JPH03504316A

JPH03504316A - Ｔ細胞活性化マーカー

Info

Publication number: JPH03504316A
Application number: JP1502671A
Authority: JP
Inventors: ブラウン，キース・ディー; モスマン，ティモシー・アール; ツラウスキー，ジェラード; ツラウスキー，サンドラ・エム
Original assignee: シェリング・バイオテック・コーポレーション
Priority date: 1988-02-18
Filing date: 1989-02-13
Publication date: 1991-09-26
Anticipated expiration: 2014-06-23
Also published as: AU3192889A; ATE87655T1; ES2046462T3; CA1340869C; EP0415930A1; EP0329363B1; US5001230A; DE68905633T2; JP2910861B2; EP0329363A1; DE68905633D1; WO1989007646A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、一般に免疫系の状態をモニターするための方法と組成物に関連１−でおり、さらに詳細には、本発明は、核酸ハイブリダイゼーションプローグおよヒ／マタは免疫化学的アッセイにより、活性化されたＴ細胞を検出するための組成物を与えるものである。

正常の免疫反応性の調節は、種々のサブセントのＴ細胞により発揮される正および負の影響のバランスからなっている。異常に活性の高（・Ｔ細胞および異常に活性の低いＴ細胞は、ＡＩＤＳ（ヘルパーＴ細胞サブセット・の低活性および破壊）および、Ｔ細胞によるガンマ・インターフェロンの過剰な生産に起因すると信じられて（・るＭＥＣ−関連自己免疫疾患（例えば紅斑性狼癒）などの徨々の自己免疫疾患を含む、数例の免疫異常に関係していると信じられている。

されてきた。例えば、細胞毒性サブセットのヒトＴ細胞上に存在する表面分子Ｔ８は、ｏｘＴｓＣオルソ・ダイアグノースティックス、レイリタン；　０ｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｈｏ−ｓＬｉｃｓ＋　Ｒａｒｉｔａｎ、　ＮＪ　）　　あるいはＬｍｓ　−２（ベクトンーデイツキンソン、マウンテン・ビュー；Ｂｍｃｔｏｎ− Ｄｉｃｋｉｎｔｒｏｎ、　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉａｓｏ　ＣＡ　）などの、ネズミ科の抗ヒトモノクローナル抗体を用いた免疫螢光染色により検出することができる。しかし、こうしたマーカーは、よくてもサブポピユレーションのサイズを測定するためにのみ着用であり、活性化状態に関連した産物を細胞が分泌していることを必ずしも示しているわけではない。

タンパク質の免疫化学的検出、例えば米国特許第４．５６２，００３号、第４，４７４，８９２号および第４．４２７．７８２号あるいは、標的細胞中にあるまたは標的細胞が生産する核酸、すなわちＲＮＡまたはＤＮＡの検出、例えばヘーターソンら（Ｐｇｔｔａｒａｓｏｎ　ａｔ　ａｌ、）、杵築４，３５８．５３５号またはギレスピーら（Ｇｉｌｌａｓｐｉａａｔ　ａｌ、）、米国特許第４，４８３．９２０号などに基づいた診断用アッセイが数多（開発されてきた。後者のアッセイは、核酸プローブ、すなわち、適当に調製された試料あるいは組織中の相補的な標的核酸に優先的にハイブリダイゼーションされ得る、通常は螢光色素あるいは放射性同位体により標識されたＤＮＡある（・はＲＮＡを用いる。このアッセイでは、例えばＲＮＡ〕゛ロッテイング：トーマス（ｒｏｍａｍ）、Ｐｒｏｃ、ＮｃＬｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ｒ　Ｖｏ１７７、ｐｇａ、５２０１− ５２０５（１９８０）；　ドツト、　／％イブリダイゼーション：ホライトら（Ｗｈｉｔｅ　ａｔ　ａｌ、）／、　Ｂｉｏｌ　、　Ｃｈｕｍ、　＋　Ｖｏｌ　＋　２５７、ｐｒｎ、８５６９−８５７２（１９８２）；ササン・プロッテイング：ササン（Ｓｏｕｔｈｅｒ７Ｌ）、／、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　Ｖｏｗ、　９８、Ｐｇｓ、５０３ら（Ｐｉｎｋｅｒ　ａｔ　ａＬ、）、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｐ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、。

ＶｏＬ、８３、ｐｇａ、２９３４−２９３８（１９８６）：および方法を採用することができる。

現在、異常なＴ細胞の活性化を測定する便利で直接的な方法が欠如していることを鑑み、活性化されたＴ細胞を検出するための感度の高い免疫化学的アッセイ法ある　　　−いは核酸プローブを用いることができることは、有用な診断手段を与えることとなるだろう。

発明の概要本発明は、活性化されたＴ細胞の免疫化学的アッセイで用いられる抗体を生産するために有用な、ここではＨ４００と呼ばれている、活性化されたＴ細胞によって生産される成熟型ヒトタンパク質および、それから作製１−だ免疫原性ペプチド断片を含んでいる。Ｈ４００をコードするオープン・リーディング・フレームに相当するアミノ酸配列は第１式に示されている：Ｌｙｅ−Ｌａｓ−Ｃｙａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｍｓ−５ａｙ−Ｌｍｍ−Ｌｅｓ−ＭａＬ−Ｌａｗ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈａ−Ｃｙａ−５ａｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌａｓ−５ａｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍａ　ｔ−Ｇｌ　ｙ−５ａｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ −Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｃｙａ−Ｃｙｓ−Ｐｈａ−５ａｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ −Ｇｌｓ−Ａｌａ−５ａｒ−５ａｒ−Ａｓｎ−Ｐｈａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａａｐ −Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｓ−Ｔｈｒ−５ａｒ−５ａｒ−Ｌａｓ−Ｃｙａ−５ａｒ −Ｇｌｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｈａ−Ｇｌｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｅ −Ａｒｇ−５ｅｔ−Ｌｙｅ−Ｇｌｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａａｐ−Ｐｒｏ −５ａｒ−６１％−５ａｒ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ　−Ｇｌｓ−Ｇｌｓ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｌａｓ−Ｇｌｓ−Ｌａｓ−Ａｓ舅第１式本発明は、さらに成熟型Ｈ４００タンパク質およびその免疫原性ペプチド断片に特異的なモノクローナル抗体および、Ｂ４Ｏ０メツセンジヤーＲＮＡ（倶ＲＮＡ）に対する核酸プローブを構築するために有用なり４００およびペプチド断片をコードする核酸を含んでいる。

Ｈ４００をコードするオープン・リーディング・フレームの好ましい核酸配列は、第■式に示されている。

ＡＴＧ−ＡＡＧ−ＣＴＣ−ＴＧＣ−ＧＴＧ−ＡＣＴ−ＧＴＣ−ＣＴＧ−ＴＣＴ− ＣＴＣ−ＣＴＣ−ＡＴＧ−ＣＴＡ−ＧＴＡ−ＧＣＴ−ＧＣＣ−ＴＴＣ−ＴＧＣ− ＴＣＴ−ＣＣＡ−ＧＣＧ−ＣＴＣ−ＴＣＡ−ＧＣＡ−ＣＣＡ−ＡＴＧ−ＧＧＣ− ＴＣＡ−ＧＡＣ−ＣＣＴ−ＣＣＣ−ＡＣＣ−ＧＣＣ−ＴＧＣ−ＴＧＣ−ＴＴＴ− ＴＣＴ−ＴＡＣ−ＡＣＣ−ＣＧＡ−ＧＡＡ−ＧＣＴ−ＴＣＣ−ＴＣＧ−Ａ、４Ｃ −ＴＴＴ−ＧＴＧ−ＧＴＡ−ＧＡＴ−ＴＡＣ−ＴＡＴ−ＧＡＧ−ＡＣＣ−ＡＧＣ −ＡＧＣ−ＣＴＣ−ＴＧＣ−ＴＣＣ−ＣＡＧ−ＣＣＡ−ＧＣＴ−ＧＴＧ−ＧＴＡ −ＴＴＣ−ＣＡＡ−ＡＣＣ−ＡＡＡ−ＡＧＡ−ＡＧＣ−ＡＡＧ−ＣＡＡ−ＧＴＣ −ＴＧＴ−ＧＣＴ−ＧＡＴ−ＣＣＣ−ＡＧＴ−ＧＡＡ−ＴＣＣ−ＴＧＧ−ＧＴＣ −ＣＡＧ−ＧＡＧ−ＴＡＣ−にＴＧ−ＴＡＴ−ＧＡＣ−ＣＴＧ−ＧＡＡ−ＣＴＧ −ＡＡＣ−（ＴＧＡ）ここで用いられている、タンパク質Ｂ４Ｏ０に関する「成熟型」という用語は、分泌型のＨ４００、すなわちシグナルペプチドのタンパク質加水分解による切断により生じた凰のＨ４０−０を意味している。

