JPH03246298A - 副甲状腺ホルモン様タンパク質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、乳を原料として副甲状腺ホルモン様タンパク
質を製造する方法に関する。

副甲状腺ホルモン様タンパク質は、カルシウム吸収や骨
形成に重要な役割を果しており、生理活性物質としであ
るいは癌診断に有効な物質とじて医薬、食品、化粧品素
材の分野あるいは診断薬の分野で有用に利用される。

〔従来の技術〕

副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ；ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　
ｈｏｒｍｏｎｅ）は、癌細胞によって産生される分子量
約８，６００のタンパク質であり、骨に対して骨形成を
抑制し、カルシウムの放出を促進して高カルシウム血症
の原因物質となることが知られていた。したがって、癌
診断における重要な物質であると認識されていた。

近年、ＰＴＨは正常細胞によっても産生されることが知
られるようになり、骨吸収活性、骨芽細胞増殖など、骨
形成やカルシウム吸収に重要な働きをもっているらしい
ことが判ってきている。

一方Ｒｏｄａｎらのグループは、各種正常組織における
副甲状腺ホルモン様タンパクｔ　（ＰＴＨ−ＬＰ；ｐａ
ｒａｔｈｙｒｏｒｄ　ｈｏｒｍｏｒ＋ｅ−１ｉｋｅ　ｐ
ｒｏｔｅｉｎ）のｍＲＮＡの発現について調べ、授乳時
の乳腺組織においてＰＴＨ−ＬＰのａ＋ＲＮＡが発現さ
れていることを報告した（サイエンス召２４２：２７８
−２８０．１９８８）。

さらにＢｕｄａｙｒらは、ＰＴＨ−ＬＰが乳中にも存在
していることを報告し、乳児に対してもＰＴＨ−ＬＰが
重要な働きをもっていることが示唆されるに到っている
（プロシーディング　オブ　ザ　ナショナルア力デミイ
　オプ　サイエンス、Ｕ　Ｓ　Ａ　８虹７１８３７１８
５、１９８９）。

また、Ｂｕｒｔｉｓらは乳癌細胞から、８Ｍ尿素、０．
２Ｍ塩酸、および１０ｍＭシスティンを含む０．１１’
ｌトリス緩衝液（ｐＨ７，４）を用いて細胞抽出液を得
、エタノール／食塩沈澱、逆相ＨＰＬＣ法を経てＰＴＦ
Ｉ−ＬＰを精製した（ジャーナル　オブ　バイオロジカ
ル　ケミストリー」渣か７１５１−７１５６．１９８７
）。しかし、このような方法は、実験室における精製法
であるので工業的にＰＴＨ−ＬＰを得ることができない
ばかりでなく、医薬、化粧品、食品素材等としても利用
できるような安全なＰＴ）Ｉ−ＬＰを得ることができな
い。さらに、乳中にＰＴＨ−ＬＰが存在していることは
明らかとなったものの、乳からの精製方法として公知な
ものはまだない。

〔発明が解決しようとする課題〕

かかる状況にあって、本発明は、乳を原料とし、大量に
かつ安価であり、しかも医薬品、食品、あるいは化粧品
素材としても充分使用可能な安全なＰＴＩ（−ＬＰの製
造方法を徒供することを目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、乳を陰イオンに帯電した担体と接触させて副
甲状腺ホルモン様タンパク質を吸着させ、イオン強度０
．３以上の水溶液または緩衝液で該担体に吸着された副
甲状腺ホルモン様タンパク賞を溶出し、次いで分画分子
量が２０，０００〜１００，０００の分子篩で濾過して
副甲状腺ホルモン様タンパク質を回収することよりなる
副甲状腺ホルモン様タンパク質の製造法に関する。

本発明では、上記分子篩で濾過した濾液を濃縮、脱塩し
て副甲状腺ホルモン様タンパク質を回収するとよい。

本発明で原料として用いられる乳として、牛乳、人乳、
水牛孔、山羊孔および豚乳等を例示することができるが
、原料入手の容易さを考えれば牛乳が最も便利である。

乳をそのまま原料として用いることも可能であるが、あ
らかじめ脱脂したものの方が吸着担体へのよごれを考慮
した場合有利である。乳は加熱殺菌されたもの、ホエー
、あるいはこれらの乾燥粉末を水に還元したものであっ
てもよい。

