JPH03503757A - タンパク質およびその誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３４、トロンビンに高い親和力で結合することにより定義されたヒトトロンボモ デュリンとほとんど同じ生物学的活性を有するタンパク質であって該タンパク質 とトロンビンとの複合体へプロティンＣを活性化しうる能力を付与しうる力を有 するタンパク質を製造する方法であって、ａ）細胞へ請求項３１に記載のベクタ ーを挿入し、ｂ）前記細胞を適当な培地中で増殖し、そしてｃ）前記ベクターで エンコードされそして前記細胞により作られるトロンボモデュリン活性を有する タンパク質生成物を単離する ことからなる前記タンパク質の製造方法。

３５、前記細胞がバクテリア細胞、酵母細胞、真菌細胞または哺乳動物細胞、好 ましくは哺乳動物細胞である請求項３４に記載の方法。

３６、生理学的に許容されうるキャリヤーまたは賦形剤と組合わせて請求項１〜 １６のいずれかによるタンパク買掛なくとも１つまたはその生理学的に適合なそ の塩もしくはエステルを含む医薬品。

３７、生理学的溶液の形の請求項３６に記載の医薬品。

３８、トロンビン症状の治療または予防のための請求項１〜１６のいずれかに記 載のペプチドまたは請求項３６または３７に記載の医薬品の使用。

３９．請求項１〜１６のいずれかに記載のタンパク質受なくとも１つまたは請求 項３６または３７に記載の医薬品の有効量を哺乳動物へ投与することからなる哺 乳動物におけるトロンビン症状の治療方法。

４０、請求項１〜１６のいずれかに記載のタンパク質受なくとも１つまたは請求 項３６または３７に記載の医薬品の有効量を哺乳動物へ投与することからなる哺 乳動物におけるトロンビン症状の予防方法。

４１、血液との接触および／または哺乳動物の身体への挿入および／もしくは埋 込みのために考案された製品に塗布するための請求項１〜１６のいずれかに記載 のペプチドの使用。

４２、血液との接触および／または哺乳動物の身体への挿入および／もしくは埋 込のために考案された製品であって、請求項１〜１６のいずれかに記載のペプチ ドを含む組成の被膜を有する製品。

浄書（内容に変更なし） 明　　　細　　　書 タンパク質およびその誘導体 本発明は組換体ＤＮＡ技術により作られる真正で変更されたヒトトロンボモデュ リン、これらの分子をコードするＤＮＡ配列、これらの分子を含有する医薬品お よびトロンビンエピソードの治療および予防のためのヒト治療ならびに予防にお けるこれらの使用に関する。

発明の背景 血液凝固は化学的増幅の古典的例である。凝固において鍵となる物質たとえば血 小板、Ｘ■および／または■因子の最小限の刺激が血液の完全なゲル化を誘発す ることができる。

増幅は一連のタンパク質加水分解活性化物たとえば凝固因子ｘｎ、■、■、Ｘ、 Ｖおよびプロトロンビンにより仲介され、これはプラズマ中でフィブリンを析出 し細胞要素を閉じ込めることになる。しかしながら、血液凝固は前凝固刺激と釣 合いをとる他の相互反応により調整されそして局所の生理学的必要性に対しもと もと危険な段階式反応と一致させなければならない。これらの影響なしで、開始 された凝固は逃げ去りそして散在的静脈内凝固が起こるであろう。

血管の内側被膜を形成する内皮細胞は潜在的抗血栓症物質の１つの供給源である 。内皮表面上のヘパリンスルフェートは幾つかのレベルで凝固過程を阻害しうる アンチトロンビン■を非常に強化する。

組織プラスミノーゲンアクチベーター、別の血液流動性調節要素は一定の刺激後 向皮細胞から遊離しそしてすでに形成されたフィブリン繊維を再溶解する反応を 開始する。

第三の例は、この発明が向けられるものであるが、トロンボモデュリンである。

トロンボモデュリンは内皮および特定の他の細胞の表面上の糖タンパクであり凝 固の調節に寄与するものである（ダプリュ’オウエンＷ、０ｉｎｅｎおよびシイ 、エスモンＣ，Ｅｓｍｏｎ、　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｓ、　％瓜：　５５３２−５５３５　ｉエヌ、エスモンらＮ 、Ｅｓｍｏｎ　ｅｔａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５７　：　８５９ −８６４．１９８２　；また、エル、クローズＬ、Ｃ１ｏｕｓｅおよびビイ、コ ンブＰ、Ｃｏｍｐ、　Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ。

３１４　：　１２９８−１３０４．１９８６参照）。これは凝固カスケードの終 りから２番目でトロンビンと化学量論的に結合し、そしてそのタンパク質加水分 解特異性を変える。通常、トロンビンはフィブリノーゲンを不溶性フィブリンへ 変える。これはまたＶ因子および■因子をそれぞれＶａ因子および■ａ因子へ活 性化し、これにより陽性のフィードバックにより凝固を強化する。トロンボモデ ュリンと結合後、新しい活性が突出するようになる：トロンビンートロンボモデ ュリン複合体はプロティンＣを活性化する。活性化プロティンＣ（ＰＣａ）はプ ロティンＳと組合わせて活性化Ｖａおよび■ａ補助因子を分解し、したがって凝 固を止める（アール、マーラーらＲ，Ｍａｒｌａｒ　ｅｔａｌ、、　Ｂｌｏｏｄ 　５９　：　１０６７−１０７２．１９８２）。活性化プロティンＣはまたプラ スミノーゲンアクチベーター（ＦＡＩ）の阻害物質を分解しこれにより繊維素溶 解を促進する（ブイ・ファンヒンスブルグらＶ、　ｖａｎ　）Ｉｉｎｓｂｕｒｇ ｈ　ａｔ　ａｌ、、　Ｂｌｏｏｄ　６５　：　４４４−４５１＋１９８５）。同 時にトロンボモデュリンとトロンビンの間の相互作用は明らかにトロンビンのフ ィブリノーゲン、活性化Ｖ因子および集合した血小板を固まらせる能力を低下さ せる（シイ、エスモンら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５７　：　７９４４− ７９４７．１９８２、エヌ、エスモンら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５８　 ：　１２２３８−１２２４２．１９８３）。

要するに、トロンポモデュリンとの相互作用はトロンビンを凝固前駆体から抗凝 固剤へ変えそして繊維素溶解作用に変えるものである。トロンボモデュリンの効 果は劇的であり、これはＰＣａの形成を１００から２００００倍に促進する。実 際、トロンビンートロンボモデュリン複合体は公知のプロティンＣの断然強力な アクチベーターであり、たぶんただ１つのまたは重要な生理学的関連物質である 。

トロンビンートロンボモデュリン複合体により開始されそしてプロティンＣによ り仲介される陰性のフィードバックループはインビボで非常に重要なものである 。恐らく異型接合性遺伝子欠乏のためと思われるプロティンＣ欠乏を部分的に有 するヒトは静脈内血栓形成のエピソードを時々有する（エル、クロウズＬ、Ｃ１ ｏｕｓｅおよびビイ、コンブＰ、Ｃｏｍｐ、同上）。

完全なプロティンＣ欠乏を有する患者の運命はより厳しい。

彼らはプロティンＣ−豊富濃厚物で処置しない限り多くの血栓症状により幼児の ように死亡する。

したがって、トロンボモデュリン開始フィードバックは身体の止血機構において 重要な調節機能を果すことが明らかである。この観点にしたがえば、溶解された トロンボモデュリンはインビトロで抗凝固作用を有する。界面活性剤により溶液 に保持される、はぼ４ｎＭの濃度がヒト血漿の部分的トロンボプラスチン時間を ２倍にするために報告されている（ニス。

クロサワＳ、Ｘｕｒｏｓａｗａおよびエヌ、アオキＮ、Ａｏｋｉ、　Ｔｈｒｏｍ ｂ。

Ｒｅｓ、　３７　：　３５３−３６４．１９８５）。

トロンポモデュリン分子 ヒトトロンボモデュリンは胎盤から精製される（エイチ。

サレムら）１．ｓａｌｅｍ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５ ９　：　１２２４６−１２２５１　；ニス、クロサヮおよびエヌ、アオキ、同上 ）。簡単に言えば、方法は膜の製造、非イオン系界面活性剤中での可溶化および そのプロテアーゼ活性がジイソプロビルホスホフルリデートにより破壊された固 相トロンビンにおいて２回のアフィニティクロマトグラフィからなる。精製は両 方とも追加工程、すなわちイオン交換クロマトグラフィまたはサイズ排除クロマ トグラフィのいずれかを含む。

トロンボモデュリンは非常に安定な糖タンパクである。活性は、１％ＳＯＳ、８ Ｍウレア、ｐＨ２、ｐＨ１０で処理し、または１０分間沸とうさせてもサンプル から定量的に回収されうる。

しかしながら、メルカプトエタノールまたはペプシンでの処理は完全に活性を破 壊する。分子は界面活性剤の不存在下では非常に可溶性が低い。

トロンポモデュリンの精製した標品はゲル電気泳動において１つの優勢なバンド を示す。生物学的活性はゲルから回収されそしてバンドと一致する。電気泳動移 動度はだいたい分子量８８−１０５．０００ダルトンに相当するが、しかし推定 値はゲルシステムに応じてむしろ明らかである。等電点は低く、はぼ４である。

