JPH03501741A - グリコシル化インターロイキン‐２含有医薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 グリコジル化インターロイキン−２含有医薬本発明は新規なグリコジル化インタ ーロイキン−２、蛋白生産組換えＣＨＯの培養上清からのこれを単離する方法お よびグリコジル化インターロイキン−２を含む新規医薬に関する。

インターロイキン−２（以下、単にＩＬ−２という場合がある）は抗体またはマ イトジェン化合物による活性化に応答して主に哺乳動物のＴリンパ球により分泌 されるリンホカインである。これは免疫応答に関与する種々の細胞の増殖および 分化およびその他の細胞に作用することによって主な機能を果す（Ｒ，Ｊ、ログ 、イミノロジー・ツデイ（Ｉｍｍｎｏｌ、　Ｔｏｄａｙ）第５１！第２０３−２ ０９頁（１９８４年）。

人由来グリコジル化インターロイキン−２は詳細に研究されて来た。これは１３ ３個のアミノ酸を含み、トレオニンの３位に少糖類構造を有する蛋白質の形で生 産される（Ｈ，Ｓ、コンラドら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミ ストリー（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）第１５３巻第２５５−２６１ 頁（１９８６年））。Ｔリンパ球はこれを最初は１５３個のアミノ酸を含む前駆 体の形で合成し、小胞体の段階で２０個のアミノ酸のシグナルペプチドを切断し た後、ゴルジ装置中でグリコジル化された１３３個のアミノ酸を有する蛋白質の 形で分泌する（成熟グリコジル化蛋白質）。

末梢リンパ球またはジュルカット系などのリンパ芽球系のいずれからも不十分な 量のインターロイキン−２しか得られないことを考えると、真核および原核細胞 のいずれの場合にも外来宿主中の蛋白質遺伝子を発現し得ることから、遺伝子組 換え技術が期待し得る。

すなわち、インターロイキン−２遺伝子は成功裏にクローン化され、エシェリキ ア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）バクテリアおよび種々の真核細 胞、さらに、具体的にはＣＯＳサル細胞およびＣＨＯ・チャイニーズ・ハムスタ ー・卵巣細胞中で発現する。

最近、発明者らは組換えＣＨＯ細胞から、インターロイキン−２を製造し、主と してグリコジル化インターロイキン−２の形で得られる蛋白質を高収率でもたら す方法を開発した（出願ＥＰ−Ａ−３０７２８５号参照およびＰ、フェラら、フ ェツス・レターズ（Ｆｅｂｓｌｅｔｔｅｒｓ）第２２６巻（１）第４７−５２頁 （１９８７年）参照）。そこで、グリコジル化インターロイキン−２を多量に分 離する研究を培養上清から出発する医薬用蛋白質の単離および精製には困難な問 題がある。生成系に含まれる、特に、単離された蛋白質に主成分として存在し、 粗悪化し、生産株を汚染する蛋白質、核酸、エンドトキシン、ウィルスなどの汚 染物を除去する必要がある。蛋白質が変性しないように注意し、その活性を維持 し、患者の免疫反応に妨害を惹起しないようにしなければならない。さらに、工 業的規模の生産では、好ましくは蛋白質の分離方法としてイムノアフィニティー のような困難な技術を用いるべきでなく、培養培地中の蛋白質に対して単離蛋白 質を高収率で得ることを確実にすべきである。

天然および組換インターロイキン−２の精製方法はすでに報告されている。例え ばに、カトクは活性化末梢リンパ球の培養物から生産されたインターロイキン− ２の精製方法を報告しており、この方法は連続的なつぎのような工程を含む：カ チオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、排除クロマ トグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーである（Ｋ、カトク、バイ オケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂ 　ｉｏｃｈｅｍ　ａｎｄ　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ　ｃｏｍｍｕｎ）第１２７巻（１） 第１８２−１９０頁（１９８５年））。Ｍ、Ｐ、ウニイル（ウニイル、Ｍ。

Ｐ、ジャーナル・オブ・クロマトグラフ４−（Ｊ　、　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏ ｇｒａｐｈｙ）第３９６巻第２０９−２１５頁（１９８７年））はエシェリキア ・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）から誘導された組換インターロイキレ−２の抽出およ び精製方法を開示しており、この方法は次のような工程を含む：音波処理による 細胞融解、ブタノールによる抽出、ジチオスレイトール存在下で８Ｍ塩化グアニ ジン中へのインターロイキン−２凝集物の溶解、排除クロマトグラフィー、硫酸 銅存在下塩化グアニジン稀釈による蛋白質の再生、カチオン交換クロマトグラフ ィーおよび逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーである。

これらの方法は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーの工程を含み、この方法は分子 の疎水性により高い精製度が得られるが、酸性ｐＨおよび有機溶媒の使用が不可 欠であり、これはインターロイキン−２を変性させ得る過酷な条件である。これ らの方法では上述の規準を満足させる方法でＣＨＯ細胞の培養上清中に存在する グリコジル化インターロイキン−２を精製することはできない。

今回、驚くべきことに、組換えＣＨＯ細胞の上清から出発して単純かつ大規模生 産に使用し得る方法により、特に有益な医薬的性質を有するグリコジル化インタ ーロイキン−２を単離することが可能であることが判明した。この方法は次のよ うな工程を含む二上清からのインターロイキン−２が主体をなすフラクションの 分離、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーお よび排除クロマトグラフィーである。本発明は従って、下記の工程を含む方法に よる組換えＣＨＯ細胞の培養物の上清から得られるグリコジル化インターロイキ ン−２に関する。

ａ）培養上清からのインターロイキン−２が主体をなすフラクションの単離 ｂ）カチオン交換クロマトグラフィー Ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィーｄ）排除クロマトグラフィー このグリコジル化インターロイキン−２は１５　Ｘ　１０　”Ｕ／ｍｙより大の ＣＴＬＬ−２活性を有し、天然のインターロイキン２（約２０Ｘ１０”Ｕ／瀧９ ）のＣＴＬＬ−２活性に近い。ｐ）１６．５の水溶液に溶解したグリコジル化イ ンターロイキン−２を凍結乾燥し、直ぐに凍結物を解凍した後、解凍液は生理学 的ｐＨでは澄明であり、初めのＣＴＬＬ−２活性の少なくとも８０％を有する。

好ましくは組換ＣＨＯ細胞はインターロイキン−２の前駆体およびＤＨＰＲの発 現ベクターによる形質転換によるＤＸＢ　１１株から誘導されたＣＨＯｄＭｒ細 胞であることが好ましい。この場合、好ましい発現ベクターはプラスミドｐＳＶ ７２６を特徴を有するプラスミドである。組換えＣＨＯ細胞は好ましくは低蛋白 人工培地中で培養する。培地は、何ら不利益なく、組換えＣＨＯ細胞からインタ ーロイキン−２の産生を特に増加する化合物、ポリビニルピロリドンを含むこと ができる。

本発明はまた、組換えＣＨＯ細胞の培養上清からグリコジル化インターロイキン −２を分離する新規方法に関するもので、それは下記工程よりなることを特徴と する。

ａ）培養上清からのインターロイキン−２に富むフラクシーンの分離 ｂ）カチオン交換クロマトグラフィー Ｃ）疎水性相互反応クロマトグラフィー及びｄ）排除クロマトグラフィー 組換えＣＨＯ細胞は、当業者によく知られた適当な培地、好ましくは蛋白の少な い人工培地、例えば総蛋白的４　Ｒ９／１（ｌを含む培地で培養する。培地は好 ましくはポリビニルピロリドンを含む。

インターロイキン−２に富むフラクシジンは、より有利には、蛋白を透過しうる 膜１とこれを保持する膜２との間の二重濾過により培ａｈ清から分離される。膜 ｌは、例えばミクロ濾過又は限外濾過膜である。膜２は限外濾過膜である。好ま しくは、膜ｌは、ストップ閾値３０ｋＤａ以上、より詳しくは５０と１５０ｋＤ ａの間を有し、膜２は、ストップ閾値１０ｋＤａ以下、好ましくは５と１０ｋＤ ａの間を有する。膜１と膜２は、好ましくは酢酸セルロース及びポリスルホンか ら製造される。

カチオン交換工程は、好ましくはｐＨ４、５と６．５の間、より具体的には５． ２と５．７の間の範囲で、親水性ポリマー、例えば、所望により架橋結合したア ガロース、又はポリアクリルアミド又は親水性ビニルポリマー、又は親水性ポリ マーで被覆されたシリカ、を基礎とする硬質又は半硬質ゲルよりなるクロマトグ ラフィー支持体で、置換基が支持体に強力チオン交換性を付与するようグラフト 化されたもので実施される。スルホプロピル（ＳＰ）はこの種の好ましい基であ る。

カチオン交換クロマトグラフィ一工程は、好ましくはアニオン交換クロマトグラ フィ一工程が予め行われる。

この場合、アニオン交換工程は、好ましくはｐＨ５，５と８．５の間、より具体 的には６．５と８．２の間の範囲で、親水性ポリマー、例えば架橋結合アガロー ス、又はポリアクリルアミド又は親水性ビニルポリマー、又は親水性ポリマーで 被覆されたシリカを基礎とする硬質又は半硬質ゲルよりなるクロマトグラフィー 支持体で、置換基が支持体に弱アニオン交換性を付与するようグラフト化された もので実施される。ジエチルアミノエチル（ＯＥＡＥ）はこの種の好ましい基で ある。

好ましくは、疎水性相互反応工程は、ｐＨ４、５と８．０の間、より具体的には ６．０と８．０の間の範囲で、カオトロピック試薬又は有機溶媒又はｐＨ４、５ 以下又は８．０以上を有する水性溶媒を添加することなく、グリコジル化ＩＬ− ２の脱離用クロマトグラフフィー支持体上で行われる。かかる支持体の例は、親 水性ポリマー、例えば架橋結合アガロース、又は親水性ビニルポリマー、又は親 水性ポリマーで被覆されたシリカを基礎とするゲルである。ブチル、フェニル又 はプロピル基が支持体にグラフト化される。

排除クロマトグラフィ一工程は、好ましくはｐＨ５、０と８．０の間、より詳し しくは６．０と７．０の間の範囲で、ｌと２５０ｋＤａの間の分別範囲を有する 支持体で実施される。支持体は、好ましくははアクリルアミドと架橋結合したデ キストリンを基礎としたもの又はアガロースを基礎としたものである。

前記の方法により分離されたグリコジル化インターロイキン−２は、他の精製組 換えインターロイキン−２、さらに具体的にはエシェリキア・コリ（Ｅ、　ｃｏ ｌｔ）から誘導されたものに比べて薬物の有効物質としての使用に非常に適した 性質、即ち、改良された抗腫瘍活性、すぐれた免疫促進性質、大きく低下した毒 性、少ない免疫原性、有毒溶解剤を添加したり分子を化学的に修飾することなく 、水性溶媒中生理的ｐＨでの溶解性及び製薬上許容されうる処方での凍結乾燥後 のすぐれた安定性などである。

それゆえ、本発明はまた、有効成分が先に定義したグリコジル化インターロイキ ン−２である医薬に関する。本物質は、それ自体だけで又は他の有効物質、例え ば他のサイトカイン、例えばインターロイキン−１１インターロイキン−４、α −インターフェロン、γ−インターフェロン又はＴＮＦ、又は抗腫瘍剤例えば酢 酸フラボン又はシクロホスファミド又は抗有糸分裂剤又は免疫調節剤例えばサイ クロスポリン又はＢＣＱ、又は抗体又は胸腺ホルモンと共に使用できる。

