JPH04126080A - 耐熱性キシロースイソメラーゼの製造方法 - Google Patents
耐熱性キシロースイソメラーゼの製造方法Info
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- JPH04126080A JPH04126080A JP24549090A JP24549090A JPH04126080A JP H04126080 A JPH04126080 A JP H04126080A JP 24549090 A JP24549090 A JP 24549090A JP 24549090 A JP24549090 A JP 24549090A JP H04126080 A JPH04126080 A JP H04126080A
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- Japan
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- xylose isomerase
- thermohydrosulfuricum
- production
- gene
- fructose
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
（以下、Ｃ，サーモハイドロスルフリカムと略記する）
の耐熱性キシロースイソメラーゼを高い生産性で製造す
る方法に関する。
の耐熱性キシロースイソメラーゼを高い生産性で製造す
る方法に関する。
キシロースイソメラーゼは、Ｄ−キシロースとＤ−キシ
ルロースの相互変換を触媒する酵素であると同時にグル
コースをフラクトースに変換する能力も有し、工業的に
重要である。
ルロースの相互変換を触媒する酵素であると同時にグル
コースをフラクトースに変換する能力も有し、工業的に
重要である。
一方、Ｃ，サーモハイドロスルフリカムは、高熱性細菌
の一種であり、ＡＴＣＣ３３２２３の寄託番号が付され
ている。
の一種であり、ＡＴＣＣ３３２２３の寄託番号が付され
ている。
Ｃ，サーモハイドロスルフリカムがキシロースイソメラ
ーゼを産生ずることは、従来から知られていた［Ｊ、Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、 １６４．１１４６−１１５２（１
９８５）参照〕しかし、Ｃ，サーモハイドロスルフリカ
ムのキシロースイソメラーゼ遺伝子は知られておらず、
本発明者らはその配列を決定し、先に特許出願した〔特
願平２−４４７１６号〕。
ーゼを産生ずることは、従来から知られていた［Ｊ、Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、 １６４．１１４６−１１５２（１
９８５）参照〕しかし、Ｃ，サーモハイドロスルフリカ
ムのキシロースイソメラーゼ遺伝子は知られておらず、
本発明者らはその配列を決定し、先に特許出願した〔特
願平２−４４７１６号〕。
ところで、イソメラーゼは、高フラクトースコーンシロ
ップ（ＨＦＣ５）を生産するのに用いられている。従来
のＨＦＣ５の生産温度は、イソメラーゼの耐熱性から６
０℃に設定されており、６０℃における生産物中のフラ
クトースの濃度は４２％である。しかし、実用的には、
フラクトース濃度が５５％まで上げられれば、清涼飲料
等の食品甘味料としてそのまま使用すことができる。そ
こで、生産温度を８５℃にできれば、化学平衡がフラク
トース側に移動し、フラクトース濃度を５５％にするこ
とが可能になる。
ップ（ＨＦＣ５）を生産するのに用いられている。従来
のＨＦＣ５の生産温度は、イソメラーゼの耐熱性から６
０℃に設定されており、６０℃における生産物中のフラ
クトースの濃度は４２％である。しかし、実用的には、
フラクトース濃度が５５％まで上げられれば、清涼飲料
等の食品甘味料としてそのまま使用すことができる。そ
こで、生産温度を８５℃にできれば、化学平衡がフラク
トース側に移動し、フラクトース濃度を５５％にするこ
とが可能になる。
Ｃ，サーモハイドロスルフリカムのキシロースイソメラ
ーゼは、８５℃付近に最適温度があり、このキシロース
イソメラーゼを大量に入手できればフラクトース濃度を
５５％のＨＦＣ５を生産することが可能となる。しかし
、Ｃ，サーモハイドロスルフリカムによるキシロースイ
ソメラーゼの生産性ハ低く、Ｃ，サーモハイドロスルフ
リカム自身を用いてキシロースイソメラーゼを生産する
ことは実用的でない。
ーゼは、８５℃付近に最適温度があり、このキシロース
イソメラーゼを大量に入手できればフラクトース濃度を
５５％のＨＦＣ５を生産することが可能となる。しかし
、Ｃ，サーモハイドロスルフリカムによるキシロースイ
ソメラーゼの生産性ハ低く、Ｃ，サーモハイドロスルフ
リカム自身を用いてキシロースイソメラーゼを生産する
ことは実用的でない。
そこで本発明の目的は、Ｃ，サーモハイドロスルフリカ
ムのキシロースイソメラーゼ遺伝子を用いて耐熱性キシ
ロースイソメラーゼを大量に生産する方法を提供するこ
とにある。
ムのキシロースイソメラーゼ遺伝子を用いて耐熱性キシ
ロースイソメラーゼを大量に生産する方法を提供するこ
とにある。
本発明は、Ｃ，サーモハイドロスルフリカムのキシロー
スイソメラーゼ遺伝子及び細胞壁タンパク質遺伝子プロ
