JPH0358781A - クロストリジウム属細菌変異株の取得方法,該変異株及び該変異株を用いてl―バリン又は酪酸を製造する方法 - Google Patents
クロストリジウム属細菌変異株の取得方法,該変異株及び該変異株を用いてl―バリン又は酪酸を製造する方法Info
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- JPH0358781A JPH0358781A JP19043089A JP19043089A JPH0358781A JP H0358781 A JPH0358781 A JP H0358781A JP 19043089 A JP19043089 A JP 19043089A JP 19043089 A JP19043089 A JP 19043089A JP H0358781 A JPH0358781 A JP H0358781A
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- Japan
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- valine
- clostridium
- butyric acid
- acid
- mutant
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、クロストリジウム属細菌変異株の取得方法,
該変異株および該変異株を用いてL−バリンまたは酪酸
を製造する方法に関する。本発明の方法で得られる新菌
株は、L−バリンまたは酪酸を安価かつ著量に生産する
能力を有する突然変異株であり、本発明により生産され
るL−バリンは、ア旦ノ酸輸液や総合アミノ酸製剤等の
戒分として医薬品工業,食品工業等において利用され、
また酪酸は食品等の着香料や香料威分の原料として食品
工業,香料工業等において利用される。
該変異株および該変異株を用いてL−バリンまたは酪酸
を製造する方法に関する。本発明の方法で得られる新菌
株は、L−バリンまたは酪酸を安価かつ著量に生産する
能力を有する突然変異株であり、本発明により生産され
るL−バリンは、ア旦ノ酸輸液や総合アミノ酸製剤等の
戒分として医薬品工業,食品工業等において利用され、
また酪酸は食品等の着香料や香料威分の原料として食品
工業,香料工業等において利用される。
〔従来の技術および発明が解決しようとする課題〕現在
までに好気性菌によるL−バリンの発酵生産法としては
、特開昭63−267286号公報,同63−2585
88号公報,同59−143595号公報,同56−5
1989号公報,同5639792号公報,同51−1
30986号公報,同50−155684号公報等に記
載の方法やαアミノ酪酸耐性変ゲZ株を用いてL−バリ
ンを生産ずる方7去(J. Bactcriol.,
106(2), 493. 1971)が知られている
。一方、嫌気性菌によるI、一ハリンの発酵生産法とし
ては、クI」ストリジウム属バストリアヌ1、による方
法(Anu. Microbiol., 1298+.
75. 1987)が知られているが、生産量が10〜
20mg/pと低いものであった。また、ビフィドハク
テリウム属細菌による力法(Eur. .1. App
l . Microbiol4, 177. 1977
)が報告されているものの、胞子形或能のないビフィト
ハクテリウJ、は死滅しやずく、発酵プロセスには適さ
ないものであった。嫌気性菌による発酵法は、通気,撹
拌のコス1・が不要である点で有利であるので、嫌気性
菌によるL−バリンの発酵生産法が望まれている。
までに好気性菌によるL−バリンの発酵生産法としては
、特開昭63−267286号公報,同63−2585
88号公報,同59−143595号公報,同56−5
1989号公報,同5639792号公報,同51−1
30986号公報,同50−155684号公報等に記
載の方法やαアミノ酪酸耐性変ゲZ株を用いてL−バリ
ンを生産ずる方7去(J. Bactcriol.,
106(2), 493. 1971)が知られている
。一方、嫌気性菌によるI、一ハリンの発酵生産法とし
ては、クI」ストリジウム属バストリアヌ1、による方
法(Anu. Microbiol., 1298+.
