JPH0380097A - ミリストイルグリシルペプチドを認識するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 の１ 本発明は、ミリストイルグリシルオリゴペプチドと特異
的に反応するモノクローナル抗体およびその製造方法並
びに該抗体の利用法に関する。

の 近年、ある種の蛋白質リン酸酵素（Ａｄｅｎｏｓ　１ｎ
ｅ３’５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　　ｄｅｐｅｎｄｅｎ
ｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　　ｔｙｐｅ＋１）
のＮ末端グリシンがミリスチン酸と共有結合しているこ
とが発見され［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　Ｖｏｌ、７９’、　ｐ６１２８　（１９８２）
、　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ’５ｔｒｙ　Ｖｏｌ。

２２　ｐ３７０２　（１９８３）］、これを端緒として
ミリストイル化された種々の蛋白質に関する数多くの研
究がなされている。特に、Ｎ末端グリシンのミリストイ
ル化は細胞の形質転換や成長の調節に関わりのあるある
種の蛋白質の機能発現に重要な意味を持つというミリス
トイル化の生物学的意義に関する報告［５ｃｉｅｎｃｃ
　Ｖｏｌ、２２７．　ｐ４２７　（１９８５）］があり
、また、レトロウィルスが関与する種々の疾患、例えば
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、成人性Ｔ細胞白血
病（ＡＴＬ）と原因ウィルス蛋白のミリストイル化との
関連においても最近大きな注目を集めている。

蛋白質のミリストイル化の一般的な役割については未だ
詳細には解明されていないものの、上述したように、生
体系において重要な役割を果していることには疑いなく
、従って、この反応を追跡することができる手段を確立
すれば、ミリストイル化の生物学的な意義をさらに明ら
かにし、特に病態との関連を解明することができ、ひい
ては疾患の診断、予防、治療への道を拓くものと確信さ
れる。しかしながら、ミリストイル化蛋白質を簡便に検
出する方法は未だ確立されていないのが現状である。

免見曵且１ 本発明者ら＋３、上記各報告に関連して、独自に研究を
重ねる過程において、ミリストイルグリシルオリゴペプ
チドを免疫用抗原としてマウスを免疫し、このマウスか
ら得られる脾臓細胞と、マウスミエローマ（骨髄腫）細
胞とを融合して得られるハイブリドーマを調製し、この
ハイブリドーマからミリストイルグリシルオリゴペプチ
ドを特異的に認識するモノクローナル抗体を得ることに
成功し本発明を完成するに至った。さらに、このような
本発明のモノクローナル抗体は、細胞の癌化にＳＲＣ遺
伝子が強く関与している細胞とのみ特異的に反応するこ
とが確認された。

本発明の抗ミリストイルグリシルペプチドモノクローナ
ル抗体は、特定のミリストイルグリシル蛋白質を簡便に
検出・同定し得る極めて特異性の高いモノクローナル抗
体である。

日） 本発明によって得られる抗ミリストイルグリシルオリゴ
ペプチドを識別するモノクローナル抗体（以下、本モノ
クローナル抗体という）は、生体系で生じたミリストイ
ルグリシル化蛋白の性状を解析するに当たり、特定のア
ミノ酸配列を有するミリストイルグリシルペプチドを単
離するための手段として機能することができる。例えば
、本モノクローナル抗体をリガンドとするアフイニテイ
クロマトグラフィを用いれば、標的のミリストイルグリ
シルペプチドを選択的に分離することが可能である。

さらに、本モノクローナル抗体を利用した抗原抗体反応
による微量のミリストイルグリシルペプチドの検出、測
定も可能である。すなわち、体液中および組織より抽出
された試料を本モノクローナル抗体を用いた免疫二重拡
散法、免疫電気泳動法、放射免疫測定法並びに酵素免疫
測定法に共することにより、試料中のミリストイルグリ
シルペプチドの検出、定量を行うことができる。また、
本モノクローナル抗体を利用した免疫組織化学的手段（
例えば、酵素標識した本モノクローナル抗体の利用）に
より、生体組織内のミリストイルグリシル化蛋白を直接
検出することもできる。

本発明で言うミリストイルグリシルオリゴペプチドの代
表例としては、発癌遺伝子であるｐ６ＱｓＲｃ遺伝子の
発現産物のＮ末端アミノ酸配列であるＮ−Ｍｙｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓが挙げられ（Ｎ−はＮ末端
、Ｍｙｒ−はミリストイル基を示す）、本発明における
上記のミリストイルグリシルオリゴペプチドを認識する
抗体は、癌化細胞の原因を調べる診断に極めて有効であ
る。すなわち、本モノクローナル抗体を用いて、対象と
なる癌化細胞について免疫反応を行い、本モノクローナ
ル抗体と反応する物質が発癌細胞内で確認されれば、そ
の細胞の癌化を引き起こしている原因は、ｐ６ＱＳＲＣ
遺伝子であることを示す。さらに将来的には、このよう
な癌化細泡中にこのモノクローナル抗体を導入すること
ができれば、細胞の癌化を阻止することができる抗体と
しての利用も期待できる。

