JPH03500788A - 補体カスケードの阻害剤としてのオリゴサッカライドヘパリン断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 補体カスケードの阻害剤としての オリゴサツカライドヘパリン断片 及五分■ 本発明は米国特許出願第７１７．２１３号の部分継続出願である。

本発明は抗凝固活性の過度の副作用を伴わないで補体カスケードを阻害するため の化合物及び医薬組成物に関する。この化合物は、約６サツカライドユニツト〜 約１６サンカライドユニツトの、より大きなポリサッカライドヘパリンの小さな 鎖断片である。

見匪夏宜景 ヘパリンはウロン酸とグルコサミンとの高度に硫酸化された多分散性α−（１→ ４）−結合コポリマーである。Ｊａｑｕｅｓ。

の分子量のプロテオグリカンとして合成される。ヘパリンは蛋白質コアーに結合 する。この蛋白質コアーはゲルコサミノグリカンヘパリン（平均分子量１０，０ ００〜１４，０００ダルトン）を得るために商業的工程で取り出される。

ヘパリンの主たる用途は抗凝固剤としてである。しかしながら、ヘパリンは他の 多くの生物学的活性を有し、これには（１）°アンジオゲネシス（ａｎｇｉｏｇ ｅｎｅｓｉｓ）を制御する能力（Ｆｏｌｋｍａｎら、５ｃｉｅｎｃｅ　２２１　 ニア１９−２５．１９８３）、（２）他の細胞増殖及び増加過程を制御する能力 、（３）血漿リボプロティンリパーゼを活性化しそして放出する能力（Ｍｅｒｃ ｈａｎｔら、其匡匹匹旦匹牡紅婬：１５１−５８．１９８４）　、及び（４）補 体カスケードを阻害する能力、が含まれる。

１９２９年に、Ｅｃｋｅｒ及びＧｒｏｓｓは初めて補体活性化を制御するヘパリ ンの能力を証明した。次に、他の研究者が、ヘパリンが使用し得る補体の古典的 及び他の増幅経路の多様性を示した。ヘパリンの抗凝固活性はアンチスロンビン ■と結合することができるヘパリンポリマー上の特定のオリゴサツカライド配列 に介在される。しかしながら、補体カスケード系に対するヘパリンの構造−活性 関係はまだあまり理解されていない。

ヘパリンの補体カスケード阻害活性は宿主の免疫応答を低下させるための種々の 機能のために使用することができる。

器官植植拒絶は個々の宿主（すなわち哺乳類）にとって不利な該当する免疫応答 である。同様に、個体自身の細胞を攻撃する免疫応答から生ずる種々の自己免疫 疾患が存在する。これらの免疫疾患及び自己免疫疾患は効果的に治療することが しばしば困難な疾患の一群を代表する。免疫抑制薬であり得る多数の薬物が存在 するが、補体カスケード活性化を調製するか又は特異的に阻害するために適当な 現在利用可能な薬剤は存在しない。補体の阻害は種々の免疫不全における重要な 観点である。補体カスケード系を阻害する物質が療法的に有用であるような疾患 には突発生夜間血球素尿症、関節リウマチ（この場合、補体の活性化を回避する ために物質が関節のうに直接投与されるであろう）、及び遺伝性アンギオエドマ （ａｎｇｉｏｅｄｍａ）　（この場合、補体調節蛋白質の不足が活発な補体消費 を導く）が含まれる。他の疾患には放血ショ・ツク、関節リウマチ及び全身性紅 斑性狼庶が含まれる。

ヘパ８リンの抗凝固活性は、その構造中にアンチスロンビン■の結合のための特 異的オリゴサツカライド配列が存在することと関連することが証明されている。

ヘパリンに結合した後、アンチスロンビン■は多数の血液凝固因子を阻害するこ とができ、そしてそれ故に血液の凝固を防止する。

ヘパリンの抗補体活性は種々の補体カスケード蛋白質への結合により介在され、 そしてそれにより古典（ｃｌａｓｓｉｃａｌ）経路及び代替（ａ　１　ｔｅｒｎ ａ　ｔｅ）経路の両方を制御する。ヘパリン及びヘパリンオリゴサツカライドは 、細胞結合増幅経路Ｃ３コンバーターゼ類（ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ）、Ｃ３ｂ、 　Ｂｂ、　Ｃ３ｂ、　Ｂｂ、　Ｐ及びＣ３ｂ、　Ｂｂ、　Ｎｅｆ、の生成を阻害 することにより補体カスケードの部分を阻害。ヘパリンの抗凝固活性はＣ３ｂ上 の結合部位を妨害する。さらに、ヘパリンはＣ３ｂの存在下でＤによるＢの流体 相消費を防止し、やはりＣ３ｂへの直接作用を示す。

従って、ヘパリン様抗補体活性と有し、そして重量ベースでヘパリンの抗凝固活 性が大きく低下している（例えば１０％以下）療法剤の必要性が当業界において 存在する。本発明はこの必要を満たすものである。