75. 1987)が知られているが、生産量が10〜
20mg/pと低いものであった。また、ビフィドハク
テリウム属細菌による力法(Eur. .1. App
l . Microbiol4, 177. 1977
)が報告されているものの、胞子形或能のないビフィト
ハクテリウJ、は死滅しやずく、発酵プロセスには適さ
ないものであった。嫌気性菌による発酵法は、通気,撹
拌のコス1・が不要である点で有利であるので、嫌気性
菌によるL−バリンの発酵生産法が望まれている。
また、酪酸は食品等の着香料や香料合成の原料として有
用なものであり、クロストリジウム・′り゛ーモサンカ
ロリティクJ8による発酵生産法(特開昭61−212
282号公報2同62−267号公報)が知られている
ように、従来からクロス1・リシウム属細菌による発酵
法で工業的に生産されている。しかし、この方法ではそ
の際に酢酸やソL酸が副生し、酪酸の収率が不十分てあ
るとい・う問題があった。
用なものであり、クロストリジウム・′り゛ーモサンカ
ロリティクJ8による発酵生産法(特開昭61−212
282号公報2同62−267号公報)が知られている
ように、従来からクロス1・リシウム属細菌による発酵
法で工業的に生産されている。しかし、この方法ではそ
の際に酢酸やソL酸が副生し、酪酸の収率が不十分てあ
るとい・う問題があった。
そこで、本発明者らはL−バリンまたは酪酸をコス1・
等の面で有利な嫌気性菌を用いて発酵法により著量に生
産することを目的として、これに適づーる嫌気性菌の検
索を行なったとごろ、既知の菌株クロスI・リシウム属
細菌を変異させて得られる変異株が適ずることを見出し
、本発明を完威した。
等の面で有利な嫌気性菌を用いて発酵法により著量に生
産することを目的として、これに適づーる嫌気性菌の検
索を行なったとごろ、既知の菌株クロスI・リシウム属
細菌を変異させて得られる変異株が適ずることを見出し
、本発明を完威した。
すなわち、本発明はクロスI−リジウ/、属細菌を突然
変異処理後、α−アごノ酪酸耐性によりクロストリジウ
ム属細菌の変異株を得ることを1)徴とするクロストリ
ジウム属細菌変異株の取得方法、α−アξノ酪酸耐性を
有し、L−バリンまたは酪酸生産能を有する該変異株お
よび該変異株を培養してL−バリンまたは酪酸を蓄積せ
しめ、これを採取することを特徴とずるI,−バリンま
たは酪酸の製造方法を提供するものである。
変異処理後、α−アごノ酪酸耐性によりクロストリジウ
ム属細菌の変異株を得ることを1)徴とするクロストリ
ジウム属細菌変異株の取得方法、α−アξノ酪酸耐性を
有し、L−バリンまたは酪酸生産能を有する該変異株お
よび該変異株を培養してL−バリンまたは酪酸を蓄積せ
しめ、これを採取することを特徴とずるI,−バリンま
たは酪酸の製造方法を提供するものである。
本発明のクロスI・リジウム属細菌変異株は、クロスI
・リジウム属細菌を親株として、変異処理をし、α−ア
ミノ酪酸而1性により分離することにより得られる。
・リジウム属細菌を親株として、変異処理をし、α−ア
ミノ酪酸而1性により分離することにより得られる。
ここで、クロスI・リジウム属細菌どしては、クロスl
・リジウム・バストリアヌム(Clostridium
J!可リや扛I測坪)DSM 525株が挙げられる。
・リジウム・バストリアヌム(Clostridium
J!可リや扛I測坪)DSM 525株が挙げられる。
また、親株の変異処理は既知の方法によって行なえばよ
く、たとえば、紫外線I!{射,X線照射,γ線などの
放射線照射,突然変異誘起剤による処理などの方法を適
用することができる。ここで突然変異講起剤としては、
エチルメタンスルホ不−1−N−メチル−N′−二1・
口−N−二I・ロソグアニジン シメチルサルフェート
2−アミノプリン アクリフラビン.アクリジンオレ
ンジ ヒドラジン,4二1・ロキノリン−N−オキン1
・.塩化マンガンなどがある。
く、たとえば、紫外線I!{射,X線照射,γ線などの
放射線照射,突然変異誘起剤による処理などの方法を適
用することができる。ここで突然変異講起剤としては、