推定されたアミノ酸組成は公表されている（ニス、クロサワおよびエヌ、アオキ 、同上）が、詳しい特徴は少量の物質により重大に妨害された。

他の種類からのトロンボモデュリンの研究は上記記載を非常に強固にする（エヌ 、エスモンらＮ、Ｅｓｍｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、ｂｔｏｌ。

Ｃｂｅｍ、　２５７　：　８５９−８６４．１９８２）。さらに、最近の結果は ヒトトロンボモデュリンの分子特性にさらに光を与える。Ｃ−末端側の半分から なるウシトロンボデユランの部分的ｃＤＮＡ配列はこの部分がＬＤＬレセプター とある程度類似していることを示す（アール・ジャックマンら、Ｒ，Ｊａｃｋｍ ａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８３　：　８８３４−８８３８．１９８ ６）。はぼ２４０個のアミノ酸領域はシスティン残基を含みその間隔は表皮成長 因子（ＥＧＦ）に似た６単位のフォーメーションと一致する。この領域にはＮ− 結合したグリコジル化のための２つの潜在的部位がある。またこれはセリン、ト レオニンおよびプロリン残基に冨む５６個のアミノ酸の領域により部分的にオー バーラツプされ、ＬＤＬレセプターとの類似においてＯ結合した糖鎖を有するで あろう。次いでたぶんトランスメンプラン領域を表わす２４個の疎水性アミノ酸 の一つづきが続き、そして最後に多価陽電荷残基で始まる５６個のアミノ酸セグ メントであってたぶん短かい細胞質ドメインを表わすものが続く。以下に記載し たように、我々の結果はヒトおよびウシトロンボデユランが少なくとも一部分類 似することを示している。

ウシトロンボデユランは最近イオン交換によりその抗凝固特性に差がある酸性お よび非酸性フラクションに分離された（エム、シイ、ボウリンらＭ、Ｃ，Ｂｏｕ ｒｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　影葺５９２４−５９２８．１９８６） 。両方のフラクションはプロティンＣ活性化に必要なトロンビン補因子活性を含 有していた。さらに、酸性フラクションはトロンビンによるフィブリノーゲン凝 固を予防しそしてヘパリンと同様の方法で抗トロンビンによるトロンビン中和を 促進する。２つの後者の特性はポリカチオンポリブレンによりおよびヘバリナー ゼにより廃止される。これらの結果は直接および間接トロンビン中和活性がペプ チド鎖の第二グリコジル化によるものであり、一方プロチインＣコアクチベータ ー活性がそうでないことを示している。

国際特許出願ＮαＰＣＴ　ＪＰ８６１００３３０（Ｗ０８７１０００５０）にお いてはヒト肺から単離されたトロンポモデュリン活性を有する化合物の作成が言 及されている。

特定の問題が今までひどく抗凝固剤としてトロンボモデュリンの使用を妨害して きた：１）分子がヒトの一次的材料から制限された純度の最小限量で入手できる のみである。２）分子が界面活性剤の存在下で可溶性であるだけである。

これらの問題はトロンボモデュリンが臨床的に有用となり得る前に解決されなけ ればならない。さらに、特定の生理学的構造に分子の目標を置くことによりトロ ンボモデュリンの特異性を増強することが好ましい。

この点に関しトロンボモデュリンの可溶性形態の存在が存在することを示したこ とを記すことが興味深い（エイチ、イシイＨ，ｌ５ｈｉｉおよびビイ、ダブリュ 、マジェラスＰ、Ｗ、Ｍａｊｅｒｕｓ。

Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　７６　：　２１７Ｂ−２１８１，１９８５）。

著者はまた可溶性トロンボモデュリンの組成についても推測しそして膜結合ドメ インを有しないトロンボモデュリンの合成から生じうろことを言及している。

ここにおいて、本発明の発明者により、適当な宿主でヒトトロンボモデュリンの 遺伝子を発現するＤＮＡ組換技術を使用することによりそして天然産生ヒトトロ ンボモデュリンに固有の欠点を排除および／または攻撃によりその使用を増加す るために前記遺伝子を変更することにより前記問題を解決した。

定義 本発明を説明する前に以後使用する特定の用語の定義を説明することがその理解 を助けることになるであろう。

相補的ＤＮＡすなわちｃＤＮＡ　：　ｍＲＮＡ鋳型に存在する配列から酵素的に 合成されるＤＮＡ分子または配列。

ＤＮＡ構築物：　ＤＮＡ分子またはこの分子のクローンで、−末鎖または二本鎖 であり、これは自然に生ずる遺伝子から一部を単離したものまたはそうでなけれ ば自然に存在しない方法で組合わせおよび並べられるＤＮＡセグメントを含有す るために変更されたものである。

プラスミドまたはベクター：宿主細胞へ挿入したときその複製を提供しうる遺伝 子情報を含むＤＮＡ構築物のプラスミドは一般に宿主細胞に表現されるべき少な くとも１つの遺伝子配列、ならびにプロモーターおよび転写開始部位を含むこの ような遺伝子発現を促進する機能をエンコードする配列を含む。これはまた線吹 または閉じた環状分子である。

結　合：ＤＮＡ配列は１つの配列の５′および３′端部が隣接する配列のそれぞ れ３′および５′端部とホスホジエステル結合により接続するとき結合すると言 われている。結合は平滑末端または接着末端の連結のような方法により、ｃＤＮ Ａクローニングを介して結合配列の合成によりまたは直接突然変異誘発方法を介 して配列を除去または挿入することにより達成される。

プレプロ領域二特定タンパク質の前駆体のアミ酸末端に一般に生じ、そして分泌 の間少なくとも一部が一般にタンパク質から開裂するアミノ酸配列。プレプロ領 域は細胞の分泌経路へタンパク質を向ける配列からなる。

ドメインまたはモジュール：タンパク質分子のアミノ酸の三次元、自己組立て配 列であって該タンパク質の特定の生物学的活性に必要な構造要素を含むもの。

凝固と繊維素溶解の特別な関連性とともにドメインとモジュールのさらに別の定 義および別の参考は、フィンガー、増殖因子領域、クリングルスおよびビタミン に一依存性ガンマカルボキシル化領域を含めて次のものを参照せよ：エル、バニ アルらり、Ｂａｎｙａｌ　ｅｔ　ａｌ、、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒ　１６３　 ：　３７−４１．１９８３およびエル、パティＬ、Ｐａｔｔｈｙ、　Ｃｅ１ｌ　 ４１　：　６５７−６６３．１９８５゜トロンボモデュリン活性 トロンボモデュリンは３つの分れた活性を有する。第一に、これはトロンビンと 高い親和性で結合する。第二に、これは特異的にトロンビンートロンボモデュリ ン複合体へプロティンＣを活性化しうる能力を与える。第三に、この結合は複合 化トロンビンの反応性を変えて、フィブリノーゲン、血小板およびアンチトロン ビンを含む幾つかの異なった成分にする。

本発明の目的のために、我々はトロンボモデュリン活性がこれらの活性の第一お よび第二に相当し、第三の型の活性を無視すると考えるべきである。したがって 、トロンボモデュリン誘導体または一般にトロンボモデュリンは、これらが結合 したトロンビンの別の反応性を変化させるかどうかにかかわらず、もしこれらが プロティンＣコアクチベーター活性を有するならば、活性であると考えられる。

プロティンＣの活性化 プロティンＣは分子量はぼ５７，０００ダルトンを有する二本鎖糖タンパクであ る。軽い鎖と称する１つの鎖はアミノ末端ガンマカルボキシル化領域とそれに続 く表皮成長因子（ＥＧＦ）と類似する２つのドメインとからなる。重い鎖と称す る他の鎖はセリンプロテアーゼドメインを含む。プロティンＣの活性化は重い鎖 における１つのペプチド結合、Ａｒｇ−１２とＬｅｕ−１３の開裂からなる。こ れがトロンビンートロンボモデュリンによる触媒作用が大いに促進され、一般に １００〜２０．０００倍にする反応である。実際に、トロンビンートロンボモデ ュリ”ｉ？１体は公知であるプロティンＣの非常に強いアクチベーターであり、 そしてただ１つの生理学的関連物である。

本発明の記載 １つの見地において本発明は、本明細書においてトロンボモデュリンおよびその 誘導体からなるトロンポモデュリンと称する一部の化合物に関する。本発明トロ ンボモデュリンのすべては、上記で言及しそして以下にさらに詳細に特定される であろう共通のある種の特徴を有する。

前記トロンボモデュリンが凝固の治療管理に有用であろうことは予見されている 。患者におけるトロンボモデュリンの量を増加することにより、プロティンＣの 活性化を増強しこれにより患者の抗凝固能力を強力にすることができるであろう 。

