JPH0376591A - Ｌ―カルニチンの微生物学的方法による断続的製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、微生物を利用したＬ−カルニチンの新規な製
造方法に関する。

Ｌ−力ルニヂンは、人の物質代謝だＬえば脂肪酸の分解
に不可欠の物質である。　それゆえ、合成り一カルニチ
ンは対応するビタミン欠乏症への作用物質εして、その
医薬製剤に使用されている。

Ｌ−カルニチンをγ−ブチロベタインから製造すること
は知られている。　これは、γ−ブチロベタインを、ナ
トリウム−２−オキソグルタル酸、還元剤、鉄イオン源
およびヒドロキシル基供与体としての空気中の酸素の存
在下で、アカパンカビ（Ｎ　ｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒ
ａｓｓａ　）の胞子から出るヒドロキシラーゼ酵素ε接
触させる（ＵＳ−ＰＳ４３７１６１８〉ことによって行
なう。　しかし、この方法は多数の補助因子を必要とし
、それらを外部から補給しなければならない欠点がある
。　反応に際しては、化学通論最の２−オキソグルタル
酸が酸化脱炭酸されて］ハク酸になる。　活性体εして
のＦｅ２＋は、鉄イオンを還元形態に保持するためにア
スコルじン酸を必要＆し、また、わずかに生成する有害
な口、０２を分解するためにカタラーゼを必要とする。

リントシュテッドらは、γ−ブチロベタインを、Ｃ源お
よびＮ源として増殖するシュードモナス（ｐ　５ｅｕｄ
０１１１０ｎａＳ　）類の微生物を分離した（　Ｌ　１
ｎｄ−ｓｔｅｄｅｔａｌ、　　１３ｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ５．　１２６２−１２７０（１９６７）　”Ｔｈｅ
　　Ｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄ　　Ｄｅｇｐａ−ｄａｕ
ｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｒｎｉｔｉｎ　ｉｎ　　ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ”〕。

分解過程の最初の反応は、Ｔ−ブチ０ベタインのＬ−カ
ルニチンへの水酸化であるが、中間で生成するし一カル
ニチンは完全にＣＯ２，１」２０およびＮＨ３に分解さ
れてしまう。

また、バクテリアから得られたヒドロキシラーゼをＬ−
カルニチン生産に用いると、補助因子の欠乏をひき起こ
ｒＪ−εいう欠点がある（　Ｌ　１ｎｄｓｔｅｄｅｔ　
ａｌ、　　３　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ工６　、　２１
８１−２１８８　（１９７７）“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ　ａｒｏｊ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　　７−
Ｂｕｔｙｒｏｂｅｔａｉｒｉｅ　　Ｈｙｄｒｏｘｙｌａ
ｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｐｓｅｕｄｏ−ｍｏｎａｓ　　ｓｐ、
　　ＡＫＩ”）。

さらに、アメリカ特許第４７０８９３６月明細書によれ
ば、Ｌ−カルニチンを微生物学的方法で連続的に製造す
ることがで送る。　しかし、この方法には、連続的製造
に際し、菌株安定性をかなり高く（１０００時間以上）
しなければならないうえに、培地中の製品濃度が比較的
低いεいう欠点がある。　製品／中間体の比も同様に低
い。

本発明の課題は、従来方法に伴う欠点がなく、クロトノ
ベタインおよび（または）Ｔ−ブチロベタインからし一
力ルニチンを、対掌体選択的かつ微生物学的に高収率で
製造できる方法を提供することにある。

上記の課題は、請求項１に：記載の方法により解決され
る。

すなわち本発明は、シュド−モナス（Ｐ　５ｅｕｆｌｏ
＝ｎ＋ｏｎａｓ　）　、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕ
ｍ）　、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｅｔｅｒｉ
ｕｍ）　、イー・コリ（Ｅ。

ｃｏｌｉ）などの微生物、またはサッカ０マイセス（Ｓ
　ａｃｃｈａｌ″ｏｔｎｙｃｅｓ　）の酵母を含む培地
に、γ−ブチ日ベタインおよびくまたは〉りＯトノベタ
インε炭素源および窒素源としてのベタインとを供給づ
−るとともに補助炭素源を加え、し−力ルニヂンの濃度
が最高になったときにし一力ルニチンを分離することを
特徴εする。