エチルメタンスルホ不−1−N−メチル−N′−二1・
口−N−二I・ロソグアニジン シメチルサルフェート
2−アミノプリン アクリフラビン.アクリジンオレ
ンジ ヒドラジン,4二1・ロキノリン−N−オキン1
・.塩化マンガンなどがある。
次に、α−ア呉ノ酪酸耐性とはα−アミノ酪酸を含む培
地で生育できる性質をいう。変異株の分離方法について
さらに具体的に説明する。
地で生育できる性質をいう。変異株の分離方法について
さらに具体的に説明する。
?ず、クロス1・リジウム・バス1リアヌ1、DSM5
25株を第1表に示すCN3培地で37゜Cにて窒素雰
囲気下で嫌気的に12時間培養する。培養収量後、遠心
分離を行なって集菌し、50mMI■リスマレー1・(
Tris−Malate)緩衝液(pll 5. 5
)にて2回洗菌する。次いで、N−メチル−N’−二1
・ロ−N−二l・ロソグアニジンQ 2mg/m立を添
加した同緩衝液にこの菌体を懸濁した後、37゛cで1
5分間振とう処理することによって変異処理を行なう。
25株を第1表に示すCN3培地で37゜Cにて窒素雰
囲気下で嫌気的に12時間培養する。培養収量後、遠心
分離を行なって集菌し、50mMI■リスマレー1・(
Tris−Malate)緩衝液(pll 5. 5
)にて2回洗菌する。次いで、N−メチル−N’−二1
・ロ−N−二l・ロソグアニジンQ 2mg/m立を添
加した同緩衝液にこの菌体を懸濁した後、37゛cで1
5分間振とう処理することによって変異処理を行なう。
変異処理終了後、集菌してI・リスーマレート緩衝液に
て3回洗菌する。
て3回洗菌する。
/
/′
努U
グルコース 10gポリペプト
ン 5g酵母エキス
2g(NI+4)2304
1. 3 gK211PO4
5 gMgCN2・61120
1 gMOPS“
5gCaCj2z
1 5 0mgFeSOa
1. 3 mgレヅスリンナトリウム (酸
化i元色素) 2mgL−CySH
−11c p.(還元剤) 0.5g合計
1.0乏(pH 7. 0 ) *モルホリノプ口バンスルホン酸 次に、変異処理して得られる上記菌体を第l表に示した
CM3培地中のポリベプトンと酵母エキスを除き、代わ
りにL−ロイシン2g/L L−イソロイシン2 g
/L寒天15g/j2を添加した培地出、α−アミノ酪
酸O〜10g/ffiの濃度勾配寒天平板に塗布し、3
7゜Cで3日間培養後、寒天培地上のα−ア旦ノ酪酸耐
性株のコロニーを分離する。このようにして、本発明の
α−アξノ酪酸耐性を有し、L−バリン生産能を有する
クロストリジウム属細菌突然変異株が得られる。本発明
者らは、この変異株をクロストリジウム・パス1一リア
ヌム(Clostricium 肚1剋亘躾竺)AB
605株と命名した。木菌は、工業術院微生物工業技
術研究所にFERM P−10819として寄託されて
いる。
ン 5g酵母エキス
2g(NI+4)2304
1. 3 gK211PO4
5 gMgCN2・61120
1 gMOPS“
5gCaCj2z
1 5 0mgFeSOa
1. 3 mgレヅスリンナトリウム (酸
化i元色素) 2mgL−CySH
−11c p.(還元剤) 0.5g合計
1.0乏(pH 7. 0 ) *モルホリノプ口バンスルホン酸 次に、変異処理して得られる上記菌体を第l表に示した
CM3培地中のポリベプトンと酵母エキスを除き、代わ
りにL−ロイシン2g/L L−イソロイシン2 g
/L寒天15g/j2を添加した培地出、α−アミノ酪
酸O〜10g/ffiの濃度勾配寒天平板に塗布し、3
7゜Cで3日間培養後、寒天培地上のα−ア旦ノ酪酸耐
性株のコロニーを分離する。このようにして、本発明の
α−アξノ酪酸耐性を有し、L−バリン生産能を有する
クロストリジウム属細菌突然変異株が得られる。本発明
者らは、この変異株をクロストリジウム・パス1一リア
ヌム(Clostricium 肚1剋亘躾竺)AB
605株と命名した。木菌は、工業術院微生物工業技
術研究所にFERM P−10819として寄託されて
いる。
一方、変異処理して得られる上記菌体を第1表に示した