ここで用いられている、Ｈ４００に関する「免疫原性ペプチド」とは、（１）成熟型Ｅ４００の同等の長さの領域と同一の配列を有する６から４０アミノ酸からなるペプチドおよび（２）成熟型Ｈ４００と交さ反応する抗体を誘導することのできるキャリヤータンパク質に°結合させたペプチドを意味している。

ここで用いられている、「核酸断片」とは、第■式で定義される核酸の同等の長さの領域と相補的な配列を有する、約１８から２６４ヌクレオチドからなる核酸を意味している。

Ｈ４００をコードすることのできるＣＤＮＡインサートを含む、ｐｃＤ（ＳＲα ）４４００と本文書中で呼ばれるプラスミドは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ａｃｔｉｏｓ＋ＲｏｃｋｖｉｌＬｍ＊ＭＤ）により、寄託番号６７６１４として（Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＪＭｌｏｌを宿主として）寄託されている。

図面の簡単な説明第１図は、プラスミドｐｅＤ（ＳＲα）−Ｂ４Ｏ０および選ばれた制限酵素部位を図式的に表わしたものである。

第２図は、ｐ、Ｄ（ＳＲα）−Ｈ４００のＣＤＮＡインサートのヌクレオチド配列を表わし、またその最も大きなオープン・リーディング・フレームに相当するアミノ酸配列を示している。

発明の詳細な説明本発明は、活性化されたＴ細胞によって特異的に産生される、新規なタンパク質であるＨ４００の発見に基づいている。タンパク質Ｈ４００は、ｐＣＤ（ＳＲα ）−８４００のＣＤＮＡインサートの最も大きなオープン・リーディング・フレームによってコードされている。本発明は、Ｈ４００タンパク質を産生、あるいはＨ４００タンパク質をコードすることのできるｍ　Ｒ／Ｖ　Ａ転写物を産生ずる細胞を検出するため忙有用な化合物にたいするものである。これらの化合物は、成熟型タンパク質Ｅ　４００．その免疫原性ペプチド断片、成熟型Ｂ４Ｏ０あるいはその抗原性ペプチド断片に対するモノクローナル抗体、Ｂ４Ｏ０をコードし得る核酸、およびＨ４００をコードするｍ　Ｒ／Ｖ　Ａに特異的な核酸プローブを構築するための核酸断片からなる。

■、成熟型８４００の生産Ｈ４００は、適当な発現系において、それをコードするヌクレオチド配列を発現することによって生産され得る。その目的に供する事のできるタイプの宿主細胞は、それらに限られるわけではないが、細菌、酵母、昆虫、哨乳動物等である。

発現系を選択し、それによるタンパク質の生産を最適化することは、以下のような数多（の因子、すなわち、（１）発現されるタンパク質の性質、例えばそのタンパク質がいくつかの宿主生物にとって有毒であるかも知れない、あるいは宿主のタンパク質分解酵素によって分解を受は易いかも知れない、またはいくつか宿主ではそれが不活性なコンフォメーションあるいは不溶性の形で発現されるかも知れないこと、（２）目的のタンパク質に当たるメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の性質、例えば、そのｍ　ＲＡ’　Ａが宿主のエンドヌクレアーゼに特に分解を受けやすい配列を有し、それによりｔｙ＋ＲＮＡの機能的な有効時間が激減するかも知れないこと、あるいは、ｔｍ　ＲＮ　Ａが開始コドンあるいはリポソーム結合部位をマスクしてしまうような２次構造を取り、それが原因でいくつかの宿主において翻訳の開始が阻害されるかも知れないこと、（３）コード領域に＠接する３′−領域および５′−領域中の宿主に適合した発現調節配列の選択、有用度および配置−一これには、プロモーター、５′−および３′−保護配列、リポソーム結合部位、転写終結部位、エンハンサ−、ポリアデニル酸付加部位、キャップ部位、イントロン−スプライス部位などが含まれている、（４）そのタンパク質が、宿主によりプロセスされ得る分泌シグナル配列を有しているか否か、あるいは宿主にとって内在性のシグナル配列をコードして〜・る発現調節配列が成熟型タンパク質をコードする領域でスプライスされなければならないか否か、（５）宿主のトランスフェクションあるいはトランスフオーメ〜ンヨンカ可能な様式と効率、および一時的あるいは安定な発現が求められているか否か、（６）タンパク質を発現するために求められる、宿主培養系の規模および費用、（７）翻訳後修飾が必要か、およびいずれのタイプの翻訳後修飾が必要か、例えば、グリコジル化の程度や種類は宿主の選択に影響を与えるだろう、（８）宿主細胞または培地中のタンパク質および他の物質と発現されたタンパク質を分離する容易さ、例えば、いくつかの場合、後のＭ製段階を助けるために特殊なシグナル配列をもつ融合タンパク質を発現することが求められるかも知れない（例えば、サツセンフエルドら（ＳａａｓｇｎｆｅＬｄ　ａｔ　ａｌ、）、Ｂｉｏｔｇｃ−の特定のベクターの安定性とコピー数、例えば、ホソフシ、ｚナイダーら（Ｂｏｆｓｔｈｎｅｉｄｓｒ　ａｔ　ａｌ、）　ｍ、大腸菌以外の菌体中での遺伝子クローニング（Ｇ５ｎ５　Ｃ１ｏｎｉｎｇガー−）ｘ−！５−り、ベルリン、Ｃ５ｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ。

Ｂｅｒｌｉｎ、　１９８２　）、および（１０）当業者に知られるところの同様な因子、などを熟考しかつバランスを取ることを含んで（・る。

詳述したところの因子に鑑みて、特異的な発現系の選択ある（・は修飾を行うためのガイドを与える総説は、数多く得られる：例えば、クルーン（Ｋｒｏｏｎ）編、遺伝子：構造と発現（Ｇａｎ５ｓ　：　Ｓｔｒｓｃｔｕｒｇ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　）（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌａｙ　＆　５ｔｒｎｓ　Ｎｓｗ　Ｙｏｒｋ、１９８３）中の、デ・ベーアとシェパード（ｄｅ　Ｂｏｇｒ　ａｎｄ　Ｓｈｇｐａｒｄ　）による略（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ　Ｆｏｒｅｉｇｎ　ＧｇｓｇＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　　ｉｎ　　Ｅａｃ、ｈｇｒｉｃｈｉα　ｃｏＨ）、　ｐｇｓ、２０５−２４７、は種々のＥ、　ｃｏｌｉの発現系を総説しており；クツヒヤ〜ラバティら（ＫｕｃｈｓｒＬａｐａｔｉ　ａｔ　ａＪ、）の、第４刷、ｐｇｓ、３４９　３７９（１９８４）、およびバナジーら（＆。ｒｊｉ　ｇｔ　ａｌ、）の、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｇｇｒｉ’ｎｇ＋第５巻、ｐｇｓ、１９−３１（１９８３）は、哺乳動物細胞のトランスフェクションおよびトランスフォーメーションの方法を総説しており；レズニコフとゴールド（Ｒａｔｎｉｋｏｆｆ　ａｎｄ　Ｇｏｌｄ　）編、遺伝子の最大発現（Ｍａｔｉｔｎｉｚｉｎｇ　　Ｇａｎｇ　　Ｅｚｐｒｅｉｒｓ　ｉｏｎ　）（Ｂｕｔ　ｔａｒＪＦｏｒｔｈｓｒＢｏｓｔｏ？Ｌ１９８６　）は、Ｅ　、　ｅ　ｏ　ｌ　ｓ　ｓ酵母および哺乳動物細胞における遺伝子発現に関して、選ばれた話題を総説している；またシ’）　　（Ｔｈｉｒｔｙ）、哺乳動物細胞技術（Ｍａｍｍａｌ　ｉａｎ　Ｃｍ　ｌ　Ｌ　Ｔｇｃｈｎｏ　ｔ　ｏｇｙ　）　（Ｂｓｃｔ　ｔ　ｍｒｗｏｒｔｈｓ　＊Ｂｏｓｔｏｎ、１９８６　）は、哺乳動物における発現系を総説している。