ＩＬ−２の全ての既知又は将来の応用において、又、他の有効物質との併用にお いて、本発明によるグリコジル化ＩＬ−２は、エシェリキア・コリ（Ｅ、　ｃｏ ｌｉ）から誘導されたＩＬ−２に有利な代替品足り得るものである。

これらの応用は下記のものを含む。

−種々の症状、例えば癌、先天的又は後発的免疫不全、免疫異常（さらに自己免 疫及び炎症疾患）及び伝染性疾患（とりわけ、微生物及び寄生のウィルス感染） の処置、 −前述の症状、さらに具体的には感染疾患の予防処置、及び−ワクチン接種（ア ジュバントとしてのＩＬ−２の使用）グリコジル化ＩＬ−２及び他の有効物質と グリコジル化ＩＬ−２との併用、神経節又は他の免疫関与器官への注射（静脈内 用ポーラス、潅流で、皮下、腹腔内又は局所、例えば腫瘍に）により、又は別法 として、患者からあるいはドナーから採取された細胞にインビトロでの作用によ って治療に用いることができる。

本発明は下記の実施例からより容易に理解しうるが、これらは単なる例示の手段 に過ぎない。

実施例１　インターロイキン−２の前駆体及びＤ　ＨＦ　Ｒ，を発現するベクタ ーの構築ニブラスミド　ｐｓＶ７２０及びｐＳＶ７２６プラスミドの構築は、な かんづく、既存のベクターから出発して、制限酵素を用いてＤＮＡフラグメント の分離、オリゴヌクレオチドの化学的合成、−所望によりそれらの末端を修飾し た後−酵素、例えばファージＴ４のＤＮＡリガーゼを用いることによる種々のフ ラグメントを連結すること、クローニング後（エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅ ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）での細菌の形質転換後）のプラスミドの選択及びそれ らの精製よりなる。

操作は、当業者に周知の技術を用いる。

これらの技術は、Ｔ、マリアチス等によるモレキュラー・クローニングニア・ラ ボラトリイーｖ＝、アル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｉｇ：ａ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）と題する、１９８２年にコールド・スプリング・ ハーバ−・プレス、二ニー・ヨーク（ニー・ニス・エイ）より出版された著作に 記載されている。

以下に記載されるベクターを構築するのに必要とされる制限酵素のセットは、と りわけ二ニー・イングランド・バイオラブ（ニー・ニス・エイ）より市販されて いる。

ファージＴ４のＤＮＡリガーゼは二ニー・イングランド・ヌクレアー（ニー・ニ ス・エイ）から入手可能である。

ａ）プラスミドｐｓＶ７２Ｇ 本物質は１．第１図に示され、既に記載した方法により下記の７個のＤＮＡフラ グメントを連結したものである。

−ゲノム５Ｖ４０（Ｗ、ファイアーズ（１９７８）、ネイチ＋　−（ｎａｔｕｒ ｅ）第２７３巻第１１３−１２０頁（１９７８年））から得られた３４２塩基対 （以下、ｂｐと称す）を含み、又、本ウィルスの初期プロモーターを含むＰｖｕ Ｉ［−ＨｌｎｄＩ［ｌフラグメント−ＩＬ−２の天然前駆体をコードし、その中 で、コード化鎖の５°末端に位置してい！ＡＧＣＴＴＣＣＡＣＡＡＴＧＴＡＣＡ ＧＧヌクレオチド配列が合成配列ＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡＧＧによ り置換され、コドンＡＴＧを囲んでいるヌクレオチドのレベルで、Ｍ、コザック （（１９８４）ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、１２，８５７−８７２）ｉ ：より記載されたＣＣＡＣＣＡＴＧＧ共通配列に対応する配列を有する、ＤＮＡ 配列を含んでいる５゜４ｂＰのＨｆｎｄＩ［Ｉ　−Ｂ　ａｍＨｌフラグメント− マウス・アルファグロビン（Ｙ、ニシオカおよびＰ、レーダー（１９７９）セル 、１８，８７５−８８２）の遺伝子から得られ、この遺伝子の遠位のイントロン を含む、３０５ｂｐのＢａｍＨＩ　−Ｂａｔ　ｌフラグメント −ウィルスＳＶ４０のゲノムからの、このウィルスの初期ポリアルデニル化シグ ナルを含む１３３ｂＰのＨｐａｌ　−Ｂ　ａｍＨｌフラグメント −プラスミドｐＢＲ３２２（エフ・ポリバー（１９７７）、ジーン２２．９５− １１３）からの１ａｓｂｐのＢａｍＨＩ　−ＥｃｏＲＶフラグメント −ＡＴＣＣに、寄託番号３７１４６で寄託されたプラスミドｐｓＶ　２−ｄｈｆ ｒプラスミド（ニス・スブラマリ等（１９８１）モレキュラー・アンド・セルラ ー・バイオロジー１，８５４−８６４）からの２６７７ｂＰのＰｖｕＩ［−Ｅｃ ｏＲｌフラグメント及び−プラスミドｐＢＲ３２２がらの２２９５ｂｐのＥｃｏ ＲＩ　−Ｐｖｕｌｌフラグメント プラスミドｐｓＶ７２０は、次のものを含む。

Ｉ　Ｌ−２の天然前駆体を発現する単位。本単位中のプロモーターは、ウィルス ＳＶ４０の初期プロモーター：　ＩＬ−２の前駆体に対するコードづけ配列の下 流にある。単位は、マウス・アルファグロビンの遺伝子の第２イントロンを含む 配列とそれに続くウィルスＳＶ４０の処理アデニル化シグナルを含む配列を含む 。及び−ａｈｆｒを発現する単位。本単位内のプロモーターは、ウィルスＳＶ４ ０の初期プロモーター：　ＤＨＰＲのコードづけ配列の下流にあり、この単位は 、−ダブリニー・ファイアーズ表示法を用いると一つィルスＳＶ４０のゲノムの 位置４６９３と４０８３におけるＭｄ。

１部位の間の配列を含み、ウィルスＳＶ４０のｔ抗原に対するインドロンとそれ に続くウィルスＳＶ４０の初期ポリアデニル化シグナルを含む。本単位は、プラ スミドｐＳ　Ｖ　２−ｄｈｆｒからのＰｖｕＩ［−Ｅｃ。

Ｒ１フラグメント中に含まれる。

ｂ）プラスミドｐＳＶ７２６ 本プラスミドは、第２図に示され、以下のようにプラスミドｐｓｖ７２０から得 られる。

プラスミドＩ）ＳＶ（７）ＨｉｎｄｌＵ−ＢａｍＨＩ切片の上流部に位置（１、 ■Ｌ−２の天然前（体の、且つ成熟１ｔ、−２の第１アミノ酸の修飾シグナルペ プチド（それは、コザック共通配列に相当する配列の採用によるチロシン基の代 わりに２位にアラニン基を含む）に相当する配列を含んでいるＨｉｎｄＩＩ［と ８ｇ１ＡＩ制限部位の間のＤＮＡ切片は、次いでヒト生成ホルモンＧＨの天然前 駆体のシグナルペプチド（以下、ｈＧＨシグナルペプチドと称す）、および成熟 ＩＬ−２の第１アミノ酸を、その第９のヌクレオチドからコードする合成二重鎖 オリゴヌクレオチドにより置換される。

得られたプラスミドがプラスミドｐｓＶ７２６で、そこでＨｉｎｄＩ［［−Ｂａ ｍＨＩ切片は、ｈＧＨのシグナルペプチドを含むＩＬ−２の前駆体（プレカーサ ーｐｓ−ｈＧＨ−Ｉ　Ｌ　−２）のコードづけ配列を組み込む。

プラスミドｐＳＶ７２６は、下記のものを含む。

−プレカーサー（ｐｓ−ｈＧ　Ｈ）　−１Ｌ　−２を発現する単位。本単位にお けるプロモーターは、ウィルスＳＶ４０の初期プロモーターであり（ｐｓ−ｈＧ 　Ｈ）　−１Ｌ　−２の前駆体に対するコードつけ配列の下流にあり、この単位 は、マウス・アルファグロビンの遺伝子の第２イントロン、それに続く、ウィル スＳＶ４０の初期ポリアデニル化シグナルを含む配列を含む、及び −ｄｌｒを発現する単位。本単位におけるプロモーターは、ウィルスＳＶ４０の 初期プロモーターであり；　ｄｈｆｒに対するコードづけ配列の下流にあり、こ の単位は、−ダブリニー・ファイアーズ表示法を用いると一つィルスＳＶ４０の ゲノムの位置４６９３と４０８３におけるＭｄｏ１部位の間の配列よりなり、ウ ィルスＳＶ４０のｔ抗原に対するイントロンとそれに続くウィルスＳＶ４０の初 期ポリアデニル化シグナルを含む。本単位は、プラスミドｐＳ　Ｖ　２−ｄｈｆ ｒからのＰｖｕｌｌ　−ＥｃｏＲＩフラグメント中に含まれる。

下記凡例は、第１及び２図に用いられる。

Ｈ−一一一一門　プラスミドｐＢＲ３２２からのＤ　Ｎ　Ａ配列口＝＝＝＝＝コ 　ウィルスＳＦ４０のゲノムからのＤＮＡ配列Ω；ＸＸＸＸＸコ　マウス・アル ファグロビンに対するコードづけ遺伝子からのＤＮＡ配列 の天然前駆体に対するコードづけ配列を構築しているＤＮＡ配列 四コ］］】】ココ　ｄｂ４ｒをコードするＤＮＡ配列実施例２ インターロイキン−２を高収率に与えるセルラインすなわちライン５８−１２お よび１０９−２７の製造 ＤＸＢ　１１株のＣＨ０ｄｈｆｒ−細胞（ウルラウブ等、プロシーディンゲス・ オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・ニーニスエイ、第 ７７巻、第７号、第４２１６−４２２０頁（１９８０年）に開示されたＣ　ＨＯ Ｋ　、　Ｄ　ＨＰ　Ｒ−のクローン）をプラスミドｐＳＶ７２６またはプラスミ ドｐｓＶ７２０で移入した。

操作方法はＦ、グラハムおよびＡ、ファン・デル・ニブ（パイロロジー、第５４ 巻、第５３６二５３９頁（１９７３年））により開示された方法である。

細胞を１０％（Ｖ／Ｖ）ウシ胎児血清、ゲンタマイシン２０μ９／ｄｉ、チロシ ン６０μ９／好およびＬ−グルタミン３００μ９／Ｉ（を混合したアルファーＭ ＥＭ（ギブコ社）中で最初に増殖した（この培地を以下、非選択培地と称する） 。

水洗後、前日にまいた細胞を非選択培地に覆い、プラスミドの１種１０μ９をさ け精子Ｄ　Ｎ　Ａなしでりん酸カルシウムの存在下加えた。この方法で製造した 細胞を７時間３７℃でインキュベートした。

細胞を５％（Ｖ／Ｖ）ウシ胎児血清を含むアルファーＭＥＭ培地中３時間３７℃ で培養した。インキュベーション後、細胞をギブコ社製最少必須培地、コード番 号０４１−１０９５中ベトリ皿あたり５゜１０’部分に分けた。この場合、培地 は透析ギブコ社ウシ胎児血清（ｌＯ％ｖ／ｖ）、ゲンタマイシン（２０μ９／ｊ １１２）、チロシン（５０μｙ／ｘｃ）、Ｌ−グルタミン（３００μ９／及Ｑ） およびＬ−プロリン（１５０μ９／酎）を混合して使用した。これらの添加物を 含む培地は以下、選択培地と称する。