モーターを含むバチルス プレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｂｒｅｖｉｓ 、以下、Ｂ、プレビスと略記する）の
プラスミドで形質転換したＢ、プレビスを培養し、生成
するキシロースイソメラーゼを採取することを含む耐熱
性キシロースイソメラーゼの製造方法に関する。
スイソメラーゼ遺伝子及び細胞壁タンパク質遺伝子プロ
モーターを含むバチルス プレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｂｒｅｖｉｓ 、以下、Ｂ、プレビスと略記する）の
プラスミドで形質転換したＢ、プレビスを培養し、生成
するキシロースイソメラーゼを採取することを含む耐熱
性キシロースイソメラーゼの製造方法に関する。
本発明に用いるＣ、サーモハイドロスルフリカムのキシ
ロースイソメラーゼ遺伝子は、例えば第１図に示す塩基
配列を有する。Ｃ，サーモハイドロスルフリカムのキシ
ロースイソメラーゼ遺伝子は、大腸菌へクローニングす
ることにより調製することができる。
ロースイソメラーゼ遺伝子は、例えば第１図に示す塩基
配列を有する。Ｃ，サーモハイドロスルフリカムのキシ
ロースイソメラーゼ遺伝子は、大腸菌へクローニングす
ることにより調製することができる。
キシロースイソメラーゼ遺伝子は、細胞壁タンパク質遺
伝子プロモーターを含む、例えばＢ、プレビスのプラス
ミドｐ Ｎ Ｕ ２１０ ＣＹａｍａｇａｔａ Ｈ，
ら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃ、 Ｓｃｉ、 １９
８９； ８６ （３５８９−３５９３） 〕に導入し、
さらにＢ、プレビスを得られたプラスミドで形質転換し
た形質転換体を本発明の製造方法に用いる。Ｂ、プレビ
スの形質転換は、高橋らの方法〔Ｔａｋａｈａｓｈｉ
Ｗ、ら、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ、 １９８７；
２６２゜２１ （１００３５−１００３８））により
行うことができる。
伝子プロモーターを含む、例えばＢ、プレビスのプラス
ミドｐ Ｎ Ｕ ２１０ ＣＹａｍａｇａｔａ Ｈ，
ら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃ、 Ｓｃｉ、 １９
８９； ８６ （３５８９−３５９３） 〕に導入し、
さらにＢ、プレビスを得られたプラスミドで形質転換し
た形質転換体を本発明の製造方法に用いる。Ｂ、プレビ
スの形質転換は、高橋らの方法〔Ｔａｋａｈａｓｈｉ
Ｗ、ら、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ、 １９８７；
２６２゜２１ （１００３５−１００３８））により
行うことができる。
尚、Ｂ、プレビスとしては、４７株（ＦＥＲＭ Ｐ−７
２２４）、４７に株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２３０８） 、
４７−５ Ｑ株（鵜高、Ａｇｒ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ
ｍ、 １９７６； ４０．３ （５２３−５２８）等を
例示できる。
２２４）、４７に株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２３０８） 、
４７−５ Ｑ株（鵜高、Ａｇｒ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ
ｍ、 １９７６； ４０．３ （５２３−５２８）等を
例示できる。
また、プラスミドｐＮＵ２１０は、枯草菌のプラスミド
であるｐＵＢ １１０とＢ、プレビスの細胞壁タンパク
質遺伝子の５゛位制御領域を含む多コピープラスミドで
あり、鵜高重三、日本農芸化学会誌６１６６９ （１９
８７）及びＴ、カワズ（Ｋａｗａｚｕ）ら、Ｊ、Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、、 １６９．１５６４（１９８７）に記
載の方法により得られるプラスミドｐＮＵ２００から、
山形（Ｙａｍａｇａｔａ Ｈ，）ら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ、 Ａｃ。
であるｐＵＢ １１０とＢ、プレビスの細胞壁タンパク
質遺伝子の５゛位制御領域を含む多コピープラスミドで
あり、鵜高重三、日本農芸化学会誌６１６６９ （１９
８７）及びＴ、カワズ（Ｋａｗａｚｕ）ら、Ｊ、Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、、 １６９．１５６４（１９８７）に記
載の方法により得られるプラスミドｐＮＵ２００から、
山形（Ｙａｍａｇａｔａ Ｈ，）ら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ、 Ａｃ。
Ｓｃｉ、 １９８９； ８６ （３５８９−３５９３
）の方法により得ることができる。
）の方法により得ることができる。
Ｂ、プレビスの形質転換体は、例えば、グルコース、酵
母抽出物、ポリペプトン、内袖出物、ウラシル、エリス
ロマイシン等を含有する培養液中で、Ｂ、プレビスの最
適温度である３７℃付近で、好ましくは強攪拌下で培養