さらに、本発明とともに用いるために適当な発現ベクターを作る、あるいは修飾するために、特異的なｃＤＮＡと発現調節配列とを連結あるいは操作するための技術と条件について述べた＃Ｓ説が数多く得られる：例えば、マニアナイスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｇｔ　ａｌ、）、モレキュラークローニングニアラボラトリ −マニュアル（ＭＯｔａｃｓｌα７Ｃ１ｏｎｉｎｇ　　：　Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ　）（Ｃｏｌｄ　　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ　、Ｙ−１１９８２）　ニゲローバー（Ｇｌｏｖｅｒ）、ＤＮＡクローニングニアプラクティカル１９８５）；およびバーベル（Ｐｅｒｂａｌ　）、モレキュラークローニングの実際的なガイド（Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅｔｏ　Ｍｏｌｅｃｗｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ→（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌ　ｍｙ　＆　Ｓｏ％ＩＩＮ、Ｙ、、１９８４）などがある。一般に、本発明のｃ　ＤＮＡの挿入のために、発現ベクター内に種々の部位を選択することができるだろう。これらの部位は通常、それらを切断する制限酵素によって表示され、また当業者によってよく知られている。これらの部位へＤＮＡ配列を挿入し、組み換えＤＮＡ分子を形成するさまざまな手法も、当業者にはよく知られている。

これらは例えば、ｄＧ−ｄＣあるいはｄＡ−ｄＴ末端、直接的なライゲーション、合成リンカ−、エンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼ一連結修復反応とそれに続くライゲーション、あるいはＤＮＡポリメラーゼと適当なシングル−ストランドの鋳型を用いた、ＤＮＡストランド伸長反応とそれに続くライゲーションなどを含んでいる。

本発明のｃＤＮＡを含むベクターはしばしば、宿主培養中の細胞のトランスフェクションおよびトランスフォーメーションが行われる前に、大量に得られなければならない。この目的のために、このベクターは、しばしば最終的に発現に用ｔ・られるものとは異なり、生物（クローニング宿主）中で有意な発現を起こさずに複製される。

このような場合、増殖させた後、このベクターは、例えばマニアナイスら（上述）により開示されたような標準的な技術をもって、クロー二／グ宿主から単離される。

好ましくは、Ｈ４００はｐＣＤベクターに適した宿主細胞、例えばＣＯＳサル細胞（ＡＴＣＣから、寄託番号ＣＲＬ　１６５０およびＣＲＬ１６５１により入手が可能である）Ｃ１２７マウス乳腺魔細胞（ＡＴＣＣから、寄託番号ＣＲＬ　１６１６ＶＣより入手が可能である）、あるいはマウスＬ細胞などにおいて、ｐ　ｃ　Ｄ　（Ｓ　Ｒα）−Ｈ４００に運ばれたＨ　４００　６　ＤＮＡ　　を発現することにより製造される。真核細胞宿主は、新たに翻訳されたＥ４００ポリペプチドからシグナルペプチドを切断して、成熟型Ｂ４Ｏ０ポリペプチドを形成することができる。真核細胞宿主はまた、抗原性の面から重要であろうと思われるグリコジル化等の、その他の翻訳後修飾を行うことも可能である。

バクテリアの発現系におけるＢ４Ｏ０の生産は、成熟型Ｈ４００ポリペプチドをコードする核酸の直接的な発現を行うためあるいは、このような核酸を内在性のシグナルペプチドｔコードするバクテリアの配列に連結するために、シグナルペプチドの切断部位が決定されていることを必要とする。高い精度でこうした予測を行うための経験則が発達してきた：例えば、７オン・ヘイジュニ（Ｖｏｎ　Ｉｉａｉｊｎｍ　）、ＥｓＬｙ、　／、　Ｂｉｏｃｈａｔｎ、＋メｏｊ−１３３、ｐｇａ−１７２１（１９８３）：Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｔ、、Ｖｏｌ、１８４、ｐｃｔａ、　９９　１０５　（１９８５）　：ＩＶｕｃｌａｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒａｇｅ　−ｒａｒｃｈ＋　Ｖｏｌ、　１４、ｐｇｓ、４６８３−４６９０（１９８６）；およびパルマン（Ｐａｒｌｍａｎ　ａｔ　ａｌ、）ら、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ＊ＶＯＬ、１６７、ｐｇｓ、３９１４０９（１９８３）などである。

フォノ・ヘイシュニー則は、成熟型Ｂ４Ｏ０は、第１式のＮ−末端アミノ酸に関しては、２３番目のアラニンから始まっていることを示してにす：予想され不成熟型配列は、以下の第■式に茨わされている。

成熟型Ｂ４Ｏ０は、ｐｅＤ（ＳＲα）−Ｂ４Ｏ０で一時的にトランスフェクションしたＣＯ５７細胞によって以下のように生産される。トランスフェクションの前日に、１０％のウシ胎児血清および２ｍＭグルタミンを含むデュルベツコの修飾イーグル培地（ＤＭＥ）を入れた各々の１００３のプレートに、約１０’のＣＯ５７サル細胞をまく。トランスフェクションを行うために、培地を各々のプレートから吸引棄却し、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｍ−ＥＣＩ　ｐＨ７，４，４００μｆ／ｍｔＤＥＡＥ−デキストランおよび５０μ？のテストすべきＤＮＡを含む４１のＤＭＥＫ置換する。このプレートを３７℃で４ＦＦｆ間インキュベーションし、プレートを５ｍｇの無血清ＤＭＥで２回洗う。３７℃で３時間イキュベーションしたプレートにＤＭＥを戻す。フレートをＤＭＥで１回洗い、次に４％ウシ胎児血清、２渇Ｍグルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤＭＥを絵加する。細胞を次に３７℃で７２時間イキュベーションする。培地を回収し、これから標準的な方法を用いてＨ４００を精製する。

不発明は、キャリアーと結合したとき抗原を形成する８：感型Ｅ４００由来のペプチドを含んでいる。ここで用いている抗原という用語は、免役応答を引き起こすことのできる物質を意味している。ここで用いているキャリアーという用語は、本発明のペプチドと化学的に結合したとき宿主生物を免疫し、その結果、結合したペプチドに特異的な抗体を産生ずることが可能な物質を意味している。キャリアーには、赤血球、バクテリオファージ、タンパク質およびアガロースビーズのような人工顆粒が含まれる。キャリアーは、血清アルブミン、ガンマ−グロブリン、キーホル・リンペットのヘモシアニン、チログロブリン、オブアルブミン、フィブリノーゲン等のタンパク質が好ましい。