朋−路 本明細書において使用される補体の略号は、第三補体蛋白質についてはＣ３、活 性化された第三補体蛋白質についてはＣ３ｂ、活性化された第四補体蛋白質につ いてはＣ４ｂが使用され、Ｂ、Ｐ及びは補体の代替増幅経路のレター成分（ｌｅ ｔｔｅｒ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）である。他の略号には、表面Ｃ４ｂ及びＣ３ｂ を含むヒツジ赤血球細胞性中間体についてのＥＡＣ４ｂ、　３ｂが含まれる。Ｅ ＡＣ４ｂ、３ｂ’　、ＥＡＣ４ｂ、３ｂ”、及ヒＥＡＣ４ｂ、３ｂ”’　ハ、１ ×１０９のＥＡｃｌ、４ｂ当り５■、２０Ｉ！ｇ及び１１００ＩＪを用いてＥＡ ＣＩ　、　４ｂから生産された細胞性中間体を意味する。サツカライドについて は、ΔＵＡは４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−へキス−４−エノピロノシルウロ ン酸（非還元糖）を意味し、ｐはピラノースを意味し、ＧｌｃＡはグルクロン酸 を意味し、ＩｄｏＡはイドウロン酸（ｉｄｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）を意味し、 そして、Ｓはサスフェートを意味する。

主肌■Ｍ丞 要約すれば、本発明は約６〜約２４のサツカライドユニットの重合度を有するヘ パリンオリゴサツカライド画分に関する。

本発明のオリゴサツカライドは偶数のサツカライドユニットを有することができ 、ここでサツカライドユニットのグループはジサッカライド、テトラサツカライ ド及びヘキササツカライドである。

本発明はまた、約５〜約２３サツカライドユニツトの奇数の重合度を有するオリ ゴサツカライド画分に関し、ここでは非還元末端（Δ［！Ａｐ）サツカライドが 除去されている。非還元末端サツカライドの除去は、偶数個オリゴサツカライド を、本明細書に記載するように、酸性ｐＨにおいてオゾンで処理することにより 達成することができる。

好ましくは、サツカライドユニットのジサンカライドグループはトリサルフェー トジサッカライド、例えばΔＵＡｐ２５（１→４　）　−ａ：　−Ｄ−ＧＩｃＮ ｐ２Ｓ６Ｓ（第１表中の１、及び式Ｉにおいてｎ＝０の場合）である。サンカラ イドユニットのテトラサツカライドグループは、ペンタサルフェートテトラサツ カライド、例えばΔＵＡｐ２Ｓ（１→４　）　−α−Ｄ−ＧｌｃＮｐ２Ｓ（１→ ４　）　−ａ　−Ｌ　−ＩｄｏＡｐ２Ｓ　−ａ　−Ｄ−ＧｌｃＮｐ２Ｓ６Ｓ（第 １表中土人）及びΔＵＡｐ２Ｓ（１＝　４　）　−ｃｒ　−Ｄ　−ＧｌｃＮｐ２ Ｓ６Ｓ（１→４）−β−Ｄ　−ＧｌｃＡｐ（１→４　）　−ｃｘ　−Ｄ−Ｇ１ｃ Ｎｐ２Ｓ６Ｓ（第１表中１旦）、並びにヘキササルフェートテトラサツカライド 、例えばΔＵＡｐ２Ｓ（１→４）−α−Ｄ　−ＧｌｃＮｐ２Ｓ６Ｓ（１→４）− α−Ｌ−ＩｄｏＡｐ２Ｓ（１−＋　４　）　−ａ　−Ｄ−ＧｌｃＮｐ２Ｓ６Ｓ（ 第１表中１旦）から成る群から選択され、そしてサツカライドユニットのヘキサ サツカライドグループはセプタサルフエートヘキササッカライド、例えばΔＵＡ ｐ２Ｓ（１→４　）　−ｃｘ−Ｄ−ＧｌｃＮｐ２Ｓ６Ｓ（１−＋４　）−α−Ｌ −１ｄｏＡｐ（１→４）　ｏニーＤ　−ＧＩｃＮＡｃｐ６Ｓ−（１−）４）β− Ｄ　−ＧｌｃＡｐ（１→４　）　−ｏ：　−Ｄ−Ｇ１ｃＮｐ２Ｓ３Ｓ６Ｓ（第１ 表中−１９である。

トリサルフェートジサッカライドの例は、α−Ｄ−２−デオキシー２−アミノ− グルコピラノシル−２，６−ジサルフエートに１→４結合した４−デオキシ−α −Ｌ−スレオ−へキス−４−エノピロノシルウロン酸−２−サルフェートであり 、ここでα及びβは糖のアノマーコンフィグレーションを示し、そしてＤ及びＬ は糖の絶対コンフィグレーションを示す。