こうして製造した細胞を２ｉＩ１間３７℃でインキュベートし、選択培地を３日 ごとにとりかえ１こ。インキュベーション後に観察されたコロニーは全て効果的 にプラスミドを組み入れた細胞からきたものだった。これらのコロニーをとり、 選択培地で個々に再培養し、ＩＬ−２生産に対する適性を確証するためＩＬ−２ 型活性を測定することにより試験した。

！Ｌ−２型活性は、ＩＬ−２マウスリンパ球Ｔライン依存ＣＴＬＬ−２の増殖刺 激試験における培養培地の生物活性である（Ｐ、ベイカー等、ジャーナル・オブ ・イシスペリメンタル・メディシン、第１４９−１７３頁（１９７９年））。コ ノ活性は以下、ＣＴＬＬ−２活性と称し、ＢＲＭＰ（バイオロジカル・リサーチ ・モディファイヤー・プログラム、リンフ中キン・リサーチ、第４巻、第１９３ −２２７頁（１９８４年））に定義された標準に関するユニット（以下、Ｕと省 略）で表現される。

最も産生力のあるコロニーは選択培地の４つの製品で連続的に二次培養し、各製 品はＦ、アルド等（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２５ ３巻、第１３５７−１５７０頁（１９７８年））に開示された方法で前述の製造 より大きい濃度（０，０２，０，０５，０，１および０．２ｕＭ）のメトトレキ サートを有する。

こうして維持した物質は、プラスミドｐｓＶ７２０により形質転換したＣＨＯ５ ８，１２ラインおよびプラスミドｐＳＶ７２６により形質転換した１０９．２７ であり、両ラインはインターロイキン−２の産生力が高い。

実施例３ インターロイキン−２の高産生カラインすなわちＣＨ０５８−１２および１０９ −２７セルラインの培養（１）蛋白質が適度にある培養培地中でのＣＨＯ５８− １２ラインからＩＬ−２の製造 充分な数の細胞をローラーボックス（回転フラスコ）で増殖することにより得た 後、産生発酵槽に約３０００００細胞／祿接種した。

発酵条件は次の通りである。

ａ）潅流率をおよそ１日あたりｌ容量で潅流培養をする、ｂ）上清をスピンフィ ルターを通過後連続的に集める（回転フィルターはアギチーターシャツ）・に固 定）、Ｃ）変性コラーゲンのフィルム（サイトデックスＩＩＩＲ，ファルマシア 社）に覆われた架橋デキストランの小胞子を培養する、ｄ）培養のＰＨを約７． ３に調整する、ｅ）溶解酸素圧を３０％に調整する（空気を吹込んだ後、酸素で 培地を飽和したものを１００％と定義する）、ｆ）培養の温度を約３７℃に調整 する、ｇ）培地ｌと称する基礎培養培地は、主に次の混合物（５０：５０）すな わちイーグルＭＥＭ（フロラ）最少必須培地およびＦ１２ハム（ギブコ社）栄養 培地に基づく。

培地ｌの組成物は以下の通りである。

発酵方法は成長相および産生相と称する２つの部分である。成長相の間で、ウシ 胎児血清（５％）を培地に加えた。産生相の間で、培地をＦＩＶ−１と称する、 コーン分画法によりウシ血清から単離した蛋白分画と混合した。培養培地には適 度に蛋白を含んでいた（総蛋白／１２の４００ｍ９）。産生は少なくとも３０日 間続けられた。収穫物を６℃の温度にライン中で冷却した。総蛋白濃度は５００ ｖ：ｇ／（１であった。培養上清のＣＴＬＬ−２活性は、４００００Ｕ／次Ｑ１ すなわち約２　Ｒ９／　ｌ！のＩＬ−２濃度であった（ＩＬ−２特異活性が２× １０’Ｕ／ｘ９およびＩＬ−２蛋白純度が０１４％に仮定する）。この培養上清 を以下培養上清Ａと称する。

（ｎ）蛋白の少ない培地中のＣＨＯ１０９−２７ラインからのＩＬ−２の製造 充分な数の細胞をローラーボックス（回転フラスコ）で増殖することにより得た 後、産生発酵槽に約３０００００細胞／１１１１２接種した。

発酵条件は次の通りである。

ａ）潅流率をおよそ１日あたり１容量で潅流培養をする、ｂ）上清をスピンフィ ルターを通過後連続的に集める、Ｃ）変性コラーゲンのフィルムに覆われた架橋 デキストランの小胞子を成長させる（ファルマシア社製すイトデッシスＩＩ［Ｒ ）、ｄ）培養の温度を約３７℃に調整する、ｅ）溶解酸素圧を１００％にする、 ・ ｆ）培養の温度を約３７℃にする、およびｇ）基礎培養培地は前記に定義した培 地１である。

発酵方法は成長相および産生相と称する２つの部分である。成長相の間で、ウシ 胎児血清（２，５％）を培地に加えた。産生相の間で、血清をインスリン３ＪＩ ９／１２および培地中の唯一の蛋白であるラクトフェリン１次９／Ｉ２に変えた 。

この相の場合、平均分子量が４００００を有する０、５％ポリビニルピロリドン をこの培地に加えた。このポリマーは組換えＣＨＯからＩＬ−２の特異出力を増 加し得ることが見出された（単位時間および単位生物量あたりに分泌するＩＬ− ２の量）。従って、培養培地は蛋白の少ない合成培地であった（総蛋白４１！９ ／（１＞。産生は少なくとも３０日間続けた。収穫物を６°Ｃの、星度でライン 中で冷却した。培養上清の総蛋白濃度は１００　ｒ９／Ｑであった。ＣＴＬＬ− ２活性は１２００００１Ｊ／ｘ（ｌすなわち約６ｚ＆／Ｉ２の濃度および６％蛋 白純度であった。培養上清を以下、培養上清Ｂと称する。

実施例４ ＣＨＯ５Ｂ−１２および１０９−２７セルラインにより分泌されたＩＬ−２の部 分的特徴 １、ＩＬ−２の精製 ＩＬ−２を培養上清１１２から精製した。

最初の段階は濃縮、および上溝に０．０５Ｍ酢酸アンモニウムで予じめ平衡にし たセファロースＲアガロースカラム（Ｓ−ファスト・フロウーファヘマシア・ケ ミカル社、スウェーデン）のイオン交換クロマトグラフィーを付す最初の精製で あった。溶出はＮａｃｌ（モル濃１ｆ０．０５Ｍ、それから０．５Ｍ）を含む０ ．０５Ｍ酢酸アンモニウムで実施した。ＣＴＬＬ−２活性を測定することにより 生物学的活性をもつことを示す溶出した分画は、集められ、それらのプールを逆 相カラムの高速液体クロマトグラフィーに付した。選択した支持体はＣ３グラフ トシリカゲルであった。カラム寸法は１．０Ｘ２５．Ｏｃｍであった。

溶出はトリフルオロ酢酸０．１％水溶液（Ｖ／Ｖ）中５−１００％（Ｖ／Ｖ）に 変化したアセトニトリル直線勾配で、８０分間流速４ｘ（１／分で実施した。

分画溶出した生物学的活性を集め、それらのプールをカラム寸法２．０ＸＩＯ， Ｏｃｍの０１８グラフトシリカゲルで同一溶出条件下インターアリアなしの前述 と同電のクロマトグラフィーに付した。

クロマトグラフィーで集めた生物学的活性の溶出フラグメントプールは、ドデシ ル硫酸ナトリウムの存在下ポリアクリルアミドで電気泳動により示されるところ ではＩＬ−２純度が９５％以上であった（ラエミ、ネイチャー、第２７７巻、第 ６８０−６８５頁（１９７０年））。このプールはＩＬ−２を特徴づけるのに使 用する材料である。

２、末端アミノ配列を決定することによるＫＬ−２の特徴づけ処理試料を臭化へ キサジメトリン（またはポリブレン）フィルターの表面に置く。フィルターは、 クロマトグラフィー（アプライド・バイオシステムモデル４３０Ａ）を備えた蛋 白配列装置（アメリカ合衆国アプライド・バイオシステム社製モデル４７０Ａ） に挿入し、それぞれの分解サイクル後、連続的にフェニルチオヒダントイン誘導 体を分析した。

この決定の結果は、アミノ酸が検出されない部位３を除いて天然物（Ｒ，ロブ等 、プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシ ーズ・イン・ニーニスエイ、第８１巻、第６４８６−６４９０頁（１９８４年） ）について発表された配列と一致した。この非検出は部位３のオリゴ糖の存在下 により説明される。

配列は最初の１０個のアミノ酸の場合法のように書かれる。

Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−９ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒア ラニンはＮ末端部位で検出した唯一のラジカルである。これにより、プレカーサ ー（ｐｓ−ｈＧ　Ｈ）　−１Ｌ　−２は分泌する間に適当に切断されたことが確 証された。

実施例５ ＣＨＯ１０９−２７ラインの培養上清から出発する本発明の方法によるグリコジ ル化インターロイキン−２の単離この実施例および実施例７で使用する水は、ミ リーＱ型装置で精製および超濾過した脱塩水であった。

１、インターロイキン−２が豊富にある分画からの培養培地の単離実施例３に記 載された培地Ｂの上清１３０リツトルをとり、超濾過膜を妨害する可能性のある 大きな粒子を脱離するため８μｌスレシヨールドフイルターで前濾過した。

分子量がＬ　５ｋＤａ−１７ｋＤａのインターロイキン−２を分画し、以下記載 の方法を操作して、！００ｋＤａのストップ閾値を有する第１膜および１０ｋＤ ａのストップ閾値を有する第２＠の二重接線超濾過により濃縮した。第１および 第２膜は酢酸セルロースのスパイラルカートリッジ、すなわち第１膜からの濾液 が第２膜によって保持される材料を供給するようにカスケード状にマウントした アミコン社製膜ＹＭ１００およびＹＭＩＯであった。

前濾過液は第１膜に供給し、まず第１に、第１膜および第２膜により保持される 材料を第１膜により保持される材料の容量が約１５リツトルになるまで濃縮した 。次に、保持された材料を、第１膜で保持された材料からのＩＬ−２を全部取り 除き、第２膜で保持された材料のイオン力を減少させるように超精製水８０リッ トルで透析濾過した（一定容量で洗浄）。次に後者の材料を１．５リツトルに濃 縮し、インターロイキン−２を、水で膜をリンスした後回収した。

生じた濃縮物を、超濾過中に形成した沈澱物を除くために０．２μｌストツプ閾 値を有するフィルターを通して濾過した。精製物はＩＬ−２の濃縮水溶液２．４ リツトルであった。

２、グリコジル化インターロイキン−２の単離ａ）陰イオン交換クロマトグラフ ィー この段階では、上清培養に存在する核酸、外毒素、ＣＨＯ蛋白および他の蛋白の ようなある種の汚染物をクロマトグラフィー支持体に固定することにより除去し た。ＩＬ−２は選択溶出条件下でカラムに保持されなかった。使用したクロマト グラフィー支持体は、弱陰イオン交換架橋アガロースに基づくゲル、すなわち直 径１４０ｍ＋ｍ高さ２１０＋ｎｍのガラスカラムのファルマシア社製ＤＥＡＥセ ファロース・ファースト・フロラであった。酢酸アンモニウムの結晶を、５ｍＳ ／ｃｍの伝導性に調整するため前に得た濃縮ＩＬ−２に加え、ｐＨ７の酢酸アン モニウム緩衝液を前述平衡化したクロマトグラフィー支持体に注入した。次にカ ラムを最後に述べた溶液で洗浄した。