本発明のペプチドは、以下に示す成熟型Ｒ４００のアミノ酸配列中の位置によって定義される：（１）　　　Ａｌ１−Ｐｒｏ−Ｍａｔ−Ｇｌｙ−５ａｔ−Ａｓｐ −Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−（９）　　　Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｃｙｍ−Ｃｙａ−Ｐｈａ−５ａｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−（１７）　　　Ａｒｇ−Ｇｌｓ−Ａｌａ−５ａｒ−５ａｒ−Ａａｓ−Ｐｈａ−Ｖａｌ−（２５）　　Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ− Ｇｌｓ−Ｔｈｒ−５ａｒ−５ａｒ−（３３）　　ＬローＣνａ−５ａｒ−Ｇｌｘ −Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−（４υ　　Ｐｈａ−Ｇｌｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｅ−Ａｒｇ−５ａｒ−Ｌｙｅ−Ｇｌｓ−（４９）　　Ｖａｎ−Ｃｙｓ−Ａｌａ− Ａｓｐ−Ｐｒｏ−５ａｙ−ＧＬ塾−５ａｙ　−（５７）　　　Ｔｒｐ−Ｖａｌ− Ｇｌｓ−Ｇｌｘ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａａｐ−（６５）　　Ｌａｗ−Ｇｌｓ−ＬａＳ−Ａｓｓ第■式のアミノ酸は、成熟型Ｂ４Ｏ０ポリペプチドのＮ−末端から番号性けがなされ又いる。したがって、ｓａｙ＠は第５査信のセリンである。ペプチドはＱ：熱量Ｈ４００ポリペプチドの断片として定義されている。したがって、本明細書で５ａｒＳ−Ｃｙａ１１によって表わされるペプチドはＳｕｒ−Ａｍｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｃｙｓというペプチドである。

本発明のペプチドの基もまた、成熟型Ｈ４００ポリペプチドの断片によって定義されている。したがって、本明細書で（Ｓｕｒ、−Ｃｙａ１．〕。で表わされる基は、その配列がペプチドＳ”５−Ｃ１／’ｕの全て、あるいは一部と向−であるところの５−および６−アミノ酸ペプチド（すなわち、全て５−量体および６ −量体）からなっている。すなわち、この基は、以下の５つのペプチドからなっている：　５ａｒ−Ａａｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＡｌａｔＡｓｐ−Ｐｒｏ −Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｃｙａ＋５ａｙ−Ａａｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ、Ａｍｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＡｌａおよびＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｅ−Ａｌａ−Ｃｙｇである。

一般に、本発明は成熟型Ｈ４００の６−量体から２４−量体のペプチド断片全て、すなわち［Ａｌａ（−Ａ８％６１λ嘲を含んでいる。本発明は、成熟ｆｊｌＨ４００ポリペプチドのＮ−末端あるいはＣ−末端配列を含む、あるいは、例えばホップとウッド（Ｅｏｐｐ−Ｆｏｏｄ　）、Ｐｒｏｃ　、　Ｎａｔ　ｌ　、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、Ｖｏｌ、７Ｂ、ｐｇｓ、３８２４　３８２８（１９８１）；あるいはカイトとドウーリトウル（λｙ！ａ　ａ％４Ｄｏｏｌｉ−（１９８２）のように、ホップ−ウッド分析あやいはそれに関連した分析技術によって決定されたような、平均以上の親水性を有する成熟型Ｂ４Ｏ０ポリペプチドの配列に対応する、６−量体から２４−量体のペプチド断片からなるのが好ましい。本発明の好ましいペプチドのうちの後者のセット（平均以上の親水性を有するもの）は、以下の基：　ＣＡ　ｌ　ｃＬ、−Ｓｇ　１２６　〕〕６−２およびＣＴｈ１ｓ−Ａ８ｎ６Ｂ〕６−２４を含んでいる。

アミノ酸に対しては全体を通して、標準的な記号、例エバ、ニーエン（Ｃｏｈａｎ　）、アルファーアミノ酸の命名法と記号（Ｎｏｍｅｒｃｌａｔｕｒａ　ａｎｄ　Ｓｙｍｂｏｌｉｓｍ　ｏｆ　ａｌｐ−１０６、ｐｇｓ、　３−　Ｉ　７　（，４ａａｄａｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ、］’、。

１９８４）が用いられている。したがって、この引用文献Ｃ第１表は本明細書に引用文献として取り入れられている。

本発明のペプチドは標準的な技術、例えばスチュワートとヤング（Ｓｔｇｗａｒｔ　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ　）、固相ペプチド合成法（５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｇｓｉｓ　）、第２版（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｎｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ　Ｉ　Ｌ。

１９８４）によって合成することができる。市販の目動化された合成機、例えばヴエガ・バイオケミカルズ（Ｖｇｇａ　Ｂｉｏｔｈｇｍｉｃａｌｍ　）　（タクソン＋　Ｔｕｃｓｏｎ　Ａ　Ｚ　）モデル２９６Ａある（・はＢまたは、（有）アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔａｍｓ　）　（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔ、ＣＡ）モデル４３０Ａを用いることが好ましい。

本発明のペプチドは、架橋されたポリスチレン支持体上でカルボキシル末端を開始とし、全体の鎖が形成されるまで段階的にアミノ酸を加えてい（固相−合成法によって組み立てられ得る。われわれは、完全に自動化されたペプチド合成機（アプライド・バイオシステムズ　モデル４’３０，４）で合成を行った。以下の引用文献は、合成に用いられた化学についての案内書である二メリーフィールド（ＪＶｇｙｒｊ　ｆｉ　ａ　Ｉｄ　）、Ｊ、　Ａｒｎｅｒ、　Ｃｈ＃ｒｎ、、　５ｏｃｘＶｏ１．８５、ｐｇ、２１４９（１９６３）：ケントらＷａｋｓｓｔｌ＋　、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、　１９８４　）　：ケントら（Ａｇ？ＬＬイズミヤ編（プロティン・リサーチ・ファウンデーション；　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅａａｒａｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　）　Ｂ、Ｈ，大阪、１９８５）；メリーフィールド（，１４ｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　）、５ｃｉｅｎｃｅ　、　Ｖｏｌ、　２３２、ｐｇｓ、３４１　３４７（１９８６）；および本明細書の最後の引用文献に記載の引用文献。

固相合成法において王に終結、欠失、あるいは修飾ペプチドであるところの合成副産物を排除することが最も重要である。大部分の副反応は清浄で、良く特徴のわかっている樹脂と、清浄なアミノ酸誘導体と、清浄な溶媒を用い、また、適当なカンプリングおよび開裂法および反応条件を選択することによって排除あるいは最少に抑えることができる：例えば、バラニーとメリーフィールド（Ｂａｒａｎｙ　ａｎｄ　ＭａｒｒｉｆｉｍＬｄ）、ペプチド（ＴｈｅＰｅｐｔｉｄｅｓ　）、クロスとマイエンホファー（Ｃｒｏｗｎａｎｄ　Ｍｇｉｎｈｏｆｍｒ　）編、Ｖｏｌ　、２　、ｐｇｓ、１−２８４（Ａｃ１−２８４（Ａｃａｄｅ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋　１９７９　）などがある。反応が最後まで進み、その結果ｌあるいは複数残基を欠いた欠失ペプチドの生成が回避されたことを確認するために、カップリング反応を監視することが重要である。定量的ニンヒドリン反応、すなわち、サリン（５ａｒｉｎ　ｇｔ　ａ、１．）ら、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈａｍ、、　Ｖｏｔ、　１１７．７）１７．１４７　（１９８１）はこの目的に有用である。Ｎα−ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ酸は鎖集合反応の条件で安定だが、強酸に不安定である基を保護する適当な側鎖とともに用いられた。

保護されたペプチド鎖の集合な行った後、保護基は除かれ、ペプチドな固定していた結合は、チオエステル捕捉剤の存在下で、無水フッ化水素な低濃度、次に高濃度で用いることにより切断した：タム（Ｔａｒｎ　ａｔαｉ）ら。