本発明のトロンボモデュリン誘導抗凝固剤が非常に良く知られた抗凝固剤たとえ ばヘパリンおよびビタミンに拮抗薬より優れていることは予想できる。これらの 良く知られた抗凝固剤は凝固カスケードの幾つかのレベルで妨害しそして合成を 阻害しまたは凝固因子活性を阻害することにより通常の凝固メカニズムを妨げる 。さらに、ビタミンに拮抗剤はガンマカルボキシル化タンパク質の形成を無差別 にブロックすることによりプロティンＣの生理学的抗凝固反応を減らし、そして 一般には皮膚の壊死として徴候が表われる血栓症エピソードが抗ビタミンに処置 の初期に生じる（ニー、プレツクマンこれと対照的に、トロンボモデュリンはＦ ＡＩおよび活性化Ｖａおよび■ａ因子の生き残りを制限することにより天然の抗 凝固および繊維素溶解メカニズムを強固するであろうが、しかし血漿中の凝固因 子の集団はほとんどそのままにする。

活性度と同じ位い高いであろう空間特異性はトロンビンの局所形成に依存し、そ して全身的活性度はしたがってごくわずかである。本発明のトロンボモデュリン の抗凝固活性は止血栓の形成を直接妨害するものでもなくフィブリンの構造を変 化させるものでもない。それゆえエピソード流失の形の合併症が通常の抗凝固物 質の使用と比べてより少ないことが期待される。

トロンボモデュリンは、出血の危険が増大した患者またはそのような危険を受は 入れることのできない患者における抗凝固剤として特に有用である。このような 患者には、最近脳血管における血栓が原因で発作を受けた者、最近外科手術を受 けた者、または出血の潜在的供給源（腫瘍、ガン等）を有する者が含まれる。

本発明はさらに図面および例を参考にして以下に詳述するが、添付の請求の範囲 に定義される本発明の範囲がこれらにより限定されるものではない。

図面の簡単な説明 図において 第１図は、ヒトトロンボモデュリンｃＤＮＡクーロンを同定するために使用され る６０量体ＤＮＡプローブの配列を示す。

第２図は、ウシトロンボモデュリン（Ｂ　）　ｃＤＮＡ　（ヌクレオチド８５０ 〜１０３５）　（ジャックマンらＪａｃｋ＋＋＋ａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ＰＮＡ Ｓ、　ＵＳＡｉ　：　８８３４−８８３８．１９８６、第３図）およびヒトトロ ンボモデュリン（Ｈ）　ｃＤＮＡクローン９２．１Ｃ本発明）における相当する 領域からの推測されたアミノ酸配列を存するＤＮＡ配列の列を表わす。強い相同 性（囲み線で示される）が分子のこの部分に見られ、これはトランスメンプラン 領域を含む。

第３図は、ウシトロンボモデュリンＣＢ）ｃＤＮＡ（ジャックマンら、ＰＮＡＳ 、　ｌｌ５Ａ、邸：　８８３４〜８８３８．１９８６、第３図）およびヒトトロ ンボモデュリン（Ｈ）ｃＤＮＡクーロンｐ２．Ｈ本発明）における相当する領域 から推測されるアミノ酸配列を有する一連のＤＮＡ配列を示す。２つの領域（ウ シヌクレオチドＮα１〜６６および１４５〜１８６）が比較され、そして２つの 分子間の同一部分を取り囲む。

第４図はクローン２２．１からのヒトトロンボモデニリンｃＤＮＡ配列（本発明 ）を示す。配列はウシｃＤＮＡ配列（ジャックマンら、ＰＮＡＳ、　ＵＳＡ、益 ：　８８３４−８８３８．１９８６．、第３図）の３′未翻訳化部分におけるヌ クレオチド１７５４〜２１２３　（３６９ｂｐ　）に相当する３６５ｈｐを示す 。

第５図はヒト細胞系Ａ３４９　ｍＲＮＡのＲＮ　Ａプロット分析を示す。２つの 異なった標品からのｍＲＮＡ　５ｇを１％アガロースゲル上で分離し、ニトロセ ルロースにプロットしそしてプラスミド２２．１からのニンクートランスレーシ ョン化制限断片を用いてハイブリッド形成する。公知ＤＮＡのヌクレオチド長さ を示す。

第６図は、Ａ、ＢおよびＣのマークを付けた選択されたドメインを有するヒト組 織プラスミノーゲンアクチベーターのアミノ酸配列を示す。

第７図は２２．１における３６４０ｂｐ挿入のＤＮＡ配列を示す。

アミン末端におけるそのシグナルペプチドを有するヒトトロンボモデュリンのア ミノ酸配列がこれらの１文字記号で示されるすべてのアミノ酸残基とともに示さ れる。

第８図はプラスミドｐＢｏｅ１７４３−２−９−８のＢａ＋ｗＨＩ挿入の配列を 示す。合成オリゴヌクレオチドから構築された領域に水平矢印でアンダーライン を引く。エンコードされたヒトｔＰＡシグナルペプチドおよびヒトトロンボモデ ュリン突然変異体のアミノ酸配列はすべてのアミノ酸残基の１文字コードにより 示される。幾つかの制限エンドヌクレアーゼ識別部位を示す。

第９図は哺乳動物発現ベクターｐＢｏｅｌ−ＴＭ　１の構築を示す。

第１０図は哺乳動物発現ベクターｐＢｏｅｌ−ＴＭ　２の構築を示す。

発明の詳細な説明 その主な１つの見地において、本発明はトロンビンとの強い親和性結合力で定義 されるトロンボモデュリン活性を有する一部の化合物、およびこのような化合物 とトロンビンとの複合体へプロティンＣを活性化する能力を付与する力を持ち、 次の構造要素２つ以上を分子のＣ末端部分から有する：ａ）はぼ５６個のアミノ 酸の短かい細胞質ドメイン、ｂ）はぼ２４個のアミノ酸のトランスメンプラン領 域、Ｃ）セリン、トレオニンおよびプロリン残基に富む領域、ｄ）少なくとも２ つのＥＧＦドメインからなるドメイン、および ｅ）Ｎ−末端 であって、その際要素ａ）、ｂ）および／′またはＣ）の１つ以」二は削除され るかまたは親和性付与部分または生理学的溶液における溶解性を増強する部分に 替えられてもよく；またはこれらの生理学的に匹適する誘導体に関する。

この点において、本発明はトロンボモデュリン活性を有する分子を記載しており 、これは生理学的溶液中の真正なヒトトロンボモデュリンと比較して向上した溶 解特性を与えられている。本発明の他の分子はインビボでの特異的組織構造に対 する親和力を与えられているかまたは表面または他の分子もしくは存在物との連 結を与えられている。

このような変更トロンボモデュリンはヒトトロンボモデュリンのアミノ酸配列の 一部を有するが、しかし疎水性メンブランスバニング領域の一部またはすべてを 含むＣ−末端部分が欠失するかまたは親和性付与物により置換される。

ヒトトロンボモデュリン配列を終結させる１つの好ましい部位は第２図の旧５− １２〜Ｇｌｙ−１４に相当する疎水性メンブランスバニング領域の開始点である （第７図）１ｉｓ−５１４〜Ｇｌｙ−５１６（塩基１６７０−１６７８）に相当 ）。

ヒトトロンボモデュリン配列を終結させる第二の好ましい部位は増殖因子ドメイ ンの配列のＣ−末端にある。

さらに好ましい実施態様はＥＧＦドメインの数が４と等しいかまたはそれ以上で ある領域ｅ）およびｄ）だけを含む分子からなることである。

このことは、ヒトトロンボモデュリン配列が２つの最初の増殖因子ドメインのい ずれかのＮ−末端で終結し、Ｃ−末端で疎水性のメンプランスパニング領域の開 始、または増殖因子ドメイン４．５または６のいずれかのＣ−末端であることが さらに好ましい実施態様であることを示している。

変更したトロンボモデュリンは同時に、これらがＮ−またはＣ−末端延長部とし て新規の好ましい異種構造のタンパク質ドメインであって前記ドメインが特定の 生理学的構造物すなわちフィブリン凝固、メンプラン表面、レセプター分子また は細胞質外マトリックス成分に対し好ましい親和力を有するものを備えている点 で融合タンパク質であるかもしれない。

ヒトトロンボモデュリン配列を適当な異種構造ドメインと融合するための１つの 好ましい部位は、第２図における旧５−１２〜Ｇ１ｙ４４に相当するメンプラン スパンニング領域の出発点である。

ヒトトロンボモデュリンを適当な異種構造ドメインと融合するための第二の好ま しい部位は、増殖因子単位配列のＣ−末端である。

ヒトトロンボモデュリンを適当な異種構造ドメインと融合するためのさらに好ま しい部位は増殖因子ドメイン１．２または３のいずれかのＮ−末端または増殖因 子ドメイン４．５または６のいずれかのＣ−末端である。

生理学的構造物に特異的親和力を有するドメインであって融合相手として適当で あるものは増殖因子モジュール、クリングル、フィンガーモジュール、ビタミン に一依存性カルシウム結合ガンマカルボキシル化領域、および抗体誘導、抗原− 識別構造体を包含する。

生理学的構造体に親和力を有する好ましい異種構造ドメインは組織ブラスミノー ゲンアクチベーターおよびフィブロネクチンのフィンガーモジュール、ウロキナ ーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーターおよびプロティンＣの増殖因子モジ ュール、組織プラスミノーゲンアクチベーターのクリングルモジュールおよびプ ラスミノーゲンの１番目、４番目および５番目のクリングルモジュールを包含す る。