リゾビウム種の微生物としては、西ドイツ微生物奇・託
機関（ＤＳＭ＞であるバイオテクノ日ジー研究所（グリ
ーズバッハシュトラーセ　８．Ｄ−３４００、ゲッチン
ゲン）に１９８５年２月８日に寄託したＮＱＤＳＭ３２
２５の菌「口に１３３１ｂＪおよび１９８４年１月２３
Ｂに同所に寄託（）たＮｃＤＳＭ２９０３の菌「口に１
３」を用いるのが好ましい。

この方法には、遺伝〒工学的に変化させた微生物を用い
るこεもできる。

既知のシステムによる技術の場合εは異なり、本発明に
よる微生物は、ヒドロキシル基供与体として、０２では
なく口２０を使用する。　これは、目２１８０ε１８０
２を用いた独特の試験により確認することができる。

この、さくにずぐれた微生物の選択と分類は、ＥＰ−Ａ
−０１５８１９４に開示されている。

本発明によるし一カルニチンの製造は、最初にいわゆる
バッチ相において、生産能力のあるバイオマスを生産す
ることにより開始するのがよい。

そのためには、ＥＰ−Ａ−０１５８１９４の記載に対応
する既知の方法に従って、前記の菌を、滅菌した、好ま
しくはビタミンを含有する無機培地（Ｋｕｌｌａ　ｅｔ
　ａｌ、　Ａｒｃｈ、　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１３
５゜１　（１９８３））中で、２０〜４０℃とくに３０
℃で、ｐＨ６〜８とくに７とし、５〜８０時間、好まし
くは１５〜４０時間培養する。　この培地には、成長基
質として０．０１〜１０重量％、好ましくは０．０１〜
５重量％のコリン、グルタミン酸塩、酢酸塩、ジメチル
グリシンまたはベタインを添加するのがよい。　とくに
ベタインをグルタミン酸塩その他の炭酸源とともに０．
０２〜５重量％用いることが好ましい。

さらに、バッチ相においては、転換すべき出発原料であ
るγ−ブチロベタイン、クロトノベタインまたはその混
合物を、反応媒体基準で０．０１〜１０重量％、好まし
くは０．１〜５重量％加えておく。

γ−ブチロベタインおよびクロトノベタインは、一部は
塩酸塩として、残りは遊離の分子内塩として使用するこ
とができる。

バッチ相で培養したバイオマスは、ざらに次の培養に移
す。　この培養は、前の培養と同一の組成で行なうのが
よい。

本発明方法によれば、バッチ相で培養したバイオマスは
、いわゆる「フェッド・バッチ相」におけるし−カルニ
チン製造の原料となる。

「フエツド・バッチ相」の培養培地は、バッチ相のそれ
とほとんど同じである。

この「フエツド・バッチ相」の特徴は、培養液に未加工
物であるクロトノベタインおよび（または）γ−ブチロ
ベタイン、ベタインおよび補助炭素源を投入することで
ある。

炭素源としては、当該分野において通常用いられ、また
たとえばリゾビウム画用として文献に記載された化合物
（Ｔｈｅ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ、　Ｃｈａｐｔｅｒ
６７、　　Ｔｈｅ　ｇｅｎｕｓ　　Ｒｈ１ｚｏｂｉｕｎ
＋、　　ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ１９８１．　ｐ
８２５）を使用することができる。

このような炭素源としては、グルコース、フラクトース
などの糖、グリセリンなどのシユガーアルコール、酢酸
などの有機酸が例示される。

とくに、グルコースまたはグリセリンを用いるのが好ま
しい。

炭素と窒素とのモル比（Ｃ：Ｎ）は、５：１〜１０．０
００：１の範囲、とくに１０：１〜１００：１の範囲が
好ましい。

ベタインを窒素源として用いるときは、Ｃ／Ｎをとくに
高くすることが必要である。　他の窒素源としては、通
常のもの、アンモニウムのような既知の前駆体を使用す
ることができる。　このほかに、イオウ源、リン源、ト
レーサ元素、ビタミンなどの補助栄養素や、肉エキス、
酵母エキスまたは麦芽汁、メイズなどの複合栄養素を添
加してもよい。