Ｊ、Ａｍａｒ、Ｃｈａｍ、Ｓｏｃ、、Ｖｏｌ、ｘ０５．ｐｇ　６４４２（１９８３）。

用いた側鎖保護基は、ＡＢｐ（ＯＢｔυ、Ｇ１５（ＯＢｔυ、Ｓｇｒ（ＢｇＪ）、Ｔｈｒ（Ｂｉｔ）、Ｌｙｓ　（ＣＺ−Ｚ　）、Ｔｙｒ（ＢＴ−Ｚ）、ｋｃｔ　ＣＮ０Ｔｏｓ　）、ＣｖＢ　（４−ＭｅＢｇｌ　）およびＨｉ　ｓ　（ＩｒｒＪ）ＮＰ　）でアッタ。（Ｂπｌｋｔへ７ジル；　Ｔｏｓはトルエンスルフォニル：ＤＮＰはジニトロフェニル；　Ｉｔｎ　ｔ’！（ミタソール；Ｚはベンジルオキシカルボニルを示す。）側鎖中の、残りのアミノ酸は保護基をいっさい持たなかった。全てのアミノ酸は、ペニスラ・ラボラトリーズ（ｌ１ｎｉｎｓｓｌａ。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から得られたが、例外として、ｔＢＯＣ−Ｈｉ８（Ｉ惰ＤＮＰ）はケミカル・ダイナミックス（ＣＡｓ惧ｉｃαｌＤｙｎａｍｉｃ８　）から得たもので、使用前にエタノールから再結晶された。（ｇＢｏｃは、Ｎ α−【−ブチルオキシカルボニルを表わす。〕各々のサイクルにおいて、ｔＢＯＣ−Ｎα−保護を受けたペプチド樹脂は、ジクロロメタン（ｎＣＭ）（マーレンクロット）中、６５％の３７ツ化酢酸（イーストマン・コダック社より）（使用前に希釈）にさらした二つまり、Ｎα−保護基を除去するために、はじめは１分間、次に１３分間処理した。ペプチド樹脂は、ＤＣＭで洗い、次にジメチルフォルムアリド（ＤＭＦ　）（アプライド・バづオシステムズ）中の１０％ジイゾプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（アルドリッチ；Ａｌｄｒｉｃｈ）により２回、それぞれ１分間ずつ中和した。

中和に続き、ＤＭＦで洗浄を行った。カップリングは、ＤＭＦ中で１６分間アミノ酸の、あらかじめ形成された対称的な無水物を用いて行った。あらかじめ形成された対称的な無水物とは、ＤＣＭ６ｒｎｌに２ｍｍｏｌのアミノ酸を溶解し、２１のＤＣＭＫ　１　ｍｔｎｏｌのシンクロヘキシカルボジイミド（アルドリッチ）を添加することにより、合成機上で調製された。５分後、活性化されたアミノ酸を別の容器に移し、連続的な窒素ガスの流れの中でパージングすることによりＤＣＭを蒸発させた。パージングの様々な段階で、ＤＣＭはＤＭＦ（総量６　ｍｌ　）によって置換された。はじめのカップリング反応の後、ペプチド樹脂は、ＤＣＭ、次にＤＣＨに溶解した１０％　ＤＩＥＡおよびＤＣＭで洗浄した。カップリング反応を再度行うために、同じアミノ酸および活性化試薬、ジクロロへキシルカルボジイミドを反応容器に順番に移した。ｉｎ　Ｂｉｔｗで活性化し、１０分間カップリングさせた後、５０％のＤＭＥ−ＤＣＭ混合液を作るために充分量のＤＭＦを６加し、カップリングを１５分間続けた。アルギニンは６０分間ヒドロキシベンゾトリアゾール（アルドリッチ）のＤＭＦ溶液で前もって作られたエステルとしてカップルされ、次に同様にして他のアミノ酸と再度カップルされた。アスパラギンとグルタミンは、前もって作られたヒドロキシペンシトリアゾニルエステルのＤＭＦ溶液として２回、それぞれ４０分間カップルされた。全ての残基に対して、樹脂は、第２回目のカップリングの後洗浄され、定量的なニンヒドリン反応によって残留するカップルしていないα−アミンをモニタリングするために自動的に試料が分取された：サリンら（５ａｒｉｎ　ａｔ　ａｌ、）　（上述）。

合成ペプチドを担体に連結する一般的な技術はいくつかの引用文献に述べられている：例えば、ワルターとブラーリットル（Ｈ７ａｌｔｍｒαｎｄ　Ｄｏｏｌｉｔｔｌｇ　）　、合成ペプチドに対する抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ａｇａｉｎｓｔ　ＳｙｎｔｈｅｔｉｃＰｇｐｔｉｄａｓ　）、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｇｅｒｉｎｇ＋　（セｙ　）　Ｃ１ウら（Ｓｇｔｌｏｗ　ａｔ　ａｌ、）編）、Ｖｏｌ、　５ｐｇｓ、　６１−９１（Ｐｌａｎｗｍ　Ｐｒａｗｎ、Ｎ、Ｙ、　　１９８３　）　；グリーンら（Ｇｒｅｅｎ　ａｔ　ａｔ、）、Ｃｅ１１．Ｖｏｌ　、　２８　、　ｐｇ８−４７７−４８７（１９８２）；ラーナーら（Ｌｇｒｎａｒ　ａｔ　ａｌ、）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　Ｖｏｌ、　７８　ｒ　ｐｇｓ、　３４０３−３４０７（１９８１）；シミズら（Ｓｈｉｍｉｔｓ　ａｔ　ａｌ、）、米国特許第４．４７４，７５４号；およびギャンフィールドら（Ｇａｎｆｉａｌｄ　ａｔ　ａＬ、）、米国特許第４．３１１，６３９号などで述べられている。したがって、これらの引用文献は引用文献の項目に取り入れられている。また、ハプテンをキャリアーに結合させるために用いた技術は、原理的には上で引用した技術と同様であり、例えばテイジュセ−（Ｔｉｊｓｓａｓ）　、エンサ゛イムイムノアッセイの実際と理論（Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　ＥｎｚｙｍｅＩｍｍｓｎｏα５ｓｃＬｙａ　　）（Ｅｌｓｇｖｉａｒ＊Ｎａｗ、Ｙｏｒ＆、１９８５）の第２０章がある。

ペプチドを担体に連結するための、４種類の最も広く用いられている方法は、（１）　アミノ酸カップリングのためのグルタルアルデヒド、例えば、カガ／とグリツク（Ｋａｇａｎ　ａｎｄ　Ｇ１１ｃｋ　）、ジャッフエとベールマン（Ｊａｆｆａ　ａｎｄ　Ｂｇｈｒｒｎａｎ　）編、ホルモンのライジオイムノアッセイの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ｒａｄｉｏ−Ｐｒｍｓｓ、Ｎ、Ｙ、、　１９７９　）、およびワルターら（ＷｃＬｌ　ｔ　ｅ　ｒ５１９７− ５２００（１９８０）に開示されるようなもの；（２）カルボキシル−アミノカップリングのための水溶性カルボジイミド、例えば、ノ・−レら（Ｈ，αデ＃＃ＣαＬ）、Ｊ　、Ｂ％　ＯＩ　Ｃｈ　ｇｆｎ−＋　Ｆ　Ｏｌ　、２４２　、ｐｇＪ　−２４４７−２４５３（１９６７）によって開示されるようなもの；（３）チロシン−チロシン側鎖のカップリングのためのビス−ジアゾベンジジン（ＢＤＥ）、例えばバシリら（Ｂαｓｓｉデｉａｔ　ａｌ、）、ｐｇｓ　、　４６−４７　ｒ　Ｍｍｇｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｈｏｒｍｏｎｅａｎｄ　Ｂａｈｒｔｎａｎ　）　ｉｎ！　（上述）％およびウオルターら（Ｔｌ’ａｌｃａｒ　ａｔ　ｇＪ、）（上述）によって開示されるようなもの；および（４）アミノ酸の基に対しシスティン（あるいはほかのスルフィドリル）をカップリングするためのマレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシコノ１り酸エステル（あるいはほかのスルフィドリル）、例えば、キタガＶｏ１．７９．ｐｇｓ、２３３−２３９（１９７６）あるいは、ラーナーら（Ｌａｒｎｍｒ　ａｔ　ａｌ、　）　（上述）によるものである。

