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JPH0358781A - クロストリジウム属細菌変異株の取得方法,該変異株及び該変異株を用いてl―バリン又は酪酸を製造する方法 - Google Patents

クロストリジウム属細菌変異株の取得方法,該変異株及び該変異株を用いてl―バリン又は酪酸を製造する方法

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Publication number
JPH0358781A
JPH0358781A JP19043089A JP19043089A JPH0358781A JP H0358781 A JPH0358781 A JP H0358781A JP 19043089 A JP19043089 A JP 19043089A JP 19043089 A JP19043089 A JP 19043089A JP H0358781 A JPH0358781 A JP H0358781A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
valine
clostridium
butyric acid
acid
mutant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP19043089A
Other languages
English (en)
Inventor
Kyo Nagashima
協 長嶋
Katsuhisa Shirai
勝久 白井
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Idemitsu Kosan Co Ltd
Original Assignee
Idemitsu Kosan Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Idemitsu Kosan Co Ltd filed Critical Idemitsu Kosan Co Ltd
Priority to JP19043089A priority Critical patent/JPH0358781A/ja
Publication of JPH0358781A publication Critical patent/JPH0358781A/ja
Pending legal-status Critical Current

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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、クロストリジウム属細菌変異株の取得方法,
該変異株および該変異株を用いてL−バリンまたは酪酸
を製造する方法に関する。本発明の方法で得られる新菌
株は、L−バリンまたは酪酸を安価かつ著量に生産する
能力を有する突然変異株であり、本発明により生産され
るL−バリンは、ア旦ノ酸輸液や総合アミノ酸製剤等の
戒分として医薬品工業,食品工業等において利用され、
また酪酸は食品等の着香料や香料威分の原料として食品
工業,香料工業等において利用される。
〔従来の技術および発明が解決しようとする課題〕現在
までに好気性菌によるL−バリンの発酵生産法としては
、特開昭63−267286号公報,同63−2585
88号公報,同59−143595号公報,同56−5
1989号公報,同5639792号公報,同51−1
30986号公報,同50−155684号公報等に記
載の方法やαアミノ酪酸耐性変ゲZ株を用いてL−バリ
ンを生産ずる方7去(J. Bactcriol., 
106(2), 493. 1971)が知られている
。一方、嫌気性菌によるI、一ハリンの発酵生産法とし
ては、クI」ストリジウム属バストリアヌ1、による方
法(Anu. Microbiol., 1298+.
75. 1987)が知られているが、生産量が10〜
20mg/pと低いものであった。また、ビフィドハク
テリウム属細菌による力法(Eur. .1. App
l . Microbiol4, 177. 1977
)が報告されているものの、胞子形或能のないビフィト
ハクテリウJ、は死滅しやずく、発酵プロセスには適さ
ないものであった。嫌気性菌による発酵法は、通気,撹
拌のコス1・が不要である点で有利であるので、嫌気性
菌によるL−バリンの発酵生産法が望まれている。
また、酪酸は食品等の着香料や香料合成の原料として有
用なものであり、クロストリジウム・′り゛ーモサンカ
ロリティクJ8による発酵生産法(特開昭61−212
282号公報2同62−267号公報)が知られている
ように、従来からクロス1・リシウム属細菌による発酵
法で工業的に生産されている。しかし、この方法ではそ
の際に酢酸やソL酸が副生し、酪酸の収率が不十分てあ
るとい・う問題があった。
〔課題を解決するための手段〕
そこで、本発明者らはL−バリンまたは酪酸をコス1・
等の面で有利な嫌気性菌を用いて発酵法により著量に生
産することを目的として、これに適づーる嫌気性菌の検
索を行なったとごろ、既知の菌株クロスI・リシウム属
細菌を変異させて得られる変異株が適ずることを見出し
、本発明を完威した。