未加工物のγ−ブチロベタインまたはクロトノベタイン
は、培地中の濃度が０．００５〜５％、好ましくは０．
０２〜２％となるように供給する。

Ｃ源／Ｎ源の供給速度は、バイオ反応器におけるバイオ
マスの量に依存する。　バイオマス濃度の測定方法は、
培養液の乾燥重量を測定することである。　この乾燥重
量および所望の炭素／窒素比に合わせて、炭素源および
ベタインを、乾燥培地１　Ｋ９あたり１時間に０．０１
〜１００モル、好ましくは０．１〜１０モルの炭素とな
るように供給する。

温度２０〜４０℃、ｐＨ６〜８の条件で行なうのが有利
である。

この「フエツド・バッチ相」で通常２５〜２５０時間の
培養を行なうと、培養液中のし一カルニチンの濃度が６
％以上になる。

この方法の実°！ｉ！態様として、発酵が終了したら培
養液を一部抜き出し、残りの部分に新しい培養媒体を加
えて「フェッド・バッチ」培養を新たに行なうこともで
きる。　このいわゆる「繰り返しフエーヲド・バッチ」
法を行なうと、発酵の容量生産性を高めることができる
。

培養を終えたら、用いたＴ−ブチＯベタインおよび／ま
たはり目トノベタインを、イオン交換または電気透析に
より脱塩精製する。

焙養液からし一カルニチンを分離づ°る方法は、たとえ
ばＥＰ−Ａ−１９５９４，４により知られでいるから、
これに従って行なえばよい。　すなわち、バイオマスを
たεえば遠心分離、限外濾過または精密濾過により分離
した後、溶液を電気透析装置にかけて負荷部分（カチオ
ンおよびアニオン）を除（。　脱塩の終点は、電導度測
定により確認する。　これにより、塩は濃縮循環液に残
り、「−カルニチンは西部塩（ベタイン）として稀釈循
環液中に残る。　このようにして、稀釈液中の１．。

−カルニチンの収率は、脱塩後９５％以止になる。

電気透析の代りに、口“型の強酸性イオン交換樹脂を使
ってＬ−カルニチンを脱塩することができる（Ｊ、　Ｐ
、　Ｖａｎｄｅｃａｓｔｅｅｌｅ、　Ａｐｐｌ、Ｅｎｖ
ｉｌ′ｏｎ−Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　３９．３２７　（
１９８０）参照〕。

イオン交換塔に溶液を供給し、イオン交換体が使い尽さ
れてＬ−カルニチンが流出しでくるまで続ける。　アニ
オンは遊＠塩こして流用液中に出てくる。　カチオンは
イオン交換樹脂に吸１れる。

イオン交換樹脂を水で中和洗浄したのち、アンモニア水
でり、−アルニヂンを溶出する。　このようにして、ア
ンモニア性アルカリ溶出液中のＬカルニチンの収率は９
５％以上になる。

電気透析またはイオン交換によって得られた１−カルニ
チンの稀釈溶液は、蒸発または逆滲透法により濃縮し、
共沸蒸沼により水を除去ターる。

次いで、このようにして得られたし一力ルニヂンを、イ
ソブタノール／アセトン、メタノール、エタノール、ｎ
−ブタノールまたはｌ−一カルニチンがあまり溶解しな
い溶媒、たと孟ばアセトン、エチル酢酸、Ｔ−ブチル酢
酸、イソブチルメチルケトン、アセ式ニトリル８組合わ
せたものから再結晶させる。　と（に好ましいのはイソ
ブタノールであり、同時に活性炭で処理すると、白色の
精製り一カルニチンが得られる。　この方法により、５ 比旋光度〔α〕、が−３０，５〜３１゜Ｏ’　　（Ｃ＝
１．ｔ４２０）（文献値−３０，９°　；３［ｒａｅｋ
ｅｔ　ａｔ、　　目ｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、
　ｆ、　　ｉ）ｈｙｓｉｏｌｏｇ。