最も好ましくは、ヘキササツカライド、オクタサツカライド及びデカサツカライ ドは、トリサルフェートジサッカライドであるヘパリンジサンカライド（２）の トリー、テトラ−及びペンタ−オリゴマー、例えば構造（Ｉ）、を有するデカサ ツカライドＩＯＤ　（第１表）である。

本発明の方法は、約６〜約２４のサツカライドユニットの偶数重合度を有するオ リゴサツカライドを形成するために重合される（重合された）サツカライドユニ ットのグループを調製した。本発明の方法はさらに、約５〜約２３サツカライド ユニツトの奇数重合度のサツカライドを形成するための末端非還元糖除去の段階 を含む。オリゴサツカライドは高度にサルフェート化されている。例えばナトリ ウム塩を用いて分子量ベス（％）で計算すれば硫黄の％は、オリゴサツカライド は１４％以上の硫黄を有する。

本発明のオリゴサツカライドは、分子基準でヘパリンと同程度の強い抗補体活性 を有する。本発明のオリゴサツカライドはまた、重量基準でヘパリンの抗凝固活 性の１０％未満と定義される低下した抗凝固活性を示す。

置皿■皿単久脱里 第１図は、ヘパリナーゼにより触媒されるヘパリンを３０％完結まで解重合する ことにより調製されたヘパリン−オリゴサツカライド混合物の強イオン交換−Ｈ ＰＬＣを示す。カラムから？岩田するヘパリン−オリゴサツカライドサンプル（ Ａ）及び４■（Ｂ）の２３２ｎｍにおける吸光度を溶出時間（分）に対してプロ ットしたものである。カラムから集められたピークを標識してサンプルを特定す る（サンプル番号は重合の程度に対応する）。

第２図は、補体の代替（ａ　ｌ　ｔｅｒｎａ　ｔｅ）増幅経路に対するヘパリン 及び構造的に特徴付けられたヘパリン−オリゴサツカライドの効果を示す。量応 答曲線がヘパリン（○）、セプタサルフェートヘキササッカライドー６Ａ（＋） 、ヘキササルフェートテトラサンカライド−４Ｃ（ム）、ペンタサルフェートテ トラサツカライド−４Ｂ（口）、及びトリサルフェートジサッカライド−呈（・ ）について示される。

第３図は、ヘパリン−オリゴサツカライドによるＥＡＣ４ｂ，３ｂ”’の溶解の 阻害を示す。活性は（　（ＥＤ５０ヘパリン／ＥＤ５Ｑヘパリン−オリゴサツカ ライド）　Ｘ１００　）として示される。ＥＤ５０はヘパリンの平均分子量１４ ，０００を用いて分子基準で測定される。

第４図は、４１！ｇのヘパリン及び均一な構造的に定義されたヘパリンーオリゴ サ・シカライドによる、ＥＡＣ４ｂ，　３ｂ”°に対する増幅経路Ｃ３コンベル ターゼ（ｃｏｎｖｅｒ　ｔａｓｅ）の生成の阻害を示す。ヘパリンオリゴサツカ ライド旦へ，ｌ且，６Ｃ．８人。

旦旦，８Ｃ，８Ｄ．１立へ．　ＩＯＢ　、　ＩＯＣ及び川は本明細書の第１表に 定義されている。

第５図は、種々の市販のヘパリン、及びヘパリンオリゴサツカライド（第１表に 示す）によるＥＡＣ４ｂ　、　３ｂ　”　’の溶解の阻害を抗凝固活性に対して プロットしたものを示す。抗凝固活性は、第２表に示すように、重量基準で標準 的ブタヘパリン（Ｈｌ）に比較して抗−フアクタ−ＩＩａアミトリシスアッセイ により測定された。補体活性の阻害は重量基準で（（ＥＤ５０ヘパリン／ＥＤ５ ０ヘパリン−オリゴサツカライド）　Ｘ１００　）として表現される。ブタヘパ リン（■Ｈ１→Ｈ６）、ウシヘパリン（口Ｈ７，Ｈ８）、低分子量ヘパリン（・ Ｈ９）、及びヘパリン−オリゴサツカライド（◆２−＋１６　ｂ　）が隣接する 番号により特定される。

尤凱傅註廠ム記載 ヘパリンの部分的酵素的解重合が、次の式：（式中、Ｒは金属陽イオンもしくは 非金属陽イオン、又は遊離酸については水素であり、ＸはＨ又はＳＯＪであり、 ＹはＨｌＣＯＣＩ−ｂアルキル又は５ｏ３Ｒであり、そしてｎは約１〜約１１の 整数である） で表わされるヘパリン−オリゴサツカライドの制御された且つ再現性のある分布 をもたらした。好ましくはＹがＣ０ＣＨ：ｌであり、ｎが４であり、そしてＲが 水素、ナトリウム又はカリウムである。

６ユニット〜２４ユニツトの重合度を有しそして２．４又は６サン力ライドユニ ット複合体を重合せしめることにより形成されたヘパリンオリゴサンカライドは 重量基準で生来のヘパリンに匹敵する補体阻害活性を有し、そして抗凝固活性を ほとんど又は全く有しないことが見出された。