すなわち、本発明はクロスI−リジウ/、属細菌を突然
変異処理後、α−アごノ酪酸耐性によりクロストリジウ
ム属細菌の変異株を得ることを1)徴とするクロストリ
ジウム属細菌変異株の取得方法、α−アξノ酪酸耐性を
有し、L−バリンまたは酪酸生産能を有する該変異株お
よび該変異株を培養してL−バリンまたは酪酸を蓄積せ
しめ、これを採取することを特徴とずるI,−バリンま
たは酪酸の製造方法を提供するものである。
本発明のクロスI・リジウム属細菌変異株は、クロスI
・リジウム属細菌を親株として、変異処理をし、α−ア
ミノ酪酸而1性により分離することにより得られる。
ここで、クロスI・リジウム属細菌どしては、クロスl
・リジウム・バストリアヌム(Clostridium
J!可リや扛I測坪)DSM 525株が挙げられる。
また、親株の変異処理は既知の方法によって行なえばよ
く、たとえば、紫外線I!{射,X線照射,γ線などの
放射線照射,突然変異誘起剤による処理などの方法を適
用することができる。ここで突然変異講起剤としては、
エチルメタンスルホ不−1−N−メチル−N′−二1・
口−N−二I・ロソグアニジン シメチルサルフェート
 2−アミノプリン アクリフラビン.アクリジンオレ
ンジ ヒドラジン,4二1・ロキノリン−N−オキン1
・.塩化マンガンなどがある。
次に、α−ア呉ノ酪酸耐性とはα−アミノ酪酸を含む培
地で生育できる性質をいう。変異株の分離方法について
さらに具体的に説明する。
?ず、クロス1・リジウム・バス1リアヌ1、DSM5
25株を第1表に示すCN3培地で37゜Cにて窒素雰
囲気下で嫌気的に12時間培養する。培養収量後、遠心
分離を行なって集菌し、50mMI■リスマレー1・(
Tris−Malate)緩衝液(pll 5. 5 
)にて2回洗菌する。次いで、N−メチル−N’−二1
・ロ−N−二l・ロソグアニジンQ 2mg/m立を添
加した同緩衝液にこの菌体を懸濁した後、37゛cで1
5分間振とう処理することによって変異処理を行なう。
変異処理終了後、集菌してI・リスーマレート緩衝液に
て3回洗菌する。
/ /′ 努U グルコース            10gポリペプト
ン           5g酵母エキス      
      2g(NI+4)2304       
     1. 3 gK211PO4       
        5 gMgCN2・61120   
          1 gMOPS“       
        5gCaCj2z         
    1 5 0mgFeSOa         
     1. 3 mgレヅスリンナトリウム (酸
化i元色素)          2mgL−CySH
−11c p.(還元剤)       0.5g合計
1.0乏(pH 7. 0 ) *モルホリノプ口バンスルホン酸 次に、変異処理して得られる上記菌体を第l表に示した
CM3培地中のポリベプトンと酵母エキスを除き、代わ
りにL−ロイシン2g/L  L−イソロイシン2 g
/L寒天15g/j2を添加した培地出、α−アミノ酪
酸O〜10g/ffiの濃度勾配寒天平板に塗布し、3
7゜Cで3日間培養後、寒天培地上のα−ア旦ノ酪酸耐
性株のコロニーを分離する。このようにして、本発明の
α−アξノ酪酸耐性を有し、L−バリン生産能を有する
クロストリジウム属細菌突然変異株が得られる。本発明
者らは、この変異株をクロストリジウム・パス1一リア
ヌム(Clostricium  肚1剋亘躾竺)AB
 605株と命名した。木菌は、工業術院微生物工業技
術研究所にFERM P−10819として寄託されて
いる。
一方、変異処理して得られる上記菌体を第1表に示した
CM3培地に寒天15g/fを添加した培地で、α−ア
旦ノ酪酸O〜10g/I!.の濃度勾配寒天平板に塗布
し、37゜Cで3日間培養後、寒天培地上のα−アミノ
酪酸耐性株のコロニーを分離する。このようにして、本
発明のα−アごノ酪酸耐性を有し、酪酸生産能を有する
クロストリジウム属細菌突然変異株が得られる。本発明
者らは、この変異株をクロストリジウム・バストリアヌ
ム(Clostricium  aSteurianu
m)AB 202株と命名した。本菌は、工業術院微生
物工業技術研究所にFERMP−10818として寄託
されている。
クロス1−リジウム・パス1・リアヌムAB 605株
(FERM P−10819)およびクロストリジウム
・バストリアヌムAB 202株(FERM P−10
818)の菌学的性質を以下に示す。
(1)0.8X3〜10μmの桿菌 (2)周鞭毛で運動性あり (3)内生胞子あり (4)ダラム染色陽性 (5)生育温度30〜40゜C (6)Wの利用性 アミクダリン    ー    マルトース     
+    サリシンアラビノース    士    マ
ンニトー}ト    +    ソルピトール  +セ
Uピ才−ス    ー    マンノース     +
    スターチ    ±7ラクトース    + 
   メレシトース    +    シュクロース 
 +ガラクトース    士    メリビ才一ス  
  +    トレハl−ス  +クリコーゲン   
 ー    ラフィノース    +    キシロー
ス   士イヌリン      ー    ラムl−ス
ラクトース      −     リネース上記のよ
うにクロストリジウム・バストリアヌムAB 605株
