JPH03224479A - Novel bioactive polypeptide - Google Patents
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Landscapes
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
（１） 産業上の利用分野
本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物細胞及び該
微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製造方
法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新規ポ
リペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと略す
こともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域
を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって形質転
換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用いた新
規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法、該新規抗腫瘍活
性ポリペプチドを含有する医薬組成物に関する。Detailed Description of the Invention (1) Industrial Application Field The present invention relates to a novel physiologically active polypeptide, a recombinant plasmid containing a DNA region encoding the polypeptide, a recombinant microbial cell transformed with the plasmid, and a recombinant microbial cell transformed with the plasmid. The present invention relates to a method for producing a novel physiologically active polypeptide using the microbial cells. More specifically, novel polypeptides having antitumor activity (hereinafter sometimes abbreviated as novel antitumor activity polypeptides), recombinant plasmids containing a DNA region encoding the polypeptides, and constructs transformed with the plasmids. The present invention relates to a modified microbial cell, a method for producing a novel antitumor active polypeptide using the microbial cell, and a pharmaceutical composition containing the novel antitumor active polypeptide.
本明りＩｌ書において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵ
ＰＡＣ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方
法により略記するものとし、たとえば下記の略号を用い
る。In this specification, amino acids and polypeptides are IU
It shall be abbreviated according to the method adopted by the PAC-IUB Committee on Biochemistry (CBN), for example, the following abbreviations are used.
ＡＩａＬ−アラニン
Ａｒｇ Ｌ−アルギニン
ＡｓｎＬ−アスパラギン
ＡｓｐＬ−アスパラギン酸
ＣＶＳ Ｌ−システィン
Ｇｌｎ Ｌ−グルタミン
Ｑｌｕ ｌ−グルタミン酸
Ｇｌｙ グリシン
１−１ｉｓｌ−−ヒスチジン
１１ｅＬ−イソロイシン
１−ｅｕｌ−ロイシン
ＬｙｓＬ−リジン
Ｍｅｔ Ｌ−メチオニン
Ｐｈｅ Ｌ−フェニルアラニン
ｐｒｏｌ−プロリン
５ｅｒｌ−−セリン
Ｔｈｒ Ｌ−スレオニン
ＴｒｐＬ−トリプトファン
Ｔｙｒ Ｌ−チロシン
Ｖａｌ Ｌ−バリン
また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。AIaL-Alanine Arg L-Arginine AsnL-Asparagine AspL-Aspartic acid CVS L-Cystine Gln L-Glutamine Qlu l-Glutamate Gly Glycine 1-1isl--Histidine 11eL-Isoleucine 1-eul-Leucine LysL-Lysine Met L-Methionine Phe L-phenylalanine prol-proline 5erl--serine Thr L-threonine TrpL-tryptophan Tyr L-tyrosine Val L-valine Furthermore, the sequence of DNA shall be abbreviated by the type of base contained in each deoxyribonucleotide constituting it,
For example, use the following abbreviations.
Ａ アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ チミン （デオキシチミ
ジル酸を示す。）さらに、（Ｈ２Ｎ）−及び−（ＣＯＯ
Ｈ）はそれぞれアミノ酸配列のアミノ末端側及びカルボ
キシ末端側を示すものであり、（５′ ）−及び（３′
）はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端側
を示すものである。A Adenine (represents deoxyadenylic acid) C Cytosine (represents deoxycytidylic acid) G Guanine (represents deoxyguanylic acid) T Thymine (represents deoxythymidylic acid) Furthermore, (H2N) - and -( COO
H) indicates the amino terminal side and carboxy terminal side of the amino acid sequence, respectively, (5')- and (3'
) indicate the 5' end and 3' end of the DNA sequence, respectively.
（２） 発明の前景
Ｃａｒｓｗｅｌｌ らは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａ１
ｌｌｅｔｔｅ −Ｑｕｅｒｉｎ （ＢＣＧ＞などで前
もって刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した
後に採取した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫による
癌を出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、
この物質を腫瘍壊死因子（Ｔ ｕｍｏｒ Ｎ ｅｃｒ
ｏｓｉｓｌ”ａｃｔｏｒ 、以下ＴＮＦと略記すること
もある）と名づけだ［Ｅ、 Ａ、 Ｃａｒｓｗｅｌｌら
、 Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｌ。(2) Foreground of the invention Carswell et al.
They discovered that serum collected after administering endotoxin to mice that had been previously stimulated with llette-Querin (BCG) contained a substance that caused hemorrhagic necrosis of transplanted cancer caused by MethA sarcoma.
This substance is called tumor necrosis factor (tumor necrosis factor).
[E, A. Carswell et al., Proc. Natl.
Ａ ｃａｄ、Ｓ ｃｉ、、ＬＩ Ｓ Ａ 、 ７２．３
６６６ （１９７５）コ。このＴＮＦはマウス、ウサギ
、ヒト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に、
しかも種を越えで働くことから、制癌剤としての利用が
期待されてきた。A cad, Sci,, LISA, 72.3
666 (1975) Ko. This TNF is found in many animals such as mice, rabbits, and humans, and is specific to tumor cells.
Moreover, since it works across species, it has been expected to be used as an anticancer drug.
最近になッテ、Ｐ ｅｎｎｉｃａらは、ヒトＴＮＦのｃ
Ｄ Ｎ Ａクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の
一次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトＴ
ＮＦ遺伝子の発現について報告したＦＤ、 Ｐｅｎｎ
１Ｃａら、 Ｎａｔｕｒｅ 、 ３１２． ７２４
（１９８４） ］ 、その後、自弁ら［Ｔ、 ５ｈｉｒ
ａｉら。Recently, Nitte, Pennica et al.
We carried out DNA cloning to clarify the primary structure of human TNF protein and to
FD, Penn, who reported on the expression of the NF gene.
1Ca et al., Nature, 312. 724
(1984)], then Jiben et al.
ai et al.