３０％反応完結において、ヘパリン−オリゴサツカライド混合物は１０〜２４サ ツカライドユニツトの重合度を有するヘパリン−オリゴサンカライドを最大濃度 で含んでおり、ここですべてのヘパリン−オリゴサンカライドは偶数のサツカラ イドユニットを含有していた。このオリゴサツカライド混合物は強陰イオン交換 −ＨＰＬＣ（第図に示す）を用いて電荷に基ずいて分画され、定義された重合度 を存し且つ単一の主成分を含む精製されたヘパリン−オリゴサンカライドサンプ ルが得られる。）ＩＰＬＣカラムからの溶出順序は重合度に依存しくすなわち、 ジサッカライド、これに続くテトラサツカライド、これに続くヘキササツカライ ド等）、そしてサイズ群内では溶出順序はサルフェート化度に依存する（すなわ ち、５サルフエートを有する第１表中のテトラサツカライド４Ａ及び４Ｂ。

次に６サルフエートを有するテトラサツカライド４Ｃ）。オリゴサツカライド成 分を再分画して十分な純度のヘパリン−オリゴサンカライドを生じさせ、下記の 第１表に示す組成分析を得た。

男工」−一衷 ６〜１０の重合度を有するヘパリンオリゴサツカライドの構造ヘパリン−オリ　 オリゴサン力　サルフェートゴサン力ライド　ライド組成（１＋　ｂ）　分子量 　基の数６Ｄ”　２．土Ｃ１９９５９ ８Ａ　２，２．４Ａ　２４５６　１１ 刊人　主、影、！、土人　３２２３　１４刊旦　Ｉ、叢、叢、土旦　３２２３　 １４刊旦　２　、２　、６　Ｃ３１６３１３（ａ）配列は基本オリゴサツカライ ドの順序を意味しない。

（ｂ）各一時的オリゴサツカライドを構成する基本オリゴサツカライドの構造は 次の通りである。

ＩニトリサルフェートジサッカライドΔＵＡｐ２Ｓ　（１→４）　−α−Ｄ　− ＧｌｃＮｐ２Ｓ６Ｓ　；友人：ペンタサルフェートテトラサッカライドΔＵＡｐ ２Ｓ（１→４）　−ｃｘ−Ｄ−Ｇ１ｃＮｐ２Ｓ（１→４）　ｔｘ　−Ｄ　−ＧＩ ｃＮｐ２Ｓ６Ｓ　； 土旦：ペンタサルフェートテトラサッカライドΔＵＡｐ２Ｓ（１＝４）　ａニー Ｄ−Ｃ１ｃＮｐ２Ｓ６Ｓ（１→４）−β−Ｄ　−ＧｌｃＡｐ（１→４）−α−Ｄ 　−ＧｌｃＮｐ２Ｓ６Ｓ、　；４Ｃ：ヘキササルフェートテトラサツカライドΔ ＵＡｐ２Ｓ（１→４）　−ｔｘ−Ｄ−ＧＩｃＮｐ２Ｓ６Ｓ（１→４）　（Ｘ−Ｌ −１ｄｏＡｐ２Ｓ（１→４）　ｃｘ−Ｄ−ＧｌｃＮｐ２Ｓ６Ｓ；旦旦：セプタサ ルフエートヘキササッカライドΔＵＡｐ２Ｓ（１→４　）　−ｃｘ−Ｄ　−Ｃ１ ｃＮｐ２Ｓ６Ｓ（１→４）−αＬ−１ｄｏ八ｐ（１→４　）　−α−Ｄ　−Ｇ１ ｃＮＡｃｐ６Ｓ　−（１→４）−β−Ｄ−Ｇ１ｃＡｐ（１→４　）　−ｃｘ−Ｄ −Ｇ１ｃＮｐ２Ｓ３Ｓ６Ｓ　。

（Ｃ）このヘパリン−オリゴサツカライドのオリゴサツカライド組成は１つの形 でのみ配置され得る。なぜなら、４Ｃ＝２．２であり、このオリゴサツカライド の配列は確立されているからである。

ヘキササツカライド６Ｄ、オクタサツカライド８Ｄ、及びデカサツカライドＩＯ Ｄについては１つの配列のみが可能である。なぜなら、それらの組成分析が示す ところによればこれらは単にヘパリンジサッカライド２のオリゴマーだからであ る。