与えられたペプチドを担体にカップリングするための適白な方法を選択するための一般則は、次のようにいうことができる二カップリングに選ばれたアミノ酸は、配列中にただ一方所有るだけで、また分節の中で適当な末端にあることが好ましい。例゛えは、チロシン残基がその潜在的な抗原性な示す特徴として選ばれた配列の主要部分にある場合、ＢＤＢは用いられるべきではない。同様に、中央にあるリジンは、グルタルアルデヒド法を不可能とし、アスパラギン酸あるいはグルタミン酸の存在は、カルボジイミド法をしばしば不可能とするだろう。一方、適当なアミノ酸残基は、それが選択されたタンパク質配列中で天然に存在しようとしまいと、選択された配列分節のどちらかの末端に結合部位として置かれることができる。

成熟型Ｈ４００の実際のアミノ酸末端あるいはカルボキン不端を含む分節は、分節のもう一方の端で、末端を遊離した状態にしたまま担体に結合されることが好ましいだろう。実際の末端を両方欠（分節は、その遊離の端が成熟型Ｅ４００の本来の末端ではないという問題を生ずるかも知れない。この問題は、α−アミノ基をアセチル化し、次にそのカルボキシ端を経てペプチドに結合することによりある程度矯正することができる。

担体タンパク質への、与えられたペプチドのカップリング効率は、合成のある段階で放射性同位体を含むアミチロシン残基なヨード化により標識する事により、放射性同位体で標識したペプチドを用いて都合よく測定することができる。ペプチド中のチロシンの存在は、もし必要とあらば、感度の高いラジオイムノアッセイを構成することも可能にする。したがって、もしチロシンが本来のＨ４００ポリペプチドによって定義されるペプチド配列の一部でなければ、末端基としてチロシンを導入することが望まれるかも知れない。

好ましい担体はタンパク質であり、好ましいタンパク質担体は、ウシ血清アルブミン、ミオグロビン、オブアルブミン（ＯＶＡ）、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＪＬＢ）等である。

ペプチドは、リューら（Ｌｉｕ　ａｔ　ａｌ、）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

Ｖｏｌ、１８．ｐｇｓ、６９０　６９７（１９７９）によって開示されたように、ＭＥＳによってシスティンを介してＫＬＨに連結することができる。ペプチドは、リン酸緩衝生理食塩水ＣｐＨ７，５）、０．１Ｍホウ酸すｔｌｌラム衝液ＣｐＨ９，０）あるいは１．ｏＭ酢酸ナトリウム緩衝液ＣｐＨ４，０）に溶解される。ペプチドの溶解のためのｐＨはペプチドの溶解性を最もよ（するものを選択する。

溶解性のペプチドに対する遊離システィンの含量はエル？　７　（Ｅｌ　１ｍａｎ　）、Ａｒｔ：ｈ、Ｂｉｏｃｈｇｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、、Ｖｏｌ　。

８２、ｐｇ、７０７７（１９５９）の方法によって決定される。

各々のペプチドに対し、１０ｍＪ／のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，２）　０．２５に溶油した４ｍ９（ｒ）ＫＬＨｆ、（０、７ｒｎ９のＭＢＳ　　（ジメチルホルムアミドに溶解したもの）と反応し、室温で３０分間撹拌する。ＫＬＨは３０％以上のフォルムアミドに不溶性であるため、局所的なフォルムアミドの濃度が高くなり過ぎないようにＭＢＳを滴下する。反応産物であるＭＢＳ−ＭＢは次に、遊離のＭＢＳす除＜ために、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化したセファデックスＧ−２５に通す；（ＯＤ２８０でモニターした）カラム溶出液のピーク画分からのＫＬＨの回収率は約８０％と推定される。

ＫＬＨ−ＭＥは次に、選択された緩衝液１　ｍｌに溶解した５〜のペプチドと反応する。ｐＨ１（７−７，５に調整し、反応液を室温で３時間撹拌する。カップリング効率は複合物の試料ナリン酸緩衝生理食塩水に対して透析することにより、放射性同位元素を含むペプチドを用いて監視され、効率は８かも６０％の範囲である。

モノクローナル抗体は、標準的な技術によつ゛Ｃ成熟型Ｈ４００あるいはペプチド−担体複合体に対して作製される：例えば、モノクローナル抗体技術ＣＭｏｎｏｃｔｏｎα１Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　（Ｅｌｓｅｖｉｇｒ　Ｎ６ｗ　Ｙｏｒｋ。

１９８４）の中でキャンペル（Ｃａ情ｐｂａｌｌ　）によって開示すし；ハーレル（Ｈｔデｖａｎ）１１４のモノクローナル　ハ（ＣＲＣＰｒｇｓｓｌＢｏｃａ　ＲｃＬｔｏｎ、　ＦＬ＋　１９８２）　；　　シュライア−ら（Ｓｃｈｒｅｉｇｒ　ａｔ　ａｔ、）　　のハイブリドーマ技術（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　　）（Ｃｏ１ｄ　　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ αｔｏｒｙ、Ｎａｗ　Ｙｏｒｋ、　’１９８０　）　；米国特許第４，５６２．００３号等に開示される様なものがある。特に、米国特許第４，５６２，００３号は引用文献に取り入れられている。モノクローナル抗体産生のための第一段階は、８９７７球のもとを得るための宿主動物を免疫する事である。モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマな作るために、８９７７球な適当な不死化した細胞系列に融合する。不死化した細胞系列は、通常、ミエローマなどの腫瘍細胞系列である。宿主動物はげつし類で、不死化した細胞系列もげつし類の細胞、特に同じげつし類由来であることが好ましい。作製後、ハイブリドーマは、本発明のペプチドに対する抗体を産生ずるものに関してスフソーユングされる。免疫化、リンパ球の収穫、および細胞融合はすべて当業者によく知られる技術である。

免疫化は、精製されたペプチド−担体複合体を、通常は適当な補助剤とともに混合し、宿主動物に繰り返し注射する方法によって行われる。免疫化は、最初の注射と次の追加抗原刺激に用いる抗原の量、注射の経路、注射と採血の時間割、および補助剤、例えば２０インドの完全補助剤あるいは不完全補助剤の使用を含む様々な因子を変化させることにより最適化され得る。細胞融合の技術も当業者によ（知られており、一般に、細胞を最も広く使われているポリエチレン・グリコール等の融合試薬と混合することを含んでいる。

良好に行われたハイブリドーマの形成は、例えばＨＡＴ選択のような標準的な方法によって評価、選択される。

良好なハイプリドーマのうちから、求める抗体を良好に分泌するものを、培養液についてその抗体の有無をアッセイすることにより選択される。通常、免疫反応に基づいたアッセイ、例えばウェスタンのプロット、ＥＬＩＳＡあるいはＲＩＡアッセイを用いて行われる。抗体は、標準的なタンパク質精製技術を用いて培地から回収され得る。

例えば米国特許第４，４８６．５３０号に開示されるような、１２点（’　Ｔｓｏｏ　Ｓｉｇｈ　’　）　Ｊあるいは「サンドイッチ」免疫アッセイ法は、本発明の免疫アッセイ法として好ましいものである。したがって、この特許は引用文献に取り上げられている。こうしたアッセイ法は２つの異なる対の抗−Ｂ４００抗体を利用し、その少な（とも一方は本発明のモノクローナル抗体からなるものである。

２対のうちのひとつからの抗体は固相支持体の表面に固定されている。固定された抗体は次に、Ｈ４００を含むと思われる試料にさらされる。８４００分子は固定された抗体と結合する。次に、２組目の抗体を結合したＲ４００にかけると、これは、はじめの抗体が結合したものとは異なるひとつあるいは複数の抗原決定基と結合する。これにより、Ｈ４００は２組目の抗体に関連した間接あるいは直接的なシグナル生成法によって検出される。