することが適当である。
母抽出物、ポリペプトン、内袖出物、ウラシル、エリス
ロマイシン等を含有する培養液中で、Ｂ、プレビスの最
適温度である３７℃付近で、好ましくは強攪拌下で培養
することが適当である。
培養後、遠心分離により菌を集め、得られた菌を超音波
で破砕し、残骸を遠心分離により除去する。さらに、８
５℃で熱処理して不要なタンパク質をデネーチャーし、
遠心分離によりデネーチャーしたタンパク質を除去し、
さらに必要により常法にて精製して、所望の耐熱性キシ
ロースイソメラーゼを得ることができる。
で破砕し、残骸を遠心分離により除去する。さらに、８
５℃で熱処理して不要なタンパク質をデネーチャーし、
遠心分離によりデネーチャーしたタンパク質を除去し、
さらに必要により常法にて精製して、所望の耐熱性キシ
ロースイソメラーゼを得ることができる。
本発明の方法のように、細胞壁タンパク質遺伝子プロモ
ーターを含むＢ、プレビスのプラスミドで形質転換した
Ｂ、プレビスを用いれば、Ｃ，サーモハイドロスルフリ
カム自身を用いた場合の数百倍の収率でＣ，サーモハイ
ドロスルフリカムのキシロースイソメラーゼを生産する
ことができる。さらに、本発明の方法によれば、クロー
ニングやクローン遺伝子の発現等の過程で突然変異やオ
ルタートホールディングが起きず、得られるキシロース
イソメラーゼは、Ｃ，サーモハイドロスルフリカム自身
を用いて得たものと同一のものが得られる。
ーターを含むＢ、プレビスのプラスミドで形質転換した
Ｂ、プレビスを用いれば、Ｃ，サーモハイドロスルフリ
カム自身を用いた場合の数百倍の収率でＣ，サーモハイ
ドロスルフリカムのキシロースイソメラーゼを生産する
ことができる。さらに、本発明の方法によれば、クロー
ニングやクローン遺伝子の発現等の過程で突然変異やオ
ルタートホールディングが起きず、得られるキシロース
イソメラーゼは、Ｃ，サーモハイドロスルフリカム自身
を用いて得たものと同一のものが得られる。
以下本発明を実施例によりさらに説明する。
１巷：
クロストリジウム サーモハイドロスルフリカム：ＡＴ
ＣＣ３３２２３ 大腸菌ＭＶ１１８４：ａｒａ、△（ｌａｃ−ｐｒｏ）、
５ｔｒＡ、ｔｈｉ、 （φ８０△１ａｃＩＺ△Ｍ１５
）、△（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）３０６： ：ＴｎｌＯ（ｔ
ｅｔ’）；Ｆ’ ；ｔｒａＤ３６゜ｐｒｏＡＢ、１ａ
ｃＩ’Ｚ△Ｍ１５（１）バチルス プレビス４７株（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−７２２４）生育条件 Ｃ，サーモハイドロスルフリカム菌は、メラス二エミの
方法ＣＭｅｌａｓｎｉｅｍｉ、 Ｊ、 Ｇｅｎ、 Ｍｉ
ｃｒｏ、 Ｂｉｏｌ。
ＣＣ３３２２３ 大腸菌ＭＶ１１８４：ａｒａ、△（ｌａｃ−ｐｒｏ）、
５ｔｒＡ、ｔｈｉ、 （φ８０△１ａｃＩＺ△Ｍ１５
）、△（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）３０６： ：ＴｎｌＯ（ｔ
ｅｔ’）；Ｆ’ ；ｔｒａＤ３６゜ｐｒｏＡＢ、１ａ
ｃＩ’Ｚ△Ｍ１５（１）バチルス プレビス４７株（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−７２２４）生育条件 Ｃ，サーモハイドロスルフリカム菌は、メラス二エミの
方法ＣＭｅｌａｓｎｉｅｍｉ、 Ｊ、 Ｇｅｎ、 Ｍｉ
ｃｒｏ、 Ｂｉｏｌ。
１９８７、１３３ （８８３−８９０）］によりキシロ
ースを炭素源として用い、かつＮＨ，ＣＩ Ｉｇ／ｊ
ｌ’、Ｃ。
ースを炭素源として用い、かつＮＨ，ＣＩ Ｉｇ／ｊ
ｌ’、Ｃ。
Ｃ１２０，０３ｇ／ｌを補充した培地を用いて６５℃で
生育させた。
生育させた。
大腸菌細胞は、２倍濃度のイーストエキス・トリプトン
培地（Ｄｉｒｃｏ）中で３７℃で生育させた。
培地（Ｄｉｒｃｏ）中で３７℃で生育させた。
クローニング及びシーフェンシング操作ゲノムＤＮＡは
、斉藤の方法（Ｓａｉｔｏ、 Ｈ，及びＭｉｕｒａ、
Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ １９
６３．７２（６１９−６２９）〕により、Ｃ，サーモハ
イドロスルフリカムから抽出した。凍結ペレット（０，
３４ｇ）をＮａＣｌを２００ ｍＭ、 ＥＤＴＡを１０
０ｍＭ含むトリス５０ｍＭ（ｐＨ８，０）４．５Ｗｌに
溶解した。ｌＯ％Ｓ Ｄ Ｓ ０．５−を加え、混合物
は６０°ＣＩ５分間ゆっくりと回転させ、次いで６０℃
３０分間 ＲＮＡ５ｅ Ａ （０，０５＋ｎｇ／−）
で処理した。次に６０℃で６０分間プロテイナーゼＫ（
０，５■／−）で処理した。溶菌液は、フェノール／ト
リスバッファーで３回、フェノール／クロロホルムで１
回抽出した。残渣を遠心分離（１０分間、１５０００
ｒｐｍ ）で除去した。０゜８容のイソプロパツールを
添加した後、ＤＮＡを巻き出し、ＥＤＴＡを１ｍＭ含む
トリス１０ｍＭ （ｐＨ８，０）１、５−に溶解した。
、斉藤の方法（Ｓａｉｔｏ、 Ｈ，及びＭｉｕｒａ、
Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ １９
６３．７２（６１９−６２９）〕により、Ｃ，サーモハ
イドロスルフリカムから抽出した。凍結ペレット（０，
３４ｇ）をＮａＣｌを２００ ｍＭ、 ＥＤＴＡを１０