本発明の１つの特定実施態様において、変性トロンボモデュリンは、第２図の５ ｅｒ−１３までのヒトトロンボモデュリンのＮ−末端配列、組織プラスミノーゲ ンアクチベーターのフィンガードメイン（第６図における領域Ａ、アミノ酸４〜 ５０を包含する）を含むまで延長されたＣ−末端からなる。これは分子にフィブ リンに対する親和力を付与する。

本発明の第二の特定実施態様においで、変性トロンボモデュリンは第２図の５ｅ ｒ−１３までのヒトトロンボモデュリンのＮ−末端配列と組織ブラスミノーゲン アクチベーターの第二のクリングルドメイン（第６図における領域、アミノ酸１ ７６〜２６３を包囲する）を含むまで延長されたＣ−末端とからなる。

これはまた分子にフィブリンに対する親和力を付与する。

本発明の第三の特定実施態様において、変性トロンボモデュリンは第２図の５ｅ ｔ−１３までのヒトトロンボモデュリンのＮ−末端配列と、組織プラスミノーゲ ンアクチベーターの増殖因子モジュール（第６図における領域Ｃ、アミノ酸５０ 〜８７を包含する）を含むまで延長されたＣ末端とからなる。

本発明の第四の特定実施態様において、変性トロンボモデュリンは、その最後の 増殖因子モジュールの第一のシスティン残基までであるがこれを含まないヒトト ロンボモデュリンのＮ−末端配列、この分子における第一のシスティン残基で出 発する組織ブラスミノーゲンアクチベーターの増殖因子モジュール（第６図にお けるアミノ酸５１）を含むまで延長されたＣ末端とからなる。

本発明の第五の特定実施態様において、変性トロンポモデュリンは、ヒト組織型 ブラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ　）および短かいアダプター配列（第 ８図）とＮ−末端結合した細胞外０−グリコジル化豊富ドメインとともに４つの カルボキシル末端表皮増殖因子ドメインからなる。

六番目の実施態様は上記三番目の実施態様に相当するが、しかし細胞外Ｏ−グリ コジル化豊富ドメインを排除する。

これに代わり、分子が遊離システィン残基、または１つ以上のりシン残基を含む Ｃ−末端延長部を有しインビトロでの共有結合を促進するかまたは簡単にリジン およびアルギニンまたはグルタミン酸またはアスパラギン酸において非常に高い 荷電領域を含み表面との非共を接着を仲介してもよい。

本発明の別の実施態様において、変性トロンボモデニリンは、前出の段落で言及 した切断部位までのヒトトロンボモデュリンのＮ−末端配列であってスペーサー 分子を介してＮ　−末端配列が抗体またはそのフラグメントのような親和力付与 物と結合してなるものである。適当なスペーサー分子および技術の記載について はティジッセンＴｉｊｓｓｅｎ″Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄＴｈｅｏｒｙ　ｏｆ 　Ｅｎｚｙａ＋ｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、オランダ、アムステルダム、エ ルセブール、１９８５またはテンマーク特許出願第１１０７／８７号（これは参 考により編入される）を参照せよ。

第二の主な見地において、本発明は適当な細胞中に完全ヒトトロンボモデュリン 分のすべてまたは一部をエンコードするクローン核酸構築物を発現することによ り真正なならびに上述した変性ヒトトロンボモデュリンを作る手段を提供するも のである。トロンボモデュリンまたはその関連部分は単独でまたは他のドメイン との融合物として発現され生産を促進するか、または上述したような所望する特 別のドメインを提供する。

１つの好ましい実施態様において、本物のまたは変性されたトロンボモデュリン はクローン化した核酸構築物中にヒトトロンボモデュリン遺伝子の天然領域を含 む形でエンコードされ、前記領域は、細胞からの天然タンパク質の輸送に積極的 に含まれそしてついには完全にまたは少なくとも一部が細胞から切り離されるよ うなアミノ酸の発現に原因のあるものである。

第二の好ましい実施態様において、真正なまたは変性されたトロンボモデュリン はクローン化核酸構築物中で組織プラスミノーゲンアクチヘーターのプレープロ 領域を含むブレープロ形でエンコードされる。

第三の主な見地において、本発明は、血栓症疾患を予防または復帰させる点で患 者の治療に有用な、真正または変性トロンボモデュリン含有医薬品を記載するも のである。

本発明のために、ここにおいて出発物質としてｃＤＮＡまたはゲノムクローンを 用いた組換え体ＤＮＡ技術を介して真正なヒトトロンボモデュリンならびに変性 したヒトトロンボモデュリンを作ることが可能になる。

ＤＮＡクローンの完全な配列を決定するための技術および新しく独立してはいる が部分的配列がすでに決定されている類似クローンを得るための技術は当該分野 で良く知られておりたとえばマニアティスらの”Ｍｏ１ｅｃｕｌｌａｒ　Ｃｌｏ ｎｉｎｇ＋　Ａ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｐｒｅｓｓ＋　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、アメリカ、ニュー ヨークのような刊行物に記載されており、これらはここに参考のために編入され る。

好ましい端末化ヒトトロンボモデュリンをエンコードするＤＮＡ配列およびヒｌ −）ロンボモデュリンの一部と他のタンパク質からの好ましい機能的ドメインと の融合物をエンコードするＤＮＡ配列の構築は、ヒトトロンボモデュリンｃＤＮ Ａおよび好ましいドメイン供与分子のｃＤＮＡにおける特定位置に特異的制限酵 素識別部位を導入後に行なうのが最も良い。ＤＮＡ分子の特定位置に制限酵素識 別部位を導入することは、オリゴデオキシリボヌクレオチド指示部位特異的突然 変異誘発についての幾つかの良く知られた非常に効率的な方法（たとえばワイ、 モリナガらＹ、Ｍｏｒｉｎａｇａ　ｅｔ　ａｌ、、　ＢＩＯ／ＴＥＣ）ＩＮＯＬ ＯＧＹ２　：　６３６−６３９．１９８４）の１つを用いて有利に得られる。Ｃ −末端欠失変性ヒトトロンボモデュリンの発生は、オリゴヌクレオチド指示部位 特異的突然変異誘発を用いて得られるのが有利である。疎水性の、メンプラン・ スパニング領域の開始点で終結するこのように好ましい変性ヒトトロンボモデュ リンの１つは、存在するＧｌｙ−コドンＧＧＣ（第２図における塩基Ｎα８８９ −８９１）の位置にストップコドンを特異的に導入することにより構築される。

この同じ突然変異誘発実験においてオリゴヌクレオチドが使用され導入されたス トップコドンへ便利な制限酵素識別部位ちょうど３′を導入しこれによりこの短 かくしたヒトトロンボモデュリンｃＤＮＡの翻訳を用いて別の構築作業を助ける 。ヒトトロンボモデュリンｃＤＮＡの異なった部分および補充されるべき特異的 ドメインからの他のｃＤＮＡの異なった部分を小さなりＮＡベクター（たとえば ｐＵｃ１９．　ｐＢＲ３２２およびｐＧＥＭ３）中でサブクーロンしてから突然 変異誘発を行なう。適当に突然変異を誘発して結合位置に新しい制限部位を導入 後、ｃＤＮＡを順番に配列して突然変異した遺伝子型を確認する。突然変異した フラグメントを次いで発現ベクターにおける連結反応により直接−緒にするかま たは短かい二本鎖合成オリゴヌクレオチドアダプターの使用を介して一緒に結合 する。

これらすべての操作は当該分野でよく知られた手段（ティ。

マニアテイスら、”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ″。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、米 国ニューヨーク、１９８２）を含み、たとえばＤＮＡフラグメントの連結および 別の構築物またはエンコードされた突然変異タンパク質および融合タンパク質の 発現のいずれかのための異なったベクター中でのこれらのクローニングである。

哺乳動物細胞、酵母、真菌および細菌を含む様々な宿主細胞がタンパク質を作る ために使用されうる。しかしながら、培養した哺乳動物細胞が好ましい。１つの 特に好ましい細胞系列はＢＨＫ細胞系ｔｋ−ｔｓ１３（ヴエクタ−Ｗａｅｃｈ　 ｔｅｒおよびバセルガＢａｓｅｒｇａ）、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ　７９　：　１１０６−１１１０＋１９８２）である。これらの タイプの宿主の各々にクローン化遺伝子を発現する方法は当該分野で公知である 。

培養した哺乳動物細胞における変性トロンボモデュリンの発現のために、適当な トランスフェクション法たとえばリン酸カルシウム仲介トランスフェクション（ グラムハＧｒａｈａｍおよびファンデル　ニブＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　Ｖｉｒ ｏｌｏｇＶ　５２　：　４５６−４６７゜１９７３　；ウィグラーら引ｇｌｅｒ 　ｅｔ　ａｌ、による変性として）により細胞へ導入される。ＤＮＡ−リン酸カ ルシウム沈でん物が形成し、この沈でん物を細胞へ施こす。細胞の一部がＤＮＡ を取り込み数日間で細胞内部にこれを保つ。細胞のわずかなフラクションがＤＮ Ａを宿主細胞のゲノムへ組込ませる。これらの組込みは選択可能な表現型（選択 可能なマーカー）を付与する遺伝子とコトランスフェクションすることにより同 定される。好ましい選択可能なマーカーはマウスジヒドロホレートレダクターゼ （ＤＨＦＲ）であり、これは薬剤メトトレキセ−ト（ＭＴＸ）に対する細胞耐性 を付与する。宿主細胞がＤＮＡを取込んだ後、適当なやり方で選択可能なマーカ ーを発現する細胞集団を選択するために薬剤選択を行なう。