(FERM P−10819)の菌学的性質は、αアミ
ノ酪酸耐性とL−バリン生産能を有すること以外は新株
のクロストリジウム・バストリアヌムDSM 525株
と同一の菌学的性質を示す。同様に、クロストリジウム
・バストリアヌムAB 202株(FERMp−t08
18)の菌学的性質も、α−アミノ酪酸耐性と酪酸生産
能を有すること以外は、新株のクロストリジウム・バス
トリアヌムDSM 525株の菌学的性質と同一の菌学
的性質を示す。
本発明では、α−アミノ酪酸耐性を有し、L−バリン生
産能を有するクロストリジウム属細菌突然変異株、例え
ばクロストリジウム・バストリアヌム八B605株(F
ERM P−10819)を培養してL−バリンを蓄積
せしめ、これを採取することによってL−バリンを製造
し、またα−アミノ酪酸耐性を有し、酪酸生産能を有す
るクロストリジウム属細菌突然変異株、例えばクロスト
リジウム・バストリアヌム八B202株(FERM P
−10818)を培養して酪酸を蓄積せしめ、これを採
取することによって酪10 酸を製造する。
培養に用いる培地は、炭素源,窒素源,無機イオン,存
機栄養aなどを含有する通常の培地でよく、炭素源とし
てはグルコース,シュクロース,フラクl〜−ス,マル
トース,マンノース メリビオース,ソルビI・−ル.
マンニ1・−ル メレジ1・一ス.ラフィノース,トレ
ハロース,デンプン等の糊類が使用される。
培養は、温度20〜40’C,pll5〜8、好ましく
646〜7に調節し、嫌気的条件rで静置または弱く攪
拌して行なう。また、木菌の植菌量は0.1〜10%、
好ましくは1〜5%である。培養期間は、丁7−バリン
または酪酸が十分景生産されるまで行なえばよく、通常
は1〜10目間、好ましくは2〜5目間である。培養液
中に生或したL−バリンの確認定量は、薄層クロマトグ
ラフィーおよびアξノ酸分析機を用いて行なう。また、
培養液中に生威した酪酢等の有機酸およびアルコール類
は、培養液をリン酸で酸性乙こした後、ガスク1コマト
グラフィーにより確認定量する。
「実施例〕 次に、本発明を実施例により説明する。
実施例工 前記第1表に示したCM3培地にクロス1・リジウム−
 パスr ’) −? ヌムAB 605株(FERM
 P−10819)を接種し、37゛Cで18時間嫌気
的に液体培養を行なった。この培養液を、C)13培地
5mQに2%の割合で植菌し、IOmR不ジロ試験管中
で37゜Cにて2日間婢気的に静置培養した。
得られた培養液から菌体を遠心分離し゛(除去した後、
薄層クロマ1・グラフィーおよびアミノ酸分析機により
L.−バリンの生或量を測定したところ、480mg/
ffであった。
実施例2 実施例1において、クロス1・リジウム・バス1・’J
 7ヌムAB 605株(FERM P−10819)
 ノ代わりにクロストリジウム・バス1・リアヌムAB
 202株(FliRMP−108].8)を用いたこ
と以外は実施例1と同様の操作を行なったところ、第2
表に示す量の生成物が得られた。得られた酪酸は対糖収
率25%であった。
比較例 実施例1において、クロストリジウム・バストリアヌム
AB 605株(FERM P−10819)の代わり
にク1コスI・リジウ1、・バストリアヌムDSM 5
25株を用いたこと以外は実施例1と同様の操作を行な
った。
L−−バリンの生或量は20mg/j2であり、その他
第2表に示す量の生威物が得られた。得られた酪酸は対
糖収率7%であった。
菫L表 生       2 テクノー)ト   酢酸  フクノール   酪酸  
乳酸実施例2  0.1.   0.3  0.1  
 2.5  0.00.2      ]..2   
 0.6      0.7    0.2〔発明の効
果〕 本発明の取得方法により得られるク口ストリジウム属細
菌突然変異株は、α−ア廼ノ酪酸耐性を有し、1,−バ
リンまたは酪酸を安価、かつ著量6こ生産する能力を有
する。本発明により得られるLハ゛リン 酪酸は医薬品工業 香ネ」王業 食品工 業等の分野で有用なものである。

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)クロストリジウム属細菌を突然変異処理後、α−
    アミノ酪酸耐性によりクロストリジウム属細菌の変異株
    を得ることを特徴とするクロストリジウム属細菌変異株
    の取得方法。
  2. (2)α−アミノ酪酸耐性を有し、L−バリン生産能を
    有するクロストリジウム属細菌突然変異株。
  3. (3)α−アミノ酪酸耐性を有し、酪酸生産能を有する
    クロストリジウム属細菌突然変異株。
  4. (4)請求項2記載のクロストリジウム属細菌突然変異
    株を培養してL−バリンを蓄積せしめ、これを採取する
    ことを特徴とするL−バリンの製造方法。
  5. (5)請求項3記載のクロストリジウム属細菌突然変異
    株を培養して酪酸を蓄積せしめ、これを採取することを
    特徴とする酪酸の製造方法。
JP19043089A 1989-07-25 1989-07-25 クロストリジウム属細菌変異株の取得方法,該変異株及び該変異株を用いてl―バリン又は酪酸を製造する方法 Pending JPH0358781A (ja)

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