０ｍＭ含むトリス５０ｍＭ（ｐＨ８，０）４．５Ｗｌに
溶解した。ｌＯ％Ｓ Ｄ Ｓ ０．５−を加え、混合物
は６０°ＣＩ５分間ゆっくりと回転させ、次いで６０℃
３０分間 ＲＮＡ５ｅ Ａ （０，０５＋ｎｇ／−）
で処理した。次に６０℃で６０分間プロテイナーゼＫ（
０，５■／−）で処理した。溶菌液は、フェノール／ト
リスバッファーで３回、フェノール／クロロホルムで１
回抽出した。残渣を遠心分離（１０分間、１５０００
ｒｐｍ ）で除去した。０゜８容のイソプロパツールを
添加した後、ＤＮＡを巻き出し、ＥＤＴＡを１ｍＭ含む
トリス１０ｍＭ （ｐＨ８，０）１、５−に溶解した。
最後に、ＤＮＡをＤＥＡＥカラム（洗浄バッファー：ト
リス５０ｍＭ、 ｐＨ８，０゜ＥＤＴＡ １ｍＭ、
ＮａＣ１Ｏ，１５Ｍ ；溶出バッファー：トリス５０
ｍＭ、 ｐＨ８，０、ＥＤＴＡ ｌ ｍＭ、 ＮａＣ
１Ｉ Ｍ）を用いたアニオン交換樹脂により精製した。
リス５０ｍＭ、 ｐＨ８，０゜ＥＤＴＡ １ｍＭ、
ＮａＣ１Ｏ，１５Ｍ ；溶出バッファー：トリス５０
ｍＭ、 ｐＨ８，０、ＥＤＴＡ ｌ ｍＭ、 ＮａＣ
１Ｉ Ｍ）を用いたアニオン交換樹脂により精製した。
ゲノムＤＮＡは、ＥｃｏＲＩ 、Ｈｉｎｄｌｌｌ及びＰ
ｓｔＩを用いて消化した。フラグメントは、０．４％ア
ガロースゲル電気泳動で分離した。ＤＮＡは、２５分間
１．５ ＭＮａＣｌ、 ０．５ Ｍ ＮａＯＨ中にゲ
ルを浸すことにより変性した。ゲルは、３Ｍ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ５，５）で中和した。ＤＮＡは、エレクトロ
ブロッティング（３時間、２ ｍＡ／ ｃｍ）によりナ
イロン膜（Ｂｉｏｄｙｎｅ）に移し、８０℃で１時間焼
成した。
ｓｔＩを用いて消化した。フラグメントは、０．４％ア
ガロースゲル電気泳動で分離した。ＤＮＡは、２５分間
１．５ ＭＮａＣｌ、 ０．５ Ｍ ＮａＯＨ中にゲ
ルを浸すことにより変性した。ゲルは、３Ｍ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ５，５）で中和した。ＤＮＡは、エレクトロ
ブロッティング（３時間、２ ｍＡ／ ｃｍ）によりナ
イロン膜（Ｂｉｏｄｙｎｅ）に移し、８０℃で１時間焼
成した。
このプロットを、バチルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ） キシロースイソメラーゼ遺
伝子から得た３２Ｐラベルされた２４０ヌクレオチドＢ
ｂｅ［Ｄｄｅｌフラグメント（１０’ｃｐｍ／ｍｌ）を
用いて５８°Ｃでハイブリダイズさせた。このフラグメ
ントは、スイソメラーゼアミノ酸配列と比べると分かる
ように、２つの比較的高いホモロジー領域を含む。
ｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ） キシロースイソメラーゼ遺
伝子から得た３２Ｐラベルされた２４０ヌクレオチドＢ
ｂｅ［Ｄｄｅｌフラグメント（１０’ｃｐｍ／ｍｌ）を
用いて５８°Ｃでハイブリダイズさせた。このフラグメ
ントは、スイソメラーゼアミノ酸配列と比べると分かる
ように、２つの比較的高いホモロジー領域を含む。
ハイブリダイゼーションの後、ＥｃｏＲＩでは８．７
Ｋｂ。
Ｋｂ。
Ｈｉｎｄｌｌｌでは２．２Ｋｂ及びＰｓｔｌでは３．６
Ｋｂ付近に単一のバンドが現れた。
Ｋｂ付近に単一のバンドが現れた。
Ｐｓｔｌ消化クロスりリジュウムＤＮＡの３．６Ｋｂ±
０．６Ｋｂのフラグメントは、ガラスミルク（ｇｌａｓ
ｓｍｉｌｋ）を用いた抽出により単離され、ＰｓｔＩ消
ｆヒされた大腸菌ベクターｐＵｃ１１９とリゲートさせ
た。コンピテント大腸菌ＭＶ１１８４細胞をリゲートし
たＤＮＡで形質転換した。所望のクロストリジウムＤＮ
Ａを有するコロニーをＢ、スブチリスブローブと形質転
換体のコロニーとのハイブリダイゼーションにより検出
した。ポジティブなシグナルを与えるコロニーからアル
カリ溶解法によりプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素
による消化及びサザンハイブリダイセーンヨンにより分
析した。バチルススブチリスキシロースイソメラーセ遺
伝子から得たプローブと強力にハイブリダイズする３、
５５ＫｂＰＳｔＩフラグメントを得た。
０．６Ｋｂのフラグメントは、ガラスミルク（ｇｌａｓ
ｓｍｉｌｋ）を用いた抽出により単離され、ＰｓｔＩ消
ｆヒされた大腸菌ベクターｐＵｃ１１９とリゲートさせ
た。コンピテント大腸菌ＭＶ１１８４細胞をリゲートし
たＤＮＡで形質転換した。所望のクロストリジウムＤＮ
Ａを有するコロニーをＢ、スブチリスブローブと形質転
換体のコロニーとのハイブリダイゼーションにより検出
した。ポジティブなシグナルを与えるコロニーからアル
カリ溶解法によりプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素
による消化及びサザンハイブリダイセーンヨンにより分
析した。バチルススブチリスキシロースイソメラーセ遺
伝子から得たプローブと強力にハイブリダイズする３、
５５ＫｂＰＳｔＩフラグメントを得た。
この３．５５ Ｋｂフラグメントを、制限酵素Ａｌｕｌ
、ＨａｅｌｌＩ、 Ｎｄｅｌ及び旧ｎｄＩＩＩを用いて
小さイフラグメントに消化した。これらのフラグメント
