JPH0365759B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は澱粉糖の製造法に関し、詳しくは特定
の多孔質キトサンに固定化した各種アミラーゼを
充填した反応器に澱粉液化液を供給して対応する
グルコース、マルトース、アルトオリゴ糖等の澱
粉糖を製造する方法に関する。 ［従来の技術、発明が解決しようとする問題点］ 固定化酵素を利用して澱粉糖を製造する方法に
ついては種々提案されており、たとえば固定化し
たグルコアミラーゼを利用して高濃度のグルコー
スを製造する方法が特公昭57−17517号、特開昭
58−60989号などに示されている。しかし、前者
の方法は生産されるグルコース濃度が十分でな
く、後者の方法は高濃度のグルコースは馬鈴薯系
澱粉を原料として達成されており、一般に高濃度
グルコースの作りにくいコーンスターチ等を原料
とした場合については記載されていない。 また、β−アミラーゼを固定化してマルトース
の製造に利用することは特開昭59−198977号など
に示されているが、酵素活性の維持に対してさら
に改善することが望ましい。 さらに、マルトトリオース以上の重合度を有す
るマルトオリゴ糖を生成するアミラーゼを固定化
してマルトオリゴ糖を製造する方法について本発
明者らは既に開発した（特願昭60−125093号（特
開昭61−285998号））。この技術は工業的にも十分
に実施しうるものであるが、高価な酵素をより有
効に利用することにおいて改善の余地がある。 ［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、アミラーゼを固定化する担体に
ついて検討を重ねた結果、特定の多孔質キトサン
を用いた場合に従来よりも通液速度を大きくする
ことができ、しかも酵素活性を安定的に維持しう
ることを見出し、本発明に到達した。また、固定
化酵素を組合せて複合系とすることにより目的と
する澱粉糖の収率を高めることが出来ることも見
出した。 本発明は第１に、天然高分子キチンを脱アセチ
ル化した後、ジカルボン酸、ジアルデヒド、ジイ
ソシアネート等で架橋して耐酸性を付与したもの
に、さらにスペーサーとして脂肪族または芳香族
系などの官能基を導入した多孔質キトサンに固定
化したアミラーゼを澱粉液化液に作用させること
を特徴とする澱粉糖の製造法に関するものであ
り、第２に上記多孔質キトサンに固定化したアミ
ラーゼを固定化枝切り酵素と共に澱粉液化液に作
用させることを特徴とする澱粉糖の製造法に関す
るものである。 本発明に用いるアミラーゼとしては各種のもの
があり、グルコアミラーゼはリゾプス属、アスペ
ルギルス属、ムコール属、ピリカラリア属、など
のカビ起源のものが主に用いられ、特にリゾプ
ス・デレマー起源のものが好適である。そのほか
エンドマイセス属、トリコデルマ属、サツカロミ
セス属などの酵母やクロストリジウム・アセトブ
チリカムなどの細菌起源のものが知られている。
β−アミラーゼとしては、大豆、麦芽等の植物起
源のもののほかにバチルス・ポリミキサ［D.
French，Arch.Biochem.Biophys.，104、338
（1964）］、バチルス・セレウス［Y.Takasaki，
Agric.Biol.Chem.，40、1515、1523（1976）］、シ
ユードモナス属細菌［S.Sinkeら、J.Ferment.
Technol.，53、693、698（1975）］、ストレプトミ
セス・ヒグロスコピカス［Y.Hidakaら、
Sta¨rke、26、413（1974）］、ストレプトミセス・
プレコツクス［若生勝雄ら、澱粉化学、25、155
（1978）］等の微生物起源のものがある。 また、マルトトリオース以上の重合度を有する
オリゴ糖を生成するアミラーゼとしては次のもの
が知られている。 マルトトリオース生成アミラーゼ［若生勝雄
ら：澱粉化学、26、175（1979）、ストレプトミセ
ス・グリセウス（Streptomyces griseus）起源
のもの；高埼義幸：昭和58年度日本農芸化学大会
要旨集、P169（1983）、バチルス（Bacillus）属起
源のもの］ マルトテトラオース生成アミラーゼ［J.F.
Robyt and R.J.Ackerman：Arch.Biochem.
Biophys.，145、105（1971）、シユードモナス・
ストツツエリ（Pseudomonas stutzeri）起源の
もの］ マルトペンタオース生成アミラーゼ［N.