CM3培地に寒天15g/fを添加した培地で、α−ア
旦ノ酪酸O〜10g/I!.の濃度勾配寒天平板に塗布
し、37゜Cで3日間培養後、寒天培地上のα−アミノ
酪酸耐性株のコロニーを分離する。このようにして、本
発明のα−アごノ酪酸耐性を有し、酪酸生産能を有する
クロストリジウム属細菌突然変異株が得られる。本発明
者らは、この変異株をクロストリジウム・バストリアヌ
ム(Clostricium aSteurianu
m)AB 202株と命名した。本菌は、工業術院微生
物工業技術研究所にFERMP−10818として寄託
されている。
CM3培地に寒天15g/fを添加した培地で、α−ア
旦ノ酪酸O〜10g/I!.の濃度勾配寒天平板に塗布
し、37゜Cで3日間培養後、寒天培地上のα−アミノ
酪酸耐性株のコロニーを分離する。このようにして、本
発明のα−アごノ酪酸耐性を有し、酪酸生産能を有する
クロストリジウム属細菌突然変異株が得られる。本発明
者らは、この変異株をクロストリジウム・バストリアヌ
ム(Clostricium aSteurianu
m)AB 202株と命名した。本菌は、工業術院微生
物工業技術研究所にFERMP−10818として寄託
されている。
クロス1−リジウム・パス1・リアヌムAB 605株
(FERM P−10819)およびクロストリジウム
・バストリアヌムAB 202株(FERM P−10
818)の菌学的性質を以下に示す。
(FERM P−10819)およびクロストリジウム
・バストリアヌムAB 202株(FERM P−10
818)の菌学的性質を以下に示す。
(1)0.8X3〜10μmの桿菌
(2)周鞭毛で運動性あり
(3)内生胞子あり
(4)ダラム染色陽性
(5)生育温度30〜40゜C
(6)Wの利用性
アミクダリン ー マルトース
+ サリシンアラビノース 士 マ
ンニトー}ト + ソルピトール +セ
Uピ才−ス ー マンノース +
スターチ ±7ラクトース +
メレシトース + シュクロース
+ガラクトース 士 メリビ才一ス
+ トレハl−ス +クリコーゲン
ー ラフィノース + キシロー
ス 士イヌリン ー ラムl−ス
ラクトース − リネース上記のよ
うにクロストリジウム・バストリアヌムAB 605株
(FERM P−10819)の菌学的性質は、αアミ
ノ酪酸耐性とL−バリン生産能を有すること以外は新株
のクロストリジウム・バストリアヌムDSM 525株
と同一の菌学的性質を示す。同様に、クロストリジウム
・バストリアヌムAB 202株(FERMp−t08
18)の菌学的性質も、α−アミノ酪酸耐性と酪酸生産
能を有すること以外は、新株のクロストリジウム・バス
トリアヌムDSM 525株の菌学的性質と同一の菌学
的性質を示す。
+ サリシンアラビノース 士 マ
ンニトー}ト + ソルピトール +セ
Uピ才−ス ー マンノース +
スターチ ±7ラクトース +
メレシトース + シュクロース
+ガラクトース 士 メリビ才一ス
+ トレハl−ス +クリコーゲン
ー ラフィノース + キシロー
ス 士イヌリン ー ラムl−ス
ラクトース − リネース上記のよ
うにクロストリジウム・バストリアヌムAB 605株
(FERM P−10819)の菌学的性質は、αアミ
ノ酪酸耐性とL−バリン生産能を有すること以外は新株
のクロストリジウム・バストリアヌムDSM 525株
と同一の菌学的性質を示す。同様に、クロストリジウム
・バストリアヌムAB 202株(FERMp−t08
18)の菌学的性質も、α−アミノ酪酸耐性と酪酸生産
能を有すること以外は、新株のクロストリジウム・バス
トリアヌムDSM 525株の菌学的性質と同一の菌学
的性質を示す。
本発明では、α−アミノ酪酸耐性を有し、L−バリン生
産能を有するクロストリジウム属細菌突然変異株、例え
ばクロストリジウム・バストリアヌム八B605株(F
ERM P−10819)を培養してL−バリンを蓄積
せしめ、これを採取することによってL−バリンを製造
し、またα−アミノ酪酸耐性を有し、酪酸生産能を有す
るクロストリジウム属細菌突然変異株、例えばクロスト