は、ｐＵＣ１１８及びｐＵｃ１１９を用いて大腸菌ＭＶ
１１８４にサブクローンした。１本鎖ＤＮＡをビエイラ
（Ｖｉｅｉｒａ）の方法に従って調製し、Ｔ７ＤＮＡポ
リメラーゼ（シーフェンスｖｅｒ２． Ｏ：商品名）及
び７−デアザｄＧＴＰを用いて配列を決定した。
、ＨａｅｌｌＩ、 Ｎｄｅｌ及び旧ｎｄＩＩＩを用いて
小さイフラグメントに消化した。これらのフラグメント
は、ｐＵＣ１１８及びｐＵｃ１１９を用いて大腸菌ＭＶ
１１８４にサブクローンした。１本鎖ＤＮＡをビエイラ
（Ｖｉｅｉｒａ）の方法に従って調製し、Ｔ７ＤＮＡポ
リメラーゼ（シーフェンスｖｅｒ２． Ｏ：商品名）及
び７−デアザｄＧＴＰを用いて配列を決定した。
Ｃ，サーモハイドロスルフリカムのキシロースイソメラ
ーゼ遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を第１図に示す
。
ーゼ遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を第１図に示す
。
Ｂ、プレビスでの発現
Ｃ，サーモハイドロスルフリカムのキシロースイソメラ
ーゼ遺伝子の全配列並びに上流１００ヌクレオチド及び
下流１０００ヌクレオチドを含む２゜５ Ｋ Ｐｓｔｌ
−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔｌで消
化したＢ、プレビス発現ベクターｐＮＬ’２１０（制限
酵素地図を第２図に示す）にリケードした。得られたベ
クター中で、キシロースイソメラーゼ遺伝子は、予めベ
クター中に存在する細胞壁タンパク質遺伝子プロモータ
ーによって制御される。
ーゼ遺伝子の全配列並びに上流１００ヌクレオチド及び
下流１０００ヌクレオチドを含む２゜５ Ｋ Ｐｓｔｌ
−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔｌで消
化したＢ、プレビス発現ベクターｐＮＬ’２１０（制限
酵素地図を第２図に示す）にリケードした。得られたベ
クター中で、キシロースイソメラーゼ遺伝子は、予めベ
クター中に存在する細胞壁タンパク質遺伝子プロモータ
ーによって制御される。
得られたベクターを用いて、高橋らの方法（Ｔａｋａｈ
ａｓｈｉ Ｗ、ら、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ
ｍ、 １９８７； ２６２． ２１（１００３５−１
００３８））によりＢ、プレビスを形質転換した。即ち
、５０ｍＭ）リン酸緩衝液（ｐＨ８，５）の中にＢ、プ
レビス菌を懸濁し、次いでＤＮＡを加え、ポリエチレン
グリコールを３０％になるように加え、３７℃で２分間
放置することにより形質転換体を行った。
ａｓｈｉ Ｗ、ら、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ
ｍ、 １９８７； ２６２． ２１（１００３５−１
００３８））によりＢ、プレビスを形質転換した。即ち
、５０ｍＭ）リン酸緩衝液（ｐＨ８，５）の中にＢ、プ
レビス菌を懸濁し、次いでＤＮＡを加え、ポリエチレン
グリコールを３０％になるように加え、３７℃で２分間
放置することにより形質転換体を行った。
Ｂ、プレビスの形質転換体は、以下の培養液中、強攪拌
下、３７℃で培養した。
下、３７℃で培養した。
グルコース １０ｇ／ｆ
酵母抽８物 ２ｇ／ｌ
ポリペプトン Ｌｏｇ／ｆ
内袖出物 ５ ｇ ／ １２ウラシル
０．１ ｇ ／ ｐエリスロマイシン ｌ
Ｏｍ ｇ ／ １培養後、遠心分離（５に、１０分間、
１５℃）により固定相として菌を集めた。
０．１ ｇ ／ ｐエリスロマイシン ｌ
Ｏｍ ｇ ／ １培養後、遠心分離（５に、１０分間、
１５℃）により固定相として菌を集めた。
得られた菌のベレットをリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ
７）で洗浄した。洗浄したペレットは、トリエタノール
アミン１００ｍＭ、ｐＨ７、フラクトース４００ｍＭ、
Ｍｎ Ｃ１２１０ｍＭを含む１ｍＭのＰＭＳＦ（プロ
テアーゼ阻害剤）に溶解した。菌は、超音波で３０秒間
破砕し、残骸を遠心分離（１５に、１０分間、４℃）に
より除去した。さらに、上澄液を８５℃で１０分間イン
キュベートすることにより熱処理した。放冷後、回復で
きないデネーチャーしたタンパク質を、遠心分離（１５
に、１０分間、４℃）によりを除去して粗キシロースイ
ソメラーゼを得た。次に、５００重量倍のＥＤＴＡ５ｍ
Ｍを含む緩衝液に対して３回、及び５００重量倍のＥＤ
ＴＡを含まない緩衝液に対して２回それぞれ透析を行っ
た。さらに、ＦＰＬＣアニオン交換クロマトグラフィー
及びスベローズ（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ） Ｉ ２による
ゲル濾過により精製した。
７）で洗浄した。洗浄したペレットは、トリエタノール
アミン１００ｍＭ、ｐＨ７、フラクトース４００ｍＭ、
Ｍｎ Ｃ１２１０ｍＭを含む１ｍＭのＰＭＳＦ（プロ
テアーゼ阻害剤）に溶解した。菌は、超音波で３０秒間
破砕し、残骸を遠心分離（１５に、１０分間、４℃）に
より除去した。さらに、上澄液を８５℃で１０分間イン
キュベートすることにより熱処理した。放冷後、回復で
きないデネーチャーしたタンパク質を、遠心分離（１５
に、１０分間、４℃）によりを除去して粗キシロースイ
