素活性の測定方法を提供するものである
。
酵素反応に伴う反応熱の存在は従来から知られているが
、本発明は、この反応熱量を酵素活性の測定に利用する
ことにより、時間とともに変化する酵素活性を経時的か
つ連続的に評価することが可能である。
、本発明は、この反応熱量を酵素活性の測定に利用する
ことにより、時間とともに変化する酵素活性を経時的か
つ連続的に評価することが可能である。
■素
本発明の方法は、酵素反応に発熱あるいは吸熱の反応熱
を伴う酵素に適用可能である。また反応基質は、測定す
る酵素に対して反応する基質が使用可能である。
を伴う酵素に適用可能である。また反応基質は、測定す
る酵素に対して反応する基質が使用可能である。
本発明の方法によって酵素活性を測定できる酵素として
は、例えば、グルコアミラーゼ等の加水分解酵素、グル
コースイソメラーゼ等の添加酵素、グルコースオキシダ
ーゼ等の酸化酵素などが挙げられる。
は、例えば、グルコアミラーゼ等の加水分解酵素、グル
コースイソメラーゼ等の添加酵素、グルコースオキシダ
ーゼ等の酸化酵素などが挙げられる。
測定される酵素は、固定化されていても、また固定化さ
れていなくてもよい。固定化する場合、固定化方法は公
知の何れの方法でもよく、例えば担体結合型、格子内包
捨型、架橋型、ミクロカプセル内包括型等がある。その
際に用いられる担体には、例えばポリスチレン、ポリウ
レタン、シリコン等の合成有機高分子、または例えばガ
ラス、シリカ、セラミックス等の合成無機高分子等が挙
げられるが、その他酵素や反応基質影響を与えない限り
いずれの担体も使用可能である。
れていなくてもよい。固定化する場合、固定化方法は公
知の何れの方法でもよく、例えば担体結合型、格子内包
捨型、架橋型、ミクロカプセル内包括型等がある。その
際に用いられる担体には、例えばポリスチレン、ポリウ
レタン、シリコン等の合成有機高分子、または例えばガ
ラス、シリカ、セラミックス等の合成無機高分子等が挙
げられるが、その他酵素や反応基質影響を与えない限り
いずれの担体も使用可能である。
勇足１！
反応熱の測定手段としては、例えば熱電対、サーミスタ
、白金測温抵抗体等の測温体を使用することができる０
代表的な測定装置は、恒温槽中で酵素を反応させ、その
反応熱量を測定する装置である。
、白金測温抵抗体等の測温体を使用することができる０
代表的な測定装置は、恒温槽中で酵素を反応させ、その
反応熱量を測定する装置である。
測温体は、１０−４℃以上の精度で温度変化を検出可能
であることを必要とし、好ましくはサーミスタである。
であることを必要とし、好ましくはサーミスタである。
恒温槽は槽内温度を精密に制御可能であることが必要で
あり、２５°Ｃ±０．１ ”Ｃの範囲で制御可能である
ことが好ましい。
あり、２５°Ｃ±０．１ ”Ｃの範囲で制御可能である
ことが好ましい。
かかる測定装置の具体例を第１図に示す。この装置は、
恒温槽１内に反応容器２が収納され、該反応容器２の底
に測温体３が接続されている。反応容器２内には反応基
質を溶解した溶液４が入れられ、その中に酵素封入アン
プル５を配置しである。該装置には、攪拌機６が備わり
溶液４を攪拌できるようになっている。酵素封入アンプ
ル中５には、例えば固定化されたジアスターゼのような
酵素が封入されており、このアンプルを破壊することに
より酵素と基質を接触させ、反応を開始させるものであ
る。以下に実施例を示す。
恒温槽１内に反応容器２が収納され、該反応容器２の底
に測温体３が接続されている。反応容器２内には反応基
質を溶解した溶液４が入れられ、その中に酵素封入アン
プル５を配置しである。該装置には、攪拌機６が備わり
溶液４を攪拌できるようになっている。酵素封入アンプ
ル中５には、例えば固定化されたジアスターゼのような
酵素が封入されており、このアンプルを破壊することに
より酵素と基質を接触させ、反応を開始させるものであ
る。以下に実施例を示す。
〔実施例１〕
固定化する担体としてシャモットを用い、その表面にシ
ランカップリング剤としてＴ−アミノプロピルトリエト
キシシランを付与し、カップリング反応が終了した後、
該表面上にジアスターゼを固定化した。この固定化酵素
を５ ｃｃのガラスアンプル中に封入した。一方、反応
基質としてデンプンを濃度３重量％で含む水溶液２０ｃ
ｃ （デンプンとして６００■）をステンレス製の容量
１００ｃｃの反応容器に入れ、この中に前記の該ガラス
アンプルを置いた０次に、この反応容器を恒温槽内に装
填した。
ランカップリング剤としてＴ−アミノプロピルトリエト
キシシランを付与し、カップリング反応が終了した後、
該表面上にジアスターゼを固定化した。この固定化酵素
を５ ｃｃのガラスアンプル中に封入した。一方、反応
基質としてデンプンを濃度３重量％で含む水溶液２０ｃ
ｃ （デンプンとして６００■）をステンレス製の容量
１００ｃｃの反応容器に入れ、この中に前記の該ガラス
アンプルを置いた０次に、この反応容器を恒温槽内に装
填した。
恒温槽により反応容器中の温度が２５°Ｃ±０．１℃の
範囲に保たれたことを確認した後、テフロン棒によりガ
ラスアンプルを破壊した。攪拌機により反応溶液を攪拌
しながら、反応熱によるサーミスタの抵抗の経時の変化
を電圧に変換して測定した。
範囲に保たれたことを確認した後、テフロン棒によりガ
ラスアンプルを破壊した。攪拌機により反応溶液を攪拌
しながら、反応熱によるサーミスタの抵抗の経時の変化
を電圧に変換して測定した。
結果を第２図に示す、サーミスタの電圧変化曲線と横軸
（時間軸）に囲まれた部分の面積を計算することにより
、発生した全反応熱量は１ 、０４ｃａ ｌであること
がわかった。
（時間軸）に囲まれた部分の面積を計算することにより
、発生した全反応熱量は１ 、０４ｃａ ｌであること
がわかった。
［実施例２］