Ｎ ａｔｕｒｅ 、 ３１３． ８０３ ＜ １９８
５）コ、宗村ら［宗村ら、癌と化学療法、 １２． １
６０（１９８５） ］ 、Ｗａｎ（１ら［Ａ、Ｍ、Ｗａ
ｎｇら、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２２８． １４９（１
９８５） ］及びＭ ａｒｍｅｎｏｕｔら［Ａ 、
Ｍ ａｒｍｅｎｏｕｔら。Nature, 313. 803 < 198
5) Koh, Munemura et al. [Monemura et al., Cancer and Chemotherapy, 12. 1
60 (1985)], Wan (1 et al. [A, M, Wa
ng et al., 5science, 228. 149 (1
985)] and Marmenout et al. [A,
M armenout et al.
Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｎ、、 １５２．
５１５（１９８５） ］ が、ヒトＴＮＦ遺伝
子の大腸菌における発現について相ついで報告している
。Eur, J., Biochen, 152.
515 (1985)] subsequently reported on the expression of the human TNF gene in E. coli.
このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多部に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［１３、３ｅｕｌｔｅ
ｒら、 ＮＢｕｒｅ 。Through the use of genetic engineering techniques, pure human TNF protein has become available in large quantities, and the physiological activities of TNF other than its antitumor activity are becoming clearer. For example, cachectin, which is one of the causes of cachexia seen in patients with terminal cancer or severe infections, is very similar to TNF [13, 3 eult
r et al., NBure.
３１６、 ５５２＜１９８５） ］ 、カケクチンがリ
ポプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、Ｔ
ＮＦの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、そ
の結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可能
性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血管
内皮細胞への影響［Ｊ、Ｒ。316, 552<1985)], and since cachectin has lipoprotein lipase inhibitory activity, T
It has been suggested that administration of NF increases the amount of triglyceride in the blood, which may result in side effects such as hyperlipidemia. In addition, there are also effects on vascular endothelial cells [J, R.
Ｑａｌｂｌｅら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６２．２１６
３（１９８５） ］ 、骨吸収作用［Ｄ、 Ｒ，Ｂｅ１
ｔｏｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ 、 ３１９． ５１
６（１９８６） １等が報告されている。Qalble et al., J. Exp. Med, 162.216
3 (1985)], bone resorption effect [D, R, Be1
tolini et al., Nature, 319. 51
6 (1986) 1st prize has been reported.
一方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。On the other hand, recent advances in genetic engineering technology have enabled the substitution or addition of arbitrary amino acids in proteins with other amino acids,
or allowed to be deleted.
このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。In this way, many studies have been carried out to create new proteins that serve specific purposes by modifying naturally occurring proteins.
ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第１図記載のヒトＴ Ｎ Ｆ蛋白質のアミ
ノ酸配列において、Ｃｙｓ＃及びＣｖ ｓ ／’／のい
ずれか又は両方のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への
置換（ＰＣＴ出願公開ＷＯ３６／ ０４６０６号、特願
昭６ｌ−１０６７７２） 、Ｇ １ｙ”の他のアミノ酸
残基への置換（特願昭６１−１０６７７２号、特願昭６
１−２３８０４８号） 、 Ａ １ａ１Ｂの他のアミノ
酸残基への置換（特願昭６１〜２３３３３７号）が報告
されている。また、アミノ末端側のアミノ酸残基の欠失
についても、６アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有
していること（特開昭６１−５０９２３号）、７アミノ
酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること（特願昭
６１９００８７号）、１〜１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細
胞障害活性を有しており、その比活性は６〜８アミノ酸
欠失ＴＮＦにおいて極大になること（ＰＣＴ出願公開Ｗ
Ｏ３６／ ０２３８１号）、１０アミノ酸欠失ＴＮＦが
細胞障害活性を有していること〈特願昭６１−１１４７
５４号）、１１アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有
していること（特願昭６１−１７３８２２号）、及び７
アミノ酸欠失ＴＮＦを基盤として、ｐ ｒｏ８Ｓｅｒ９
ＡＳｐ１０をＡ ｒｇＬ ｙｓＡ ｒ（ｌへ置換を行な
うと、その比活性が大きく上昇することが報告されてい
る。Several studies have also been conducted on the modification of human TNF protein, and in the amino acid sequence of human TNF protein shown in Figure 1, either or both of the amino acid residues Cys# and Cv s /'/ have been modified. Substitution of G 1y” with other amino acid residues (PCT Application Publication No. WO 36/04606, Patent Application No. 1983-106772), Substitution of G 1y” with other amino acid residues (Patent Application No. 106772-1981, Patent Application No. 1983)
1-238048) and substitution of A 1a1B with other amino acid residues (Japanese Patent Application Nos. 61-233337). Regarding the deletion of amino acid residues on the amino terminal side, it has been shown that 6-amino acid-deleted TNF has cytotoxic activity (JP-A-61-50923), and that 7-amino acid deleted TNF has cytotoxic activity. (Japanese Patent Application No. 6190087), 1-10 amino acid deletion TNF has cytotoxic activity, and the specific activity is maximum in 6-8 amino acid deletion TNF (PCT application publication W
036/02381) and that 10 amino acid deleted TNF has cytotoxic activity (Patent Application No. 1147-1982).
54), that 11 amino acid deleted TNF has cytotoxic activity (Patent Application No. 173822/1982), and 7.
Based on amino acid deletion TNF, pro8Ser9
It has been reported that substitution of Asp10 with ArgLysA r(l) greatly increases its specific activity.
そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上１反
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。Therefore, the present inventors have conducted intensive research on modification of human TNF protein with the aim of improving specific activity, improving stability, broadening the reaction spectrum, and reducing side effects.
The present invention has now been completed.
（３）発明の目的
本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。(3) Purpose of the Invention The purpose of the present invention is to provide a novel polypeptide with antitumor activity.
本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。Another object of the present invention is to provide a recombinant plasmid containing a DNA region encoding a novel antitumor active polypeptide.