ＩＬ−２を含む固定流出および洗浄溶液を合わせた。生成物はＩＬ−２が豊富に ある水溶液７．０８リツトルであった。

ｂＪ＆イオン交換クロマトグラフィー この段階は培養上清に存在し、陰イオンクロマトグラフィー支持体に固定しない ポリビニルピロリドン、ＣＨＯ蛋白および他の蛋白のようなある種の汚染物を除 去するため、およびＩＬ−２の異型を分離するためのものである。

使用したクロマトグラフィー支持体は、直径５０ｃｍ高さ２３０ｍｍのカラムの メルク社製ＳＰフラクトゲル６５０　（ｓ）の親水性樹脂に基づくゲルであった 。前段階で得られた溶液のｐＨを酢酸を加えながら５．５に調整し、溶液をカラ ムに注入した。次に、カラムに固定したＩＬ−２をイオン化性を次第に増加させ る溶液で溶出し、塩化ナトリウムの２Ｍ水溶液と様々な割合の酢酸アンモニウム 溶液（５０ｍＭＳＰＨ５，５）を混合して得られた。溶液の売文密度は２８０頁 ｍであった。この方法で、蛋白を含む次の３つの分画が分離した。

ジルアリル化グリコジル化ＩＬ−２（Ｎ２型Ｘ’）を含む分画１モノシアリル化 グリコリル化ＩＬ−２（Ｎ、型）（１）を含む分画２非シアリル化グリコジル化 ＩＬ　２（Ｎｏ型）（りおよび非グリコジル化ＩＬ−２（Ｍ型）（１）を含む分 画３（’）Ｈ、コンラド（ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリ ー、第１５３巻、第２５５−２６１頁（１９８５年））に記載されたＩＬ−２の 様々な型、参照。

分画ｌおよび２を合わせてグリコジル化ＩＬ−２水溶液０．４５リットルを得た 。

Ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィー使用したクロマトグラフィー支持体は親 水性ポリビニル樹脂に基づく疎水性相互作用ゲル、すなわちメルク社製ブチルフ ラクトゲル６５０　（Ｍ）であり、直径７０闘高さ１３５ｍｍのカラムに入れた 。

１．２Ｍモル以上の硫酸アンモニウムおよびｐＨ６，５に調整したアンモニアを グリコジル化ＩＬ−２の前に得た溶液を加え、あらかじめ（ｐＨ６，５，５０ｏ ＋Ｍりん酸アンモニウムおよび１．２Ｍ硫酸アンモニウムの）水溶液で平衡化し たクロマトグラフィー支持体に注入した。これらの条件で、グリコジル化ＩＬ− ２はクロマトグラフィー支持体上で保持された。保持されない生成物は、前記溶 液、つづいて（ｐＨ６，５，５０ｍＭりん酸アンモニウムおよび０．８Ｍ硫酸ア ンモニウムの）水溶液で洗浄除去した。次にＩＬ−２をりん酸アンモニウムおよ び０．１Ｍ硫酸アンモニウム水溶液（ｐＨ３、５，５０ｍＭ）で溶出した。生成 物はグリコジル化ＩＬ−２水溶液２．１７リツトルであった。

ｄ）排除クロマトグラフィー 排除クロマトグラフィー支持体は架橋デキストランおよび２５０−５ｋＤａの範 囲の分画化に基づくゲル、すなわち直径１００ｍｍ高さ９００＋＋＋ｍのカラム を置いたファルマシア社製セファクリル５２００ＨＲであった。

段階Ｃ）の最後に得られた溶液を１０ｋＤａのストップ閾値を有する酢酸セルロ ースらせん膜上で濃縮した後、溶液をあらかじめｐＨ６。

５のりん酸ナトリウム５０ｍＭ水溶液で平衡化したカラムに注入し、グリコジル 化ＩＬ−２を最後に述べた溶液で溶出した。溶液は光学濃度２８０ｎｍで測定す ることによりカラム出口で検出した。集めた様々な分画をそれらの純度に従って 合わせて、逆相ＨＰＬＣで分析した。

生成物はりん酸ナトリウムのグリコモル化！Ｌ−２溶液０．６リツトルであった 。

３、生成物の純度の検定 ＊ＳＤＳ存在下ポリアクリルアミド電気泳動還元剤（ジチオスレイトール）存在 下ＰＡＧＥ−ＳＤＳポリアクリルアミド（硫酸ドデシルナトリウム）の電気泳動 がラエムリ法（Ｕ。

Ｋ、ラエムリ、アナルズ・オブ・バイオケミストリー、第７８巻、第４５９頁（ １９７７年））で実施され、ノリル法（Ｃ，Ｒ，メリル、プロシーディンゲス・ オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・ニーニスエイ、第 ７６巻、第４３３５頁（１９７９年））により銀染色した。

生じた電気泳動図は第３図に示され、これはグリコジル化ＩＬ−２の純度が９９ ．５％以上であることを確証している。

＊逆相カラムのＨＰＬＣ分析 クロマトグラフィー支持体はグラフトシリカゲル、すなわちソシエテ・フランセ ーズ・ド・クロマトーコロンヌ社製粒径５μｍのヌクレオシルＣ４３００Ａであ った。溶出は（７０％Ａ＋３０％Ｂ）から（２５％Ａ＋７５％Ｂ）の６分勾配で 実施した。Ａは０．１％トリフルオロ酢酸を含む水溶液で、Ｂは０．１％トリフ ルオロ酢酸を含むアセトニトリル溶液であった。

生じたクロマトグラムは第４図に示され、総生成の約５．５％の不純物が１つ見 られる。不純物は部分的に特徴づけられ、それはＣＴＬＬ−２活性を有する酸化 グリコジル化ＩＬ−２であった。

＊陽イオン交換カラムの）ＩＰＬＣ分析クロマトグラフィー支持体はクルゼアウ 社製「ポリキャットＡ５μｍ３００　ＡＪのポリアスパラギン酸被覆シリカゲル であった。溶出は（８５％Ａ’＋　１５％Ｂつから（７５％Ａ’＋２５％Ｂつの ３．５開、および（７５％Ａ’＋２５％Ｂ＋）から（５０％Ａ’＋５０％Ｂつの ６゜５＋＋＋ｍの勾配で実施され、ＡｌはＫＨ１ＰＯ４（ｐＨ５，０、モル濃度 ２５ｍＭ）、Ｂ′はＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ５，０、モル濃度２５ｍＭ）および１Ｍ 塩化ナトリウムであった。

生じたクロマトグラムは、第５図に示され、２つの型のグリコジル化ＩＬ−２の 存在、すなわちＩ　Ｌ　−２（Ｎ＊）４８％およびＩＬ−２（Ｎ、）５２％の定 量に使用することができる。他の試験ではＮ、が優勢である。

４、バランス 各単離段階の最後では、保持生成物に存在するＩＬ−２量をそのＣＴＬＬ−２活 性を測定することにより測定した。ＩＬ−２の様々な型は同じＣＴＬＬ−２活性 を有している。

その結果を以下第１表に示す。

第１表 総収率＝４９．４％ 表が示すように、単位容鴬あたりのＣＴＬＬ−２活性は培養培地中よりも段階２ −ｄ）の最後でのほうが１０倍濃縮されており、グリコジル化ＩＬ−２の総収率 は上清に存在する総ＫＬ−２に対して約５０％であった。

実施例６：　ＣＨＯ２０９，２７セルラインの上清から出発する、本発明の方法 により単離したグリコジル化インターロイキン−２の特性 一特異的ＣＴＵ−２活性の測定＝（１８±３）ｘ　１０’Ｕ／ｘｖ−末端アミノ 配列の決定 産生物の試料は、臭化へキサジメスリン（または、ポリブレン）フィルターを通 した。フィルターは、生成したフェニルチオヒダントイン誘導体を連続的に分析 するクロマトグラフィー（４３０Ａ型−アプライドーバイオシステムズ）を装備 したプロテインシークエンサ−（４７０Ａ型−アプライドバイオシステムズ（Ｕ 　Ｓ　Ａ））に挿入した。

この測定の結果は、すでに解読された天然の産生物の配列（Ｒ，ロブらプロシー ディング・オブ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス、ＵＳＡ　８１巻 ６４８６−６４９０頁（１９８４年））と、アミノ酸が検出されなかりた３位に 関しては例外であるが、それ以外は一致した。３位にアミノ酸が検出されなかっ たのは、３位にオリゴ糖が存在したためと説明される。

この配列の最初の６個のアミノ酸は以下のとおりである。

Ａｌａ　−Ｐｒｏ　−Ｔｈｒ　−Ｓｅｒ　−Ｓｅｒ　−Ｓｅｒ　−Ｔｈｒ　−Ｌ ｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｔｈｒ−一次構造の決定 還元およびカルボキシメチル化した産生物は、室温で、トリプシンを１／３０（ 重量／重量）の割合で加えて一晩分解させた。そして得られたペプチドは、逆相 ＨＰＬＣクロマトグラフィーを用い、アセトニトリル勾配（０，１％トリフルオ ロ酢酸の存在下）で、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソツメ８１巻１５ −３０頁（１９８５年）に記載された方法により分離した。

各々のトリプシン処理、精製ペプチドは、アミノ酸分析に供し、一部はエドマン 減成に供した。

このようにして、単離産生物の完全なアミノ酸配列が分析できた。

これは、すでに解読された天然産生物のアミノ酸配列（Ｒ，ロブら、プロシーデ ィング・オブ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス、ＵＳＡ　８１巻６ ４８６−６４９０頁（１９８４年））に合致する。

ビニル−４−ピリジンと反応した後得られた産生物のトリプシン処理ペプチド地 図の研究より、産生物をジチオスレイトールで還元する前後で、システィン５８ とシスティン１０５の間にジスルフィド架橋およびシスティン！２５に遊離チオ ール基（Ｓ　Ｈ）があることを示している。

一オリゴ糖の分析 ＳＤＳ存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動によると、Ｎ、型およびＮ、 型に相当する分子量約１６．５および１６．０ｋＤａの２形態の産生物が示され た（第３図参照）。ノイラミニダーゼ処理（Ｐ、フェラーラら、２２６巻１号４ ７−５２頁（１９８７年））すると、検出されていた２本のバンドが消失し、分 子量！５．５ｋＤａのＮｏ型（第３図参照）に相当するバンドが発現する。この ことは、２者の相違点は、分子中のシアル酸の存在に帰するものだということを 示している。産生物は、クロマトエレクトロフォカリセーション（ｅ　ｈ　ｒ　 ｏ’ｍａｔｏｅｌｅｃｔｒｏｒｏｃａｌｉｓａｔ　１ｏｎ）で分析し、この結果 を確認し、これら２成分の等電点を測定した。すなわち、分子量１６．５ｋＤａ Ｏものは７．０、分子量１６ｋＤａのものは７．６であった。

−糖の構造の特性 １５．５ｋＤａのバンドに相当する物質（ノイラミニダーゼ処理により得られる ）を特異的Ｏ−グルカナーゼ（すなわち、ゲンザイムより発売されている０−グ ルカナーゼ、商品番号：２０　０−ＡＳＥ）で処理１．て、さらに糖分析を行っ た。この酵素処理により、物質の分子量が１５．５ｋＤａから１５．０ｋＤａに 減少したが、物質の電荷は変化しなかった。最終的にＮ１型およびＮ、型の精製 Ｎ末端トリプシン処理ペプチドを、ＦＡＢ　ＭＳ（高速原子衝撃質量分析法）で 分析した。その結果、Ｎ、型のＮ末端トリプシン処理ペプチドには、Ｎ−アセチ ルガラクトサミン、ガランＩ・−スおよび２個のノイラミニン酸が付いており、 Ｎ、型のＮ末端トリプシン処理ペプチドには、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガ ラクトースおよび１個のノイラミニン酸が付いていることが、確認された。本発 明によるグリコジル化［、−２ＯＮ、型およびＮ、型の糖の構造は、コンラドッ トらのニーロビアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー１５３巻２５５− ２６１頁（１９８５年）に記載されたＮ、およびＮ、型の糖の構造と同一であっ た。