リジウム・バストリアヌム八B202株(FERM P
−10818)を培養して酪酸を蓄積せしめ、これを採
取することによって酪10 酸を製造する。
産能を有するクロストリジウム属細菌突然変異株、例え
ばクロストリジウム・バストリアヌム八B605株(F
ERM P−10819)を培養してL−バリンを蓄積
せしめ、これを採取することによってL−バリンを製造
し、またα−アミノ酪酸耐性を有し、酪酸生産能を有す
るクロストリジウム属細菌突然変異株、例えばクロスト
リジウム・バストリアヌム八B202株(FERM P
−10818)を培養して酪酸を蓄積せしめ、これを採
取することによって酪10 酸を製造する。
培養に用いる培地は、炭素源,窒素源,無機イオン,存
機栄養aなどを含有する通常の培地でよく、炭素源とし
てはグルコース,シュクロース,フラクl〜−ス,マル
トース,マンノース メリビオース,ソルビI・−ル.
マンニ1・−ル メレジ1・一ス.ラフィノース,トレ
ハロース,デンプン等の糊類が使用される。
機栄養aなどを含有する通常の培地でよく、炭素源とし
てはグルコース,シュクロース,フラクl〜−ス,マル
トース,マンノース メリビオース,ソルビI・−ル.
マンニ1・−ル メレジ1・一ス.ラフィノース,トレ
ハロース,デンプン等の糊類が使用される。
培養は、温度20〜40’C,pll5〜8、好ましく
646〜7に調節し、嫌気的条件rで静置または弱く攪
拌して行なう。また、木菌の植菌量は0.1〜10%、
好ましくは1〜5%である。培養期間は、丁7−バリン
または酪酸が十分景生産されるまで行なえばよく、通常
は1〜10目間、好ましくは2〜5目間である。培養液
中に生或したL−バリンの確認定量は、薄層クロマトグ
ラフィーおよびアξノ酸分析機を用いて行なう。また、
培養液中に生威した酪酢等の有機酸およびアルコール類
は、培養液をリン酸で酸性乙こした後、ガスク1コマト
グラフィーにより確認定量する。
646〜7に調節し、嫌気的条件rで静置または弱く攪
拌して行なう。また、木菌の植菌量は0.1〜10%、
好ましくは1〜5%である。培養期間は、丁7−バリン
または酪酸が十分景生産されるまで行なえばよく、通常
は1〜10目間、好ましくは2〜5目間である。培養液
中に生或したL−バリンの確認定量は、薄層クロマトグ
ラフィーおよびアξノ酸分析機を用いて行なう。また、
培養液中に生威した酪酢等の有機酸およびアルコール類
は、培養液をリン酸で酸性乙こした後、ガスク1コマト
グラフィーにより確認定量する。
「実施例〕
次に、本発明を実施例により説明する。
実施例工
前記第1表に示したCM3培地にクロス1・リジウム−
パスr ’) −? ヌムAB 605株(FERM
P−10819)を接種し、37゛Cで18時間嫌気
的に液体培養を行なった。この培養液を、C)13培地
5mQに2%の割合で植菌し、IOmR不ジロ試験管中
で37゜Cにて2日間婢気的に静置培養した。
パスr ’) −? ヌムAB 605株(FERM
P−10819)を接種し、37゛Cで18時間嫌気
的に液体培養を行なった。この培養液を、C)13培地
5mQに2%の割合で植菌し、IOmR不ジロ試験管中
で37゜Cにて2日間婢気的に静置培養した。
得られた培養液から菌体を遠心分離し゛(除去した後、
薄層クロマ1・グラフィーおよびアミノ酸分析機により
L.−バリンの生或量を測定したところ、480mg/
ffであった。
薄層クロマ1・グラフィーおよびアミノ酸分析機により
L.−バリンの生或量を測定したところ、480mg/
ffであった。
実施例2
実施例1において、クロス1・リジウム・バス1・’J
7ヌムAB 605株(FERM P−10819)
ノ代わりにクロストリジウム・バス1・リアヌムAB
202株(FliRMP−108].8)を用いたこ
と以外は実施例1と同様の操作を行なったところ、第2
表に示す量の生成物が得られた。得られた酪酸は対糖収
率25%であった。
7ヌムAB 605株(FERM P−10819)
ノ代わりにクロストリジウム・バス1・リアヌムAB