本発明の化合物は、第２表に示すように、補体活性化を阻害し、他方抗凝固活性 をほとんど又は全く有しない能力により特徴付けられる。

約２〜２４オリゴサツカライドユニツトの重合度を有するオリゴサツカライドは 、ヘパリナーゼを用いてのヘパリンの部公的解重合によって製造することができ る。解重合の程度（すなわち、反応完結％）を約１％〜約１００％と変化せしめ て特定のサイズ又は重合度を有するオリゴサツカライドの生産を最適化すること ができる。部分的な又は完全な解重合の後、オリゴサツカライド混合物を、強陰 イオン交換ＨＰ　Ｌ　Ｃカラム又は他の適当な技法、例えばポリアクリルアミド ゲル電気泳動を用いて分画する（Ｒｉｃｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、　２４４ 　：５１５−２２（１９８７）を参照のこと〕。これらの技法の１つ又は組合わ せによる再分画が高度に精製されたオリゴサツカライドをもたらす。６サツカラ イドユニツトより大きなオリゴサツカライド（すなわち、１０００ダルトンより 大きな分子量）は、制御された孔の透析膜を用いての脱イオン水に対する十分な 透析により脱塩される。

メーじし一表 ヘバリン−オリゴサンカライドの抗凝固活性（ａ）活性は１６７ユニツト／ｍｇ の活性を有するヘパリン（平均分子量１４，０００）を用いての標準曲線に基い て決定される。

（ｂ）ｎｄ、決定されず。

本発明の化合物は溶解酵素ヘパリナーゼによるヘパリンの解重合により得られる 。ヘパリナーゼ消化により得られるオリゴサツカライドの混合物は重量基準又は 分子基準で所望の抗補体活性を有し、そして生来のヘパリンと比べて存意に低下 した抗凝固活性を有するか又は該活性を有しない。ヘパリナーゼ消化及びそれに 続く精製により生産されたオリゴサツカライドは約６〜約２４のサツカライドユ ニットを有しそして偶数のサツカライドユニットを含有する。好ましくは、オリ ゴサツカライドは１６〜２４サツカライドユニツトを有する。最も好ましくは、 オリゴサツカライドは２４個のサツカライドから成るオリゴサツカライドである 。

本発明の化合物はまた、約５〜２３サツカライドユニツトの奇数サツカライドユ ニットを有し、そして本発明の偶数オリゴサツカライドを酸性条件下でオゾンに より処理することにより末端非還元糖を除去することにより調製されるオリゴサ ツカライドの一連の補完体を含む。

次の実施例は、オリゴサツカライドの合成、並びにその抗補体活性及び抗凝固活 性を例示する。実施例は例示的なものであり限定的なものではない。

実施炎上 ヘパリン−オリゴサツカライドをヘパリナーゼ（０，２５ユニツトの精製酵素、 ５０ユニット／■；又は市販の酵素（０，２３ユニツト／■）〕を用いて調製し た。ヘバリナーゼを、３７．５ｄの２５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２．５ｍＭ酢酸 カルシウム溶液（ｐＨ７，０）中３００■のヘパリン（ブタ粘膜ヘパリン又はウ シ肺ヘパリンのごとき市販のもの）に加えた。この混合物を３０°Ｃにて４０時 間インキュベートした。アリコートを定期的に取り出し、そして該サンプルを０ ．０３Ｎ塩酸に１００（＠稀釈した後２３２ｎｍにて吸光度を測定した。約３０ ％の完結の後、反応混合物を１００″Ｃに１分野加熱することにより反応を停止 させた。生成物を一７０°Ｃにて凍結させ、凍結乾燥し、そして蒸留水に再溶解 して４ｄの容量とした。次に、再溶解したサンプルをセファデックスＧ−１０上 で脱塩し、集め、凍結乾燥し、そして６ｍｌの蒸留水に再溶解して最終濃度５０ ■／ｄにする。

ヘパリンの部分的酵素的脱重合が３０％の反応完結において制御されたそして再 現性あるヘパリン−オリゴサツカライドの分布を示し、そして混合物が約１０〜 約１６サツカライドユニツトの重合度のヘパリン−オリゴサンカライドを最大数 及び濃度で含んでいた。この混合物はさらに２〜１０サツカライドユニツトの重 合度を有するヘパリン−オリゴサンカライド及び１６〜２４サツカライドユニツ トの重合度を有するヘパリン−オリゴサツカライドを、これらを精製するのに十 分な量で含有していた。２〜１０サツカライドユニツトの重合度のヘパリン−オ リゴサツカライドが必要な場合、反応を５０〜７５％完結において停止するのが 好ましい。１６〜２４サツカライドユニツトの重合度のヘパリン−オリゴサンカ ライドが必要な場合、反応を１０〜２０％完結で停止するのが好ましい。

実】ｌ速入 この実施例はヘパリン−オリゴサツカライドの分画を例示する。ヘバリンーオυ ゴサ、カライド混合物（２０ｍｇ　）を、０．２Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ３，５ ）により前平衡化した強陰イオン交換ＨＰＬＣ半分取用カラムに、１．５ｄ／分 の流速で適用した。塩化ナトリウム（ｐＨ３，５）を用いて１．５ｍｆｌ１分で 直線塩グラジェントをすぐに始めた。各ピークからの両分を集め、凍結乾燥し、 ４　ｍｌの蒸留水で再溶解し、そして３　ｃｍ　Ｘ　４５ｃｍカラム上での３Ｉ ｎ１７分の流速でのセファデックスＧ−１０ゲル濾過クロマトグラフィーにより （６未満の重合度のサンプル）、又は３Ｘ１０００容量の脱イオン水に対する透 析により（６より大きな重合度のサンプル）脱塩した。サンプルを凍結乾燥し、 そして−７０°Ｃにて貯蔵した。