一グリコジル化ＩＬ−２の免疫特性 タンパク質の立体配座と、抗原特性の間には相関性があり、従ってその相関性を 研究して、分子の３次元構造に関する情報を得ることができる。

グリコジル化Ｉ　Ｌ−２（Ｎｔ＋Ｎｔ）、並びに天然ＩＬ−２Ｃバイオテ曵トー ＲｐＡ）および実施例８記載のとおり調製したＩＬ−２コリの抗原特性を、２種 のＲＩＡ（ラジオ−イムノ−アッセイ）システムを用いて、研究し、比較した。

最初は（ＲＩＡ：Ａ）は天然抗ＩＬ−２モノクローナル抗体（サンドル・レジオ ナール・デ・トランスフュージョン・サンジーン・デ・ベサンコンにより供給さ れたＢＧ５抗体）を用いた。次に（ＲＩＡ：Ｂ）、抗ＩＬ−２コリ・ヒツジ抗血 清（バッチ番号ＰｏＩ２−１１００−０９−セルチックＵＫ、）を用いた。

両方とも、トレーサーには、ヨード１２５で標識したＫＬ−２（Ｎｔ）を用いた 。

以下の第２表には、これらのシステムの各々の置換曲線から得られたＩＣｓ。値 （すなわち、被験抗体の標識化したＩＬ　２（Ｎｔ）の５０％置換可能なＩＬ− ２濃度）を示す（示された値および標準偏差は、このパラメーターを３回、別個 に測定し、計算したものである）。

表２表 ＩＣ，。値は類似であるようだが、ＩＬ−２コリで得られた値とけ有意に異なり 、抗体がモノクローナルであるＲＩＡ　Ａシステムで得られた結果は、とりわけ 明確であり、信頼性が高い。この知見より、グリコジル化Ｉ　Ｌ−２（Ｎ＋＋Ｎ ＊）および天然！Ｌ−２の３次元構造が類似であることが示され、グリコジル化 ＫＬ−２（Ｎ＊＋Ｎｔ）および［、−２コリの３次元構造は相異なり、従って、 抗原決定基が異なることが示された。故に、ＩＬ−２コリが抱える問題の１つは 、免疫原性である（グリゲルＰ、Ｌ、ら、キャンサー・リサーチ４８壱３８７５ −３８８１（１９８８年）およびアレブレツタＭ、ら、ジャーナル・オブ・クリ ニカル・イムノロジー、６巻６号４８１−４９０（１９８６年））。これらの問 題が、！Ｌ−２コリに特異的な抗原決定基に依るものであり、天然ＩＬ−２には 欠如しているということは、非常にあり得ることである。グリコジル化ＩＬ−２ は、構造および合成方法では天然ＩＬ−２に類似しているが、このような抗原決 定基を持たないということは、非常にもっともらしく、前述の結果で確認されて いる。

実施例７：　５８．１２セルラインの培養上清から出発する、本発明の方法によ るグリコジル化インターロイキン２の単離 ｌ−培養上清からの、インターロイキン−２に富むフランクジョンの分離 実施例３記載の培養Ａの上清２０（Ｈを採取し、分離し、ＩＬ−２に富むフラク ションを、まず遮断限界値１００ｋＤａのポリスルホン膜、次に遮断限界値１０ ｋＤａのポリスルホン膜で、二重限外濾過を行い濃縮した。操作は、前述の実施 例５と同じ方法で行った。ＴＬ−２の濃縮水溶液５．６Ｃが得られた。

２−グリコジル化ＩＬ−２の単離 ａ）カチオン交換クロマトグラフィー クロマトグラフィーの保持体は、アガロースに架橋結合した、強度はカチオン交 換を基礎にしたゲルすなわち、ファルマシアから発売されている“Ｓ、セファロ ース・ファスト・フロラ”である。

前段階で得られた溶液に酢酸を添加して、ＰＨを５．５に調整し、伝導率は、希 釈して５ａＳに調整した。次いで溶液をカラムに注入し、それを、塩化ナトリウ ムでイオン強化した別の酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ５、５、重量モル濃１１ ！５０ｓＭ）で連続的に洗浄した。

グリコジル化！Ｌ−２は、塩化ナトリウムの１８０ｍＭ溶液で溶離し、グリコモ ル化ＩＬ−２水溶液５．７６（！が得られた。

ｂ）疎水性相互作用クロマトグラフィークロマトグラフィーの保持体は、親水性 ポリビニルレジンを基礎にし疎水性相互作用ゲル、すなわち、メルクから発売さ れている“ブチル・フラクトゲル６５０　（Ｍ）”であり、直径５ｏＩＩＩＩＩ のカラム中に充填した。

酢酸アンモニウムをモル濃度１．６Ｍまで、先に得られたグリコジル化［、−２ 溶液に加え、アンモニアを加えてｐＨ６，５に調整し、その溶液を緩衝液Ａ、す なわち酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ６、５、モル濃度１．６Ｍ）で前もって平 衡にしてがらカラムに注入した。これらの条件下で、グリコジル化！Ｌ−２は、 クロマトグラフィーの保持体に保持された。カラムは、緩衝液Ａで洗浄し、保持 されなかった物質を取り除いた。カラムは、緩衝液Ｂ５すなわち、酢酸アンモニ ウム溶液（ｐＨ６、５、モル濃度０．６５Ｍ）で溶離した。

グリコモル化ＩＬ−２水溶液１．３６１２が得られた。

Ｃ）排除クロマトグラフィー クロマトグラフィーの保持体は、架橋デキストランを基礎にしたゲル・すなわち 、ファルマシアから発売されている“セファクリル５２００ＨＲ”である。

ｂ）工程の最後に得られた溶液は、酢酸セルロース膜、すなわち、ストップ閾値 １０ｋＤａのアミコン社製ＹＭＩＯＩＩ上で濃縮した。溶液はリン酸ナトリウム 水溶液（ｐＨ６，５、モル濃度０．１Ｍ）で先に平衡にして、カラムに注入した 。グリコジル化ＫＬ−２は、上述のこの溶液で溶離した。

３−産生物の精製の実証 ラエムリ法（Ｕ、に、ラエムリ、アナリティヵル・バイオケミストリー７８巻（ １９７７年）により、還元剤（ジチオスレイトール）の存在下、ポリアクリルア ミドゲルＰＡＧＥ−ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）ゲルを用いた電気泳動後 、ノリル法による銀染色（Ｃ，Ｒ。

メリル、プロシーディング・オプ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス ・オブ・ジ・ユナイテッド・ステート・オブ・アメリカ７６巻４３３５頁（１９ ７９年））をし、グリコジル化ＩＬ−２の純度は、９９％以上になることがで示 された。

実施例８　グリコジル化インターロイキン−２のヒト・リンパ球に及ぼすイン・ ビトロ活性 グリコジル化インターロイキン−２、およびＬＡＫ細胞産性エシェリキア・コリ 由来の組換えインターロイキン２の比較研究本実施例および以下の実施例で記載 される実験は、実施例５に記載のとおり単離した１　０９．２７系により産生さ れた組み換えグリコジル化ＩＬ−２を用いて行った。この産生物は、通例グリコ ジル化ＩＬ−２、または、混同する危険性がある場合はグリコジル化■Ｌ　２　 （Ｎ　ｒ　＋　Ｎ　ｔ）と称する。

１−イン・ビトロでのＬＡＫ細胞産生実験の、ガン研究における重要性 獲得免疫療法は、ガンに対する治療の新しいアプローチであり、宿主の腫瘍に対 する免疫学的な防御反応の増強を目的としている。

ヒト末梢白血球をＩＬ−２存在下で培養すると、ガン細胞に対して強力な細胞毒 活性を存するようになる。この効果を示す細胞は、ＬＡＫ（“リンホカイン活性 化キラー”ＸＭ、Ｔ、ロツッら、キャンサー・リサーチ４１巻４４２０−４４２ ６頁（１９８１年））と称する。

ＬＡＫ細胞の作用は、採取されたばかりの腫瘍細胞を含む、全ての種類の腫瘍に 対して影響を与える。これらは、正常細胞に対しては、何ら活性を示さない、、 ＬＡＫ細胞は機能的に定義すると、ＩＬ−２で刺激した後、前もって抗原感作し なくても、ＮＫ（”ナチュラルキラー°）細胞の作用に抵抗性のある腫瘍細胞に 対してとりわけ選択的に向けられた、制限弁ＭＨＣ（’主要組織適合複合体”） 細胞毒性を発現する細胞である。この定義により、ＬＡＫ細胞はＮＫ細胞（すな わち、ＩＬ−２により活性化されずにそのままで細胞毒性がある）および細胞毒 性Ｔセル、その作用がＭＨＣを抑制し、標的による予備感作を獲得するもの、と 明確に区別される（Ｊ、Ｅ、タルマジェら、キャンサー・ドウリート、レップ、 ７０巻１７１頁（１９８２年））。

最近の研究では、実際には、ＬＡＫ細胞はおそら＜ＩＬ−２により強化されたＮ Ｋ細胞であり、ＬＡＫ前駆体は、事実、°巨大顆粒リンパ球”に由来すると示唆 される。（Ｋ、イト−ら、ジャーナル・オブ・イムノロジ−１３６巻３９１０− ３９１７頁（１９８６年））。

インターロイキン２は、イン・ビトロだけでなく、イン・ビボでもＬＡＫ細胞を 産生ずる。イン・ビトロでＬＡＫ細胞を産生させる特定のＫＬ−２の能力は、そ れ故に、抗腫瘍活性の可能性を示す重要な指標である。

２−実験方法 ａ）以下の種類のインターロイキン−２を試験したニーグリコジル化Ｉ　Ｌ　− ２（Ｎ１＋Ｎｔ）一実施例５の２ｂ工程中に単離されたフラクション１を、実施 例５のＣ）およびｄ）工程に供して得られたグリコジル化ＩＬ−２（Ｎ、） 一実施例５の２ｂ工程中で単離されたフラクション３を、実施例５のＣ）および ｄ）工程に供して得られた非グリコジル化ＩＬ−２（Ｍ） 一後述のとおりに調製したエシェリキア・コリ由来の組み換え工Ｌ−２、今後し ばしばＩＬ−２コリと略称するＩＬ−２をコード化した遺伝子は、エシェリキア ・コリ細胞に移入し、高収率で発現させる。溶解し、再生し、逆相ＨＰＬＣクロ マトグラフィーおよびリアングらにより記載された方法（Ｓ、１．リアングら、 ザ・バイオケミカル・ジャーナル２２９１に４２９−４３９頁（１９８５年）） による排除クロマトグラフィーで精製すると、５−１０ｘ　１０５Ｕ／ｚ９の特 異活性を有する組み換えタンパクが得られる。