Saito：Arch.Biochem.Biophys.，155．290
（1973）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus
licheniformis）起源のもの；小林昭一ら；昭和
58年度日本澱粉学会大会要旨集、P301（1983）；
吉儀尚浩ら：昭和59年度日本農芸化学大会要旨
集、P584（1984）］ マルトヘキサオース生成アミラーゼ［K.
Kainumaら：FEBS Lett.，26．281（1972）、エ
アロバクター・エアロゲネス（Aerobacter
aerogenes）起源のもの；J.F.Kennedy and C.
A.White：Sta¨rke、31、93（1979）；谷口肇ら：澱
粉化学、29．107（1982）；Y.Takasaki：Agric.
Biol.Chem.，47．2193（1983）］ 次に、上記アミラーゼの担体として用いる多孔
質キトサンとしては、たとえば商品名：キトパー
ル（富士紡績社製）があり、これは天然高分子キ
チンを脱アセチル化した後、ジカルボン酸、ジア
ルデヒド、ジイソシアネート等で架橋して耐酸性
を付与したものに、さらにスペーサーとして脂肪
族または芳香族系などの官能基を導入した多孔性
ビーズであり、PH安定性、耐薬品性、熱安定性に
すぐれている。この「キトパール」は粒径0.1〜
3.0mm、孔径3.0μｍ以下、比表面積15〜230m²／ｇ
であるが、本発明ではこの値に制限されるもので
はない。 各種アミラーゼをキトサンを固定化する方法は
任意であり、たとえば緩衝液中で両者を接触させ
る方法を採用することができる。その１例を示す
と、「キトパール」100mgを0.01〜0.20モル濃度の
各種緩衝液（PH4.0〜8.0）で十分に平衝化した
後、各種アミラーゼ５〜500単位を緩衝液２mlに
溶解して添加し、十分に混合する。次いで、室温
にて0.5〜24時間放置するか、または0.5〜5.0時間
往復振とう処理（120ストローク／分）した後、
ガラスフイルターで過し、続いて種々の緩衝液
50mlで洗浄する。 このようにして得られる固定化酵素は見かけ上
の固定化率が90％以上であり、固定化酵素の発現
活性は担体湿重量１ｇあたり40〜2000単位であ
る。なお、見かけ上の固定化率は次式によつて算
出した値である。 供給した酵素活性−洗浄液中の酵素活性／供給した酵素
活性×100 （％） 酵素の固定化方法としては、上記方法のほか担
体をカラムに充填したのち酵素溶液を下降法また
は上昇法により通液する方法も適用できる。 本発明に用いる固定化アミラーゼは担体への固
定化が極めて容易であり、しかも酵素の発現活性
も実用に十分耐えるものである。 次に、第２の本発明で用いる固定化枝切り酵素
について説明する。枝切り酵素としては、バチル
ス・アシドプルリテイカス、グレブシエラ・ニユ
ーモニアなどの微生物起源のプルラナーゼやシユ
ードモナス・アミロデラモサ、シトフアーガ属微
生物等が生産するイソアミラーゼを用いることが
できるが、グルコース生成アミラーゼではほとん
どがPH4.0〜6.0、マルトオリゴ糖生成アミラーゼ
でほとんどがPH5.0〜8.5の範囲に至適PHを有する
ので、枝切り酵素も同様の安定かつ至適PH範囲を
有するものを用いることが望ましい。 枝切り酵素を固定化する担体については、固定
化操作により高い発現活性を示すものであれば、
どのようなものでも良いが、特に次の担体を用い
ることが望ましい。すなわち、本発明者らは数多
くの担体の中から各種枝切り酵素を効果的に固定
化しうるものを選択すべく検討した結果、特に微
弱酸性的多孔質吸着樹脂、弱酸性カチオン樹脂、
フエノール系吸着樹脂、粒状多孔質キトサンなど
が好適な担体であることを見出した。より具体的
には、デユオライト系樹脂（ダイヤモンド・シヤ
ムロツク社製）の商品名「Ｓ−761」、「Ｓ−762」、
「ES−771」、「Ｃ−464」、「Ａ−７」、「Ｓ−587」
、
「Ａ−562」や前記の「キトパール」を挙げること
ができる。 なお、枝切り酵素の固定化方法は制限されず、
たとえば前記した方法を適用することができる。 また、ネイテイブ枝切り酵素および固定化枝切
り酵素の活性測定方法は、基質としてプルラン
（ハヤシバラ生物化学研究所製）またはアミロペ
クチンを用い、それらの至適PHで反応を行なうこ
と以外は各種アミラーゼの場合と同じである。 本発明で使用する原料澱粉としては種々のもの
が使用できるが、通常馬鈴薯澱粉、甘薯澱粉、コ
ーンスターチ、ワキシーコーンスターチ、キヤツ
サバ澱粉等を用いる。また、反応器に通液する澱
粉液化液のグルコース当量（DE）は通常、１〜
35、好ましは５〜20の範囲にあるものを用いるの
が良い。ここで澱粉液化液のDEがワキシーコー
ンスターチの場合１以下、それ以外の澱粉では