ソメラーゼを得た。次に、５００重量倍のＥＤＴＡ５ｍ
Ｍを含む緩衝液に対して３回、及び５００重量倍のＥＤ
ＴＡを含まない緩衝液に対して２回それぞれ透析を行っ
た。さらに、ＦＰＬＣアニオン交換クロマトグラフィー
及びスベローズ（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ） Ｉ ２による
ゲル濾過により精製した。
本発明の方法にょるＢ、プレビスを宿主として用いたキ
シロースイソメラーゼの生産性を、Ｃ、サーモハイドロ
スルフリカム及び大腸菌をそれぞれ宿主として用いた場
合のキシロースイソメラーゼの生産性と比較して表１に
示す。
シロースイソメラーゼの生産性を、Ｃ、サーモハイドロ
スルフリカム及び大腸菌をそれぞれ宿主として用いた場
合のキシロースイソメラーゼの生産性と比較して表１に
示す。
表１
Ｃ，サーモハイドロスルフリカム及び大腸菌の培養条件
は以下の通りである。
は以下の通りである。
Ｃ，サーモハイドロスルフリカムの 養条件６５℃、嫌
気培養、２日間 キシロース １０ｇ／ｚ 酵母エキス ５ｇ／ｌ トリプトン Ｌｏｇ／ｌ 肉エキス ５ｇ／Ｉ！ リン酸緩衝液 ５０ｍＭ、ｐＨ６，８ＦｅＳＯ
，０，０２ｇ／Ｊ ＭｇＳ○、−７Ｈ，ＯＯ，１ｇ／ｊ７ Ｃａ Ｃｌ ２・２ Ｈ２Ｏ０，ｌ ｇ／ ＩＮＨ，Ｃ
Ｉ １．０ｇ／ＩＣ０Ｃｊ７２
０．０３ｇ＃’大腸菌の培養条件 ３７℃、１６時間 酵母エキス １０ ｇ／ｌ トリプトン １６ｇ／ｆ ＮａＣ１５ｇ／ｌ ｐ Ｈ６，８ 脛１ｙＬｔ丘 酵素活性は、０．１−０．４ユニツトのキシロースイソ
メラーゼををへペス１００ｍＭ、ｐＨ７、フＩＬ、’７
トース４００ｍＭ、 ＭｇＣｌ２１０ｍＭ中テ８５℃で
行った。グルコースの生成は、グルコースオキシダーセ
分析（グルコースＢ−テスト、和光）を用い、２０μｌ
のサンプルについて行った。また、温度プロファイルに
用いた緩衝液としては、へペス１００ｍＭ、ｐＨ７、フ
ルクトース４ｏ。
気培養、２日間 キシロース １０ｇ／ｚ 酵母エキス ５ｇ／ｌ トリプトン Ｌｏｇ／ｌ 肉エキス ５ｇ／Ｉ！ リン酸緩衝液 ５０ｍＭ、ｐＨ６，８ＦｅＳＯ
，０，０２ｇ／Ｊ ＭｇＳ○、−７Ｈ，ＯＯ，１ｇ／ｊ７ Ｃａ Ｃｌ ２・２ Ｈ２Ｏ０，ｌ ｇ／ ＩＮＨ，Ｃ
Ｉ １．０ｇ／ＩＣ０Ｃｊ７２
０．０３ｇ＃’大腸菌の培養条件 ３７℃、１６時間 酵母エキス １０ ｇ／ｌ トリプトン １６ｇ／ｆ ＮａＣ１５ｇ／ｌ ｐ Ｈ６，８ 脛１ｙＬｔ丘 酵素活性は、０．１−０．４ユニツトのキシロースイソ
メラーゼををへペス１００ｍＭ、ｐＨ７、フＩＬ、’７
トース４００ｍＭ、 ＭｇＣｌ２１０ｍＭ中テ８５℃で
行った。グルコースの生成は、グルコースオキシダーセ
分析（グルコースＢ−テスト、和光）を用い、２０μｌ
のサンプルについて行った。また、温度プロファイルに
用いた緩衝液としては、へペス１００ｍＭ、ｐＨ７、フ
ルクトース４ｏ。
ｍＭ、 ＭｇＣ！：５０ ｍＭ、 ＣｏＣ１＋０．５
ｍＭを用いた。
ｍＭを用いた。
得られた耐熱性キシロースイソメラーゼの活性と温度と
のプロファイルを第３図に示す。この図から、得られた
耐熱性キシロースイソメラーゼは８５８Ｃ付近に最適温
度を有することがわかる。
のプロファイルを第３図に示す。この図から、得られた
耐熱性キシロースイソメラーゼは８５８Ｃ付近に最適温
度を有することがわかる。
グルコースのフラクトースへの異性
本発明の方法により得られた耐熱性キシロースイソメラ
ーゼを用いてグルコースのフラクトースへの異性化を行
った。
ーゼを用いてグルコースのフラクトースへの異性化を行
った。
キシロースイソメラーゼｏ、１〜０．４０／１ｎｌを、
１００ｍＭヘペス緩衝液ｐＨ７，４００ｍＭ果糖、１０
ｍＭＭｇＣｆ、中、７０℃又は８５℃で反応させ反応開
始後１３時間及び４６時間経過後の反応液中の糖の濃度
を高速液体クロマトグラフィーにより測定し、クロマト
グラムの面積パーセントとして表した。結果を表２に示
す。尚、７０’Ｃにおけるフラクトースの理論平衡濃度
は５２％であり、８５℃におけるフラクトースの理論平
衡濃度は５ ４．８％である。
１００ｍＭヘペス緩衝液ｐＨ７，４００ｍＭ果糖、１０
ｍＭＭｇＣｆ、中、７０℃又は８５℃で反応させ反応開
始後１３時間及び４６時間経過後の反応液中の糖の濃度
を高速液体クロマトグラフィーにより測定し、クロマト
グラムの面積パーセントとして表した。結果を表２に示
す。尚、７０’Ｃにおけるフラクトースの理論平衡濃度
は５２％であり、８５℃におけるフラクトースの理論平
衡濃度は５ ４．８％である。
表２
■
表２−２
ネ
ＨＦＣ３＝ｉ準高フラクト一スコーンシロツプ単位：パ
ーセント
ーセント
第１図に本発明の方法に用いたＣ、サーモハイドロスル
フリカムのキシロースイソメラーゼ遺伝子の塩基配列を
示す。 第２図にＢ、プレビス発現ベクターｐＮＵ２１０の制限
酵素地図を示す。 第３図に本発明の方法により得られた耐熱性キシロース
イソメラーゼの活性と温度とのプロファイルを示す。 第１図一 ＣＴＧＣＡＧＧＡＴＡ ＣＣＡＣＡＣＧＧＡＧ ＣＴＴＴＣＡＡＡＴＣ ＴＧＧＡＧＣＡＡＡＧ ８ｏ ＴＴＴＴＡＡＡＴＡＡ ９Ｃ ＴＴＡＴＡＴＴＴＴＣ ＴＴＴＴＡＣＡＡＴＣ ＣＡＧＡＴＧＡＡＡＴ ＡＡＴＡＧＡＣＧＧＡ ＧＴＡＧＣＧＴＡＣＴ ＧＧＣＡＣＡＣＡＴＴ ＴＡＣＡＧＣＣＡＡＴ ＣＡＡＡＧＧＣＣＡＴ ＧＧＧＡＣＣＡＴＴＴ ＴＡＣ：ＴＧＡＣＣＣＴ ＧＣＣＴＴＴＧＡＡＣ ＴＡＴＴＴＧＡＡＡＡ ＡＣＴＣＧＡＣＧＴＡ ＧＣＴＣＣＧＧＡＡＧ ＧＡＧＡＧＡＣＡＴＴ ＡＡＧＧＧＡＧＡＣＧ ＡＴＡＡＡＡＧＡＣＴ ＡＣＴＴＡＡＡＧＡＣ ＧＡＧＣＡＡＡＡＣＡ その ■ ＋ ４０ ５０