本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物、その組換え微生物細胞
を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法、
該新規抗腫瘍性ポリペプチドを含有する医薬組成物を提
供することにある。Still other objects of the present invention are a recombinant microorganism transformed with the above recombinant plasmid, a method for producing a novel antitumor active polypeptide using the recombinant microorganism cells,
An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition containing the novel antitumor polypeptide.
本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。Still other objects of the present invention will become clearer from the following description.
（４）発明の構成
本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列
（８２Ｎ ） −Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｌｊ ｃｙｓ
−Ｐｒｏ −Ｖａｌ −Ａ ｌａ −Ｈｉｓ −Ｖａｔ
−Ｖａｔ −Ａ ｌａ −Ａ ｓｎ −Ｐ ｒｏ −
Ｇ Ｉｎ −Ａ ｌａ −Ｇ Ｉｕ −Ｇ Ｉｙ −Ｇ
Ｉｎ −Ｌ ｅｌｌ −Ｇ ｌｎ−Ｔ ｒｌ）−Ｌ
ｅＬＩ−Ａ Ｓｎ−Ａ ｒＯ−Ａ ｒ＋１−Ａ ｌａ−
Ａ ｓｎ−Ａ ｌａ−Ｌ ｅｕ −Ｌ ｅｕ−Ａ ｌａ
−Ａ ｓｎ −Ｇ Ｉｙ −Ｖ ａｌ −Ｇ ｌｕ −
Ｌ ｅｕ −Ａ ｒｏ −Ａ ｓｐ −Ａ ｓｎ −Ｇ
ｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ −１１ｅ−Ｔｙ
ｒ−３ｅｒ −Ｇ Ｉｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌ
ｙｓ−Ｇ Ｉｙ−Ｇ Ｉｎ−Ｇ ＩＶ−Ｃｖｓ−Ｐ ｒ
ｏ−Ｓ ｅｔ−Ｔ ｈｒ−１−１ｉｓ−Ｖ ａｌ−Ｌｅ
ｕ −Ｌｅｕ−Ｔｈｒ −Ｈｉｓ −Ｔｈｒ −１ｌｅ
−Ｓｅｒ −Ａ ｒｇ−Ｉ ｌｅ −Ａ ｌａ−Ｖａｔ
−Ｓｅｒ −Ｔｙｒ−Ｇ ＩｎＴｈｒ −Ｌｙｓ−Ｖ
ａｔ−Ａｓｎ −Ｌｅｕ −Ｌｅｕ−８ｅｒ −Ａ ｌ
ａ −１１ｅ −Ｌ ｙｓ−Ｓ ｅｒ −Ｐ ｒｏ −
Ｃｙｓ −Ｇ ＩｎＡ ｒＱ−Ｇ ｔｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒ
ｏ−Ｇ Ｉｕ−Ｇ ｌｙ−Ａ １ａ−Ｇ ｌｕ −Ａ
Ｉａ −Ｌ ｙｓ−Ｐ ｒｏ −Ｔ ｒｐ −Ｔ ｙｒ
−Ｇ １ｕＰｒｏ −１ｌｅ −ＴＶｒ −Ｌｅｕ −
Ｇ Ｉｙ −Ｇ Ｉｙ−Ｖａｔ −Ｐ ｈｅ −Ｇ Ｉ
ｎ −Ｌ ｅｕ −Ｇ Ｉｕ −Ｌ ＶＳ −Ｇ ｌｙ
−Ａ Ｓｔ） −ＡｒＱ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−
Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ａ ｒＱ−Ｐ ｒＯ−Ａ Ｓ
ｔ）−Ｔ Ｖｒ−Ｌ ｅＬＩ−Ａ ５ｌ）−Ｐ ｈｅ−
Ａ １ａ−Ｇ Ｉｕ −Ｓ ｅｒ −Ｇ ｌｙ−Ｇ Ｉ
ｎ −Ｖ ａｌ−Ｔ ｙｒ −Ｐｈｅ −Ｇ ｌｙ −
１１ｅ −１１ｅ −Ｐｈｅ −Ｌ ｅｕ −（ＣＯＯ
Ｈ）
で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチド、また上記
新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を
含む組換えプラスミドを提供することによって達成され
、更にかくして得られた組換えプラスミドによって形質
転換された組換え微生物細胞、その微生物細胞を用いて
目的とする新規抗腫瘍活性ポリペプチドを産生ずる方法
及びこの新規抗腫１ｍ活性ポリペプチドを含有する医薬
組成物を提供することによって達成されることがわかっ
た。(4) Structure of the Invention According to the research conducted by the present inventors, the object of the present invention is to obtain the following amino acid sequence (82N) -Arg-Lys-Arlj cys
-Pro -Val -A la -His -Vat
-Vat -A la -A sn -Pro -
G In -A la -G Iu -G Iy -G
In-Lell-Gln-Trl)-L
eLI-A Sn-A rO-A r+1-A la-
A sn-A la-L eu-L eu-A la
-A sn -G Iy -V al -G lu -
L eu -A ro -A sp -A sn -G
ln-Leu-Val-Val-Pro-8er-Gl
u-Gly-Leu-Tyr-Leu -11e-Ty
r-3er-G In-Val-Leu-Phe-L
ys-G Iy-G In-G IV-Cvs-P r
o-S et-T hr-1-1is-V al-Le
u -Leu-Thr -His -Thr -1le
-Ser -A rg-I le -A la-Vat
-Ser -Tyr-G InThr -Lys-V
at-Asn-Leu-Leu-8er-A l
a-11e-Lys-Ser-Pro-
Cys -G InA rQ-G tu-Thr-Pr
o-G Iu-G ly-A 1a-G lu -A
Ia-Lys-Pro-Trp-Tyr
-G 1uPro -1le -TVr -Leu -
G Iy -G Iy-Vat -P he -G I
n -L eu -G Iu -L VS -G ly
-A St) -ArQ-Leu-3er-Thr-
Glu-11e-Asn-A rQ-P rO-A S
t)-T Vr-L eLI-A 5l)-P he-
A1a-GIu-Ser-Gly-GI
n -V al-T yr -Phe -G ly -
11e -11e -Phe -L eu -(COO
H) by providing a recombinant plasmid containing a novel physiologically active polypeptide represented by or a polypeptide having Met bound to its amino terminus, and a DNA region encoding the novel antitumor active polypeptide, Furthermore, recombinant microbial cells transformed with the thus obtained recombinant plasmid, a method for producing the desired novel antitumor active polypeptide using the microbial cell, and a medicament containing this novel antitumor 1m active polypeptide. It has been found that this can be achieved by providing a composition.