陰イオンに帯電した吸着担体としては、ヘパリン固定化
担体、例えばヘパリン−セファロース、ヘパリン−セル
ロース等を例示することができる。

また、カルボキシメチル化担体、例えば、ＣＭ−セルロ
ースを、スルホン化担体、例えばスルホン化セルロース
、スルホン化キトサン等を例示し得る。

スルホン基やカルボキシメチル基を多孔性粒子表面に被
覆した多Ｉｉ類、例えばデキストランに導入したものも
利用できる。スルホン基やカルボキシメチル基を導入す
る場合、活性基密度は１０〜５００μｅｇ／ＩＩｉ担体
、より好ましくは２０〜５０μｅｇ／ｌｄ担体であるこ
とが好ましい。５００　μｓｇより多くの活性基が導入
されていると乳中の主要タンパク質であるβ−ラクトグ
ロブリンや免疫グロブリンの吸着量が増し、吸着される
ＰＴＨ−ＬＰが減少するのみならず、精製工程が複雑と
なり、ＰＴＨ−ＬＰの純度が低下する。また、１０μｓ
ｇ以下の場合にはＰＴＨ−ＬＰの純度は向上するものの
吸着量が少なく効率が悪い。

乳とこれら吸着担体を接触させる方法は特に限定される
ものではなく、通常用いられている充填層型カラムに担
体を充填し、カラム上方、または下方から乳を通液する
方法、あるいは、タンクで乳と担体とを混合撹拌する方
法を例示しすることができる。大量の乳を高流速で通液
し、しかも効率よ（目的タンパク質を吸着させる方法と
して、回転型カラムを利用する方法（特願平１−１９４
６２０）が好ましい。このようにすると、通液後の乳に
は何ら損傷がないので、再利用することができる。

ＰＴＩ（−ＬＰを溶出させるにはイオン強度０．３以上
の塩溶液、例えば食塩溶液を用いる。この時、イオン強
度とｐｎの組合せが重要であり、用いる吸着担体の種類
によって若干具なる。例えばスルホン化担体の場合、ｐ
Ｈが中性であればイオン強度０．３以上でＰＴＨ−ＬＰ
は溶出するが、ｐＨが酸性の場合イオン強度を上げない
と溶出してこない。また、イオン強度０．３以上の緩衝
液を用いて溶出を行ってもよい。本発明で用いる吸着担
体には、ＰＴＨ−ＬＰの他、乳中の生理機能を有するラ
クトパーオキシダーゼ（ＬＰ）やラクトフェリン（Ｌｆ
）も同時に吸着する。このため、これらのタンパク質を
分別分画することは極めて有利である。

この分別分画は、まず吸着担体を温湯で洗浄した後、イ
オン強度０．１．ｐＨ４の緩衝液で洗浄する。

次いで、イオン強度０．５．ｐＨ４の緩衝液でＬＰを溶
出後、イオン強度１．０．ｐＨ７の緩衝液を用いてＬｆ
およびＰＴＨ−ＬＰを溶出させることができる。

このようにＰＴＨ−ＬＰはＬＰおよび／またはＬｆと同
時に溶出されるため、両者を分画する必要がある。

ＬＰおよびＬｆの分子量は約７５〜８０にであるのに対
し、ＰＴＨ−ＬＰは約１５〜２０にであることから分子
量分画２０〜１００Ｋの分子篩効果を利用して両者を分
画できる。

ゲル濾過法を用いる場合は分子量２０にと分子量７５Ｋ
を分画可能なゲル、例えばセファデックスＧ−１００や
スーパーロース１２等を用いることができる。しかし、
ゲル濾過法は少量の試料処理には適しているが、大量処
理には不適であるため、限外濾過を行うことが望ましい
。例えば、分子量分画５０にの膜（日東電工ＮＰＵ　３
１５０３２）を用いることができ、ＬＰやＬｆは濃縮側
に、ＰＴＨ−ＬＰは濾液側に得ることができる。

こうして得られたＰＴＨ−ＬＰ画分は濃縮・脱塩工程を
経る。濃縮は真空減圧濃縮法および／または分子量分４
２０に以下の膜を用いる方法によって行うとよい。また
、脱塩はイオン交換樹脂、電気透析、および／または分
子量分画２０に以下の膜を用いたダイアフィルトレージ
ョン法を用いることができる。なお、このようにして得
られたＰＴＨ−ＬＰをさらに抗体カラム等で精製するこ
ともできる。