トランスフェクトされた細胞により作られたトロンボモデュリン活性化合物はイ オン交換カラムへ吸着させるかまたはアフィニティクロマトグラフィにより細胞 培養基から精製される。好ましいアフィニティカラムの１つは不活性な固定化ト ロンビンを含む（エイチ、サレムらＨ，Ｓａｌｅｍ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、Ｂｉ ｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　２５９　：　１２２４６−１２２５１．１９８４）。別の有利な技 術は、所望のトロンボモデュリンにおける特異的抗原決定基に対し行なわれるモ ノクローナル抗体またはそのフラグメントを用いることである。これらを固相と 結合したアフィニティ試薬として使用して効率の良いカラム精製を付与すること ができる。

モノクローナル抗体の増大、これらのカラムマトリックスへの結合および単離な らびに精製のための抗体アフィニティカラムの使用は当該分野でよく知られてい る。

例１ ヒト細胞系Ａ３４９からのメツセンジャーＲＮＡの調製肺ガン組織（ギヤーらＧ ｉａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、　（１９７２）Ｊ、Ｎａｔｌ、ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ、 　５１　：　１４１７−１４２３）から単離されるヒト細胞系Ａ３４９　（アメ リカタイプ力ルチュアコレクションＣＣＬ　１８５）は１細胞（ｒｅｆ）当りト ロンボモデュリン約１０，０００分子に発現することがわかっている。Ａ３４９ はｍＲＮＡ調製用の供給源として使用された。Ａ３４９は、ｌＯ％ウシ胎児血清 および抗生物質を含むＲＰＭ１１６４０中で全細胞数９．４Ｘ１０’まで増殖し た。

全ＲＮＡをグアニジニウムチオシアネート法（ｇｕａｎｉｄｉｎｕｍｔｈｉｏｃ ｙａｎａｔｅ　ｍｅｔｈｏｄ）　（チルブラインらＣｈｉｒｇｗｉｎ　ｅｔ　ａ ｌ、（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１８　：　５２９３−５２９９） により単離されそしてＣｓＣｊ２グラジェント遠心分離により精製された。ＲＮ Ａ　４ＳＯｎ全量が得られ、そしてｍＲＮＡがオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラ ムの使用により単離した（アヴイブとレーダーＡｖｉｖ＆　Ｌｅｄｅｒ（１９７ ２）ＰＮＡＳ旦：　１４０８−１４１２）。全ＲＮＡ　７５０■から−ＲＮＡ　 ６１ガが得られた（１回）。エタノール沈でん後、ｍＲＮＡのこの調製物を最終 濃度１ｊｔｇ／ｍで１０ｍＭ　）リスＨＣｆ　ｐＨ７，５、０，１＋ｏＭ　ＥＤ ＴＡ−Ｎａｇに再懸濁し、次の用途のために一８０゛Ｃで貯蔵した。

記載したように調製されたＱＩＲＮＡはｃＤＮＡライブラリの構築およびｍＲＮ Ａプロット分析に使用された。

Ａ３４９　ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリィの構築ｃＤＮＡライブラリィを 、オカヤマ０ｋａｙａｎ＋ａとベルブＢｅｒｇにより記載された方法（Ｍｏ１． Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　２　：　１６１−１７０（１９８２）　：　Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　３　：　２８０−２８９（１９８３））により構築した 。

大腸菌に１２（ＭＣ１０６１）　（カサダバンＣａ５ａｄａｂａｎとコーエンシ 、ジエイＣｏｈｅｎ　Ｃ，Ｊ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１３８　：　１７９−２ ０７）を形質転換に使用した。ＭＣ１０６１を３７°ＣにてＬ−ブロス中で０Ｄ ｉａｏ＝　０．５まで増殖した。２０ｄを遠心分離し、細胞ペレットを水冷滅菌 ０、１　Ｍ　ＣａＣｊ２　ｚ　７−中に再懸濁し、水中で３０分間インキュベー トし、簡単に遠心分離し、そして最後に冷却室で一晩維持した。

形質転換−コンピテント大腸菌ＭＣ１０６１の９５１１１をｃＤＮＡ調製物１０ ｍにつき加えた。混合物を水中で３０分間インキュベートし、４３．５°Ｃで４ ５秒間熱シヨツクを与え、最後にＬ−プロス添加後３７°Ｃで３０分間インキュ ベートシた。再懸濁後、細胞をアンピシリン（５０ｘ／ｍ）含有Ｌ−ブロス平板 に薄くかぶせ、３７°Ｃで８時間増殖した。このライブラリィから個々のコロニ ー２、９　ＸＩＯ’全体が得られた。

ヒトトロンボモデュリンをコードするｃＤＮＡコロニーについてのへ５４９ライ フ゛ラリイのスクリーニング４Ｘ１０’の個々のコロニーをニトロセルロースフ ィルターを用いた標準コロニーハイブリッド法（マニアナイスら、同上）により スクリーニングした。ジャックマンら（Ｊａｃｋｍａｎ　ｅｔａｌ、）　（１９ ８６）ＰＮＡＳ　Ｆｊ４　：　８８３４−８８３８が報告しているようにヌクレ オチド５３２〜５９１をカバーするウシトロンボモデュリン配列に相当する第１ 図に示される６０量体オリゴヌクレオチドを合成（アプライドバイオシステム、 ＵＳＡからのＤＮＡ合成機）し、”Ｐ　（Ｔ、ポリヌクレオチドキナーゼおよび Ｔ−”Ｐ−ＡＴＰ使用）で標識化しそしてスクリーニングに使用した。

ハイブリッド形成溶液は６×５ＳＣ１５×デンハート溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ 　５ｏｌｕｔｉｏｎ）、０．０５％ＳＯＳ　（マニアナイスら）および１０”ｃ ｐｍ／ｄを含有した。低緊縮洗浄後、さらに分析のために４つのコロニーを選択 した。プラスミド標品を調製し、Ｈｉｎｄｌｌ！消化を行ない、１％アガロース で電気泳動し、ニトロセルロースフィルター上でプロットし、上記６０量体とと もにハイブリッド形成した。２２．１と称するプラスミドの１つは強いハイブリ ッドシグナルを与えそしてさらに特性表示のために選択した。

２２．１の特性表示 ２２．１は約３．８ｋｂのｃＤＮＡ挿入を有し、そしてこの挿入内で部分的ＤＮ Ａ配列（マキサムとギルバート、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ。

房し４９９−５６０．１９８０　、サンガーらＳａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　 ＰＮＡＳ、　ＵＳＡ７４　：　５４６３−５４６７、１９７７）を別な特性表示 のためおよびクローン同定のために得た。第２図および第３図にウシの選択され た領域（ジャックマンら、ＰＮＡＳ、　ＵＳＡ揖し８８３４−８８３８．１９８ ６、第３図）と２２．１から得られたヒ）　ｃＤＮＡとの間の配列相同性を示す 。アミノ酸同一領域を四角で囲む。第２図から、ウシ配列における２４個アミノ 酸残基長さの推定上のトランスメンプラン領域の中において、わずか２個のアミ ノ酸置換基が同じなだけである。

第４図にｐ２．１の３′未翻訳領域からの配列を示す。分子のこの部分において ウシとヒト配列間のよく保存された領域もまた同一である。

このクローンの完全性を評価するために次の実験が行なわれる。

ヒトトロンポモデュリンｍＲＮ＾のプロッティング分析ヒト細胞系Ａ３４９　ｍ ＲＮＡ　５硝を、２．２Ｍホルムアミド含有１％アガロースゲルを介して電気泳 動により変性３２ｐ−標識化ＤＮＡ分子量マーカー（ＨｉｎｄＩ［［と称するフ ァージλＤＮＡ）とともに分離した（マニアナイスら、“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 ｃｌｏｎｉｎｇ　：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｒｅｓｓ”米国ニューヨ ーク、１９８２）。電気泳動後、ゲルをｌＸ５ＳＣ（１ｘ　ｓｓｃは０．１５０ Ｍ　ＮａＣｆと０．０１５ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）。

である）中で２ｘ１０分間すすぎ、その後シーンスクリーン（Ｇｅｎｅ　５ｃｒ ｅｅｎ）　（ＴＭ）ハイブリダイゼーショントランスファー膜へｍＲＮＡを一晩 １０　Ｘ　ＳＳＣ中でブロッティングした。プロットしたｍＲＮＡを２時間８０ ℃で膜に焼付けた。プレハイブリダイゼーション（５時間）とハイブリダイゼー ション（２０時間）ヲ５０％ホルムアミド；ウシ血清アルブミン、フィコールお よびポリビニルピロリドン各々０．１％、５ＸＳＳＣ，１％ＳＤＳおよび熱変性 サケ精子ＤＮＡ０．５■／ｄ中４２℃で行なった。ハイブリダイゼーションプロ ーブとしてニック−トランスレーションしたｐ２．１　ｃＤＮＡ制限フラグメン トを使用した。ハイブリダイゼーション後、ｍＲＮＡプロットを室温にて２ｘ５ 分で２ｘｓｓｃ中、６５°Ｃにて２　Ｘ５ＳＣ、０，５％ＳＤＳ中２×３０分間 そして室温にて０．　Ｉ　Ｘ５ＳＣ中２×３０分間連続して洗浄した。第５図に この実験からのオートラジオグラフィを示す。レーン１および２は２つの異なっ た標品からのａ＋ＲＮＡを示し、レーン３はＤＮＡ分子量マーカーを示す。この 実験によりほぼ３．８ｋｂ長さのヒトトロンボモデュリンｍＲＮＡが同定された 。