DEが５以下のものは老化が激しく、工程上の取
扱いに工夫が必要である。一方、DEが35以上に
なると、グルコアミラーゼによるグルコース生成
に対しては逆合成が促進されてイソマルトース、
パノースなどの生成が増大し、グルコースの収量
が低下する。また、各種マルトオリゴ糖の生成に
対してグルコース、マルトース等の低分子糖の生
成が増大し、かつマルトオリゴ糖の収量が低下す
るので適当でない。なお、各種澱粉を液化する方
法は特に制限はないが、通常は液化型α−アミラ
ーゼまたは塩酸等の酸で処理する。次に、マルト
オリゴ糖とはマルトース、マルトトリオース、マ
ルトテトラオース、マルトペンタオース、マルト
ヘキサオース等を意味する。 本発明者らは、固定化酵素を用いて各種澱粉糖
を効率よく生成するため条件について種々検討を
重ねた結果、次のような因子等が大きく影響して
いることが判つた。すなわち、使用する基質の種
類、濃度およびその供給量、固定化担体の種類
（物性）、固定化した酵素量、その充填塔への充填
量、反応系の温度、PH等の条件などである。 これらを系統的に検討した結果、これら因子等
の影響は以下に示す表現および条件の範囲内にお
いて効率よくそれぞれの澱粉糖を生成することが
できることを見出した。すなわち、本発明の方法
では、固定化アミラーゼを反応器に充填し、前述
の澱粉液化液を固定化酵素単位活性あたりの重量
基準空塔速度が１×10^-4〜２×10^-1hr^-1（IU／ｇ）
^-1の条件で供給することによつて効率良く各種澱
粉糖を製造するものである。より好ましくは、グ
ルコアミラーゼに対しては１×10^-4〜３×
10^-3hr^-1（IU／ｇ）^-1、β−アミラーゼに対しては
１×10^-4〜４×10^-3hr^-1（IU／ｇ）^-1、各種マルト
オリゴ糖生成アミラーゼに対しては３×10^-4〜２
×10^-1hr^-1（IU／ｇ）^-1の条件を適用すべきであ
る。ここで、固定化酵素の単位活性あたりの重量
基準空塔速度は次のようにして求めた値である。
まず、反応器に充填するものと同じ固定化アミラ
ーゼ10mg（wet）を0.5mlの10ｍＭ各種バツフアー
（PH7.0）（50ml三角フラスコ中）に加え、十分に
馴染ませた後、反応器に供給するものと同じ基質
（澱粉の種類、濃度等も同じ）5.0mlを加えて、反
応器と同じ温度で往復振とう機により120ストロ
ークス／min.、４cm幅で振とうしながら酵素反
応を行い、生成還元糖をSomogyi−Nelson法で
測定するか、高速液体クロマトグラフイーのよう
な分析機器で直接生成する澱粉糖を測定して発現
する活性を測定する（この発現活性をＡ IU／
ｇ−担体とする。）。なお、酵素活性はそれぞれの
反応条件で１分間に1μmolのグリコシド結合を切
断する酵素量を１単位（１国際単位IU）として
表わすことにする。また、反応器に充填する固定
化アミラーゼをBg（wet）、反応器に供給する澱
粉液化液量を固形分としてCg−固形分／hrとす
るとき、単位活性あたりの重量基準空塔速度を
Ｃ／（Ａ×Ｂ）hr^-1（IU／ｇ）^-1として求める。な
お、DEが大きい場合には原料中に目的とする澱
粉糖やそれよりも小さい糖を含むので、上記Ｃの
値としてはそれらを除いた固形分量を用いるのが
より実際的である。単位活性あたりの重量基準空
塔速度が２×10^-1hr^-1（IU／ｇ）^-1、グルコアミラ
ーゼの場合には３×10^-3hr^-1（IU／ｇ）^-1、β−ア
ミラーゼの場合には４×10^-3hr^-1（IU／ｇ）^-1、マ
ルトトリオース以上の重合度を有するマルトオリ
ゴ糖生成アミラーゼの場合には２×10^-1hr^-1
（IU／ｇ）^-1よりも大きいと、すなわち反応器中
での反応時間が短いと加水分解反応が十分におこ
なわれないため、それぞれの澱粉糖の収率が悪く
なり好ましくない。また、マルトオリゴ糖の生成
の場合には単位活性あたりの重量基準空塔速度が
１×10^-4hr^-1（IU／ｇ）^-1よりも小さくなると、す
なわち反応器中での反応時間が長くなると、下記
の刊行物に明らかにされているように、生成した
マルトオリゴ糖がさらに過分解されるため、グル
コース、マルトース等の低分子の糖が生成され、
製品の純度が著しく低下するばかりでなく、後に
精製分離を行なう場合の効率を悪くするので好ま
しくない。 上記したマルトトリオース以上の重合度を有す
るマルトオリゴ糖の過分解については、マルトオ
リゴ糖生成アミラーゼは、反応初期にはそれぞれ
のオリゴ糖（マルトトリオース、マルトテトラオ
ース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース
等）を特異的に生産するが、反応後期になるにつ
れて生成物そのものを分解することが明らかにさ
れている［T.Nakakuki et al；Carbohydro.