ＰＴＨ−ＬＰの定量は、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　５ｃｉｅｎｃｅ並、　７１８３〜７１８５（１
９８９）に記載される方法に従って行った。すなわち、
部分的に化学合成されたＰＴＨを標準として用いたラジ
オ　イミュノアッセイによって行なう。すなわち、ウサ
ギ抗ＰＴＩ（抗体をプレートに結合させ、試料または標
準ＰＴＨと１２５１をラベルしたＰＴＨを加えコンペテ
ィティブに結合した”Ｊ−ＰＴＨをカウントし、試料中
の濃度を求めた。

次に、本発明を実施例によって具体的に説明する。

〈実施例１〉 人乳１００ｄを遠心分離してクリーム層を除き、これを
カラム（ＩＣＩＩφＸ１３ＣＩ）に充填したヘパリンセ
ファロース（ファルマシア）１０威に通液した。

水で白濁がなくなるまでカラムを洗浄した後、１Ｍ食塩
溶液で吸着タンパク質を溶出した。この溶出液をセファ
デックスＧ−１００（ファルマシア）のカラム（２Ｃ１
１φＸ６０Ｃ１１）にのせ４°Ｃにてゲル濾過し、分子
量１８にの両分を分取した。この両分１５ｍを工バポレ
ーターにて５ｄにまで濃縮した後、分子量分画３にの透
析膜を用いて透析し脱塩した。脱塩した試料中には約３
０μｇのＰＴＨ−ＬＰが含まれ、純度は約７０％であっ
た。

〈実施例２〉 山羊乳よりチーズを製造した際に得られた山羊乳ホエー
を７５°Ｃ１５秒間殺菌後４°Ｃに冷却した。

方、囲−セファデックスＣ−５０（ファルマシア）２５
ｇを水に膨潤させ、Ｎａ形にしたちの１．２１をホエー
１００ｋｇに投入し、４°Ｃにて２時間接触・撹拌した
。次いで濾過布にてイオン交換樹脂を除去し、樹脂をカ
ラムに充填した。このカラムをまず水で充分洗浄した後
、０．８Ｍ食塩溶液で吸着タンパク質を溶出し、約８１
の溶出液を得た０次いでこの回収液を分画分子量５０に
の限外濾過膜（ＯＤＲ社ＧＲ５１）を用い、４０°Ｃ１
圧力０．４ＭＰａ、平均透過流速７３１／イ・ｈにて限
外濾過を行ない、約５倍に濃縮し、透過液を得た。この
濃縮液に再度水を加えて８！とした後、再限外濾過を行
なった。２回の限外濾過で得られた透過液１３２を分画
分子量２０にの限外濾過膜（ＤＤＳ社ＧＲ６１）を用い
ダイアフィルトレージョンし脱塩し、最後に約１０倍に
濃縮した。約１．５１の濃縮液を回収し、凍結乾燥した
。３３■のＰＴＨ−ＬＰを得、純度は約８２％であった
。

〈実施例３〉 脱脂粉乳４ｋｇを水２０２に溶解し、ＩＩｌのスルホン
化セルロファイン（生化学工業）を混合し、室温にて３
時間撹拌した。デカンテーションし担体を回収後、水を
５０ｆｆｉ加え担体をよく洗浄した。次に２０ｆｆｉの
０．５Ｍ食塩を含む５ａ＋Ｍ重炭酸ソーダ緩衝液（ｐＨ
６，８）で担体を洗浄し、吸着タンパク質を脱着させた
。担体をデカンテーションして得られた回収液１８２を
実施例２と同様に限外濾過、ダイアフィルトレージョン
、脱塩、濃縮、さらに凍結乾燥し、ＰＴＨ−ＬＰを２２
■得た。純度は約７９％であった。

〈実施例４〉 脱脂した線孔５１に塩酸を加えｐＨを４．６に調整しカ
ゼインを沈澱させた。上澄ホエーを遠心分離し、約４．
３２の脱脂ホエーを得た。これを５Ｘ２５Ｃ１Ｏカラム
に充填した１００−のけ−スフェロテックス−ＬＤ（Ｉ
ＢＦ−バイオテクニクス社）に２０時間かけて通液した
。充分水で洗浄した後、０．２Ｍ食塩水でＬＰを主成分
とする両分を回収した。次いで０．７Ｍ食塩水で溶出し
、ＬｆとＰＴＨ−ＬＰを主成分とする画分８００　ｄを
得た。この画分をエバポレーターにて４０倍に濃縮後、
スーパーロース１２（ファルマシア）を充填したカラム
でゲル濾過し、ＬｆとＰＴＨ−ＬＰに分画した。ＰＴＨ
−ＬＰ画分はさらにエバポレーターで濃縮後、分画分子
量３にの膜を用い透析した。回収されたＰＴＨ−ＬＰ画
分にはＰＴＨ−ＬＰが７３０μｇ含まれ、純度は７０％
であった。