例えば、抗体は酵素、希土類元素キレート剤あるいはオレンジ色素などのシグナル生成団と直接的に複合体を形成することができる。あるいは、これらは、さらに加えた抗体あるいはアビジン−ビオチン複合体のような高い親和性を持つ複合体な介して、ひとつあるいは複数のシグナル生成口と間接的に結合することができる。Ｂ４Ｏ０濃度の定量的な測定は、既知の濃度のＢ４Ｏ０をＨ４００標準物質によって生成されるシグナルに対し、試料によって生成されるシグナルを比較することによって行うことができる。

本発明は、免疫アッセイ法、特にサンドインチ免疫アッセイ法で用いる試薬のキットを含んでいる。このようなキットは、（１）固相支持体、【２）モノクローナルで、Ｈ４００の第１の抗原決定基に結合できる第１の抗体、（３１Ｂ４Ｏ０の第２の抗原決定基に結合することのできるモノクローナル抗体から選択された第２の抗体と、Ｂ４Ｏ０に特異的なポリクローナル抗体（本明細書では、「ポリクローナル抗体組成物」と呼ばれる）、および（４７３つの抗体のひとつ、好ましくは第２の抗体と関連するシグナル生成手段。特定の態様によって、キットは３つの抗−Ｅ４００抗体タイプのうちの２つ、すなわち、第１の抗原決定基に特異的な七ツクローナル抗体と第２の抗原決定基に特異的なモノクローナル抗体、もしくは、第１あるいは第２の抗原決定基に特異的なモノクローナル抗体とポリクローナル抗体組成物のいずれかを選択を含みつる。抗体は溶液あるいは凍結乾燥された形をとりうる。これらの組の抗体のひとつはあらかじめ固相支持体に結合して供給されるか、あるいはキットが使用されるときに初めて面相支持体の表面に連結されるだろう。

シグナル生成剤は、２つの抗体タイプのうちの一方とあらかじめ結合した形で供給されるかまたは、使用前に、ひとつあるいは複数の組成物、例えば緩衝液、抗体−酵素複合体、酵素基質などと組み合わせることが必要かも知れない。数多くのタイプのシグナル生成剤な手に入れることが可能で、これはキットのひとつあるいは複数の部分をなすだろう。種々のシグナル生成剤がティジュセって開示されている。本発明のキットは、それ以外の試薬５例えば固相表面への非特異的な結合を滅するためのブロッキング試薬、洗浄試薬、酵素基質なども含んでいる。

固相表面は、ミクロタイター板、ミクロスクエアーなどの形態で、ポリ塩化ビニル、ポリスチレンあるいはタンパク質な固定するために適した同等の材料からなるだろう。螢光あるいは呈色物質の形成を触媒する酵素が、シグナル生成剤の組成物であることが好ましい。この酵素がパーオキシダーゼ、アルカリン・フォスファターゼ、あるいはベーターガラクトシダーゼから選ばれることがさらに好ましい。これらの酵素に関する基質および反応条件は当業者によ（知られるところのものであり、例えばテイジュセー（上述）がある。

■、１１０シし−Ａ本発明の核酸プローブは、第■式の核酸によって決定される核酸配列から構築される。プローブとそれに対合する核酸の性質は用いる特定のハイブリダイゼーションアッセイ法によって変化し得るものである。８４００ｍ　ＲＡ’　Ａを測定するひとつの方法は、ホワイトら（Ｆｈｉ！＃ａｔ　ａｔ、）、Ｊ、Ｅｉｏｌ　、Ｃｈａｍ、、Ｖｏｌ、　２５７　、　ｐｇｓ、　８５６９−８５７２（１９８２）およびギレスピーら（Ｇｉｌｈｓｐｉｇａｔ　ａｔ、）、米国特許第４，４８３，９２０号によって述べられているような細胞質のドツト・ハイブリダイゼーションによって行われる。したがって、これらの引用文献は本明細書中で引用文献によって取り上げられている。他アングレールら（Ａｎｇａｒｍｒ　ｌＬａ１．）、ＧｅｎｅｔｉｃＥｎ　１ｎｅａｒｉｎ　、Ｖｏｌ、７．　ｐｇｓ、４３ −６５（１９８５）および精製されたＲＮＡを用いたドツト・プロッティング、例、ｔばヘイムズら（Ｈｏｍｅｓ　ａｔ　ａｔ、）編、核酸ハイプリＰｒｅｓｓ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ＋　Ｄ、Ｃ０＋　１９８５　）　　の第６章が含まれる。一般に、細胞質のドツト・プロッティングは細胞あるいは組織試料からのｍ　ＲＡ’　Ａを固相支持体、例えばニトロセルロースに固定し、固定されたｍ　ＲＡ’　ＡにＤＮＡプローブなハイブリダイゼーションし、固相支持体に非特異的に結合したプローブ配列、あるいはｍＲＡ’Ａとの誤った対合複合体を形成したプローブ配列を除き、その結果、残った標的ｍＲｒＶＪと実質的に完全な複合体な形成しているプローブ配列のみが残ることからなる。残っているＤＮＡプローブの量は、固相支持体に固定された標的ｇＲＮＡの量を測定していることになる。残ったＤＮＡプローブの量は、その標識から生ずるシグナルによって決定される。

シングル−ストランドおよびダフ゛ル・ストランドの核酸断片を標識するために、いくつかの標準的な技術がある。それらは、放射性同位元素標識の取り込み、例えばハーバ−ら（Ｈａｒｐｅｒ　ａｃａｔ、）、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｔｎａ、Ｖｏｌ　。

８３　、ｐ１７ｇ、４３１−４３９（１９８４）；螢光標識の直接的な結合、例えばスミスら（Ｓｍ１ｔｈ　ａｔ　ｃＬｌ、）、Ｎ５ｃｌａｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ、　１３　、　ｐｇｓ、　２３９９−２４１２（１９８５）およびコロネーら（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ　ｄｌ　ａｔ、）、Ｎ５ｃｌａｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｍｓ−αデｃｈ、Ｖｏ１．ｌ　３．ｐｇｓ、４４８５−４５０２（１９８５）；および免疫化学的あるいはその他の親和性反応によって、核酸を検出可能とする核酸断片の種々の化学的修飾法：例えばチェ／ら（ＴＣｈａｎａｔ　ａｌ、）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　、　Ｖｏｌ　、　８１　ｒ　ｐｇｓ。

３４６６−３４７０（１９８４）；リチャードソンら（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ　　ａｔ　　ａｌ、）、　Ｎ５ｃｌａｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　ＲｇｓｇａｒｃｈｐＶＯｌ、１１．ｐＱＢ、６１６７−６１８４（１９８３）；　　ランガーら　（Ｌａｎｇｍｒ　　ａｔ　　ａｔ、）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、。

ＶｏＬ、７８．ｐｇｓ、６６３３−６６３７（１９８１）ｐ　　プリガテイら（Ｂｒｉｇａｔｉ　　ａｇ　ａｔ、）、ＶｉｒｏｌｏｇｙａＶｏｌ　、　ｌ　２６　＋ｐｇｓ、３２−５０（１９８３）；ブローカーら（Ｂｒｏｋｅｒａｔ　ｃｚｊ、）、Ｎｓｃｌｇｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５−αｒｃｈ、　Ｖｏｌ　、　５　、　ｐｇｓ　。

３６３−３８４（１９８７）；およびバイヤーら（Ｂａｙｅｒａｔ　ａｊ＋）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈａｒｎｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ。

Ｖｏｔ、２６．ｐｇｓ、１−４５（１９８０）などを含んでいる。

プローブは、Ｈ４００コード領域の全領域あるいは主要部分を含むｐｃＤ（ＳＲ α）−Ｈ４００の断片のニック・トランスレーショ／によって調製されるのが好ましい。

例えば、ｐＣＤ（ＳＲα）−Ｈ４００は１Ｍ１０１内で増幅され、臭化エチジウムと混合し、塩化セシウムの平衡化密度勾配遠心によって単離され、ＢａｍＨｌで消化された；そして、Ｈ４００に対するコード領域全長を持つ制限酵素断片は次に、ゲル電気泳動によって分離される。サイズ・マーカーによって容易に同定される）コード領域な含む断片はゲルから抽出され、１種あるいは複数種の標識ヌクレオチド存在下でニック・トランスレーンヨ／にかける：マニアテイスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ａｔ　ａ、１．）、あるいはブリガテイら（Ｂｒｉｇａｔｉ　ａｔ　ａｔ、）　（上述）などがある。取り込まれなかったヌクレオチドを除いた後、プローブを１から５０ｐＰ／ｍｌ（比活性が約１−２Ｘ１０’ｃｐｍ／ μタ　プローブの範囲である）の範囲の濃度で、固定された。、ＲＮＡにかける。