電荷に基く分画の結果、所望の重合度を有しそして単一の主たる成分を含有する 精製されたヘパリン−オリゴサツカライドサンプルが得られた。第１図に示すよ うに、陰イオン交換−ＨＰＬＣカラムからの溶出順序は重合度に依存した（すな わち、ジサッカライド（２）、これに続きテトラサツカライド、これに続きヘキ ササツカライド、等）。各サイズ群内では、溶出順序はサルフェート化の程度に 依存した（すなわち、５個のサルフェートを有するテトラサツカライド４Ａ及び 王立、これに続く、６個のサルフェートを有するテトラサンカライド土旦）。こ の分画方法は、２〜２４サツカライドユニツトの重合度の精製されたヘバリンー オリゴサ・ンカライドを調製するために適当である。

実新■飢本 この実施例はヘパリン−オリゴサツカライドの定量及び分析を例示する。凍結乾 燥されたサンプルを蒸留水に溶解して１戒の容量にし、各々のアリコートを取り 出し、０．０３Ｎ塩酸に添加し、そして吸光を２３２ｎｍにて測定した。次に、 サンプルの濃度をその分子量に基いて算定した。分子量はその化学構造から直接 計算し、又はゲル浸透ＨＰＬＣＣ３ｈａｒａｔｈら、釦二匹飢肛胆並旦肛、９　 ニア３−８３（１９８５）を参照のこと〕及び５、２　Ｘ１０”Ｍ−’ｃｍの分 子吸光係数を用いて決定したその重合度から算定した。

より濃厚なサンプルはさらに稀釈して、すべてのサンプルがおよそ同じ濃度（１ ■／成）となるようにした。１■／ｄのストック溶液の定量は、それらを調製す るのに用いたヘパリンを用いて作成された標準曲線に対するカルバゾールアッセ イによるウロン酸測定によった。組成分析を第１表に示す。

実施五玉 この実施例は、代替増幅経路Ｃ３コンベルターゼの生成を阻害するヘパリン及び ヘパリン−オリゴサツカライドの活性を示す。Ｗｅｉｌｅｒら、２ｂｌ月シルＩ ユ、　１４７　：４０９−４２１．１９７８；Ｗｅｉｌｅｒ。

Ｉｍｍｕｎｏ　ｈａｒｍａｃｏｌｏ　、６　：２４５−２５５，１９８３；及び ５ｈａｒａｔｈ　ら、と利」及肛駐並旦■、ユニ７３−８３．１９８３に記載さ れている方法を用いた。要約すれば、細胞表面上に多い、中程度及び少い量の０ ３を有するように調製されたＥＡＣ４ｂ、　３ｂを用いる実験において阻害を試 験した。１０９のＥＡＣ４ｂ、　２ａ細胞性中間体当り１００ｉ　、　２０μｇ 及び５μｇの０３インプツトを用いてそれぞれＥＡＣ４ｂ、３ｂ”０．ＥＡＣ４ ｂ、３ｂ”、及びＥＡＣ４ｂ、３ｂ５を調製した。補体アッセイ緩衝液（ＤＧＶ Ｂ”ａ　１００　ｐ！のみを試薬ブランク、非阻害及び１００％溶解のために用 いられるチューブに加え；あるいはヘパリン又はヘパリン−オリゴサンカライド 溶液を含む補体アッセイ緩衝液を残りのチューブを加えた。０時点において、Ｉ 　ＸＩＯ’　ＥＡＣ４ｂ、３ｂの懸濁液、過剰量のＰ及びＤ　（１００ｎｇＤ） 、及び非阻害チューブを細胞当り平均１血球溶解事象で溶解するのに必要な量の Ｂを含む補体アッセイ緩衝液１００μ！（ＥＡＣ４ｂ、　３ｂｌ　Ｇｏについて は０．０３ｎｇのり、　ＥＡＣ４ｂ、３ｂ”については０、１５ｎｇのＢ１そし てＥＡＣ４ｂ、　３ｂ５については０．５０ｎｇのＢ）を各チューブに加えた。

混合物を撹拌ながら３０分間３０°Ｃにてインキュベートした。次に、４０ｍＭ 　ＥＤＴＡ中ラットラット血清２０稀釈物３００Ｉをチューブに加え、そして撹 拌しなから３７゛Ｃにて６０分間インキュベーションを続けた。次に、塩溶液（ １，５ｍｆ）を各チューブに加え、但し１００％チューブには塩溶液の代りに１ ，５戚の水を加えて溶解を行った。最後に、チューブの内容物を混合し、遠心分 離し、そして上清の吸収を４１４ｎｍにて測定した。