Res.，128、297（1984）］。 また、グルコアミラーゼの場合は、単位活性あ
たりの重量基準空塔速度が１×10^-3hr^-1（IU／ｇ）
^-1あたりからパノース、イソマルトース等を生成
する逆反応が進行し、目的とするグルコースの収
率が低下し、効率的でなくなる。 一方、現実的にみて、単位活性あたりの重量基
準空塔速度が１×10^-4hr^-1（IU／ｇ）^-1以下になる
と、反応器中での滞留時間が長くなり、反応器の
大きさも過大となり、経済的にも有効性のないも
のとなると共に、原料澱粉液化液の老化による目
的澱粉糖の低下を来たし、また運転上のトラブル
の原因ともなりかねない。 本発明によれば、固定化アミラーゼの使用によ
つて固定化しない元のアミラーゼよりも反応条件
の拡大が期待できる。たとえばキトサンに固定化
した固定化マルトテトラオース生成アミラーゼの
場合には、温度安定性が10℃程度高温側に広がる
と共にPH安定性も広範囲にわたり改善される。ま
た、至適温度は固定化により10〜15℃上昇し、至
適PH曲線も酸性側に広がることを見出しており、
固定化酵素の酵素化学的性質は可成り改善され、
元の酵素を用いる場合よりも極めて有利な条件で
反応を行なうことができる。 本発明の方法により、たとえばマルトオリゴ糖
を製造する場合、マルトオリゴ糖の目的とする純
度に応じて様々な製造方式をとり得る。たとえば
純度20〜60％程度のマルトオリゴ糖は、40％
（ｗ／ｗ）の澱粉液化液を前述の固定化マルトオ
リゴ糖アミラーゼを充填した反応器に前述の条件
で供給することによつて得られる。また、さらに
高純度（60〜100％）のマルトオリゴ糖は、上記
反応器から得られた生成物をさらに精製分離する
ことにより得られる。この場合の精製分離手段は
特に制限はなく種々の方法をとりうるが、たとえ
ば限外過、ゲル過、カチオン交換樹脂カラム
クロマトグラフイー、カーボンカラムクロマトグ
ラフイー等の手段が有効である。また、上記精製
分離を行なつた際に得られる未分解物の一部また
は全部を固定化マルトオリゴ糖生成酵素を充填し
た反応器へ再循環させて供給原料の一部とするこ
とによつて原料澱粉液化液あたりのマルトオリゴ
糖収量を増大させることができる。さらに、該未
分解物の一部または全部をそのままリミツトデキ
ストリンとして利用することもできる。 次に固定化アミラーゼと共に固定化枝切り酵素
を併用する第２の発明について説明する。 固定化アミラーゼと併用する固定化枝切り酵素
の比率については、後者の量が増すほど澱粉糖の
濃度（収率）を高めることができるが、通常発現
活性ベースで前者１に対して後者0.1〜５、好ま
しくは0.2〜２の範囲とする。固定化枝切り酵素
の比率を上限以上としても、相応する効果が奏さ
れない上に、反応器の大きさが比例的に大きくな
るので経済的に好ましくない。ここで、枝切り酵
素を併用した場合の単位活性あたりの重量基準空
塔速度は、前述の式において発現活性（Ａ
IU／ｇ）としては枝切り酵素の発現活性は考慮
せずに使用するアミラーゼの発現活性だけを考慮
して求めればよい。 両酵素を併用する複合酵素系の場合、反応器の
形態と充填方法は種々の態様が考えられる。たと
えば、２種の固定化酵素を別々の容器に充填する
方法、２種の固定化酵素を混合してから同じ容器
に充填する方法、さらには２種のネイテイブ酵素
を一定の比率で混合した後、同時に固定化し、容
器に充填する方法等がある。 ［発明の効果］ 本発明の方法によれば、グルコース、マルトー
ス、マルトトリオース以上の重合度を有するマル
トオリゴ糖を製造するにあたり、固定化酵素単位
活性あたりの重量基準空塔速度を従来よりも大き
くでき、しかも酵素活性は長時間にわたり安定に
保持される。そのため、目的とする澱粉糖を効率
よく、かつ高収率にて製造することができる。と
りわけ、アミラーゼと共に枝切り酵素を用いて固
定化複合酵素系とした場合、目的物質の収率は格
段と向上する。 また、原料澱粉としてコーンスターチを使用し