このヒトトロンボモデュリンｍＲＮＡ０サイズから２２．１が十分な長さまたは ほとんど十分な長さのヒトトロンボモデュリンｃＤＮＡ挿入部を含むことが結論 づけられる。

プラスミド２２．１におけるｃＤＮＡの完全な配列が測定（タボ−、ニス、　Ｔ ａｂｏｒ、　Ｓ、およびリチャードソン、シイ、シイ。

Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、　Ｃ，Ｃ，（１９８７）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８４　：　４７６７−４７７１）され、そして第７図に 示す。示された配列に加えて、このプラスミドはｃＤＮＡ挿入部の３′末端にお けるポリ（Ａ）尾部に加えて５′末端にＧ：Ｃホモポリマー尾部の伸長部を含む 。

例２ ヒトトロンボモデュリン変異体 所望のヒトトロンボモデュリン（ｈＴＭ　）変異体はメンプランスバニング領域 を有さない可溶性タンパク質として発現される。このような突然変異株を得るた めに、以下のような段階を行なう。ｐ２．１をＰｓｔＩで消化し、８７０ｂｐフ ラグメント（第７図中ヌクレオチド９５２−１８２１）を単離しそしてｐＧＥＭ 　Ｓ（プロメガバイオチク）中でサブクローンした。ｐＧＥＭ　ａ中のマルチリ ンカ−のＢａｍ８１部位に対し配向したｈＴＭ　ｃＤＮＡにおけるＫｐｎ　Ｉ部 位を存するサブクローンをｐＢｏｅ１７４３−２と称した。

このプラスミドにおける挿入部がオリゴデオキシリボヌクレオチド、Ｎ０Ｒ５７ ０： ５　’　（ＧＡＴＧＧＡＧＡＴＧＣＣＴＡＴＧＧＧＡＴＣＣＴＡＧＧＡＧＴＧＣ ＡＣＧＡＧＣＣＣＣＡＣＧＧＣ）　３　’を用いて突然変異誘発を行なった（モ リナガ、ワイ、ら（１９８４）ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、　　２　：　６ ３６−６３９）。

本発明で記載されるすべての合成オリゴデオキシリボヌクレオチドはアップライ ドバイオシステム社（ＵＳＡ　）製のＤＮＡ合成機で合成され、そしてポリアク リルアミドゲル中で精製されたものである。

この突然変異はグリシン５１６コドンＧＧＣの位置にＴＡＧ翻訳ストップコドン を導入する結果となった。この変化に加えて、オリゴヌクレオチドは新しい翻訳 ストップシグナルに対するＡｐａＬ　Ｉ　（ＧＴＧＣＡＣ）部位ちょうど５′、 ストップシグナルをスパニングするＡｖｒ　ＩＩ　（ＣＣＴＡＧＧ）部位および Ｂａｓ＋ＨＩ　（ＧＧＡＴＣＣ）部位を３′側に導入した。正しい変異体ｐＢｏ ｅ１７４３−２−９はコロニーハイブリダイゼーションおよび適当な制限酵素を 用いたマツピングを介して同定された。

１つの所望のｈＴＭ誘導突然変異体において、発現したタンパク質は細胞外０− グリコジル化豊富ドメインとともにわずか４つのカルボキシル末端表皮増殖因子 類似ドメインを含む。

この突然変異体は次のように生じた。ｐＢｏｅ１７４３−２−９をＢａｍＨＩお よび旧ｎｃｌＩで消化し、そして０．５３ｋｂ　）ｌｉｎｃ　ＩＩ　／−Ｂａｍ ＨＩ断片を単離した。この断片を合成りＮＡと結合し、これはＢａｍＨＩ消化ｐ Ｌｌｃ１３においてヒト組織型ブラスミノーゲンアクチベータ・（ｔＰＡ）（ベ ンニカらＰｅｎｎ１ｃａ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ、　フ狭 ：２１４−２２１）　ｓよび短かいアダプター配列をエンコードした。正しい組 換え体ｐＢｏｅ１７４３−２−９−８が制限酵素消化で同定され、そして合成領 域が配列された。

ｐＢｏｅ１７４３−２−９−８のｔＰＡエンコード領域、アダプターおよび旧ｎ ｃ　Ｉｔ　／　ＢａｍＨＩ断面の７１１ｂｐ配列を第８図に示す。

この図においてすべての合成りＮＡは水平の矢印で示す。

精製、アニーリング、クローニングおよびアダプター断面の０．５３ｋｂ　ｔ（ ｉｎｃ　ＩＩ　／　ＢａｍＨＩ断片に対する連結に使用される方法は、すべて標 準的技術でありそして組換体Ｄ　Ｎ　Ａ技術分野の当業者にはよく知られている ｐＢｏｅ１７４３−２−９−８をＢａｍＨＩで消化し、合成領域に相当する０、 ７１ｋｂをアガロースゲル精製により精製した。この断片をＢａｎ）ｌ　Ｔ消化 Ｚｅｍ２１９ｂ　（米国特許出願第５８０６１号、　１９８７年６月４日に記載 ）中でクローン化し７た。

Ｚｅｍ２１９ｂは噴孔動物発現ベクターであり、これはマウスメタロチオネイン プロモーターおよびヒト成長ホルモンターミネータ−の調節下に挿入されたｃＤ ＮＡを発現する。プラスミドはまたＳＶ４０調節要因の管理下にマウスＤＨＦＲ （ジヒドロホレートレダクターゼ）　ｃＤＮＡを運びこれによりトランスフェク トされた哺乳動物細胞に選択可能なマーカーを提供する。

正しい組換体ｐＢｏｅｌ−ＴＭ　１を単離しそして制限酵素消化で特性表示を行 なった。ｐＢｏｅｌ−ＴＭ　１を大腸菌中で大量に増殖し、超遠心分離によりＣ ｓＣ１／エチジウムプロミド勾配中で精製した。別の所望のｈＴＭ突然変異体は Ｏ−グリコジル化が豊富な領域およびメンプランスパニング領域を有さない可溶 性タンパク質として発現される。このような突然変異体を得るために、次の段階 が行なわれた。ｐＢｏｅｌ、７４３−２をオリゴヌクレオチド、Ｎ０Ｒ５７１： ５　　’　　（ＣＴＣＧＣＣＡＧＡＧＣＣＧＣＴＧＧＡＴＣＣＣＴＡＧＴＣＣＡ ＣＣＴＴＧＣＣＧＧＡ）３　　’で突然変異誘発させた。

この突然変異はグリシン−４８７コドンＧＧＴの位置にＴＡＧ翻訳ストップコド ンを導入する結果となる。この変化に加え、オリゴヌクレオチドが翻訳ストップ シグナルへＢａｌｌ１１　（ＧＧＡＴＣＣ）部位ちょうど３′を導入した。

正しい突然変異体ｐＢｏｅ１７４３−２−１０を、コロニーハイブリダイゼーシ ョン、制限酵素を用いたマツピングおよびＤＮＡ配列決定を介して同定した。

ｐＢｏｅ１７４３−２−１０をＨｉｎｃＩＩとＢａｍＨＩで消化し０．４４ｋｂ 片断をポリアクリルアミドゲル上で精製した。このＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩ消 化およびアルカリ性ホスファターゼ処理Ｚｅｍ２１９ｂ中でｐＢｏｅ１７４３− ２−９−８からの０．１８ｋｂ　ＢａｍＨ１／−Ｈｌｎｃ　ＩＩ断片と結合する とｐＢｏｅｌ−ＴＭ　２が得られた。

このプラスミドの正しい構造は制限酵素消化によりチ、工・ツクされた。ｐＢ＋ ｅｌ−ＴＭ　２は変異体ｈＴＭ前駆体をエンコードし、ここではヒトｔＰＡシグ ナルペプチドの調節下に哺乳動物から４つのカルボキシ末端表皮増殖因子類似ド メインが分泌されうる。

ｐＢｏｅｌ−ＴＭ　２は大腸菌中で大量に増殖し哺乳動物細胞のトランスフェク ションに十分な純度のプラスミドを調製する。

例３ 哺乳動物細胞におけるＴＭ変異体の発現培養されたＢＨＫ細胞（シリアンハムス ター、チミジンキナーゼ変異体系ｔｋ−ｔｓ１３、ヴエクタ−Ｗａｅｃｈ　ｔｅ ｒおよびノイゼルガＢａｓｅｒｇａ（１９８２）、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７９　：　１１０６−１１１０゜アメリカンタイプ カルチャーコレクションＣＲＬ　１６３２）における変異体ｈＴＭの発現のため に発現ベクターｐＢｏｅｌ−ＴＭ　１とｐＢｏｅｌ−ＴＭ　２をリン酸カルシウ ム仲介トランスフェクション法（グラハムおよびファンデルニブ、（１９７３） 、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ。