次に、溶解％、細胞当り血球溶解部位の平均数（Ｚ）、及び阻害％を計算した。

データーは、阻害％として、又はヘパリンについてのＥＤ５０　（５０％の阻害 をもたらすヘパリンの量）をヘパリン−オリゴサツカライドについてのＥＤ５０ で除して１００倍したものとして表わす。ヘパリン及びヘパリン−オリゴサツカ ライドの濃度はｌＸｌ０’細胞中間体当り鱈として表わす。コンペルターゼ生成 の間の反応チューブの容量は０．２滅と０．３−の間で異った。細胞中間体の数 はチューブ当り１×１０７に保持された。非阻害チューブにおいて見られる溶解 の量（Ｚ）はコンペルターゼ生成の間チューブ中に存在する緩衝液の容量とは比 較的独立であった。同様に、コンペルターゼ生成の阻害の量はコンペルターゼ生 成の間にチューブ中に存在する緩衝液の量とは独立であった。

この実験の結果が示すところによれば、Ｃ３ｂの負荷が増加するに従ってヘパリ ンの阻害活性が低下した。この実験において、細胞当り平均工血球溶解を維持す るために細胞中間体上のＣ３ｂの濃度を低下させるに従ってＢインプットの量が 増加した。この実験は、Ｂの低、中間及び高濃度の存在下でのＥＡＣ４ｂ、３ｂ ２０上の有効なコンペルクーゼの集成を妨害するヘパリンの阻害の程度を決定す るのにＢインプットのみが役割を演するか否かを決定した。細胞中間体中に存在 するＢの量は溶解を阻害するヘパリン又はヘパリン−オリゴサツカライドの能力 になんらの影響も与えなかった。

第２図の実験の結果は、第１表に定義する配列のジサッカライド、テトラサツカ ライド工人、土且及び王立、並びにヘキササツカライド１ｑを用いてのヘパリン −オリゴサツカライドによる補体活性化の制御を示す。オリゴサツカライドは補 体活性化について低い活性を示し、細胞中間体当り１〜８鱈の直線酌量応答曲線 を示した（第２図）。次に、１８９２〜５３２０の範囲の分子量を有する６〜１ ６サツカライドユニツトの重合度のヘパリン−オリゴサツカライドを活性につい て試験した。その結果を重量基準で生来のヘパリンの活性と比較した。高分子量 ヘパリン−オリゴサンカライド（１６Ｂ、分子量５３２０）は分子基準で生来の ヘパリンの活性の５４％であり、そして重ＭＴｉ準で１３０％であった。

２４という多くのサンカライドユニットを有するヘパリンオリゴサンカライドを 本明細書に記載する方法に従って調製した。このオリゴサツカライドは非常に低 下した抗凝固活性を有していた（重量基準で生来のヘパリンの抗凝固活性の１０ ％未満と定義される）。ヘパリン−オリゴサンカライドを、本明細書に記載する ように補体活性化を制御する能力について試験した。２４サツカライドユニツト を有するオリゴサツカライドは分子基準でヘパリンと同等であった。

この実施例はまた、オリゴサンカライド構造と補体制御活性との関連を示す。ヘ キササツカライドからデカサツカライドまでにわたる定義された組成の純粋なヘ パリン−オリゴサンカライド１１種を試験した（第４図）、これらの均一なヘパ リン−オリゴサンカライドは、それらの精製度の低い対応物に比べて低い抗凝固 活性及び実質的に同じ補体活性化阻害活性を示した。

実施燃旦 この実施例は各ヘパリン及びヘパリンオリゴサンカライド断片の抗凝固活性を示 す。抗凝固活性を、ａＰＴＴ　（活性化スロンボプラスミン時間）　（Ｌｉｎｈ ａｒｄ　ｔら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２￥７　ニア３１０−１３．１９８２ ）により決定した。アンチスロンビン■−介在抗一フアクタ−Ｈａ及び抗ファク ターＸａ活性を、Ｌｉｎｈａｒｄｔら及び第２表に記載されるようにして、精製 血漿蛋白質を用いて測定した。第５図に示すように、５種類のブタヘパリンは重 量基準で標準ブタヘパリン（Ｈｌ）の９０〜１０７％の活性を示した。２種類の ウシヘパリンは標準ブタヘパリン活性の１０６％及び１２４％を有し、そして低 分子量ヘパリンは補体活性化に対して標準ブタヘパリンの活性の１００％を有し ていた。

活性化部分的スロンボプラスチン時間アッセイ及びアンチスロンビンｍ　−介在 抗一フアクター１１ａアッセイを用いてのヘパリン−オリゴサツカライド及び市 販ヘパリンの抗凝固活性は類似の結果を与え、抗−フアクタ−Ｕａアッセイがわ ずかに低い値を示した（第２表）。抗−フアクタ−Ｕａアッセイにより測定され たヘパリン−オリゴサツカライド及び市販ヘパリンの抗凝固活性を補体活性化阻 害するそれらの能力に対して第５図にプロットする。ブタヘパリン、ウシヘパリ ン及び低分子ヘパリンは一団をなし、活性の差異がわずかに過ぎないことを示す 。これに対して、ヘパリンオリゴサツカライドは、重合度の増加に従って補体制 御活性の顕、著な増加を伴って抗凝固活性のわずかな増加を示した。