以下本発明について更に詳細に説明する。The present invention will be explained in more detail below.
（Ａ）ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化：ヒトＴＮＦ遺伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［Ｄ、 Ｐ
ｅｎｎ１ｃａら、前出〕を指定するいくつかのコドンの
中から適当なものを選び、それを化学合成することによ
って取得できる。ヒトＴＮＦ遺伝子の設計に際しては、
用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択することが望
ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に行なえ
るように適当な位置に適当な制限酵素による切断部位を
設けることが望ましい。(A) Cloning of the human TNF gene: The human TNF gene consists of amino acids [D, P
It can be obtained by selecting an appropriate codon from among several codons specifying [enn1ca et al., supra] and chemically synthesizing it. When designing the human TNF gene,
It is desirable to select the most suitable codon for the host cell to be used, and it is desirable to provide a cleavage site with an appropriate restriction enzyme at an appropriate position to facilitate subsequent cloning and genetic modification.
また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ）を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン（ＴＧＡ。Furthermore, the DNA region encoding the human TNF protein preferably has a translation initiation codon (ATG) with matching reading frames upstream thereof, and a translation initiation codon (ATG) with matching reading frames in the downstream direction. Stop codon (TGA).
ＴＡＧまたはＴＡＡ）を有することが好ましい上記翻訳
終止コドンは、発現効率の向上を目的として、２つ以上
タンデムに連結することがとりわけ好ましい。さらに、
このヒトＴＮＦ遺伝子は、その上流及び下流に作用する
制限酵素の切断部位を用いることにより、適当なベクタ
ーへのクローン化が可能になる。このようなヒトＴＮＦ
遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示した。It is especially preferable that two or more of the above-mentioned translation stop codons, which preferably have TAG or TAA), are linked in tandem for the purpose of improving expression efficiency. moreover,
This human TNF gene can be cloned into an appropriate vector by using the cleavage sites of restriction enzymes that act upstream and downstream thereof. Such human TNF
An example of a gene base sequence is shown in FIG.
上記のように設計したヒトＴＮＦ遺伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについてたとえば第２図に示
したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、それ
らを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結する
方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合成
法としてはジエステル法［Ｈ，Ｇ、 Ｋｈｏｒａｎａ。To obtain the human TNF gene designed as described above, each of the upper and lower strands is divided into several oligonucleotides as shown in Figure 2, and these are chemically synthesized. It is preferable to use a method in which oligonucleotides of two types are linked. The synthesis method for each oligonucleotide is the diester method [H, G, Khorana.
“Ｓｏｍｅ Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ
ｔｓ ｉｎＣｈｅｌｌｌｉｓｔｒＶ ｏｆ Ｐ
ｈｏｓｔ）ｈａｔｅ Ｅ ５ｔｅｒＳ ｏｆＢ ｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉ ｎｔｅｒｅＳｔ ” 、
Ｊ ｏｈｎ Ｗ １ｌｅｙａｎｄ ５ｏｎｓ 、
Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９６１） ］
。“Some Recent Developments
ts in ChellistrV of P
host)hate E 5terS of B i
Logical IntereSt”,
John W 1leyand 5ons,
Inc., New York (1961)]
.
トリエステル法［Ｒ，Ｌ、 Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ
。Triester method [R,L, Letsinger et al., J
.
Ａｍ、 Ｃｈｅｗ、 Ｓｏｃ、、８９．４８０１（
１９６７） ］及びホスファイト法［Ｍ、 Ｄ、 Ｍａ
ｔｔｅｕｃｃｉら。Am, Chew, Soc,, 89.4801 (
1967)] and the phosphite method [M, D, Ma
tteucci et al.
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌ ｅｔｔ、、 ２１．
７１９（１９８０） ］があるが、合成時間、収率、操
作の簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合成機を用いたホ
スファイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌ
クレオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグ
ラフィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体ク
ロマトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用い
ることができる。Tetrahedron Lett, 21.
719 (1980)], but synthesis by the phosphite method using a fully automatic DNA synthesizer is preferred from the viewpoints of synthesis time, yield, simplicity of operation, etc. To purify the synthesized oligonucleotide, gel filtration, ion-exchange chromatography, gel electrophoresis, high-performance liquid chromatography using a reversed phase column, etc. can be used individually or in combination as appropriate.
こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した優、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を作成する方法
としては、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえばｐＢＲ３２２［Ｆ 、
Ｂ ｏｌｉｖａｒら、 Ｇｅｎｅ 、 ２． ９５
（１９７７） ］のようなベクターに一度クローン化し
た後、それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する方法
が好ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成するブ
ロックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好ましく
はｐＴＮＦＩＢＲ。The hydroxyl group at the 5' end of the synthetic oligonucleotide thus obtained is phosphorylated using, for example, T4-polynucleotide kinase, annealed, and ligated using, for example, T4-DNA ligase. A method for constructing the human TNF gene by ligating synthetic oligonucleotides involves dividing the synthetic oligonucleotides into several blocks and ligating them, for example, pBR322[F,
Bolivar et al., Gene, 2. 95
(1977)] and then ligating the DNA fragments of each block is preferred. A plasmid containing a DNA fragment of a block constituting the human TNF gene is preferably pTNFIBR.
ｐＴＮＦ２ＮまたはＤＴＮＦ３が用いられる。pTNF2N or DTNF3 is used.