（８０％　Ｔ細胞を含む）上皮血リンパ球＜ＰＢＬｓ　）をアッセイのためのＴ細胞のもととして用いる。ＰＢＬ８は標準的な技術により得られ、例えばポイム（Ｂｏｙｕｔｎ）、５ｃａｎｄ、Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｌａｂ、Ｉｎｖａｓｔ、、　Ｖｏｌ、　２１　（５ｕｐｐｌ。

９７）、７ｇｇ、７７（１９６８）がある。もし必要とあれば、Ｔ細胞を（約９５％に）濃縮した細胞の画分を、標準的な技術な用いて得ることが可能であり、例えばロゼツト形成によるＢ細胞の除去：メリグーメイリングら（Ｇｍａｌｉｇ　−Ｍａｙｌｉｎｇ　ａｔ　ａｔ、　　）、Ｖｏ　ｘ　Ｓａｎｇ　、　ｒ　Ｖｏｌ　。

３３、ｐｇｓ、５（１９７７）がある。一般に、ＰＢムは新鮮な血液からフィコール−ハイバーク中での密度勾配遠心によって得られる。ＰＢＬｓからの−ＲＮＡが、以下の方法によってフ０ロープにハイフ゛リダイゼーションするために固定されていることが好ましい。単離されたＰＢＬｓは、４℃で、終濃度ｌＸｌ０ ”細胞／　ｍｌとなるように溶解緩衝液（０，１４Ｍ　ＮａＣｌ１　、１．５　ｒｎＭ　ＭｇＣ１ｚ　、　１０　ｍｕ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　ｐＨ８，６，０，５％Ｎｏｎ１ｄａ　ｔ　Ｐ　−４０（非イオン性界面活性剤、例えばシグマから入手可能））に懸濁することにより溶解する。この懸濁液な０秒間ポルテックスミキサーにかげ核を沈澱させる（１３，０００Ｆ、２５分）。

その結果生ずる細胞質溶解液な次に、０．３容の２０Ｘ、ＳＳＣ（１ｘ　５ＳＣ −０，１５＃　ＮａＣｊ；）　、　０．０１５＆　　クエン酸三すトリウム（標準的な塩類クエン酸）および、０．２容の３７Ｘ（Ｗ／Ｗ）７オルムアルデヒドを含む滅菌したｌ、　５　ｍｌ試験管に移す。反応液を次に６０℃で１５分イキュベーションし、小分けにして一７０℃に保存する。分析には、各々の試料１５ μｌをＯ，ｌ　ｒｎｌ容量の９６穴平底ミクロ・タイター板（フアシヨン、ベクトン・デイソキンノン、オソクスナード；　Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｇｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＋０ｚｎａｒｄ、　ＣＡ　）で１５×ＳＳＣにより順次３倍に希釈する。各々の希釈液を、９６倍マニホールド装置（シュライヒャー＆シュエル；　、５ｃｈｌａｉｃｈａｒ　ａｎｄ　Ｓｃｈｕｇｌｌ　）ヲ用いて、Ｆ紙（ホワットマン３　ｗ　Ｃｌデ、ホワットマン、クリ７トン；　Ｗｈａｔｔｎａｎ　Ｉｎｃ、　＊Ｃ１１ｆｔｏｚ　ＮＪ）で支持したニドラン（シュライヒヤー＆シュエル、キーネ；　Ｋｍａｎａ、ＮＨから入手できる修飾されたナイロン支持体；０．４５μｍ孔径）シートに吸引しながらのせる。ニドラン祇を次に加熱（８０℃で２時間）し、５０％フォルムアミド（ＢＲＬ、　　ガイーｔ！ルス７’ルグ；　Ｇａｉｔｈａｒｓｂｕｒｇ％ＭＤ　）。

６　ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ，５０ｐＰ／　ＩｌｌのＥ、Ｃｏ１１　ｔＲＮΔ（ジグ？　）　、０．２％（Ｗ／Ｖ　）のフィコール（Ｍｗ−４００，０００）とポリビニルピロリドンおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）からなるプレノ・イブリダイゼーション溶液で処理する。プローブは、プレノ・イブリダイゼーション溶液１　ｍｌ当り約５０　ｎＰ　プローブの濃度でニトラ／支持体にかけた。ノ・イブリダイゼーシｉノに続き、支持体’１２Ｘｓｓｃ中、室温で２回１５分間洗浄し、次Ｋ　２　ｘ　Ｓ　５Ｃ１０，５％、ＳＤＳ中、６０℃で３０分、２回洗浄する。次に、支持体を増感紙な用いてフィルムに当て、レーサー・デンシトｉ−ター（例えばウルトロスキャｙ　ＸＬ　；　ＵＬｔｒｏｓｃａｎＸＬ、ＬＫＢ機器、ガイセルプルグ　ＬＫＢ　Ｉｎ５ｔｒｓｔｎｅｎｔｓＩｎｃ、、　Ｇａｉ＊ｈａｒｓｂｓｒｇ　ＭＤ　）で走査することに、よって定量する。

もし、細胞質のドツト・ノ・イブリダイゼーションが充分な感受性を持たなげれば、プロッティングの前にＰＢＬｓからＲＮＡをはじめに抽出する。例えば、ＲＮ　ＡはＢｉｏｃｈｅｒｎｉｓｒ、ｒｙｆｏｌ　　１８　、　ｐｇｓ、　５２９４−５２９９（１，９７９）においてチャーブウィンら（Ｃｈｉｒｇｓｏｉｎａｔ　ａｘ−）によって開示されたグアニジウム・チオシアネート法によって抽出されるかも知れない。

出願人は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクンヨン、ロックビル、ＨＤ、米国（ＡＴＣＣ）に、寄託番号６７６１４で、ｐｃＤ（ＳＲα）４４００をもつＥ、ｃｏＬｉＪＭｌｏｌを寄託している。この寄託は、微生物の寄託に関するブダペスト条約のもとでなされた。

浄書（内容に変更なし）手続補正書防式）％式％１、事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ８９１００４８８２、発明の名称Ｔ細胞活性化マーカー３、補正をする者事件との関係　　　特許出願人住所名　称　　シエリング・バイオチック・コーポレーション４、代理人住　所　　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区５、補正命令の日付　　平成　３年　５月１４日　（発送日）６、補正の対象図面翻訳文（Ｆｒｃ３．す国際調査報告１＋＋ｌａＭｔｌｌｌｌ鴫１ム・肯詐齢−ＰＣＴ／ＵＳ　　８９１００４８８国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．以下のアミノ酸配列：【配列があります】により定義されるオープン・リーデイング・フレームによつてコードされる成熟型ポリペプチド。
２．以下のアミノ酸配列：【配列があります】により定義される、請求項１に記載の成熟型ポリペプチド。
３．成熱型Ｈ４００の免疫原性ペプチド。
４．ペプチド〔Ａｌａ１−Ｓｅｒ２０〕６−２０および〔Ｔｈｒ４３−Ａｓｎ６８〕６−２４から選択された、請求項３に記載の免疫原性ペプチド。
５．Ｈ４００をコードすることのできる−群の核酸から選択された核酸。
６．以下のアミノ酸配列：【配列があります】により定義されるオープン・リーデイング・フレームの成熟型ポリペプチドをコードすることのできる、請求項５に記載の核酸。
７．以下のヌクレオチド配列：【配列があります】により定義される、請求項６に記載の核酸。
８．タンパク質Ｈ４００に特異的な抗体。