以下、本発明における免疫用抗原の調製法、本発明のモ
ノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマの調製法、
およびモノクローナル抗体の製法について述べる。

１、免疫用抗原の調製 本発明に使用されるミリストイルグリシルオリゴペプチ
ドは、目的に応じて市販のものを用いることができる。

このようなミリストイルグリシルオリゴペプチドを適当
なキャリアー蛋白質、例えばＢＳＡ　（牛血清アルブミ
ン）やＫＴ、Ｈ（−ｆｆフォールリンベツドヘモシアニ
ン）等に結合させることにより免疫抗原を調製する。こ
の際には、ヘモシアニンをキャリアー蛋白質として使用
することにより、目的の抗体を効率よく誘導するマウス
への免疫が可能となる。

２　ハイブリドーマの調製： 上記で調製したミリストイルグリシルペプチド抗原をマ
ウスに常法の免疫方法に従い免疫し、最終免疫後にその
免疫マウスのＩＩ’！’臓細胞を得る。この脾臓細胞と
マウスミエローマ細胞、代表的にはＰ３Ｕ］細胞等を用
いて常法に従い細胞融合させる。

このようにして得られた融合細胞（ハイブリドーマ〉は
、ＨＡＴ培地のような選択培地により目的のハイブリド
ーマを選択できる。

３、ハイブリドーマのスクリーニング：このようにして
得られたハイブリドーマの中からさらに、目的のミリス
トイルオリゴペプチドを認識する抗体を産生じているハ
イブリドーマをスクリーニングする。その選択方法とし
ては、免疫に用いたミリストイルグリシルオリゴペプチ
ドと同じ抗原をコートしたマイクロプレート等を用いて
、各ハイブリドーマの培養上清をＥＬＩＳＡにて測定す
ることにより目的のモノクローナル抗体を産生ずるハイ
ブリドーマをスクリーニングすることができる。

このようなハイブリドーマを、さらにマウスの腹腔内に
接種し、生体内培養することにより単一のハイブリドー
マおよびこれにより産生されるモノクローナル抗体を量
的に増幅させることができ、１週間〜２週間マウス生体
内で培養させたのちマウスの腹水として回収し、ハイブ
リドーマ並びにモノクローナル抗体を得ることができる
。

この腹水から常法の抗体精製法に従い、精製モノクロー
ナル抗体を得ることができる。

このようにして得られる本発明のモノクローナル抗体は
、すでに上述したように種々の目的に用いることができ
、特に臨床的な癌化細胞の診断において極めて有用とな
る。

以下、実施例に従い本発明をさらに詳細に説明するが、
本発明は下記の実施例に何等限定されるものではない。

水溶性のカルボジイミド（３０μｍｏｌ）を市販のＮＭ
ｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ　（２０ｐ、　
ｍｏｌ　）の５（Ｈジメチルスルホキシド溶液１０ｍ］
に加え、室温で５分間反応させた。次にこの活性化され
たＮ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ９− Ｌｙｓをヘモシアニン３０ｍｇに溶解した混合溶媒Ｍｅ
２ＳＯＣ１（ｓＣ）Ｉ−Ｈ２Ｏ２５ｍ１に加え攪拌し室
温で一晩反応させた。不溶物質を遠心操作（１８０００
ｘ　ｇ、１５分間、４℃）で除去し、上清を脱イオン水
で３日間透析後、凍結乾燥した。かくして、ヘモシアニ
ンに結合したミリストイルオリゴペプチド抗原（１ｌ−
１４ｙｒ−Ｇｌｙ’５ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−ＫＬＨ）
を得た。

２　ハ　ブ１　′−マの 上記（１）により調製したＮ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ
−Ｓｅｒ−ＬｙｓＨＬｌｌ溶液を純系マウスであるＢａ
ｌ　ｂ／ｃマウスに２００μ９／マウスとなるように７
目間隔で４回腹腔内投与した。その後最終免疫を前記基
礎免疫終了後３０日の間隔をおいて行い抗原量が４０μ
９／マウスとなるように尾静脈より投与した。その３日
後にマウスよりＩＩＩ！！臓細胞を得、これを常法によ
りポリエチレングリコールを用いてマウスミエローマ細
胞Ｐ３Ｕ１と融合を行った。このようにして得られるハ
イブリドーマは、ＨＡＴ培地により選択した。