上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、ＳＯ＜シャイン・ダルガーノ）配列の下流
につなぐことにより、発現型遺伝子とすることができる
。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン・オ
ペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモーター）。After ligating the DNA fragments of each block constituting the human TNF gene cloned as described above, an expressed gene can be obtained by ligating the DNA fragments downstream of an appropriate promoter and SO<Shine-Dalgarno) sequence. . A usable promoter is the tryptophan operon promoter (trp promoter).
ラクトース・オペロン・プロモーター（Ｉａｃプロモー
ター） 、 ｔａｃプロモーター、Ｐ−プロモーター、
＋ｐｐプロモーター等があげられるが、とりわけｔｒ
ｐプロモーターが好適である。ｔｒｐプロモーターを有
するプラスミドとして、好ましくは１）ＹＳ３１Ｎ、又
はｌ）Ａ Ａ ４１が用いられる。Lactose operon promoter (Iac promoter), tac promoter, P-promoter,
+pp promoter etc., but especially tr
The p promoter is preferred. As a plasmid having a trp promoter, 1) YS31N or 1) AA41 is preferably used.
さらに、発現効率向上を目的として、ヒトＴＮＦ遺伝子
下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を付与
することができる。このようなターミネータ−として、
１ｐｐターミネータ−ｔｒｐターミネータ−等があげら
れるが、とりわけｔｒｐ Ａターミネータ−が好適であ
り、ｔｒｐ Ａターミネータ−を有するプラスミドとし
て、好ましくはｐＡ Ａ ４１が用いられる。この発現
型ヒトＴＮＦ遺伝子を、たとえばｐＢＲ３２２由来のベ
クターにクローン化することにより、発現型プラスミド
が作成できる。ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドとし
て、好ましくはＤＴＮＦ４０１ＮＮ又はＤＴＮＦ ４０
１Ａが用いられる。Furthermore, for the purpose of improving expression efficiency, a terminator that functions efficiently in E. coli can be added downstream of the human TNF gene. As such a terminator,
Examples include 1pp terminator, trp terminator, etc., but trp A terminator is particularly suitable, and pA A 41 is preferably used as the plasmid having trp A terminator. By cloning this expressed human TNF gene into a pBR322-derived vector, for example, an expression plasmid can be created. As a human TNF gene expression plasmid, preferably DTNF401NN or DTNF40
1A is used.
（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
：
こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトＴＮＦ３１仏子内の特定
な領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリ
ゴヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる
手法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意の
アミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、ま
たは欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコー
ドする遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能にな
る。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現
型プラスミドとして、好ましくはＩ）ＴＮＦ６６８が用
いられる。(B) Cloning of a novel antitumor active polypeptide gene: The human TNF gene expression plasmid thus obtained is cut with an appropriate restriction enzyme to remove a specific region within the human TNF31 gene, and then an appropriate base sequence is extracted. We perform gene repair using synthetic oligonucleotides with By using such a method, an expression plasmid containing a gene encoding a novel anti-tumor active polypeptide in which any amino acid in the human TNF protein is replaced with another amino acid, added, or deleted is obtained. It becomes possible to create I) TNF668 is preferably used as such a novel antitumor active polypeptide gene expression plasmid.
（Ｃ）発現確認及び活性評価；
ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子を発現させるための微生物宿主としては、大腸菌、枯
草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌［エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）
］が好ましい。前記ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
ミドは、たとえば公知の方法［Ｍ、 Ｖ、 Ｎｏｒｇａ
ｒｄら。(C) Expression confirmation and activity evaluation; Examples of microbial hosts for expressing the human TNF gene and the novel antitumor active polypeptide gene include Escherichia coli, Bacillus subtilis, and yeast, but especially Escherichia coli [Escherichia coli] coli)
] is preferred. The human TNF gene expression plasmid and the novel antitumor active polypeptide gene expression plasmid can be obtained by, for example, known methods [M, V, Norga et al.
rd et al.
Ｇｅｎｅ 、 ３． ２７９＜１９７８） ］を用イテ
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ６００ｒ
−ｓ−株（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入することができ
る。Gene, 3. 279<1978)], microbial hosts, such as Escherichia coli C600r.
-s- strain (ATCC33525).
このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ、 Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら編、” Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ
” 、 Ｐ ４４０． Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒＶ 、 Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ （１９８２）参照］があげられ、必要に応じ
て、たとえばアンピシリン等を添加するのが望ましい。The recombinant microbial cells thus obtained are cultured in a manner known per se. As a medium, for example, M9 medium containing glucose and casamino acids [T, Mania
tis et al., eds., “Molecular Cloning”
”, P 440. Co1d SpringHa
rbor Laborator V, New Y
(1982)], and it is desirable to add, for example, ampicillin, if necessary.
培養は目的の組換え微生物に適した条件、たとえば振と
うによる通気、撹拌を加えながら、３７℃で２〜３Ｇｖ
ｇ間行なう。また、培養開始時または培養中に、プロモ
ーターを効率良く機能させる目的で、３−β−インドー
ルアクリル酸等の薬剤を加えることもできる。Cultivation is carried out under conditions suitable for the target recombinant microorganism, such as aeration by shaking and stirring at 37°C at 2 to 3 Gv.
Do this for g. Furthermore, a drug such as 3-β-indole acrylic acid can be added at the start of culture or during culture in order to make the promoter function efficiently.
培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以下
、ＳＯ８と略すこともある）を含むポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質
を適当な方法を用いて染色する。After culturing, the recombinant microbial cells are collected by, for example, centrifugation, suspended in, for example, a phosphate buffer, the recombinant microbial cells are disrupted by, for example, sonication, and a lysate of the recombinant microbial cells is obtained by centrifugation. Proteins in the obtained lysate are separated by electrophoresis using a polyacrylamide gel containing sodium lauryl sulfate (hereinafter sometimes abbreviated as SO8), and the proteins in the gel are stained using an appropriate method.