ｂ）　リンパ球の調製 培地は、熱で不活化（５６℃で１時間）した１０％ＡＢヒト血清（ＣＴＳプルパ ン、トウールーズ、フランス）を加えたＲＰＭ１１６４０（ギブニーＢＲＬ）、 ２ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍＭＨＥＰＥＳ、４ｍＭＬ−グルタミン、Ｉ　 ＯＯＵ／ｃ＋１２ペニシリン、１００μｇ／ｍＱストレプトマイシンおよび０． ２５μｇ／ｆｆ１Ｉ２アンホテリシンＢがら成る（この培地は、以下完全培地と 称する）。

健常者の血液は、無菌条件下で採取した。

末梢リンパ球は、Ａ、ボユムによる“メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｇ、 ジサバト、Ｊ、Ｊ、ランボン、Ｈ，パン、ブナキス編月０８巻８８頁アカデミツ ルプレス・インコーホレイテッド（１９８４年）に記載された方法で、フィコー ル−ハイバーク（ファルマシア）グラジェントを用いて遠心し、赤血球および顆 粒球より分離した。

リンパ球は、完全培地で３回洗浄した。

付着細胞（単球およびマクロファージ）は、プラスチックに付着させて除却した ：細胞は完全培地にｍｉ２あたり５−１０ＸＩＯ’の濃度で懸濁し、培養フラス コ中に１−２Ｘ１０’セル／ｃ１ｍｌの密度で播種した。フラスコは、５％ＣＯ １存在下、３７℃で１時間放置し、その後、非付着性リンパ球は、培養フラスコ をおだやかに振とうした後、吸引して回収した。

ｃ）ＩＬ−２存在下のリンパ球のイン・ビトロ培養前節で単離した非付着性リン パ球は、１回洗浄し、ＩＬ−２の２種の被験体を各種濃度（１００，３０，１０ およびＩＵ／ｍ１２）の存在下、３７℃で、および５％ｃｏ、存在下４８時間、 完全培地中でｌＯＳセル／ｍＱの濃度で培養した。次いで細胞を洗浄した。これ らの細胞は、以下有効細胞とみなす。

ｄ）細胞毒性の実証 有効細胞の細胞毒性活性は、Ｓ、Ｚ、サラツブインら（ピロロジ−１２９巻５１ −６４頁（１９８３年）およびサイエンス２２３巻７０３−７０７頁（１９８４ 年））に記載された、ＮＫ型細胞毒性抵抗性ヒトＴリンパ様Ｃ８１６６−４５／ Ｃ６３系の標的細胞に４時間接触させた後、評価した。この系統は、以下、ＨＴ Ｉ系と称する。標的細胞６Ｘ１０’セルは、血清を含まない完全培地０　、４　 ｍ１２中３７℃で１時間、”　Ｃｒ（クロム酸ナトリウム、アメルシャム）２０ ０μＣｉで標識化し、数回洗浄した。標的細胞（完全培地０　、１　ｍ１２中１ ０４）および完全培地０．１１中の有効細胞は、標的細胞に対する有効細胞の比 率を変化させて（５０：１，１０：１．１：ｌ）、丸底マイクロタイタープレー ト（ファルコン）中に分配した。マイクロタイタープレートは遠心にかけ、３７ ℃で４時間、５％ＣＯを存在下でインキュベートした後、各ウェルから上清を回 収し、ガンマ−カウンターを用いて放射活性を測定した。細胞毒性は、死んだ標 的細胞により放出された！ＩＣｒ量から決定した。非特異的細胞毒性は、有効細 胞が存在しない場合に、標的細胞により自発的に放出される放射活性の量から決 定した。細胞毒性の最高値は、有効細胞が存在せず、ＩＮ塩酸が存在する場合の 、標的細胞による放射活性の放出量から決定した。各々の実験ポイントは３倍（ 非特異的および最高細胞毒性の決定においては、６倍）であり、特異的細胞溶解 の割合は、以下の式に従い、平均値に標準偏差を加え、または減じて計算する： 特異的細胞溶解パーセント 最高ｃｐＨｌ−非特異的ｃｐ＋ｎ 前述のｂ）、Ｃ）およびｄ）で記載した方法は、グリコジル化ＩＬ−２（Ｎ、） および非グリコジル化ＩＬ−２（Ｍ）の場合も行う。Ｈ，Ｄ、エンガーズ（Ｈ， Ｄ、エンガーズら、メソッズ・オブ・エンゲイモロジ−１３２巻４３７−４５７ 頁（１９Ｂ６年））に記載された、わずかに異なる方法を、（Ｎ　、＋　Ｎ　ｔ ）グリコジル化ＩＬ−２およびＩＬ−２コリの場合に使用し、これはＨＴＩ、ダ ウディおよびジャーカット系からの、全ＮＫ溶解に抵抗性を示す標的細胞で試験 した。

３−結果 結果は後述の第３表および第４表に集計した。

第３表 非グリコジル化ＩＬ−２（Ｍ）およびグリコジル化ＩＬ−２ｃＮりにより健常者 から産生じたＬＡＫ細胞の、ＨＴ、系に対する細胞溶解活性 第４表 健常者のリンパ球を用いて多種インターロイキン−２により産生じたＬＡＫ細胞 の、ダウティ、ＨＴＩおよびジャーカット系に対する細胞溶解活性 ＊結果は、組み換えＩＬ−２コリと比較した活性指数として表現し、以下のよう に定義する。

第３表では、ＨＴ　ｉ系から標的細胞の場合の以下のことを示す＝ＩＬ−２濃度 が１０００　Ｕ／ｍｆｆ以下での、グリコジル化ＩＬ−２（Ｎ、）の優越性； −有効細胞の標的細胞に対する比率が低下した場合、この優越性は上昇する。

−ＩＬ−２の比率が高い場合（１０００Ｕ／ｉｆりおよび／または有効細胞の標 的細胞に対する比率が高い場合、優越性は低下する。

第４表では、ダウディ、ＨＴ、およびジャーカット系からの標的細胞の場合の、 以下のことを示すニ ーＩＬ−２２０１Ｊ／ｍｆｆの濃度での、ＩＬ−２コリと比較したグリコジル化 ＩＬ−２の優越性ニ ー　ＩＬ−２濃度が上昇した場合、この優越性は低下する。

これらの研究より以下のことが判明するニー　グリコジル化ＩＬ−２は、３Ｎの 腫瘍細胞系に対して活性のあるＬＡＫ細胞を産生ずる。

−二のＬＡＫ活性は、ＩＬ−２コリでより、グリコジル化ＩＬ−２での方が、低 濃度で得られる。

−グリコジル化ＩＬ−２により産生するＬＡＫｉｍ胞活性は、以下の２つの場合 、ＩＬ−２コリにより産生ずるＬＡＫ細胞の活性よりも大きい： ＊ＩＬ−２が低濃度 ＊有効細胞の標的細胞に対する比率が好ましくない（１０／１以下） これらの結果は、グリコジル化ＩＬ−２の臨床使用に関してとりわけ有望である 。なぜならば、これらの研究から、この形態のＩＬ−２は、ＩＬ−２コリよりも 低濃度で使用して同様の抗腫瘍効果を得ることができるからである。このため、 産生物投与に関る毒性を実質的に減少させるであろう。

実施例９：グリコシル化インターロイキン−２の免疫調節活性：マウスにおける 体液性介在物質に対する免疫応答の刺激 ａ）研究の目的 ＩＬ−２は、イン・ビボで非免疫化マウスにおけるポリクローナルイムノグロブ リンＭ応答（以下、ＩｇＭと略す）および免疫化マウスにおける特異的１ｇＭ応 答を刺激しくＣ，Ｍ、ウェガンド、ジャーナル・オブ・エフベリメンタル・メチ ４９２１６３巻１６０７−１６１２（１９８６年））、次にＩＬ−２コリはイン ・ビトロでヒト細胞における活性化Ｂリンパ球の分化を誘起する能力がある（Ｔ 、Ａ、ワルドマンみ、ジャーナル・オブ・エフペリメンタル・メディシン１６０ 巻１４：＋０−１４６６頁（１９８４年））ことが示されたので、この研究は、 一方で動機づけされることになった。研究目的は、ＢＡＬＢ／Ｃマウスにおける 体液性介在物質に対する免疫応答を刺激した場合のグリコジル化インターロイキ ン−２のイン・ビポ活性を、胸腺依存抗原（卵アルブミン）での免疫化に対する 一次的な膵臓の応答を測定することにより評価することである。

ｂ）実験方法 α）動物−環境条件 ＊　種：　ＢＡＬＢ／Ｃマウス ＊　馴化：動物は、処置開始前１週間、馴化した。

＊　動物数：雌９０匹 ＊　実験開始時の動物の体重：約２０ｇ＊　餌：動物には、Ｖ、Ａ、Ｒ社製完全 複合試料ＡＯ４，ｃを自由に与えた。

＊　水：自動装置を用いて、水道水を自由に与えた。

環境条件ニ ー　温度２２℃（＋２℃） −湿度６０％（±ｌＯ％） ＊　飼育場所：動物は、ステンレス−スチール製のケージ中で飼育した。動物は 、５匹づつのケージ中に分配し、同じバッチから１５匹の群に分配した。

β）動物の処置 動物は、実験第１日に、電気永動による純度９８％の卵アルブミン（シグマ社製 、商品番号：Ａ−５３７８）で、マウス１匹あたり５０μｇ卵アルブミンを０　 、５　ｉｆｆ無菌ＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水）に溶解して腹腔内投与 することにより免疫化した。卵アルブミン（分子量４００００．既知の抗原決定 基５）は、良好な免疫原性を有する異種タンパクであるので、抗原として選択し た。

実施例５に記載のとおりに単離したグリコジル化ＩＬ−２は、ＰＢＳ＠衝液で１ ：８０に希釈した正常ＢＡＬＢ／Ｃマウス血清中、２．４．６および８日に腹腔 内投与した。血清中のタンパクの存在は、免疫系に有意に影響をおよぼすことは ないが、管または注射器の壁への非特異的吸着による！Ｌ−２の損失避は得る。

以下の表は、種々のバッチのマウス１５匹への投与量を示す。

動物は９日に屠殺した。

γ）測定の実施 死亡した動物の体重を測定した後、無菌条件下で膵臓を摘出し、重量を測定し、 機械的にすりつぶした。すりつぶした試料は、滅菌ガーゼで濾過して結合−脂肪 源を全て除去し、４００．で１０分間遠心にかけた。膵臓細胞は懸濁し、３回洗 浄した。洗浄後、動物あたりの膵臓細胞の全数を計算するために、数を数え、所 望の細胞濃度とした。膵臓細胞は、１０％ウシ胎児血清を含有する培地（メサー ズ・バイオプロ社製ＲＰＭＩ培地１６４０）ｄのあたり２Ｘ１０’生存牌臓細胞 を含有するポリスチレンプレート製の５１ウエル中、９６時間培養した。

以下に示した放射線免疫測定法により、種々の洗卵アルブミン１ｇＭを測定した 。

＊　１８時間、＋４℃での、ｐｖｃプレー）（５０μｇ／ｍｆ２の０．１Ｍ５ｐ Ｈ７，５リン酸緩衝液溶液、ウェルあたり１００μｇ）上の卵アルブミンの吸収 ＊　０．１Ｍ５ｐＨ７，５リン酸緩衝液でウェルを洗浄後、ウェルは、１％トウ イーン２０界面活性剤（容量／容量）の０．１Ｍ５ｐＨ７，５リン酸緩衝液溶液 ２００μＱで、３７℃で１時間、飽和する。

＊　ウェルを洗浄しに後、培養上清を０．１Ｍ、ｐＨ７，５リン酸緩衝液で１／ ２に希釈し、０．１％（ｐ／　ｖ）ゼラチンおよび０．１％（容量／容量）トウ イーン２０界面活性剤と共に、＋４℃で１８時間インキュベートして測定する（ ウェルあたり１００μＩ２）。