〈実施例５〉 １（［のスルホン化キトパール（富士紡績）を内筒容量
１４ｆの回転型カラムリアクター（東京理化機械）に充
填し、２．０００　ｆの未殺菌脱脂牛乳（４°Ｃ）を流
速１．０００１／ｈｒにて４時間循環通液した。

通液後の脱脂乳は常法に従って噴霧乾燥し、脱脂粉乳を
製造した。リアクターに１００ｆの温湯を、１．０００
１／ｈｒの流速で通液し、ゲルを洗浄した。

次いで０．１Ｍ食塩を含む５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ
４）でゲルを洗浄した。食塩濃度を０．５Ｍに上げたク
エン酸緩衝液（ｐＨ４）でＬＰを溶出させた後１Ｍ食塩
を含む５１ＩＩＭ重炭酸ソーダ水（ｐＨ６，８）でＬｆ
およびＰＴＨ−ＬＰを溶出した。ゲルには水を通液し再
生した。溶出液６０ｊ２を分画分子量５０にの限外濾過
膜（日東電工ＮＴＵ−３１５０８−２）で限外濾過し、
濾液５５！を回収した。

濾液はＲＯ膜（Ｄｅｓａｌｉｎａｔｉｏｎ　５ｙｓｔｅ
ｎ＋　Ｉｎｃ、ＤＥＳＡＬＧ−２０）を用いてダイアフ
ィルトレージョンを行ない最終１５１の濃縮液を得た。

さらに、エバポレーターで２２まで濃縮後凍結乾燥した
。乾燥物１．５ｇ中ＰＴ）ＩＬＰは１．２ｇであり、タ
ンパク質当りの純度は８７％であった。

〔発明の効果〕

本発明によれば、ガンの診断や骨形成あるいはカルシウ
ム吸収に重要な役割を演じるＰＴＨ−ＬＰを簡便に、か
つ純度７０％以上で工業的有利に分離・精製することが
できる。また、必要に応じて様々な生理機能を有するＬ
ＰやＬｆも同時に分画できるので極めて有利である。さ
らに未吸着孔には何ら損傷が与えられていないので再利
用することも可能である。本発明で用いる副原料はすべ
て食品添加物として認められているもののみを使用して
いることから、得られたＰＴＨ−ＬＰも安全であり、医
薬品、食品あるいは化粧品素材として利用することがで
きる。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）乳を、陰イオンに帯電した担体と接触させて副甲
   状腺ホルモン様タンパク質を吸着させ、イオン強度０．
   ３以上の水溶液又は緩衝液で該担体に吸着された副甲状
   腺ホルモン様タンパク質を溶出し、次いで、分画分子量
   が２０，０００〜１００，０００の分子篩で濾過して副
   甲状腺ホルモン様タンパク質を回収することを特徴とす
   る副甲状腺ホルモン様タンパク質の製造法。
2. （２）分子篩での濾過を限外濾過法又はゲル濾過法で行
   う請求項（１）に記載の副甲状腺ホルモン様タンパク質
   の製造法。
3. （３）陰イオンに帯電した担体が多糖類であるか又は多
   糖類で被覆された担体である請求項（１）または（２）
   に記載の副甲状腺ホルモン様タンパク質の製造法。
4. （４）陰イオンに帯電した担体がヘパリン固定化担体で
   ある請求項（１）乃至（３）のいずれかに記載の副甲状
   腺ホルモン様タンパク質の製造法。
5. （５）陰イオンに帯電した担体がカルボキシメチル化及
   び／又はスルホン化された担体である請求項（１）乃至
   （４のいずれかに記載の副甲状腺ホルモン様タンパク質
   の製造法。
6. （６）カルボキシメチル化及び／又はスルホン化された
   担体のカルボキシメチル基及び／又はスルホン基の導入
   密度が１０〜５００μｅｑ／ｍｌである請求項（５）に
   記載の副甲状腺ホルモン様タンパク質の製造法。