202株(FliRMP−108].8)を用いたこ
と以外は実施例1と同様の操作を行なったところ、第2
表に示す量の生成物が得られた。得られた酪酸は対糖収
率25%であった。
比較例
実施例1において、クロストリジウム・バストリアヌム
AB 605株(FERM P−10819)の代わり
にク1コスI・リジウ1、・バストリアヌムDSM 5
25株を用いたこと以外は実施例1と同様の操作を行な
った。
AB 605株(FERM P−10819)の代わり
にク1コスI・リジウ1、・バストリアヌムDSM 5
25株を用いたこと以外は実施例1と同様の操作を行な
った。
L−−バリンの生或量は20mg/j2であり、その他
第2表に示す量の生威物が得られた。得られた酪酸は対
糖収率7%であった。
第2表に示す量の生威物が得られた。得られた酪酸は対
糖収率7%であった。
菫L表
生 2
テクノー)ト 酢酸 フクノール 酪酸
乳酸実施例2 0.1. 0.3 0.1
2.5 0.00.2 ]..2
0.6 0.7 0.2〔発明の効
果〕 本発明の取得方法により得られるク口ストリジウム属細
菌突然変異株は、α−ア廼ノ酪酸耐性を有し、1,−バ
リンまたは酪酸を安価、かつ著量6こ生産する能力を有
する。本発明により得られるLハ゛リン 酪酸は医薬品工業 香ネ」王業 食品工 業等の分野で有用なものである。
乳酸実施例2 0.1. 0.3 0.1
2.5 0.00.2 ]..2
0.6 0.7 0.2〔発明の効
果〕 本発明の取得方法により得られるク口ストリジウム属細
菌突然変異株は、α−ア廼ノ酪酸耐性を有し、1,−バ
リンまたは酪酸を安価、かつ著量6こ生産する能力を有
する。本発明により得られるLハ゛リン 酪酸は医薬品工業 香ネ」王業 食品工 業等の分野で有用なものである。
Claims (5)
- (1)クロストリジウム属細菌を突然変異処理後、α−
アミノ酪酸耐性によりクロストリジウム属細菌の変異株
を得ることを特徴とするクロストリジウム属細菌変異株
の取得方法。 - (2)α−アミノ酪酸耐性を有し、L−バリン生産能を
有するクロストリジウム属細菌突然変異株。 - (3)α−アミノ酪酸耐性を有し、酪酸生産能を有する
クロストリジウム属細菌突然変異株。 - (4)請求項2記載のクロストリジウム属細菌突然変異
株を培養してL−バリンを蓄積せしめ、これを採取する
ことを特徴とするL−バリンの製造方法。 - (5)請求項3記載のクロストリジウム属細菌突然変異
株を培養して酪酸を蓄積せしめ、これを採取することを
特徴とする酪酸の製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP19043089A JPH0358781A (ja) | 1989-07-25 | 1989-07-25 | クロストリジウム属細菌変異株の取得方法,該変異株及び該変異株を用いてl―バリン又は酪酸を製造する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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JP19043089A JPH0358781A (ja) | 1989-07-25 | 1989-07-25 | クロストリジウム属細菌変異株の取得方法,該変異株及び該変異株を用いてl―バリン又は酪酸を製造する方法 |
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JPH0358781A true JPH0358781A (ja) | 1991-03-13 |
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JP (1) | JPH0358781A (ja) |
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1989
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