た場合でもネイテイブ酵素と同程度に高濃度の澱
粉糖（特にグルコース）を得ることができる。 ［実施例］ 次に、本発明を実施例により詳しく説明する。 実施例 １ 担体として多孔質キトサン（商品名：キトパー
ルBCW3505、富士紡績(株)製）を用い、リゾプ
ス・デレマー起源のグルコアミラーゼ（新日本化
学(株)製）固定化した。すなわち、担体のキトサン
を20ｍＭ酢酸緩衝液（PH5.5）で十分に平衡化し
た後、100ml容の三角フラスコに湿重量で10ｇの
担体を秤量し、これにグルコアミラーゼを担体１
ｇあたり1050単位（液量10ml）添加した。次い
で、室温で１時間往復振とう（120ストローク／
分）して固定化した。さらに20ｍＭ酢酸緩衝液
（PH5.0）で蛋白質が溶出しなくなるまで十分に洗
浄し、固定化グルコアミラーゼ標品を得た。この
標品について前述した方法により発現活性を測定
したところ435IU／ｇ−担体であつた。 この固定化グルコアミラーゼ10mlをガラスカラ
ム（直径10mm、長さ20mm）に充填し、基質として
30％（ｗ／ｗ）のコーンスターチ液化液（DE＝
11、PH5.5）を用いて温度50℃、空塔速度0.25、
0.5および1.0hr^-1（単位活性あたりの重量基準空塔
速度はそれぞれ2.48×10^-4、4.95×10^-4および
9.89×10^-4hr^-1（IU／ｇ）^-1）の各条件で連続的に
通液した。なお、空塔速度は下記の式により計算
した。結果を第１表に示す。 空塔速度（hr^-1）＝通液量（ml／hr）／床容積（ml） 比較例 １ 担体として多孔製弱塩基性アニオン交換樹脂デ
ユオライトＡ−７（ダイヤモンドシヤムロツク社
製）を使用し、特開昭58−60989号の実施例１に
記載の方法で固定化したこと以外は実施例１と同
様に行なつた。なお、固定化酵素の発現活性は
157IU／ｇ−担体であつた。この固定化酵素を用
いて実施例１と同様に実験を行なつた（単位活性
あたりの重量基準空塔速度はそれぞれ6.85×
10^-4、1.37×10^-3および2.74×10^-3hr^-1（IU／ｇ）
^-1）。結果を第１表に示す。 第１表 反応液中のグルコース濃度（％）空塔速度(hr^-1) 実施例１ 比較例１ 0.25 95.2 94.2 0.5 96.7 93.8 1.0 95.2 87.4 実施例 ２ 担体として多孔質キトサン（商品名：キトパー
ルBCW3505、富士紡績(株)製）を用い、β−アミ
ラーゼ（大豆起源、長瀬産業(株)製）を常法により
固定化した。得られた固定化β−アミラーゼの発
現活性は230IU／ｇ−担体であつた。 この固定化β−アミラーゼをガラスカラム（直
径27mm、長さ130mm）に充填し、基質として25％
（ｗ／ｗ）の澱粉液化液（DE＝７、PH6.0）を用
いで温度50℃、空塔速度0.2、0.5、1.0および
1.5hr^-1（単位活性あたりの重量基準空塔速度はそ
れぞれ3.09×10^-4、7.73×10^-4、1.55×10^-3および
2.32×10^-3hr^-1（IU／ｇ）^-1）の各条件で連続的に
通液した。結果を第２表に示す。また、空塔速度
1.5hr^-1で連続通液したときの反応液中のマルト
ース含量の経時変化を第１図に示す。 比較例 ２ 担体としてデユオライト系吸着樹脂Ｓ−761（ダ
イヤモンドシヤムロツク社製）を使用し、実施例
２と同様にしてβ−アミラーゼの固定化を行なつ
た。固定化β−アミラーゼの発現活性は198IU／
ｇ−担体であつた。 この固定化酵素10mlを実施例２と同様にガラス
カラムに充填し、基質として25％（ｗ／ｗ）の澱
粉液化液（DE＝７、PH6.0）を用いて温度50℃、
空塔速度0.2、0.5、1.0および1.5hr^-1（単位活性あ
たりの重量基準空塔速度はそれぞれ3.59×10^-4、
8.98×10^-4、1.80×10^-3および2.70×10^-3hr^-1
（IU／ｇ）^-1）の各条件で連続通液した。結果を