３　ハイブリドーマの　ローニング ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に上記で調製し１０ たミリストイルオリゴペプチド（Ｎ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙ−
ＳｅｒＳｃｒ−Ｌｙｓ）を結合させ（Ｎ−Ｍｙｒ−ＧＩ
ｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−ＬｙｓＢＳＡ　）　、　　これを
２００μｇ／ｍｌとなるようにトリス−１（Ｃ１緩衝液
（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１（Ｃ１ｐＨ８，０，１０＋ｎ
Ｍ　ＭｇＣｈ、　０．ＩＸＴｗｅｅｎ８０）に溶解し、
これを９６穴マイクロプレートに５０β／穴加え３７℃
、２時間放置し抗原の同相化を行った。上記緩衝液と水
で該プレートを洗浄後、１ｘオブアルブミン溶液を１０
０〆／穴加え、４℃で一夜マスキングを行った。これを
洗浄後乾燥し抗原プレートとした。

次に、この抗原プレートに上記で得られたハイブリドー
マの培養上清を５０岡／穴加え３７℃で１．５時間反応
させ、洗浄後更にペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ
ウサギ血清溶液（１：５０００）を５０縛／穴加え、３
７℃、３０分間反応させた。洗浄後ＴＭＢＺ　（３’３
“５’　５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｒ＋ｚｉｄ
ｉｎｅ）を基質として発色させλ４５０／λ６３０の吸
光を測定した。

このようにして抗体産生陽性であったハイブリドーマを
限外希釈法によりクローニングを行った。

１次クローニングは、ハイブリドーマを３個／穴１１ で培養プレートにまきこみ培養し、１穴に１つのコロニ
ーを作っているものについてのみＥＬＩＳＡ法により特
異抗体産生の有無を調べた。ここで、抗体産生陽性であ
ったハイブリドーマを今度は１個／穴で培養プレートに
まき、再クローニングを行った。スクリーニングの後、
抗体産生陽性ハイブリドーマを抗Ｎ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙ−
Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓモノクローナル抗体産生細胞と
して確立した。

４　モノ　ロー　ル　　の このようにして得られた抗Ｎ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ
−ＳｅｒＬｙｓモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
を１週間前にあらかじめブリスタンを腹腔的投与したＢ
ａ１ｂ／ｃマウスに１χ１０７個／マウス腹腔内注躬し
ハイブリドーマを増殖させた。ここで、ブリスタンを前
投与することにより腹水を多量に得ることができた。

７日〜１０日後、マウスを開腹し、ハイブリドーマと共
に腹水を採取し、遠心により細胞を除去して腹水を得た
。

上記により得られた腹水を、プロティンＡを結２− 合させた抗体精製用ゲル・　アフィゲルプロティンＡ（
市販品）カラｌ＼に以下の条件にて結合させた。

操作はすべて４℃で行った。

カラム　・　アフゲルプロテインＡ　（２，Ｏｘ　１２
ｃｍ）Ｍｆｆｌ液Ａ・　］、Ｍ（ＮＨ＋＞２ｓＯＡｐｌ
（９，０緩衝液Ｂ：　０．３Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ３，
０溶出方法：　Ｍ＊液Ａで洗浄後緩衝液Ｂで溶出検出方
法・Ｕ、　Ｖ、　２８０ｎｍの吸光度を測定Ｍ’ｆｆｒ
液Ｂで溶出した両分を硫安塩析後、０．１ＭＴｒｉｓ−
１（ＣＩ　ｐＨ８，０溶液に対して一夜透析を行い、精
製モノクローナル抗体を得た。

モノ　ロー　ル 精製モノクローナル抗体のサブクラスを同定するために
、抗γ１、抗γ２ａ、抗γ２ｂ、抗γ３、抗α、および
抗］１抗体を用いてＨ鎖のサブクラスを、抗におよび抗
λ抗体を用いてＬ鎖のサブクラスをオフタロニー法によ
り決定した。その沈降免疫反応の結果、本発明の精製モ
ノクローナル抗体の■４鎖のサブクラスはγ１、Ｌ鎖の
ザブクラスはにと決定された。