発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。Human T
Confirm the expression of the NF gene or the novel antitumor active polypeptide gene.
このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの抗癌活性の評価は、マウスに移植
したＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ ｖ
ｉｖｏ活性測定法（Ｃａｒｓｗｅ ｌ ｌら、前出）、
マウスＬ細胞に対する細胞障害性を見るｉｎ Ｖｉｔ
ｒＯ活性測定法［Ｒｕｆｆ 、 Ｊ、 Ｉａ＋ｍｕｎ
ｏｌ、、 １２６． ２３５（１９８１） ］等により
行なえる。The anticancer activity of the human TNF protein and the novel antitumor active polypeptide thus obtained was evaluated by in v
ivo activity assay (Carsweil et al., supra),
In Vit to see cytotoxicity to mouse L cells
rO activity measurement method [Ruff, J, Ia+mun
ol,, 126. 235 (1981)], etc.
ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの大
腸菌ライゼートからの分離・精製は、公知の通常知られ
ている蛋白質の分離・精製法に従えばよいが、ヒトＴＮ
Ｆ蛋白質等に対する抗体を用いたアフィニティー・カラ
ム・りａマドグラフィーが有利である。なかでも、ヒト
ＴＮＦ蛋白質等に対するマウス・モノクローナル抗体を
用いたアフィニティー・カラム・クロマトグラフィーが
とりわけ好適である。こうして得られたヒトＴＮＦ蛋白
質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド精製品を用いること
により、ｉｎ ｖｉｖｏ抗癌活性（＃ｉ出）及び副作用
に関する検討が可能となる。The human TNF protein and the novel anti-tumor active polypeptide can be isolated and purified from E. coli lysate according to known and commonly known protein separation and purification methods.
Affinity column chromatography using antibodies against F protein and the like is advantageous. Among these, affinity column chromatography using a mouse monoclonal antibody against human TNF protein or the like is particularly suitable. By using the purified human TNF protein and the novel antitumor active polypeptide thus obtained, it becomes possible to study the in vivo anticancer activity (output #i) and side effects.
ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの副
作用の評価は、カケクチン活性測定に代表されるｉｎ
ｖｉｔｒｏ法、マウス等の実験動物に投与してその致死
量や面圧の降下程度等を測定するｉｎ ｖｉｖｏ法等に
より行なうことができる。Evaluation of side effects of human TNF protein and novel anti-tumor active polypeptides is carried out using in-house methods such as measurement of cachectin activity.
This can be carried out by an in vitro method or an in vivo method in which the lethal dose, degree of reduction in surface pressure, etc. are measured by administering to experimental animals such as mice.
（５）発明の効果
かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。(5) Effects of the invention Thus, according to the present invention, it is possible to obtain a novel physiologically active polypeptide that is different from the conventionally known human TNF protein, and by using this novel antitumor active polypeptide, It has now become possible to provide an excellent pharmaceutical composition.
（６）実施例
以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。(6) Examples Hereinafter, the present invention will be explained in detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to the following Examples.
実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計）
第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
。設計に際しては、Ｐ ｅｎｎｉｃａら［Ｄ。Example 1 (Design of human TNF gene) A human TNF gene having the base sequence shown in FIG. 1 was designed. For the design, Pennica et al. [D.
Ｐｅｎｎ１ｃａら、 Ｎａｔｕｒｅ 、 ユ１２．
７２４ （１９８４） コの報告したヒトＴＮＦ前駆
体ＣＤ Ｎ Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤とし
て、適当な、ｉｌｌ限酵素による切断部位を適当な位置
に設け、５′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、そして
３′側に２個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ）を
それぞれ付与した。また、５′側翻訳開始コドン上流に
は制限酵素ＣｆａＩによる切断部位を設け、ＳＤ配列と
翻訳開始コドン間を適切な状態に保った形でのプロモー
ターとの連結を可能にした。更に、３′側翻訳終止コド
ン下流には制限酵素ＨｉｎｄＩ［［による切断部位を設
け、ベクター・プラスミドと容易に連結できるようにし
た。Penn1ca et al., Nature, Yu12.
724 (1984) Based on the nucleotide sequence of the structural gene portion of the human TNF precursor CD N A reported by Ko, a suitable cleavage site by an ill restriction enzyme was set at an appropriate position, and a translation initiation codon ( ATG) and two translation stop codons (TGA and TAA) on the 3' side. Furthermore, a cleavage site using the restriction enzyme CfaI was provided upstream of the 5' translation initiation codon, allowing for ligation to the promoter while maintaining an appropriate state between the SD sequence and the translation initiation codon. Furthermore, a cleavage site with the restriction enzyme HindI was provided downstream of the 3' translation stop codon to facilitate ligation with a vector/plasmid.
実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦ遺伝子は、第２図に示したように１
７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全自動ＤＮＡ合成機（アプライド・
バイオシステムズ。Example 2 (Chemical synthesis of oligonucleotide) The human TNF gene designed in Example 1 was
Synthesize it in seven oligonucleotides. Oligonucleotide synthesis was performed using a fully automatic DNA synthesizer (Applied).
Biosystems.
モデル３８０Ａ ＞を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。The test was carried out by the phosphite method using Model 380A. Purification of the synthetic oligonucleotide was performed according to the manual of Applied Biosystems.
すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の保護
基をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲル（
ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子量の
合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、７Ｍ
［ｉＲ素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル
濃度２０％）の後、紫外線シャドウィング法により泳動
パターンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部
分を切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細か
く破砕した後、２〜５−の溶出用バッファー［５００ｍ
Ｍ ＮＨ４０ＡＣ−１１１ＭＥＤＴＡ−０，１％ＳＤ
Ｓ （１）Ｈ７，５＞ ］を加え、３７℃で一晩撮とう
した。遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水相の回収
を行なった。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液
をゲル濾過カラム（セファデックス（３−５０）にかけ
ることにより、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得た
。なお、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上を
はかった。That is, by keeping an ammonia aqueous solution containing synthetic oligonucleotides at 55°C overnight, the protecting groups of the DNA bases are removed, and the DNA bases are removed from the ammonia solution containing Sephadex G-50 Fine Gel (
A high-molecular-weight synthetic oligonucleotide fraction is collected by gel filtration using a high-molecular-weight synthetic oligonucleotide (Pharmacia). Next, 7M
After [polyacrylamide gel electrophoresis containing iR element at a gel concentration of 20%], the migration pattern is observed by ultraviolet shadowing method. After cutting out a band of the desired size and crushing the polyacrylamide gel fragments finely, add 2-5-elution buffer [500 m
M NH40AC-111MEDTA-0,1%SD
S(1)H7,5>] was added and photographed overnight at 37°C. The aqueous phase containing the target DNA was recovered by centrifugation. Finally, a purified product of the synthetic oligonucleotide was obtained by applying the solution containing the synthetic oligonucleotide to a gel filtration column (Sephadex (3-50). If necessary, polyacrylamide gel electrophoresis was repeated. We aimed to improve the purity of synthetic oligonucleotides.
実施例３（化学合成ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化）
実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒトＴＮＦ遺伝
子を３つのブロックに分けてクローン化した。Example 3 (Cloning of chemically synthesized human TNF gene) The 17 synthetic oligonucleotides prepared in Example 2 (
The human TNF gene was divided into three blocks and cloned using TNF-1 to TNF-17).
０．１〜１．０μ９の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツトのＴ
４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。0.1-1.0 μ9 synthetic oligonucleotide TNF-
2 to 5' to 15 units of T on the 5' end of TNF-6.
4-polynucleotide kinase (E.
ｃｏｌｉ３タイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μ旦の５０ｍ
ＭＴｒ１ｓ−Ｈ（Ｊ （１）Ｈ９，５） 、 １０１Ｍ
ＭＩＪ Ｃｊｚ 。E. coli type 3, Takara Shuzo) to phosphorylate each separately. Phosphorylation reaction takes place at 50 m for 10-20 μm.
MTr1s-H(J(1)H9,5), 101M
MIJ Cjz.
５ ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭ ＡＴＰ水
溶液中で、３７℃で、３０分間行なった。反応終了後、
すべての合成オリゴヌクレオチド水溶液をすべて混合し
、フェノール抽出、エーテル抽出によりＴ４−ポリヌク
レオチドキナーゼを失活、除去する。The test was carried out in an aqueous solution of 5 mM dithiothreitol and 10 mM ATP at 37° C. for 30 minutes. After the reaction is complete,
All synthetic oligonucleotide aqueous solutions are mixed together, and T4-polynucleotide kinase is inactivated and removed by phenol extraction and ether extraction.
この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μ９の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ１及びＴＮ
Ｆ−７を加え、９０℃で５分間加熱したＩ’Ｊ温まで徐
冷して、アニーリングを行なう。To this synthetic oligonucleotide mixture, add 0.1~
1.0μ9 synthetic oligonucleotides TNF1 and TN
Annealing is performed by adding F-7 and heating at 90° C. for 5 minutes, then slowly cooling to I'J temperature.
次に、これを減圧乾固した後に、３０μ文の６６ ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ （ｐＨ７，６＞ 、 ６．
６ １Ｍ ＭＣｌ Ｃ１２。Next, after drying this under reduced pressure, 30μ of 66mM
Tris-HCf (pH 7,6>, 6.
6 1M MCl C12.
１０１Ｍジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ水溶液に溶
解させ、３００ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（宝酒
造）を加えて、１１℃で１５時間連結反応を行なった。It was dissolved in 101M dithiothreitol and 1mM ATP aqueous solution, 300 units of T4-DNA ligase (Takara Shuzo) was added, and a ligation reaction was carried out at 11°C for 15 hours.
反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃
度５％）を行ない、エチジウムブロマイド染色法により
泳動パターンの観察を行なう。目的とする大きさく約２
２０ｂｐ ）のバンド部分を切出して、実施例２の方法
に従ってポリアクリルアミドゲルよりＤＮＡを回収する
。After the reaction is completed, polyacrylamide gel electrophoresis (gel concentration 5%) is performed, and the migration pattern is observed by ethidium bromide staining. The desired size is about 2
A band portion of 20 bp) is cut out, and the DNA is recovered from the polyacrylamide gel according to the method of Example 2.
一方、３μ９の大腸菌用プラスミドＤＢＲ３２２（約４
，４Ｋ ｂｐ）を３０μ文の１０ ｍＭ Ｔ ｒ＋ｓ
−ＨＣＲ（ｐＨ７，５） 、 ６０ ｉＭ Ｎａ Ｃ
Ｌ ７１ＭＭｇＣｆｚ水溶液に溶解させ、１０ユニツト
の制限酵素Ｃ１ａＩ＜ニューイングランド・バイオラブ
ズ）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。On the other hand, 3 μ9 E. coli plasmid DBR322 (approximately 4
, 4K bp) in 30 μg of 10 mM T r+s
-HCR (pH 7,5), 60 iM NaC
The residue was dissolved in an aqueous L71MMgCfz solution, 10 units of restriction enzyme C1aI (New England Biolabs) was added, and a cleavage reaction was carried out at 37°C for 1 hour.
制限酵素（ＪａＩによる切断の後、フェノール抽出。After cleavage with restriction enzyme (JaI), phenol extraction.
エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０μ磨の５０ ｍＭＴｒｉｓ
−Ｈ（Ｊ （ｐＨ７，４） 、 １００ ａ＋Ｍ
Ｎａ Ｃ１，１０１Ｍ Ｍ（ｌｓＯ＋水溶液に溶解さ
せ、１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ（宝酒造）を添加
して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了後
、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）を行な
い、エチジウムブロマイド染色法により切断パターンの
観察を行なう。プラスミドｐＢＲ３２２の大部分を含む
約３．７ＫｂｐのＤＮＡの部分に相当するバンドを切出
し、そのアガロースゲル断片を３倍量（ｖｏｌ ／ｗｔ
）のａＭ ＮａＣｆ０＋水溶液に溶解させた。Ｃｈｅ
ｎらのグラスフィルター法［Ｃ，Ｗ。Ether extraction is performed and DNA is recovered by ethanol precipitation. This DNA was washed 30μ with 50mM Tris.