＊　ウェルを洗浄した後、ヨード１２５で放射線標識（７，５，１／２Ｃｉ／　 １／２ｇ、　２５００００ｃｐｎ／　！　００μｇ、＋３７℃で３時間）したポ リクローナル抗マウスＩｇＭヒツジ抗体（イムノチックより発売、商品番号：１ １５−０５７５）、ウェルあたり１００μＱと共にインキュベートする。

＊　ウェルを溶液（０，９％Ｎ　ａ　Ｃ＋２）　（ｐ／　ｖ）、０．１％トゥイ ーン２０（ｖ／　ｖ））で洗浄した後、ガンマ−カウンターを用いて、固定され た放射活性を測定した。

以下に示した、各マウスで行う種々の測定は、マウスの各バッチごとに行った。

すなわち、各投与１、体重に相対する膵臓の平均重量の計算、動物あたりの膵臓 細胞の平均全数、および膵臓細胞に誘起される抗弁アルブミンＩｇＭの平均量で ある。後者の量は放射活性に比例する。

Ｃ）結果 結果は第６．７および８図に示す。考察は以下のとおりであるニー　投与量１． ８８　ｘ　１０’Ｕ／ｋｇ（すなわち、３７５００　Ｕ／マウス）で開始した場 合、グリコジル化ＩＬ−２は、膵臓重量および動物あたりの膵臓細胞の全数に、 ５０％以上の相対的な増加をもたらす。実験（ここでは示していない）により、 全Ｔリンパ球の比率が他に比べて増加（２０％）することも示された。

−投与量が１．８８ｘ　１０６Ｕ／ｋｇ以上の場合、各形質細胞により誘起され る特異的な種類の１８Ｍ量が、有意に増加する。

従って、グリコジル化ＩＬ−２は、かなりの免疫刺激活性を有する。

実施例１０：グリコシル化インターロイキン−２の抗腫瘍活性：マウスにおける ガンの免疫療法 ａ）実験方法 この実験は、５バツチに分けたＤＢＡ／２マウスを用いて実施した。０日に、リ ンホザルコーマＳＬ２の同遺伝子型細胞０．２Ｘ１０４をマウスに腹腔的注射し た。

最初の一連の実験では、実施例５記載のとおりに単離したグリコジル化インター ロイキン−２を種々投与量（０，８，４０，２００，１０００および５０００Ｕ ／日）で、３−７日および１０−１４日に、別個の５バツチのマウス６匹に注射 した。その日の生存マウス数は、３０日間数えた。この最初の一連の実験より、 グリコジル化インターロイキン−２を５０００ＴＪ／日投与した場合に抗腫瘍活 性が示された。

第２の一連の実験では、投与量は５０００Ｕ／日に定めて１０−１４日に投与し 、前投与の盪および、投与した日を変更した。

ｂ）結果 第２の一連の実験の結果を、以下の第５表に示し、第９図に図示した。０．１， ２および３バツチでの３０日間生存マウス数は第５表に示す。

第５表 これらの結果より、グリコジル化インターロイキン−２が、かなりの抗腫瘍活性 を示すことが、非常に明確である。

実施例！！：マウスにおけるグリコジル化インターロイキン−２の毒性試験 ａ）実験の目的 組み換えＩＬ−２（エシェリキア・コリで産生）をヒトまたはマウスに、単独で （Ｍ、ローゼンスタインら、ジャーナル・オブ・イムノロジ−１３７巻１７３５ −１７４２頁（１９８６年））またはＬＡＫ細胞と一緒に（Ｓ、Ｅ、エツチング ハウゼン、ジャーナル・オブ・ナシデナル・キャンサー・インスティテユート８ ０巻３号１７７−１８８頁（１９８８年））を投与した場合の主な毒性効果は、 血管内液の供出、すなわち、特定の臓器（胸腺、膵臓、肺、肝臓および腎臓）で のこの液の貯留である。

従って、本実験の目的は、３日問および６日間、１日３回腹腔内投与した時の、 ＢＡＬＢ／Ｃマウスの血管内体液貯留を調べて、グリコジル化インターロイキン −２の毒性がもしあるならばそれを評価することである。

ｂ）実験方法 実験は、Ｍ、ローゼンスタイン記載の方法（Ｍ、ローゼンスタインら、ジャーナ ル・オブ・イムノロジ−１３７巻１７３５−１７４２頁（１９８６年））と類似 の方法で行った。

α）動物−環境条件 ＊　種：ＢＡＬＢ／Ｃマウス ＊　実験開始時の動物の適齢：約４週 ＊　馴化＝１週間 ＊　動物数：雌１２０匹 ＊　実験開始時の動物の体重：２０１ｉ１＊　同定方法：耳に標識をつける に応じて ＊　水：水道水を要求に応じて ＊　環境条件 −温度＝２２℃（±２℃） −湿度＝６０％（±１０℃） −光照射時間＋１２／２４時間 ＊　飼育場所ニステンレス・スチール・ケージ。

動物はｌバッチあたり１２匹の群になるように分配した。

β）動物の処置 実施例５記載のとおり単離したグリコジル化ＩＬ−２は、ＰＢＳ緩衝液（リン酸 緩衝生理食塩水）で１＝８０に希釈した正常ＢＡＬＢ／Ｃマウス血清中、０．２ ．３．４および５ノ（ツチには３日間、並びに１，６．７．８および９バツチに は６日間、１日３回（朝、昼、り）腹腔的投与した。投与容量は０．５πＱであ った。

下表は、各バッチの１２匹のマウスに投与した投与量を示す。

０．２．３．４および５バツチの動物は、４日めの最後に層殺し、１．６．７お よび８バツチの動物は７日めに層殺した。

γ）実施した試験 一臨床試験 動物は全実験期間中、毎日観察した。

以下に記載する試験は、各バッチの最初の６匹のみに実施した。

−剖検試験（４日および７日） マウスは、ベンドパルビトンで麻酔した。

−血液検査 剖検中、腹部大動脈より血液試料を採取し、生化学分析を行った。

−解剖学的研究 体液貯留に伴う毒性を検出するために、肝臓、膵臓、腎臓、胸腺および肺を摘出 し、重量を測定した。

乾燥していない時の重量測定：臓器は、凍結乾燥フラスコ中で重量測定した：各 フラスコ（動物あたりおよび臓器あたり１個）は臓器を入れる前に重量を測定し ておく。

乾燥重量の測定：臓器は一８０℃で凍結し、凍結乾燥機中、４日間凍結乾燥した 。

一特殊試験 この試験は、各バッチの最後の６匹の動物で実施した。０．２．３．４および５ バツチの場合は４日に、１．６．７．８および９ノくツチの場合は７日に、ヨー ド１２５で放射線標識化したウシ血清アルブミン（特殊活性５μｃｉ／ｚ９）を ２μＣ１１マウスに血管的投与した。

注射後２時間でマウスを層殺し、肺、腎臓、肝臓、胸腺および膵臓を摘出し、重 量測定し、ガンマ−カウンターで各臓器の放射活性を測定できるように、５ｄＰ ＶＣ管中に設置した。

放射性ヨード・ウシ血清アルブミンは、血管内液の濡出を示す標識とみなすこと ができる（１）。従って、ＩＬ−２処理したマウスの臓器が、対照マウスの臓器 より放射活性が強ければ、ＩＬ−２は、試験中の臓器中の血管内液貯留に影響を 及ぼす、ということになろう。

Ｃ）結果 一臨床試験 動物の行動には変化がなく、死亡は記録されなかった。

−血液検査 生化学的バラメーター（全タンパク、アルブミン、トリグリセリド、尿素および クレアチニン）の評価より、肝または腎毒性には全く問題はなかった。

一胸腺、肝臓、肺、膵臓および腎臓の乾燥していない時および乾燥した時の重量 の比較研究 胸腺および腎臓の乾燥していない時の重量は、処置３日または６日後、ＩＬ−２ の投与量にかかわらず増加しなかった。

膵臓、肺および肝臓の乾燥していない時の重量は著明に増加したが、特に処置６ 日後の乾燥していない重量に対する乾燥重量の割合は変化しない。このことは、 これらの臓器中の水分の比率は一定であったことを意味し、ＩＬ−２の薬理活性 で生じる、リンパ組織増殖を示す。

一放射線標識化したアルブミンを用いた、何らかの誘起があるとすれば、ＩＬ− ２誘起の濡出の動的研究 試験中の臓器、すなわち胸腺、肝臓、肺、膵臓および腎臓におけるヨード１２５ で標識化したウシ血清アルブミンの比率には、投与量、処置期間にかかわらず著 明な変化はなく、膵臓では、はとんど変化しかなった。

ｄ）結論 Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウスに実施した毒性試験より、グリコジル化ＩＬ−２の評 価し得るほどの毒性効果は示されなかった。さらに具体的には、Ｍ、ローゼンス タインが用いた試験方法を行うと、ＩＬ−２コリの場合に記載されたような血管 内液の濡出は認められなかった。

実施例１２：グリコシル化インターロイキン−２０ラツ）・における毒性試験 ａ）実験の目的 この実験の目的は、グリコジル化ＩＬ−２の毒性がもしあるならばその毒性、さ らに具体的には、スブラーグ・ドーレイ・ラツ）・における浮腫形成を評価する ことである。

ｂ）実験方法 実施例５で記載されたように単離したグリコジル化ＩＬ−２は、各バッチの６匹 のラット（雄３匹および雌３匹）に、２ミリオン、１Ｏミリオンおよび５０ミリ オンＵ　Ｉ　／に９７日（すなわち、０．１，０゜５および２　、５　ｚ９／　 ｋｇ／日）の投与量を３日間、腹腔内注射した。同時に、塩化ナトリウムｔｙ／ に９／日を動物に経口投与した。

３日めに、動物に、１０ｚｙ／ｋｇ以上の水を経口的に与え、次いで代謝ケージ に入れて、２４時間、利尿を測定した。

各バッチは、処置していない対照バッチ、および塩化ナトリウムのみを与えたバ ッチと比較した。

Ｃ）結果 臨床上の異常は認められなかった。

実験開始前および３日および４日に、動物の体重を測定した。バッチ間の差異は 認められなかった。

血液検査（ヘマトクリット、尿素、クレアチニン、全タンパク、アルブミン、コ レステロール、トリグリセリド、ＧＰＴ（グルタミン酸−ビルピン酸トランスア ミナーゼ）、ＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）、ナトリウム、カリウム、塩素お よびカルシウム）は４日に実験した。有効量で、血清アルブミンおよびタンパク がわずかに減少した。

以下の尿排泄試験 ・容量 ・反応性ストリップを用いた半定量（ｐＨ，密度、タンパク、グルコース、ケト ン、ビリルビン、血液およびウロビリノーゲン）・ナトリウムイオン、カリウム 、塩素およびクレアチニンを定量すると、異常は認められなかった。

有効量あたりの膵臓重量において、いくつかの臓器（肝臓、膵臓、腎臓および胸 腺）はわずかな増加を示した。

剖検では、肉眼的な傷害は認められなかった。

光学検微鏡による試験では、ＩＬ−２は、以下に示すように、リンパ系の活性化 を誘起することが示された。

−５０ｘｌ　Ｏ’Ｕ１／に９／日を投与した３匹の動物で、動脈周囲のリンパス リーブおよび周縁の膵臓帯にわずかの肥厚−処置動物で、さらに高頻度で腫脹形 質細胞増加症、しかし有効量はなかった。