３− モ　　ロー　　　　　　いｔ・ 各種の癌細胞について、下記のとうり本発明のモノクロ
ーナル抗体を反応させその結果をみた。

ヒト大腸癌細胞であるＤＬＤ−１，Ｗ　ｉ　Ｄｒ、ＣＯ
Ｉ、０３２０Ｄ１１、Ｃ０ＬＯ２０１及びＬｏＶｏ（Ｊ
ｏｓｅｐｈ　Ｂ、　Ｔｌｏｌｅｎ　ｅｊ　ａｌ、　Ｐｒ
ｏｃＮ、Ａ、Ｓ、　ＵＳＡ　Ｖｏｌ、８４　ｐ２２５１
−２２５５．　１９８７年）および肝癌細胞をそれぞれ
１％Ｔｒｉｔｏｎ、１ｘデオキシコホル酸、　１ｍＭ　
ＰＭＳＦを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１（ＣＩ　Ｂｕｆ
ｆｅｒ　　（ｐＨ７゜４）で可溶化し、遠心処理するこ
とにより沈澱物を除去し、その上清を回収することによ
りライセードを調製し、それぞれのライセードを５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に処した。泳動後、
このゲルからニトロセルロース膜へトランスプロットを
行った。これに本発明のＮ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−
Ｓｅｒ−Ｌｙｓを認識するモノクローナル抗体を反応さ
せた。

次にペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧウサギ血清を
反応させ、さらに基質としてジアミノベンジジン溶液を
反応させゲルを染色した。　上記の操作はすべて通常の
ウェスタンプロット法に準じて行った。また、同様のニ
トロセルロース膜を、上記の］４− モノクローナル抗体の代わりに抗ＳＲＣ蛋白ウサギ血清
（ＴＢＳ：　市販品〉を、抗マウスＩｇＧウサギ血清の
代わりに抗つサギＩｇＧヤギ血清を用いて同様のウェス
タンプロットを行った。

その結果、本発明のモノクローナル抗体を用いたウェス
タンプロットでは、ｐ６ＱｓＲｃ遺伝子に癌化の因果関
係があることが判っている上記５種のヒト大腸癌細胞細
胞のライセー１〜のみにおいて、分子量６０にの位置に
バンドが検出された。一方、ＲＡＳ遺伝子に癌化との因
果関係があると思われる肝癌細胞のライセードにおいて
は、そのようなバンドは検出されなかった（第１図参照
）。また、抗ＳＲＣ抗体を用いたウェスタンプロットに
より、上記で検出されたバンドは、ｐ６ＱＳＲＣ蛋白で
あることもｉ認された。

この結果より、本発明のモノクローナル抗体は、各種の
癌化細胞においてｐ６ＱｓＲｃ遺伝子が原因となって生
じている癌細胞のみを特異的に検出することができるこ
とが確認された。

【図面の簡単な説明】

５− 第１図は、実施例（６）で行った本発明のモノクローナ
ル抗体を用いたウェスタンプロットの結果の模式図を示
す。レーン１はＤＩＤ−１，レーン２はＷｉＤｒ、レ−
ン３　ハ、Ｃ０ＬＯ３２０ＤＭ、レーン４はＣ０ＬＯ２
０１、レーン５は、ＬｏＶｏおよびレーン６は肝癌細胞
のそれぞれのライセードを電気泳動したものである。 第２図は、実施例（６）で行った抗ＳＲＣ蛋白ウサギ血
清を用いたウエスタンブロッ１への結果の模式図を示す
。各レーンは、第１図の対応する各レーンと同じサンプ
ルを電気泳動したものである。 ］６一 第２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ミリストイルグリシルオリゴペプチドを特異的に
   認識することを特徴とするモノクローナル抗体。 （２）ミリストイルグリシルオリゴペプチドが、Ｎ−Ｍ
   ｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓである前記第（
   １）項記載のモノクローナル抗体。 （３）ミリストイルグリシルオリゴペプチドを担体に結
   合させた蛋白質を免疫用抗原として免疫したマウス由来
   の脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを融合して得られ
   るハイブリドーマを培養することを特徴とするモノクロ
   ーナル抗体の製造方法。 （４）ミリストイルグリシルオリゴペプチドが、Ｎ−Ｍ
   ｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓである前記第（
   ３）項記載のモノクローナル抗体の製造方法。 （５）ミリストイルグリシルオリゴペプチド結合蛋白質
   が、Ｎ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｋ
   ＬＨである前記第（３）項記載のモノクローナル抗体の
   製造方法。（６）下記のミリストイルグリシルオリゴペ
   プチドを特異的に認識するモノクローナル抗体を用いて
   、検査対象となるガン細胞の抽出液について抗原抗体反
   応を行うことを特徴とするガン細胞の同定方法。 Ｎ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ （７）抗原抗体反応が、細胞抽出液に該モノクローナル
   抗体を反応させ、次に抗マウスＩｇＧ酵素標識抗体を反
   応させることを含む前記第（６）項記載の同定方法。