５２　：　４５６−４６７）により細胞へ導入された。

短期発現 トランスフェクション後４８時間してから、血清不含有ダルベコソコスモデイフ ァイドイーグルメデイウム（ＤｕｌｂｅｃｃｏｓＭｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ 　Ｍｅｄｉｕｍ）　（２５ＤＩＭ　Ｎ　−２−ヒドロキシエチル−ピペラジンＮ ′−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）　、ｐＨ７，４，１０■／！インシユ リン、０．２％ウシ血清アルブミン含有）で各ベトリ皿を洗い、そして同じメデ ィウムで２４時間インキエベートした。使用したメディウムを回収し下記の分析 により７Ｍ活性を分析した。

ＴＭ−変異体製造クローンの選択 トランスフェクション後４８時間してから細胞をトリプシン処理し４００ｍＭメ トトレキセー）　（ＭＴＸ）を含む培地へ入れて希釈した。１０〜１２日後、個 々のコロニーをクローン化して別々に膨らませた。膨張した培養物を上述した血 清不含有培地中で２４時間増殖した、そして生産クローンをプロティンＣコアク チベーター活性について分析を用いて同定した。

プロティンＣコアクチベーター活性 プロティンＣ活性化をポーリンらによる変法（Ｂｏｕｒｉｎ　ｅｔ　ａｌ、）（ Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳ　８３．５９２４（１９８６） ）で測定した。トランスフェクトした培養物からの血清不含有上澄２００　ｍを プロティンＣ４０ｍとトロンビン１０ｉｌ！（最終濃度１団と２０ｎＭ、各々） とともに混合し、そして塩化カルシウムを最終濃度２ｍＭまで添加した。次いで 混合物を３７゛Ｃで３０分間インキュベートし、反応を２００ｐｍｏｌｅアンチ トロンビン■と５Ｕヘパリンで停止させた。５０ｍＭ　）リス、ＨＣＩ！　／　 ０．１　Ｍ　ＮａＣｊ！　、　ｐＨ８，３で容量を６５０　ｄまで調節し、そし て同じ緩衝液中の１　ｍＭ　Ｓ−２２６６（Ｄ〜Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ｐ− ＝トロアニリン、カビビトラムＫａｂｉ　Ｖｉｔｒｕｍ）１００Ｉｌｌを加えた 。

プロティンＣ活性のために４０５ｎｍで増大する吸光度を記録した。標準曲線は 、ウサギＴＭの存在下にトロンビンにより完全に活性化されたプロティンＣの公 知量を用いて確立されこの試験の結果を次の第１表に示す。

第１表 トランスフェクトした培養物の上澄におけるプロティンＣコアクチベーター活性 なし　　　　　　　勾　配　　　　　０．５７Ｍ−１勾配　　　１．７ ７Ｍ−２勾配　　　１．３ なし　　　　　締束細胞　　　　０．３なし　　　　　締束細胞　　　　０．９ ７？Ｉ−１クローン１１．５ ＴＭ−１クローン２６．５ ７Ｍ−２クローン１３．８ ７Ｍ−２クローン２４．８ 表から、本発明の変更トロンボモデュリンがプロティンＣコアクチパーティング 活性を有することが明らかである。

凝固活性の阻害 凝固活性の阻害のために血清不含有組織培養上澄５００ｍを１００ｍＭ　ＮａＣ ｊ２．５０Ｉｌ１ＭトリスーＨＣｌ　ｐＨ７，４に対し、透析した。

ＡＰＴＴ試薬（Ｄａｄｅ）　Ｌｏｏｍを標準クエン酸血漿１００ＪＬｌとともに ３分間３７°Ｃでインキュベートした。透析した組織培養上澄１００Ｉを加え、 その後ただちに３０ｍＭ塩化カルシウム１００Ｊ！１を加えた。

凝集を測定（秒）した。

この試験の結果を次の第２表に示す： 第２表 トランスフェクトした培養物からの透析上澄の抗凝固活性ＤＮＡトランスフェク ト　　培養型　　　　凝集時間（秒）なし　　　　　宿主細胞　　　　２８ 第２表から、本発明の変更トロンボモデュリンを含む上澄に対する凝集時間はト ロンボモデュリンを含まない対称物よりもかなり長くなっていることが明らかで ある。

本発明は特定の実施態様に関連して開示しそして記載したが技術者の理解の範囲 内にあるような等個物および変法を含むものと考えるべきであり、そして本発明 はさらに添付の請求の範囲に関係して理解されそして解釈されるべきものである 。

ＣＹＳ　ＧＬＮ　ＭＥＴ　ＰＨＥ　ＣＹＳ　ＡＳＮ　ＧＬＮ　ＴＨＲＳＥＲＣＹ Ｓ　−５’　　ＴＧＣＣＡＧ　ＡＴＧ　ＴＴＣＴＧＣＡＡＣＣＡＧ　ＡＣＴ　Ｔ ＣＧ　ＴＧＣ−ＰＲＯＡＬＡ　ＡＳＰ　ＣＹＳ　ＡＳＰ　ＰＲＯＨｌｓ　ＴＹＲ ＰＲＯＴＨＲＣＣＧ　ＧＣＴ　ＧＡＣＴＧＣＧＡＴ　ＣＣＴ　ＣＡＣＴＡＣＣＣ Ｇ　ＡＣＣ３’ＡＡＡＡＡＣＡＣｒＡＡＡＡＡ　ＴＡＡＡＡＡ　ＴＧＧＣＣＡＴ ｒ　ＴＧＩ：Ｔｍ”ｒ（：ＡＣ（：ＡＧＡ　ＴＴＴＧＣｒＡＡ　ＴＴＴＡ鰐−＝ 　　−６５５７ ：ｂ−’−”　　−４３７１ ３，１３ｋｂ−１呵−、ｌ１１．、− 輪画、　　−２０２８ ＦＩＧ、　６ ｌ　　　ＡＡにＡＡＧＴＧＴＣＴＧにＧＣＴＣＣＧＡＣににＡＣＡＧＧＡＧＡＧ ＧＣＴ（ＴＣＧＣ（ＡＴＣＧにＣＣ；ＴＣＣＴＧＴＧＣＣＣbＴ　　　　６０ ＬＧＬＯＬＭＣＴＡＰＰＧＡＶＱＧＢＶＡＲＦＩＧ、’７　　　　　　　　　　 つア。

フン１〈 ＦＩＧ、　７ ＦＩＧ、　７　　　　　　　　　　　””３０６１　　　ＴＣＡＧＡＧＡＡＴＴ ＴＣＴＡＣＣＡｍＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＴＴＴＴＧＧＡＡＴＧＴＧにＣＣＣＣＴ ＧＡＡＣＡＡＧＡＡＴsＧ　　　　３１２０ ＦＩＧ、　７ ＦＩＧ、　９Ｂ ＦＩＧ、　１０ 手続補正書（方式） 平成３年６月　６日 特許庁長官　植　松　　　敏　殿 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＤＫ８８１０００８９ Ｚ　発明の名称 タンパク質およびその誘導体 ３、補正をする者 事件との関係　　　　　特許出願人 名称　ノボ−ノルディスク　アクテイーゼルスカブ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、補正命令の日付 平成３年３月１２日（発送日） ６、補正の対象 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「特許出願人の代表者」 の欄 （２）明細書及び請求の範囲の翻訳文 （３）委任状 ７、　補正の内容 （１）（３）　　別紙の通り （２）明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし） ８、　添付書類の目録 （１）訂正した特許法第１８４条の ５第１項の規定による書面　　　　　　　１通（２）明細書及び請求の範囲の翻 訳文　　　　各１通（３）委任状及びその翻訳文　　　　　　　　各１通（４） 資格証明書及びその翻訳文　　　　　　各１通国際調査報告 一＾−鵠■＾−ｅｋｍｍ　Ｎ＠、　Ｐ　ＣＴ　／　Ｄに［１Ｂ１０００８９烏１ ．，１．，２１．１１．ゆ峙＾２．嘗１．１１、〜．．ＰＣＴ／ＤＫ８Ｂ１００ ０８９特表千３−５０３７５７　（１７）