Ｃｈｅｎｉ、、３１８　（１９６０）、１２９）で、純
度が９９％（目ＰＬＣ）以東のし一カルニチンが（琴ら
れる。

以下、本発明を実施例により具体的に説明する。

Ｘ塵盟ユ 菌目に１３３１ｂを含む０．３ＪＰの前培養物を、次に
示す栄養媒体中で３０’Ｃ，ｐＨ７，０で２４時間培養
した。

（栄養媒体の組成） Ｌ−グルタミン酸塩　　　　　　　　　２ｇベタイン　
　　　　　　　　　　　　　２ｇγ−ブチロベタイン　
　　　　　　　　２ｇ緩衝溶液　　　−１００ｄ Ｍｇ−Ｃ１００ｄ溶液　　　　　　　２５ｄトレ一サー
元素溶液　　　　　　　　　１Ｗｄ！ビタミン溶液　　
　　　　　　　　　　１ｒＩＪＩｌ水　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　１ｆＪ（上記緩衝溶液の
組成） ａ２ＳＯ４ Ｎａ２　ＨＰＯ４”２Ｈ２０ ＫＨ２ｐｏ４ ＮａＣ，ｌ！ 水 （Ｌ記ＭＵ　−Ｃａ−Ｆｅ溶液の組成）ＭｑＣＪ２　　
・６目、０ ＣａＣＪ　　２　　−　　２８２　　０ＦｅＣＪ）　　
　　　　−６ト）２０ 水 ｃ−ｈ記トレーサー元素溶液の組成〉 ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０ Ｍｎ（Ｊ２−４目２０ ３８０３ ＣＯＣ擬２・６Ｈ２０ Ｃｕ（Ｊ２−２０２Ｏ Ｎ　ｉ　Ｃ４！　２　　・６０２Ｏ Ｎ８２　ＭＯＯ４’　２０２０ 水 （上記ビタミン溶液の組成） ６ｇ ０．５８ｇ ０．０３２ｇ Ｎ ２５゜ １ ８９ ０ｇ ０９ １ １０ｌ１００１ ｆｔ■ ３００！ｒｔｇ ２００１ｒ１ｇ ０Ｒｇ ２ｆＩｒｇ ３０１１１ｇ ｆＪ ピリドキサール、口ＩＣ２１０■ リボフラビン　　　　　　　　　　　　　５ｍｓニコチ
ンアミド　　　　　　　　　　　５■チアミン、口０．
１！　　　　　　　　　　　５　！Ｑビオチン　　　　
　　　　　　　　　　　２ｍｇパントテン酸ナトリウム
　　　　　　　５■ｐ−アミノ安息香酸　　　　　　　
　　５ｍｇフォル酸　　　　　　　　　　　　　　２■
ヒタミンＢＢ１２５Ｉｆｔ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
１この前培養物を同一組成の培養媒体中において、３０
℃、ｐＨ７で２４時間培養した。　ｐＨは、８％のリン
酸水溶液を添加して７．０に保った。

ａ〉　次いで「フエツド・バッチ」操作を開始した。　
次の組成の２種の溶液を連続的に供給した。

（炭素−窒素源溶液〉 ベタイン　　　　　　　　　　　　１００ｇグルコース
　　　　　　　　　　　１３５ｇ水　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　１１炭素二窒素（モル比
＞　　　　　１０．３：１（γ−ブチロベタイン溶液〉 γ−ブチロベタイン　　　　　　　３００ｇ水　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１１炭素およ
び窒素源溶液は、４．５ｄ／ｈの供給速度で投入した。

　これは、「フエツド・バッチ」相の最初に、比供給速
度を４モルＣ／　Ｋｙ乾燥重量／ｈとしたことに相当す
る。　乾燥重量は、常法に従って測定した〔たとえば、
Ａｐｐｌ、　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｔｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ　２Ｂ　（１９８８）１０９ｆ、）。　γ−ブチ
ロベタインとＬ−カルニチンの濃度は口ＰＬＣにより測
定した。

γ−ブチロベタイン溶液は、培地中０．０５〜０．５重
量％となるように投入した。　培養時間１５０時間で、
し−カルニチンの濃度は６゜４％、未転化Ｔ−ブチロベ
タインの濃度は０゜２９％となった。　これはγ−ブチ
ロベタインの転化率が９５％であることを示す。

ｂ）　　ａ）に対応して、同一組成の炭素／窒素源溶液
およびγ−ブチロベタイン溶液を用いて、「フエツド・
バッチ」操作を続けた。

炭素および窒素源溶液を、４．５ｄ／ｈの供給速度で投
入した。　これは、「フエッド・バッチ」相の最初に比
供給速度を４モルＣ／に９乾燥重量／ｈとしたことに相
当する。　乾燥重量は常法に従って測定した（たとえば
、ＡＩ）ｌ）ｌ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　２８　（
’ｌ　９３８）　１０９ｆ、〕。　〕γ−ブチロベタイ
とＬ−カルニチンの濃度は、口ＰＬＣにより測定した。