第２表に示す。 第２表 反応液中のマルトテート濃度（％）空塔速度(hr^-1) 実施例２ 比較例２ 0.2 52.5 52.4 0.5 52.5 44.8 1.0 52.3 37.5 1.5 52.1 30.3 第２表および第１図から明らかなように、本発
明によれば従来の固定化酵素を用いた場合よりも
速い空塔速度で高いマルトース生成量が得られ、
しかも30日後でも活性の低下はほとんど認められ
ず、半減期は１年以上であつた。 実施例 ３ 酵素としてマルトテトラオース生成アミラーゼ
（シユードモナス・ストツツエリ起源、比活性
80.8IU／mg・タンパク）、を用い固定化用担体と
してキトサンビーズ（商品名：キトパール
BCW3505、富士紡績社製）を使用して固定化酵
素を得た。すなわち、担体20ｇを50ｍＭ Tris
−HClバツフアー（PH7.0）で充分に平衡化した
後、100mlの同一バツフアーに溶解した20000IU
の酵素を添加し、室温で１時間往復振とう（300
ml容三角フラスコ中120ストローク／分、４cm幅）
しながら酵素を担体に固定化した。次いで、紙
で過した後、10ｍＭ Tris−HClバツフアー
（PH7.0）で蛋白質が溶出しなくなるまで十分に洗
浄し、発現活性が350IU／ｇ−担体の固定化マル
トテトラオース生成酵素を得た。 次に直径27mm、長さ130mmのガラスカラムにマ
ルトテトラオース生成固定化酵素10mlを充填し
た。基質として26.2％（ｗ／ｗ）の澱粉液化液
（DE＝７、PH7.2）を用い、温度45℃、空塔速度
2.0、5.0および10.0hr^-1（単位活性あたりの重量基
準空塔速度はそれぞれ2.42×10^-3、6.05×10^-3お
よび1.21×10^-2hr^-1（IU／ｇ）^-1）の各条件で連続
通液した。その結果を第３表に示す。また空塔速
度2.0hr^-1の条件で連続通液したときの反応液中
のマルトテトラオース含量の経時的変化を第２図
に示す。 比較例 ３ 担体としてデユオライト系吸着樹脂Ｓ−761を
用いて実施例３と同様な方法で得た固定化マルト
テトラオース生成アミラーゼ10ｇ（発現活性
215IU／ｇ）を反応器に充填し、これに原料とし
て26.2％（ｗ／ｗ）の澱粉液化液（DE＝７、PH
7.2）を24ml／hr、温度45℃、空塔速度2.0、5.0お
よび10hr^-1（単位活性あたりの重量基準空塔速度
はそれぞれ3.48×10^-3、8.71×10^-3および1.74×
10^-2hr^-1（IU／ｇ）^-1）の条件で連続通液した。そ
の結果を第３表に示す。また、空塔速度2.0hr^-1
で連続通液したときの反応液中のマルトテトラオ
ース含量の経時変化を第２図に示す。 第３表 反応液中のマルトテトラオース濃度空塔速度(hr^-1) 実施例３ 比較例３ 2.0 44.5 42.6 5.0 44.1 37.2 10.0 41.7 31.5 以上のように、本発明によれば、従来の固定化
酵素を用いた場合よりも高純度のマルトテトラオ
ースが得られる。 比較例 ４ 実施例３と同様な方法で得た固定化マルトテト
ラオース生成アミラーゼ（ただし、発現活性
273IU／ｇ）6.6ｇを反応器に充填し、これに10％
（ｗ／ｗ）の澱粉液化液（DE＝8.0、PH＝6.8）を
用いて温度40℃、流速1.1ml／hrの条件（単位活
性あたりの重量基準空塔速度は（6.83×10^-5hr^-1
（IU／ｇ）^-1）で連続通液して反応生成物を得た。
この生成物の組成を第４表に示す。 比較例 ５ 実施例３と同様な方法で得た固定化マルトテト
ラオース生成アミラーゼ（ただし発現活性
46.7IU／ｇ）6.6ｇを反応器に充填し、これに30
％（ｗ／ｗ）の澱粉液化液（DE＝8.0、PH＝6.8）
を用いて温度40℃、流速210ml／hrの条件（単位
活性あたりの重量基準空塔速度は2.29×10^-1hr^-1
（IU／ｇ）^-1）で連続通液して反応生成物を得た。
この生成物の組成を第４表に示す。 【表】 以上のように、単位活性あたりの重量基準空塔
速度が１×10^-4hr^-1（IU／ｇ）^-1よりも小さい場合