６０″； ＡＧＡＣＡＡＴＧＧＡ
ＡＧＣＡＴＡＴＡＴＴ ＧＣＡＴＧＧＣＡＣＴ＋
１００ １１０
１２０： ＡＡＡＡＡＧＧＡＧＧ ＡＡＡＡ
ＴＧＡＣＡＴ ＧＧＡＡＴＡＣＴＴＣＣＣＡＡＡＡＴ
ＣＡＡ ＡＣＡＡＴＣＣＡＴＡ ＴＧＣＡＴＴＴＡＡＡ ＡＡＡＣＣＴＴＴＡＡ ＡＡＧＡＡＣＡＣＴＴ ＧＣＧＴＴＴＴＴＣＡ ＧＧＧＡＣＡＧＡＴＣ ＣＡＴＴＴＧＧＡＧＣ ＡＣＣＣＡＣＡＡＴＧ ＡＴＧＧＡＴＡＴＴＧ ＣＣＡＡＡＧＣＧＡＧ ＡＧＴＡＧＡＡＧＣＡ ＣＣＡＴＴＴＴＴＣＴ ＧＴＴＴＣＣＡＴＧＡ ＣＡＧＡＧＡＴＡＴＡ ＡＡＣＡＡＡＡＡＴＴ ＴＡＧＡＴＡＣＡＡＴ ＡＧＴＴＧＣＡＡＴＧ ＡＡＡＧＴＡＴＴＡＴ ＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣ ＧＡＡＣＣＴＴＴＴＴ 第１図一→ ＴＣＡＡＡＴＣＣＧＡ ＧＡＴＴＴＧＴＡＣＡ ＴＧＧＡＧＣＡＧＣＴ ＧＣＡＧＣＡＧＣＧＣ ＡＡＧＴＡＡＡＡＡＡ ＡＧＣＡＣＴＴＧＡＧ ＧＴＡＴＴＴＴＧＧＧ ＧＴＧＧＡＡＧＡＧＡ ＡＧＧＡＴＡＴＧＡＡ ＣＴＴＧＡＴＡＡＣＴ ＴＡＧＣＡＡＧＡＴＴ ＴＴＴＧＣＡＣＡＴＧ ＧＡＡＧＧＧＣＡＧＴ ＴＴＴＴＡＡＴＴＧＡ ＧＣＣＡＡＡＡＣＣＴ ＧＡＴＧＣＡＧＣＡＡ ＧＴＧＴＡＣＡＴＧＣ ＡＴＴＴＴＴＡＡＡＧ ＡＡＣＡＴＡＧＡＡＧ ＣＧＡＡＣＣＡＴＧＣ ＧＡＣＡＣＴＴＧＣＡ ＧＣＡＡＧＧＡＴＴＡ ＡＣＡＡＴＡＴＧＴＴ ＡＧＧＣＴＣＴＡＴＡ ＴＧＧＧＡＴＡＣＡＧ ＡＣＣＡＡＴＡＴＣＣ ＡＡＣＡＧＡＣＡＴＡ 巳の２ ＡＣＴＴＣＣＴＧＴＡ ＡＴＧＣＡＧＡＴＧＴ ＡＴＴＴＧＣＡＴＡＴ ＡＴＡＡＣＡＡＡＡＧ ＡＡＣＴＴＧＧＡＧＧ ＡＣＡＧＡＡＣＴＡＴ ＡＣＡＴＴＡＣＴＴＡ ＡＣＡＣＡＧＡＴＡＴ ＧＧＡＡＴＴＧＧＡＡ ＧＣＡＧＴＡＧＡＡＴ ＡＴＧＣＡＣＡＡＧＡ ＧＡＴＡＧＧＡＴＴＴ ＡＡＡＧＡＡＣＣＧＡ ＣＡＡＡＡＣＡＣＣＡ ＡＴＡＴＧＡＴＴＴＴ ＡＡＧＴＡＣＧＡＣＣ ＴＴＧＡＴＡＡＡＴＡ ＣＴＴＣＡＡＡＴＴＡ ＧＧＡＣＡＴＧＡＣＴ ＴＴＣＡＡＣＡＴＧＡ ＡＴＴＡＡＧＡＴＡＴ ＧＡＴＧＣＡＡＡＴＡ ＴＧＧＧＡＧＡＴＡＴ ＧＣＴＴＴＴＡＧＧＡ ＣＧＡＡＴＧＡＣＡＡ ＣＣＣＴＴＧＣＧＡＴ ＧＴＡＣＧＡＡＧＴＣ
フリカムのキシロースイソメラーゼ遺伝子の塩基配列を
示す。 第２図にＢ、プレビス発現ベクターｐＮＵ２１０の制限
酵素地図を示す。 第３図に本発明の方法により得られた耐熱性キシロース
イソメラーゼの活性と温度とのプロファイルを示す。 第１図一 ＣＴＧＣＡＧＧＡＴＡ ＣＣＡＣＡＣＧＧＡＧ ＣＴＴＴＣＡＡＡＴＣ ＴＧＧＡＧＣＡＡＡＧ ８ｏ ＴＴＴＴＡＡＡＴＡＡ ９Ｃ ＴＴＡＴＡＴＴＴＴＣ ＴＴＴＴＡＣＡＡＴＣ ＣＡＧＡＴＧＡＡＡＴ ＡＡＴＡＧＡＣＧＧＡ ＧＴＡＧＣＧＴＡＣＴ ＧＧＣＡＣＡＣＡＴＴ ＴＡＣＡＧＣＣＡＡＴ ＣＡＡＡＧＧＣＣＡＴ ＧＧＧＡＣＣＡＴＴＴ ＴＡＣ：ＴＧＡＣＣＣＴ ＧＣＣＴＴＴＧＡＡＣ ＴＡＴＴＴＧＡＡＡＡ ＡＣＴＣＧＡＣＧＴＡ ＧＣＴＣＣＧＧＡＡＧ ＧＡＧＡＧＡＣＡＴＴ ＡＡＧＧＧＡＧＡＣＧ ＡＴＡＡＡＡＧＡＣＴ ＡＣＴＴＡＡＡＧＡＣ ＧＡＧＣＡＡＡＡＣＡ その ■ ＋ ４０ ５０
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Claims (2)
- （１）クロストリジウムサーモハイドロスルフリカムの
キシロースイソメラーゼ遺伝子及び細胞壁タンパク質遺
伝子プロモーターを含むバチルスブレビスのプラスミド
で形質転換したバチルスブレビスを培養し、生成するキ
シロースイソメラーゼを採取することを含む耐熱性キシ
ロースイソメラーゼの製造方法。 - （２）クロストリジウムサーモハイドロスルフリカムが
ＡＴＣＣ３３２２３であり、細胞壁タンパク質遺伝子プ
ロモーターがバチルスブレビス由来のものである請求項
１記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24549090A JPH04126080A (ja) | 1990-09-14 | 1990-09-14 | 耐熱性キシロースイソメラーゼの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24549090A JPH04126080A (ja) | 1990-09-14 | 1990-09-14 | 耐熱性キシロースイソメラーゼの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04126080A true JPH04126080A (ja) | 1992-04-27 |
Family
ID=17134438