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. １．トロンビンに対する高い親和性の結合により定義されるトロンボモデュリン 活性を有するタンパク質であって、該タンパク質とトロンビンとの複合体にプロ テインＣを活性化する能力を付与する力を有し、そして分子のＣ−末端部から次 の構造要素の２つ以上からなり： ａ）ほぼ５６個のアミノ酸の短かい細胞質ドメイン、ｂ）ほぼ２４個のアミノ酸 のトランスメンプラン領域、ｃ）セリン、トレオニンおよびプロリン残基に富む 領域、ｄ）少なくとも２つのＥＧＦドメインからなるドメイン、および ｅ）Ｎ−末端、 その際、要素ａ），ｂ）および／またはｃ）の１つ以上を削除するかまたは親和 力付与部分もしくは生理学的溶液中で前記タンパク質の溶解度を増加させる部分 により交換されてもよいことからなるタンパク質または生理学的適合性のこれら の誘導体。
2. ２．前記構造要素ａ）およびｂ）が削除されるかまたは変換されることからなる 請求項１に記載のタンパク質。
3. ３．前記桁造要素ａ），ｂ）およびｃ）が削除されるかまたは交換されることか らなる請求項１に記載のタンパク質。
4. ４．前記構造要素ｄ）が少なくとも４つのＥＧＦドメインからなる請求項１，２ または３に記載のタンパク質。
5. ５．前記構造要素（ｅ）がヒト組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ ）からのシグナルペプチドと短かいアダプター配列からなる請求項１，２，３ま たは４に記載のタンパク質。
6. ６．Ｃ−末端から、 ｃ）Ｏ−グリコシル化に富むドメイン、ｄ）少なくとも４つのＥＧＦドメイン、 ｅ）ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）からのシグナルペプ チドと短かいアダプター配列からなる請求項４に記載のタンパク質
7. ７．Ｃ−末端から、 ｄ）少なくとも４つのＥＧＦドメイン、ｅ）ヒト組織型ブラスミノーゲンアクチ ベーター（ｔＰＡ）からのシグナルペプチドおよび短かいアダプター配列からな る請求項５に記載のタンパク質。
8. ８．次のアミノ酸配列： 【配列があります】 からなる請求項６に記載のタンパク質。
9. ９．次のアミノ酸配列： 【配列があります】 からなる請求項７に記載のタンパク質。
10. １０．前記交換部分が親和性付与部分である請求項２または３に記載のタンパク 質。
11. １１．前記部分が生理学的構造体たとえばフィブリン凝血、膜表面、レセプター 分子、または細胞外マトリックス要素、好ましくはフィブリン凝血に対する親和 性を付与することからなる請求項１０に記載のタンパク質。
12. １２．前記部分か増殖因子モジュール、タリングル（ＸｒｉｎｇＩｅ）、フィン ガーモジュール、ビタミンＫ−依存性カルシウム結合ｒ−カルボキシル化領域お よび抗体誘導構造体からなる群から選択される請求項１１に記載のタンパク質。
13. １３．前記部分がヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターから生じる増殖因子 、フィンガーまたはクリングルモジュールである請求項１２に記載のタンパク質 。
14. １４．前記部分が血液と接触するような人工製品たとえば哺乳動物の身体へ挿入 および／または埋込みするように考案された製品たとえば人工血管の表面へ親和 性を付与する請求項１０に記載のタンパク質。
15. １５．前記親和性付与部分を前記構造要素ｄ）またはｅ）と結合させるための二 官能性スペーサー分子を含む請求項１０〜１４のいずれかに記載のタンパク質。
16. １６．ヒトが発生する汚染物のいずれもほとんど含まない請求項１〜１５のいず れかに記載のタンパク質。
17. １７．以下の領域： ａ）Ｎ−末端領域をエンコードする第一の領域、ｂ）前記第一の領域の下流に位 置する第二の領域であって、数個のＥＧＦドメインをエンコードする領域で、そ の際前記数が１より大きく、 ｃ）前記第二の領域の下流に位置する第三の領域であって、セリン、トレオニン およびプロリン残基に富むドメインをエンコードする領域、 ｄ）前記第三の領域の下流に位置する第四の領域であって、メンプランスパニン グ領域をエンコードする領域、ｅ）前記第四の領域の下流に位置する第五の領域 であって細胞質ドメインをエンコードする領域 の２つ以上から実質的になり、その際領域ｅ），ｄ）および／またはｃ）の１つ 以上が省略されるかまたは親和力付与物をエンコードする領域もしくはエソコー ドされたタンパク質の可溶性を増大させる物をエンコードするドメインにより交 換されてもよいヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物であって、トロンビンとの 高い親和結合により定義されるヒトトロンボモデュリンと同じ生物学的活性およ び前記コードされたタンパク質とトロンビンとの間に複合体にプロテインＣを活 性化しうる能力を付与する能力を有するタンパク質をコードするＤＮＡ構築物。
18. １８．前記領域ｄ）およびｅ）が省略されるかまたは交換された請求項１７に記 載のＤＮＡ構築物。
19. １９．前記領域ｃ），ｄ），ｅ）が省略されるかまたは交換された請求項１７に 記載のＤＮＡ構築物。
20. ２０．前記領域ｂ）が少なくとも４つのＥＧＦドメインをエンコードする請求項 １７，１８または１９に記載のＤＮＡ構築物。
21. ２１．前記領域ａ）がヒト組織型ブラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）お よび短かいアダプター配列をエンコードする請求項１７，１８，１９または２０ に記載のＤＮＡ構築物。
22. ２２． ａ）ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）からのシグナルペプ チドおよび短かいアダプター配列、ｂ）少なくとも４つのＥＧＦドメイン、およ びＣ）Ｏ−グリコシル化豊富ドメイン をエンコードするヌクレオチド配列を含む請求項２０に記載のＤＮＡ構築物。
23. ２３． ａ）ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）からのシグナルペプ チドおよび短かいアダプター配列、ｂ）少なくとも４つのＥＧＦドメイン をエンコードするヌクレオチド配列を含む請求項２１に記載のＤＮＡ構築物。
24. ２４．次のヌクレオチド配列： 【配列があります】 を含む請求項２２に記載のＤＮＡ構築物。
25. ２５．次のヌクレオチド配列： 【配列があります】 を含む請求項２３に記載のＤＮＡ構築物。
26. ２６．前記交換する領域が親和性付与部分をエンコードする領域である請求項１ ８または１９に記載のＤＮＡ構築物。
27. ２７．前記部分がフィブリン凝血、膜表面、レセプター分子または細胞外マトリ ックス要素、好ましくはフィブリン凝血のような生理学的構造物に対する親和性 を付与する請求項２６に記載のＤＮＡ構築物。
28. ２８．前記部分が増殖因子モジュール、タリンガル、フィンガーモジュール、ビ タミンＫ−依存性カルシウム結合ｒ−カルボキシル化領域および抗体誘導構造物 からなる群から選択される請求項２７に記載のＤＮＡ構築物。
29. ２９．前記部分がヒト組織ブラスミノーゲンアクチベーターから生ずる増殖因子 、フィンガーまたはクリングルモジュールである請求項２８に記載のＤＮＡ構築 物。
30. ３０．前記部分が血液との接触が意図される人工製品たとえば哺乳動物の身体に 挿入および／または埋込まれるように考案された製品たとえば人工血管の表面に 対し親和力を付与する請求項１８または１９に記載のＤＮＡ構築物。
31. ３１．トロンビンに対する高い親和結合により定義されるヒトトロンボモデュリ ンと同じ生物学的活性を実質的に有するタンパク質であって該タンパク質とトロ ンビンとの複合体にプロテインＣを活性化する能力を付与する力を有するタンパ ク質の発現を指示しうる発現ベクターであって、該ベクターが請求項１７〜３０ のいずれかに定義されたＤＮＡ構築物に操作可能に連結されるプロモーターを含 むことからなる発現ベクター。
32. ３２．請求項３１に記載のベクターを含む細胞。
33. ３３．細胞がバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞、好まし くは哺乳動物細胞である請求項３２に記載の細胞。
34. ３４．トロンビンに高い親和力で結合することにより定義されたヒトトロンボモ デュリンとほとんど同じ生物学的活性を有するタンパク質であって該タンパク質 とトロンビンとの複合体へプロテインＣを活性化しうる能力を付与しうる力を有 するタンパク質を製造する方法であって、ａ）細胞へ請求項３１に記載のベクタ ーを挿入し、ｂ）前記細胞を適当な培地中で増殖し、そしてｃ）前記ベクターで エンコードされそして前記細胞により作られるトロンボモデュリン活性を有する タンパク質生成物を単離する ことからなる前記タンパク質の製造方法。
35. ３５．前記細胞がバクテリア細胞、酵母細胞、真菌細胞または哺乳動物細胞、好 ましくは哺乳動物細胞である請求項３４に記載の方法。
36. ３６．生理学的に許容されうるキャリヤーまたは賦形剤と組合わせて請求項１〜 １６のいずれかによるタンパク質少なくとも１つまたはその生理学的に適合なそ の塩もしくはエステルを含む医薬品。
37. ３７．生理学的溶液の形の請求項３６に記載の医薬品。
38. ３８．トロンビン症状の治療または予防のための請求項１〜１６のいずれかに記 載のペプチドまたは請求項３６または３７に記載の医薬品の使用。
39. ３９．請求項１〜１６のいずれかに記載のタンパク質少なくとも１つまたは請求 項３６または３７に記載の医薬品の有効量を哺乳動物へ投与することからなる哺 乳動物におけるトロンビン症状の治療方法。
40. ４０．請求項１〜１６のいずれかに記載のタンパク質少なくとも１つまたは請求 項３６または３７に記載の医薬品の有効量を哺乳動物へ投与することからなる哺 乳動物におけるトロンビン症状の予防方法。
41. ４１．血液との接触および／または哺乳動物の身体への挿入および／もしくは埋 込みのために考案された製品に塗布するための請求項１〜１６のいずれかに記載 のペプチドの使用。
42. ４２．血液との接触および／または哺乳動物の身体への挿入および／もしくは埋 込のために考案された製品であって、請求項１〜１６のいずれかに記載のペプチ ドを含む組成の被膜を有する製品。