および２×10^-1hr^-1（IU／ｇ）^-1よりも大きい場合
は、いずれもマルトテトラオースの収率が小さく
なつていることが判る。 実施例 ４ 枝切り酵素であるプルラナーゼ（クルベシエ
ラ・ニユーモニア起源、比活性50IU／mg−蛋白
質、天野製薬株式会社製）を用いてPH6.0のリン
酢バツフアを使用したこと以外は実施例１と同様
の方法でキトパールBCW3505に固定化した。得
られた固定化プルラナーゼの発現活性は129IU／
ｇ−担体であつた。 次に、直径10mm、長さ200mlのガラスカラム２
本を用いて固定化グルコアミラーゼ４mlと上述の
方法で得られた固定化プルラナーゼ9.0ml（発現
活性比は約３：１）を混合して充填した。一方、
基質として30％（ｗ／ｗ）のコーンスターチ液化
液（DE＝11、PH5.5）を用い、温度50℃、空塔速
度0.25、0.5および1.0hr^-1（単位活性あたりの重量
基準空塔速度はそれぞれ2.48×10^-4、4.95×10^-3
および9.89×10^-4hr^-1（IU／ｇ）^-1）の条件で連続
通液した。得られた結果を第５表に示す。 第５表 反応生成物中のグルコース濃度空塔速度(hr^-1) 実施例５ 実施例５ 0.25 95.8 95.2 0.5 97.3 96.7 1.0 96.1 95.2 表に示すごとく、単独固定化酵素系よりも複合
固定化酵素系の方が反応生成物中のグルコース濃
度が約１％上昇した。 実施例 ５ 実施例２と同様にして得た固定化β−アミラー
ゼ10mlと実施例４と同様にして得た固定化プルラ
ナーゼ10mlを混合（発現活性比はβ−アミラー
ゼ：プルラナーゼ＝2.1：1.0）してそれぞれ充填
した。基質として25.0％（ｗ／ｗ）の澱粉液化液
（DE＝７、PH6.0）を用いて温度50℃、流速15
ml／hr（単位活性あたりの重量基準空塔速度は
2.32×10^-3hr^-1（IU／ｇ）^-1）の条件で連続通液し
た。運転日数０、15、30日後のカラム流出液の糖
組成を第６表に示す。表に示すごとく、複合固定
化酵素系の方がβ−アミラーゼのみの単一酵素系
よりもマルトース純度が約10〜12％上昇し、また
30日経過後でも活性の低下はほとんどみられなか
つた。 第６表 マルトース生成量の経時変化経時日数 単独酵素系 複合酵素系 0 53.0％ 64.2％ 15 51.8％ 64.2％ 30 50.1％ 64.0％ 実施例 ６ 実施例３と同様にして得た固定化マルトテトラ
オース生成酵素10mlと実施例３と同様にして得た
固定化プルラナーゼ５mlを混合（発現活性比、β
−アミラーゼ：プルラナーゼ＝4.1）してそれぞ
れ充填した。基質として26.2％（ｗ／ｗ）の澱粉
液化液（DE＝７、PH7.2）を用いて温度40℃、流
速24／hr（単位活性あたりの重量基準空塔速度
は4.06×10^-3hr^-1（IU／ｇ）^-1）の条件で連続通液
した。運転日数０、15、30日後のカラム流出液の
糖組成を第７表に示す。表に示すごとく、複合固
定化酵素系の方が固定化マルトテトラオース生成
酵素のみの単一酵素系よりもマルトテトラオース
純度が約５％上昇し、また30日経過後でも活性の
低下はほとんどみられなかつた。 第７表 マルトテトラオース生成量の経時変化経時日数 単独酵素系 複合酵素系 0 45.2％ 50.5％ 15 44.0％ 48.3％ 30 42.9％ 46.2％ 参考例 酵素としてマルトテトラオース生成アミラーゼ
（シユードモナス・ストツツエリ起源のもの、比
活性80.1IU／mg・タンパク質）を用い、３種の担
体を使用して固定化酵素を得た。ここで、３種の
担体とは、第１が本願発明に係る担体で、天然高
分子キチンを脱アセチル化し、乾燥、微粉砕した
ものをグルタルアルデヒドの水溶液中に加えて架
橋し、さらにスペーサーとして芳香族系の官能基
を有する４，4′−ジフエニルメタンジイソシアネ
ートを２容量加え、30℃で15時間処理した後、ア
セトンで洗浄したものである（以下、担体−１と