ｄ）結論 スプラーグ・ドーレイ・ラットにおける毒性試験では、Ｙ、ハラダにより観察さ れたＩＬ−２コリの致死量（Ｙ、ハラダ、プレクリニカル・セイフティー・オブ ・バイオテクノロジー・プロダクツ・インテンプイド・フォー・ヒユーマン・コ ース１２７−１４２頁−アランＲ，リス、インニーポレーティッド）よりも５倍 多い量（０，５ｍ９／に９／日に対して２．５次９／に９７日）のグリコジル化 ！Ｌ−２の、評価し得る毒性効果は示されなかった。

従って、グリコジル化ＩＬ−２は、マウスとラットの両方で、！Ｌ−２コリより も毒性はかなり弱い。

実施例１３：グリコシル化インターロイキン−２の実験的製剤ａ）実験方法 実施例５に記載されたようにして得られたグリコジル化ＩＬ−２を含有する、ｐ Ｈ６，５のリン酸ナトリウム水溶液は、種々賦形剤を比率を変えて加えるか、賦 形剤を加えずに、実験的に凍結乾燥した。

次いで溶質は再構成し、外観を観察し、ｐＨを測定し、存在するグリコモル化Ｉ Ｌ−２量を逆相カラムのＨＰＬＣで定量（比較：実施例５−３）Ｌ、ＣＴＬＬ− ２活性を測定した。これらの操作は、物質を４℃で１年間保存した後、２５℃で ３か月保存後、および３７℃で３か月保存後、凍結乾燥し、その直後に行った。

ｂ）結果 賦形剤は含まないでグリコジル化ＩＬ−２８０μ９／ｊ１１２を含有するリン酸 すトリウム水溶液を凍結乾燥し、および溶質に水を加えて即座に注射可能な製剤 に再構成すれば、最初０ＣＴＬＬ−２活性の８０％以上を含有する無色透明な溶 液ができあがる。凍結乾燥物を６か月間保存した後、再構成した溶液は、最初０ ＣＴＬＬ−２活性の約５０％を含有する。

加水分解ゼラチン（ローセロット、商品番号：ＤＳＦ）１０ｆｆ？／１１２、ポ リエチレングリコールｌ１９、平均分子量６０００（ヘキスト、商品番号：ＤＡ Ｂ８）またはヒト血清アルブミン（シグマ、商品番号：３７８２）１０ｒｔｔ９ ／ｚＱを、凍結乾燥中に、約１８　Ｘ　１０　”Ｕｌｚ９の特異的ＣＴＬＬ−２ 活性を有するグリコジル化ＫＬ−２，８０μ９／舷を含有するリン酸水溶液ナト リウムに加え、および凍結乾燥物を４℃で１時間保存し、溶質（透明およびｐＨ 約６．５）を再構成すれば、以下のような、クロマトグラフィー分析（精度３％ ）の結果が得られるニ ーポリエチレングリコールの場合、９０％以上−加水分解ゼラチンおよびヒト血 清アルブミンの場合、１００％全例で（ＨＰ　Ｌ　Ｃで定量したＩＬ−２の）特 異的ＣＴＬＬ−２活性、約１８Ｘ１０’Ｕ／友９を有している 従って最後の２種の賦形剤の場合、溶質好あたり０ＣＴＬＬ−２活性は、最初の 値と同一であった。

加水分解ゼラチン（ローゼロット、商品番号：ＤＳＦ）１０ｘ９／ｘ（１および 非発熱性アラニン（アジノモト）　１０　ｘ９／ｘ（ｌを、凍結乾燥中に、特異 的ＣＴＬＬ−２活性約１８　Ｘ　１０　”Ｕ／ｘ（ｌを有するグリコジル化ＩＬ −２４５０μ９／祿を含有するリン酸ナトリウム水溶液に加えると、生成した凍 結乾燥物の水分含量は３％以下である。凍結乾燥物を４℃で３か月間保存した後 、再構成した溶質は透明でｐＨ約６．５であり、クロマトグラフィー分析（精度 的３％）では、（ＨＰＬＣで定量したＩＬ−２の）特異的ＣＴＬＬ−２活性、約 １８Ｘ１０”Ｕ／ｚｇを有する最初のグリコジル化ＩＬ−２の１００％になるこ とを示す。

前述の結果より、凍結乾燥後、グリフシル化ＩＬ−２は、薬学的製剤として許容 できる、すぐれた安定性を有することが示される。

おそらく、凍結乾燥物は４℃で数年間保存できるであろう。金側で、再構成した 溶質は、可溶化のために有毒な物質を加えるか、または分子を化学的に修飾しな くても透明であり、生理学的なｐＨである。

これらは、エシェリキア・コリ由来のグリコジル化ＩＬ−２の特性である。後者 の物質は、凍結乾燥後、それの５０％以上が失われ、溶液は蛋白光を呈する（ヨ ーロッパ特許出願第０１５８４８７号、１０頁参照）。従って、可溶化するため に、有毒な可溶化剤、たとえば５ＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を加える必要 がある。

本明細書を読めば、薬剤としてのグリコジル化ＩＬ−２の重要性、およびたとえ ばエシェリキア・コリ由来の非グリコジル化ＩＬ−２と比較して、数多くの優越 性−すなわち、少ない用量で同じ活性を呈する可能性がある；毒性が弱いため、 高用量でも耐性がよい；免疫原性が低い；有毒な可溶化剤を加えたり、分子を化 学的修飾しなくても、生理学的ｐ）（で水性溶媒に溶解する；および薬学的に許 容できる製剤として凍結乾燥した後の安定性にすぐれている−が理解いただけよ う。

ｅｏＲＩ ＦＩＧ、３ 試料還元後のＳＤＳ・ポリアクリルアミドゲル電気泳動銀による染色 １４種のＩＬ−２の混合物 ２　実施例１中工程２ｄ）終了後得られた生成物３　１Ｌ２Ｎ２ Ａ　ＩＬ２Ｎ１ ５　分子量マーカー ６１と同じ ７５と同じ ＦＩＧ、４ 実施例５中工程２ｄ）終了後の生成物の逆相ＨＰＬＣ分析ＦＩＧ、５ 実施例５中工程２ｄ）終了後の生成物のカチオン交換カラムのよるＨＰＬＣ分析 ＦＩＧ、６ 体重当たりの膵臓重態 ＦＩＧ、　７ ′Ｊ動物当たりの牌細胞総数 Ｆ［Ｇ、８ 抗−オバルブミンＩｇＭの分析 二　二 国際調査報告 一一自一―−−＾−−−−−鴫一＆ＰＣＴノＦＲ８９１００５５４国際調査報告 ＦＲ８９００５５１ ＳＡ　３２２３９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ａ）培養上清からのインターロイキン−２が主体をなす画分の分離、ｂ）カチオ ン交換クロマトグラフィー ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびｄ）排除クロマトグラフィー の各工程を含む方法によって組換ＣＨＯ培養上清から分離可能なグリコシル化イ ンターロイキン−２を含むことを特徴とする医薬。 ２．グリコシル化インターロイキン−２が特異的ＣＴＬＬ−２活性約１５×１０ ５Ｕ／ｍｇを有するものである、請求項１記載の医薬。 ３．グリコシル化インターロイキン−２が水溶液中ｐＨ６．５にて凍結乾燥し、 直ぐに凍結物を解凍後、もとのＣＴＬＬ−２活性の少なくとも８０％を維持して いる、請求項１または２記載の医薬。 ４．グリコシル化インターロイキン−２が、これを含有する水溶液中ｐＨ６．５ にて凍結乾燥し、直ぐに凍結物を解凍後、生理的ｐＨにて澄明な解凍液が得られ るものである、請求項１〜３のいずれか１項記載の医薬。 ５．グリコシル化インターロイキン−２が天然抗−ＩＬ−２モノクロナール抗体 ＢＧ５に対して、天然のＩＬ−２と同じ親和性を有する、請求項１〜４のいずれ か１項記載の医薬。 ６．グリコシル化インターロイキン−２が天然抗−ＩＬ−２モノクロナール抗体 Ｐｏｌ−ｌ／００−００９（セルテク）に対して、天然ＩＬ−２と同じ親和性を 有する、請求項１〜５のいずれか１項記載の医薬。 ７．グリコシル化インターロイキン−２が加水分解ゼラチンまたはひと血清アル ブミンを添加した水溶液中ｐＨ６．５にて凍結乾燥し、凍結生成物を温度４℃に て１年間保存し、凍結物を再生後、初めのＣＴＬＬ−２活性を維持しているもの である、請求項１〜６のいずれか１項記載の医薬。 ８．グリコシル化インターロイキン−２が加水分解ゼラチンおよびアラニンを添 加した水溶液中ｐＨ６．５にて凍結乾燥し、凍結生成物を湿度２５℃にて３か月 保存し、凍結物を再生後、初めのＣＴＬＬ−２活性を維持しているものである、 請求項１〜７のいずれか１項記載の医薬。 ９．グリコシル化インターロイキン−２が加水分解ゼラチンまたはアラニンを添 加した水溶液中ｐＨ６．５にて凍結乾燥し、凍結生成物を温度３７℃にて３か月 保存し、凍結物を再生後、初めのＣＴＬＬ−２活性を維持しているものである、 請求項１〜８のいずれか１項記載の医薬。 １０．組換ＣＨＯ細胞がＩＬ−２の前駆体およびＤＨＦＲの発現ベクターにより 形質転換されたＤＸＢ１１株由来細胞である、請求項１〜６のいずれか１項記載 の医薬。 １１．発現ベクターがプラスミドｐＳＶ７２６の特徴を有するプラスミドである 、請求項１０記載の医薬。 １２．組換ＣＨＯ細胞が低蛋白人工培地中で培養されるものである、請求項１〜 １１のいずれか１項記載の医薬。 １３．低蛋白人工培地がポリビニルピロリドンを含有するものである、請求項１ ２記載の医薬。 １４．分離工程ａ）が、ストップ閾値３０ｋＤａより大、好ましくは５０〜１５ ０ｋＤａを有する膜（１）と、ストップ閥値１０ｋＤａより小、好ましくは、５ 〜１０ｋＤａを存する膜（２）の間で、２重濾過によって行なわれるものである 、請求項１〜１３のいずれか１項の医薬。 １５．カチオン交換工程がｐＨ４．５〜６．５、さらに具体的には、５．２〜５ ．７間で行なわれるものである、請求項１〜１４のいずれか１項記載の医薬。 １６．カチオン交換工程が、アニオン交換クロマトグラフィー工程により予め行 なわれるものである、請求項１〜１５のいずれか１項記載の医薬。 １７．アニオン工程が、ｐＨ５．５〜８．５、好ましくは６．５〜８．２間で行 なわれるものである、請求項１６記載の医薬。 １８．疎水性相互作用工程がｐＨ４．５〜８．０、好ましくは６．０〜８．０の 間で行なわれるものである、請求項１〜１７のいずれか１項記載の医薬。 １９．疎水性相互作用工程が、インターロイキン−２の脱離のために、クロマト グラフィー支持体に、カオトロピック剤、または有機溶媒、またはｐＨ４．５〜 ８．０を有する水溶性溶媒の添加によるものでなく行なわれるものである請求項 １〜１８のいずれか１項記載の医薬。 ２０．排除クロマトグラフィー工程が、１〜２５０ｋＤａ間の分画範囲を有する 支持体に行なわれるものである、請求項１〜１８のいずれか１項記載の医薬。 ２１．さらに加水分解ゼラチンおよびアラニンを含む、請求項１〜２０のいずれ か１項記載の医薬。