　γ−ブチロベタイン溶液は、培養培体中０．０５〜０
．１５重量％となるように投入した。　培養時間１５５
時間で、Ｌ−カルニチンの濃度は６．３％、未転化γ−
ブチロベタインの濃度は０．１３％となった。　これは
γ−ブチロベタインの転化率９８％に対応する。

Ｌ−カルニチンの　離 り一カルニチン６４ｇ／Ｊ２、γ−ブチロベタイン２．
９９／ｊ！および無機塩を含む溶液をＥＰ−Ａ−１９５
９４４に記載の方法に従って処理し、Ｌ−カルニチンの
精製品を得ることができた。

再結晶により精製して、純度９９％以上（口ＰＬ５ Ｃ〉、比旋光度〔α）、−−３０，９°　（Ｃ＝１゜日
、０〉の白色のし一力ルニチン５６．３ｇ（８８％）が
得られた。

大思開２ 実施例１においてγ−ブチロベタインの代りに２ｇ／ｌ
のクロトノベタインを含む栄養媒体３００ｒｄに菌「口
に１３３１ｂＪを接種して、３０℃、ＤＨ７で２４時間
培養した。

この前培養体を実施例１記載の栄養媒体中で、３０℃、
Ｉ）Ｈ７，０１２４時間培養した。　８％リン酸水溶液
を用いてｐＨ７，０に保った。　次いで、「フエツド・
バッチ」操作に移った。　実施例１の記載と同様に、炭
素および窒素源と次に示す組成の溶液を連続的に投入し
た。

（クロトノベタイン溶液の組成） クロトノベタイン　　　　　　　　３００ｇ水　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１１この溶液を
、炭素および窒素源とともに４．５ｍｌ／Ｆ１の供給速
度で投入した。　これは、「フ工ラド・バッチ」相の最
初に、比供給速度を約４モルＣ／　Ｋ！Ｊ乾燥重盟／ｈ
としたことに相当する。

その他は実施例１に記載の方法と同様に処理し、分析に
か【プた。　タ日トノベタイン溶液は、培地中の濃度が
０．０５〜Ｏ０５重量％となるように投入した。　培養
時間１５０時間で、し−カルニチンの濃度が６．１％、
未転化り目トノベタインの濃度が０．１７％になった。

　これはクロトノベタインが９５％転化したここに相当
する。

−カルニチンの分 し−カルニチン６１ｇ／Ｌりロトノベタイン１．７９／
１および無機塩を含む溶液を、前記と同様に巳Ｐ−Ａ−
１９５９４４号に記載の方法に従って処理し、精製し一
力ルニチンを得た。

再結晶により０龜のし一カルニチン５２５Ｆ　（８６％
）が得られた。　比旋光度などの物性は、実施例１に記
載したεころと同一であった。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）クロトノベタインおよび（または）γ−ブチロベ
   タインを微生物学的に利用してＬ−カルニチンを断続的
   に製造する方法であって、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄ
   ｏｍｏｎａｓ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、
   アグロバクテリウム（Ａｇｒｏ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
   、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの微生物またはサツ
   カロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ−ｃｅｓ）の酵母
   を含む培地に、γ−ブチロベタインおよび（または）ク
   ロトノベタインと炭素源および窒素源としてのベタイン
   とを供給するとともに補助炭素源を加え、Ｌ−カルニチ
   ンの濃度が最高になったときにＬ−カルニチンを分離す
   ることを特徴とする製造方法。
2. （２）クロトノベタインおよび（または）γ−ブチロベ
   タインの培地中の濃度を０．００５〜５％とすることを
   特徴とする請求項１の製造方法。
3. （３）ベタインと炭素源添加物とを、炭素と窒素のモル
   比が１００００：１ないし５：１となるように供給する
   ことを特徴とする請求項１または２の製造方法。
4. （４）炭素源添加物として、シユガーアルコールまたは
   有機酸を用いることを特徴とする請求項１の製造方法。
5. （５）炭素源添加物としてグルコースまたはグリセリン
   を用いることを特徴とする請求項４の製造方法。
6. （６）ベタインと炭素源添加物の供給速度を、乾燥培地
   １Ｋｇ当り０．０１〜１００モル／時とすることを特徴
   とする請求項１の製造方法。