いう。）。第２は上記と同様にして架橋した後、ス
ペーサーとして脂肪属系の官能基を有するヘキサ
メチレンジイソシアネートを同様にして導入させ
たものである（以下、担体−２という。）。さらに
第３は上記と同様にして架橋した後、スペーサー
の導入を行なわなかつたものである（以下、担体
−３という。）。 担体0.2ｇに対して200IUの酵素をPH7.0の50ｍ
Ｍリン酸緩衝液で2.0mlとしたものを50ml三角フ
ラスコに入れて室温で１時間、120ストローク、
４cm幅で振とうしながら酵素を担体に固定化し
た。 次いで、これをろ過してろ液を除き、さらに10
ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）を用いてタンパク質
が流出しなくなるまで十分に洗浄して固定化酵素
を得た。この固定化酵素について、以下の方法で
みかけの固定化率を測定し、かつ固定化酵素の発
現活性を測定した。 みかけの固定化率は、まず上清を300倍に希釈
したもの0.1mlに対して0.5％還元可溶性澱粉溶液
0.5mlと50ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）0.4mlを添加
し、40℃で10分間反応させて生成した還元糖を
Somogyi−Nelson法で測定し、上清中の酵素活
性を求め、以下の式により求めた。 添加した酵素活性−上清中の酵素活性／添加した酵素活
性×100 結果を第８表に示す。表から明らかなように、
本願発明に係る担体−１および担体−２を使用し
た固定化酵素は、固定化率が高く、活性も格段に
優れている。 一方、単に架橋のみを行つた担体−３は不十分
な結果であり、マルトオリゴ糖生成アミラーゼに
対し、単にキトサンが良好な担体であるという予
想が成立しないことを実証している。 【表】

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例２における反応液中のマルトー
ス含量の経時変化を示し、第２図は実施例３およ
び比較例３における反応液中のマルトテトラオー
ス含量の経時変化を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 天然高分子キチンを脱アセチル化した後、ジ
   カルボン酸、ジアルデヒド、ジイソシアネート等
   で架橋して耐酸性を付与したものに、さらにスペ
   ーサーとして脂肪族または芳香族系などの官能基
   を導入した多孔質キトサンに固定化したアミラー
   ゼを澱粉液化液に作用させることを特徴とする澱
   粉糖の製造法。 ２ アミラーゼがグルコアミラーゼ、β−アミラ
   ーゼおよびマルトオリゴ糖生成アミラーゼのいず
   れかである特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 澱粉がコーンスターチである特許請求の範囲
   第１項または第２項記載の方法。 ４ 天然高分子キチンを脱アセチル化した後、ジ
   カルボン酸、ジアルデヒド、ジイソシアネート等
   で架橋して耐酸性を付与したものに、さらにスペ
   ーサーとして脂肪族または芳香族系などの官能基
   を導入した多孔質キトサンに固定化したアミラー
   ゼを固定化枝切り酵素と共に澱粉液化液に作用さ
   せることを特徴とする澱粉糖の製造法。 ５ アミラーゼがグルコアミラーゼ、β−アミラ
   ーゼおよびマルトオリゴ糖生成アミラーゼのいず
   れかである特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６ 澱粉がコーンスターチである特許請求の範囲
   第４項または第５項記載の方法。 ７ 枝切り酵素がバチルス・アシドプルリテイカ
   スまたはクレブシエラ・ニユーモニア起源のプル
   ラナーゼもしくはシユードモナス・アミロデラモ
   サまたはシトフアーガ属微生物起源のイソアミラ
   ーゼである特許請求の範囲第４〜６項のいずれか
   に記載の方法。