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24549090A Pending JPH04126080A (ja) | 1990-09-14 | 1990-09-14 | 耐熱性キシロースイソメラーゼの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04126080A (ja) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6248590B1 (en) | 1998-02-27 | 2001-06-19 | Cytomation, Inc. | Method and apparatus for flow cytometry |
| US6819411B1 (en) | 1997-01-31 | 2004-11-16 | Xy, Inc. | Optical apparatus |
| US7024316B1 (en) * | 1999-10-21 | 2006-04-04 | Dakocytomation Colorado, Inc. | Transiently dynamic flow cytometer analysis system |
| US7723116B2 (en) | 2003-05-15 | 2010-05-25 | Xy, Inc. | Apparatus, methods and processes for sorting particles and for providing sex-sorted animal sperm |
| US7758811B2 (en) | 2003-03-28 | 2010-07-20 | Inguran, Llc | System for analyzing particles using multiple flow cytometry units |
| US7772005B1 (en) | 1998-07-30 | 2010-08-10 | Xy, Llc | Method of establishing an equine artificial insemination sample |
| US7838210B2 (en) | 2004-03-29 | 2010-11-23 | Inguran, LLC. | Sperm suspensions for sorting into X or Y chromosome-bearing enriched populations |
| US7855078B2 (en) | 2002-08-15 | 2010-12-21 | Xy, Llc | High resolution flow cytometer |
| US8211629B2 (en) | 2002-08-01 | 2012-07-03 | Xy, Llc | Low pressure sperm cell separation system |
| US9879221B2 (en) | 2000-11-29 | 2018-01-30 | Xy, Llc | Method of in-vitro fertilization with spermatozoa separated into X-chromosome and Y-chromosome bearing populations |
| US11230695B2 (en) | 2002-09-13 | 2022-01-25 | Xy, Llc | Sperm cell processing and preservation systems |
-
1990
- 1990-09-14 JP JP24549090A patent/JPH04126080A/ja active Pending
Cited By (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US11261424B2 (en) | 2002-09-13 | 2022-03-01 | Xy, Llc | Sperm cell processing systems |
| US11230695B2 (en) | 2002-09-13 | 2022-01-25 | Xy, Llc | Sperm cell processing and preservation systems |
| US7799569B2 (en) | 2003-03-28 | 2010-09-21 | Inguran, Llc | Process for evaluating staining conditions of cells for sorting |
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| US7758811B2 (en) | 2003-03-28 | 2010-07-20 | Inguran, Llc | System for analyzing particles using multiple flow cytometry units |
| US10100278B2 (en) | 2003-03-28 | 2018-10-16 | Inguran, Llc | Multi-channel system and methods for sorting particles |
| US11104880B2 (en) | 2003-03-28 | 2021-08-31 | Inguran, Llc | Photo-damage system for sorting particles |
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