た偶数個のサツカライドユニットを有するヘパリンオリゴサツカライドの非還元 末端からのΔυ静サンカライドユニットの除去の方法を示す。この方法は、奇数 サツカライドユニットを有するヘパリン−オリゴサツカライドの相補群を生成せ しめる。６〜２４サツカライドユニツトのヘパリン−オリゴサンカライドを０． ０３Ｎ塩酸に１００鱈／ｄで溶解した。溶液の２３２ｎｍでの吸光がなくなるま で、この液を通してオゾンガスを泡立てた。この溶液のｐＨをｐＨ７，０に調整 し、そしてΔＵＡｐサツカライドユニットの低分子量断片を、セファデックス６ −１５カラム上でのゲル浸透クロマトグラフィーにより除去する。奇数のサツカ ライドユニットを有するヘパリンオリゴサンカライドを回収し、そしてウロン酸 を用いて定量する。

明らかにしそして理解のために説明及び実施例により本発明を記載したが、本発 明の本質及び範囲を逸脱することなく幾つかの変化及び変更を行うことができょ う。

浄！（内容に変更なし） γ　里几　Ｔ’ｉｔｌ＆　日　＼１Ｊ−Ｎ！６、　補正の対象 （１）明細書及び請求の範囲の翻訳文 （２）図面の翻訳文 （３）委任状 ７、補正の内容 （１）明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし） （２）図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）（３）別紙の通り ８、添付書類の目録 （１）明細書及び請求の範囲の翻訳文　各１通（２）図面の翻訳文　１通 （３）委任状及びその翻訳文　各１通 国際調査報告 ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０３３１２ 車・°・〜・パ“＋＊ｅｌＡｓｓμ・・１・・・ト・・−２−

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．次の式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒは金属陽イオン又は非金属陽イオンであり、ＸはＳＯ３Ｒであり、そ してｎは５〜１１の整数である）で表わされ； ヘパリン様抗補体活性を有し； ヘパリンに比べて低下した抗凝固活性を有し；そしてナトリウム塩が少なくとも １４％の硫黄を含む；ことを特徴とするオリゴサッカライド。
2. ２．ＲがＮａ，Ｋ及びＬｉから成る群から選択される請求項１に記載のオリゴサ ッカライド。
3. ３．請求項１又は２に記載のオリゴサッカライド、及び非経腸投与のための許容 される医薬キャリヤーを含んで成る医薬組成物。
4. ４．ヘパリン様抗凝固活性及びヘパリンに比べて低下した抗凝固活性を有するオ リゴサッカライドの製造方法であって、ヘパリンを酵素ヘパリナーゼにより部分 的に解重合してポリサッカライド混合物を得； 該ポリサッカライド混合物を陰イオン交換カラムにより分画しそして分離された 画分を集め； 分離されたポリサッカライド画分をヘパリナーゼで処理して第１表に２，４Ａ， ４Ｂ，４Ｃ及び６Ｃとして同定されるジサッカライド、テトラサッカライド及び ヘキササッカライドを生成せしめ；そして 該ジサッカライド、テトラサッカライド又はヘキササッカライドを重合させて１ ０〜２４サッカライドユニットの偶数の重合度を有するオリゴサッカライドを形 成する；ことを含んで成る方法。
5. ５．前記偶数重合度のオリゴサッカライドを酸性還境中でオゾンに暴露すること により末端非還元糖を除去して奇数オリゴサッカライドを形成することをさらに 含んで成る、請求項４に記載の方法。
6. ６．次の式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＲはＨ、又は金属陽イオンもしくは非金属陽イオンであり、ＸはＨ又は ＳＯ２Ｒであり、ＸはＨ、ＣＯＣ１−６アルキル又はＳＯ３Ｒであり、そしてｎ は１〜１１の整数である）で表わされ； ヘパリン様抗補体活性を有し；そして ヘパリンに比べて低下した抗凝固活性を有する；ことを特徴とする奇数オリゴサ ッカライド。
7. ７．ＲがＨ，Ｎａ，Ｋ及びＬｉから成る群から選択されたものである、請求項６ に記載の奇数オリゴサッカライド。
8. ８．ＹがＣＯＣＨ３である請求項６に記載の奇数オリゴサッカライド。
9. ９．ｎが約４〜約１０の整数である請求項６に記載の奇数オリゴサッカライド。
10. １０．請求項６〜９のいずれかに記載の奇数オリゴサッカライド、及び医薬とし て許容されるキャリヤー又は稀釈剤を含んで成る医薬組成物。