実施例１と同様にしてジアスターゼをシャモットに固定
化した後、これを３重量％のデンプン水溶液５０ｇ（デ
ンプンとして１５００■）と十分に反応させた。その後
、該固定化酵素をよく洗浄した後にガラスアンプルに封
入して使用した以外は、実施例１と同様にして反応熱に
よるサーミスタの電圧の経時的変化を測定した。
化した後、これを３重量％のデンプン水溶液５０ｇ（デ
ンプンとして１５００■）と十分に反応させた。その後
、該固定化酵素をよく洗浄した後にガラスアンプルに封
入して使用した以外は、実施例１と同様にして反応熱に
よるサーミスタの電圧の経時的変化を測定した。
結果を第２図に示す、実施例１と同様にして、発生した
全反応熱量は１．０７ｃａｌであることがわがった。
全反応熱量は１．０７ｃａｌであることがわがった。
また、反応に関与した酵素の量を測定するため、反応終
了後のシャモットを室温から１０００℃まで加熱するこ
とにより得られた重量減少量は、実施例１ではシャモッ
ト１ｇ当り５９．８■、実施例２ではシャモット１ｇ当
り３４．０■であった。
了後のシャモットを室温から１０００℃まで加熱するこ
とにより得られた重量減少量は、実施例１ではシャモッ
ト１ｇ当り５９．８■、実施例２ではシャモット１ｇ当
り３４．０■であった。
以上のことから、第２図において測温体の電圧の変化の
曲線をｆ（ｔ）とすると、ｆ（ｔ）は時間ｔにおいて基
質と反応している全酵素量（活性部位数が２以上のとき
は全活性部位量）に比例し、反応初期のｄｆ（ｔ）／ｄ
ｔは酵素の反応速度に比例し、全反応熱量５ｆ（ｔ）ｄ
ｔ（ｔ・０〜ｏｏ）は、基質量または反応生成物量に比
例することわかった。
曲線をｆ（ｔ）とすると、ｆ（ｔ）は時間ｔにおいて基
質と反応している全酵素量（活性部位数が２以上のとき
は全活性部位量）に比例し、反応初期のｄｆ（ｔ）／ｄ
ｔは酵素の反応速度に比例し、全反応熱量５ｆ（ｔ）ｄ
ｔ（ｔ・０〜ｏｏ）は、基質量または反応生成物量に比
例することわかった。
本発明の酵素活性の測定方法は、反応条件、測定条件等
の影響を受けず、経時的に連続測定が可能で、しかも再
現性の高い測定結果が得られる。
の影響を受けず、経時的に連続測定が可能で、しかも再
現性の高い測定結果が得られる。
例えば研究または生産の手段等に用いられる酵素反応に
おいて、それらに使用される酵素の活性を評価し判断す
るのに有用である。
おいて、それらに使用される酵素の活性を評価し判断す
るのに有用である。
第１図は、本発明の方法の実施に用いる装置例の概念図
であり、第２図は、実施例１及び２により得られた、時
間経過に対する測温体の電圧変化を示したグラフである
。
であり、第２図は、実施例１及び２により得られた、時
間経過に対する測温体の電圧変化を示したグラフである
。
Claims (1)
- 酵素と基質の反応において発生する反応熱量を測定する
ことからなる酵素活性の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28134790A JPH04158798A (ja) | 1990-10-19 | 1990-10-19 | 酵素活性の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28134790A JPH04158798A (ja) | 1990-10-19 | 1990-10-19 | 酵素活性の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04158798A true JPH04158798A (ja) | 1992-06-01 |
Family
ID=17637845
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28134790A Pending JPH04158798A (ja) | 1990-10-19 | 1990-10-19 | 酵素活性の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04158798A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6720675B2 (en) | 2001-03-30 | 2004-04-13 | Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha | Power converter |
| US7087413B2 (en) | 1994-07-01 | 2006-08-08 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | Hyaluronan synthase gene and uses thereof |
-
1990
- 1990-10-19 JP JP28134790A patent/JPH04158798A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7087413B2 (en) | 1994-07-01 | 2006-08-08 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | Hyaluronan synthase gene and uses thereof |
| US6720675B2 (en) | 2001-03-30 | 2004-04-13 | Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha | Power converter |
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