-H(J (pH7,4), 100 a+M
NaCl was dissolved in 1,101M M (lsO) + aqueous solution, 10 units of restriction enzyme 5alI (Takara Shuzo) was added, and the cleavage reaction was carried out at 37°C for 1 hour. After the reaction was completed, agarose gel electrophoresis (gel concentration 0. 8%) and observe the cleavage pattern using ethidium bromide staining.The band corresponding to the approximately 3.7 Kbp DNA portion containing most of the plasmid pBR322 is cut out, and the agarose gel fragment is divided into three volumes (vol. /wt
) was dissolved in an aM NaCf0+ aqueous solution. Che
The glass filter method of n et al. [C, W.
Ｃｈｅｎら、 Ａｎａｌ 、 ８ｉｏｃｈｅｍ、 １
０１． ３３９＜１９８０） ］により、約３．７Ｋ
ｂｏのＤＮＡ断片（ＣｆａＩ→５ａｌＩ＞をアガロース
ゲルより回収した。Chen et al., Anal, 8iochem, 1
01. 339<1980) ], approximately 3.7K
A DNA fragment of bo (CfaI→5alI>) was recovered from the agarose gel.
先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２２０ｂ
ｐのＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端のリ
ン酸化反応を行なった後、プラスミドｐＢＲ３２２の大
部分を含む約３，７Ｋ ｂｐのＤ Ｎ Ａ水溶液と混合
する。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両ＤＮ
Ａ断片の連結反応を行なった。Approximately 220b containing part of the previously obtained human TNF gene
The DNA fragment of p is subjected to a terminal phosphorylation reaction according to the method described above, and then mixed with an aqueous DNA solution of approximately 3.7 Kbp containing most of plasmid pBR322. After ethanol precipitation, both DNs were prepared according to the method described above.
A ligation reaction of the A fragment was performed.
エシェリヒア・コリＣ６００ｒ−１株の形質転換は、通
常のＣａＣＩｚ法（Ｍ、 Ｖ、 Ｎｏｒｇａｒｄらの方
法）の改良法で行なった。すなわち、５Ｉｄｌのし培地
（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％Ｎａ
Ｃ夕、 Ｅ）Ｈ７，２）にエシェリヒア−ｍｌすＣ６
００ｒ１−株の１８時間培養基を接種し、菌体を含む培
養液の６００ｎｍにおける濁度（ＯＤｔｐｔｙ＞が０．
３に達するまで生育させる。菌体を冷たいマグネシウム
・バッフｙ−［０，ＩＭ Ｎａ Ｃ１，５１Ｍ Ｍ
ｇＣｊｚ 。Transformation of the Escherichia coli C600r-1 strain was carried out by a modification of the conventional CaCIz method (method of M. V. Norgard et al.). That is, 5Idl medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% Na
C evening, E) H7, 2) Escherichia-ml C6
An 18-hour culture medium of 00r1- strain was inoculated, and the turbidity (ODtpty> at 600 nm of the culture solution containing bacterial cells was 0.
Grow until it reaches 3. The bacterial cells were soaked in cold magnesium buffer y-[0,IM Na C1,51M M
gCjz.
５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ （ｐＨ７，６，０℃）
］中で２回洗い、２Ｉｄｌの冷したカルシウム・バッフ
ァー［１００１ＭＣａ Ｃ１２，２５０ＩＢＭ ＫＣ
ｆ、 ５ ｎＭＭＱ Ｃ１ｚ 、 ５１Ｍ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｆ （ｐｔ−＋ ７．６゜０℃）］中に再懸濁さ
せ、０℃で２５分間放置する。5 mM Tris-HCj (pH 7, 6, 0°C)
] in 2 Idl of cold calcium buffer [1001 MCa C12, 250 IBM KC
f, 5 nMMQ C1z, 51M Tris
-HCf (pt-+ 7.6° 0°C)] and left at 0°C for 25 minutes.
次に菌体をこの容量の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２＝１ （Ｖ
Ｏｌ、： ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分間
。Next, the bacterial cells were concentrated in a calcium buffer to 1/10 of this volume, and the DNA aqueous solution after ligation and 2=1 (V
Ol,: vol,) mix. Stir this mixture for 60 minutes.
０℃で保った後、１ｄのＬＢＧ培地（１％トリプトン、
０．５％酵母エキス、１％ＮａＣ１，０，０８％グルコ
ース、 ｐｈ ７．２）を添加し、３７℃で１時間振
とう培養する。培養液を、選択培地［アンピシリン（シ
グマ） ３０Ｍｇ／−を含むし培地プレート］に１００
μρ／プレートの割合で接種する。プレートを３７℃で
１晩培養して、形質転換株を生育させる。得られたアン
ピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を用いてＤＮ
Ａを調製し、アガロースゲル電気泳動により、目的のプ
ラスミドｐＴＮＦＩＢＲ（約４．０Ｋ ｂｐ）の取得を
確認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦ１ＢＲの作成
方法を示す。After keeping at 0°C, 1 d of LBG medium (1% tryptone,
Add 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 0.08% glucose, pH 7.2), and culture with shaking at 37°C for 1 hour. The culture solution was transferred to a selective medium [medium plate containing 30 Mg/- of ampicillin (Sigma)] at 100%
Inoculate at a ratio of μρ/plate. The plates are incubated overnight at 37°C to grow the transformants. From the obtained ampicillin-resistant colonies, DN was isolated using a known method.
A was prepared, and acquisition of the target plasmid pTNFIBR (approximately 4.0 K bp) was confirmed by agarose gel electrophoresis. FIG. 3 shows the method for constructing plasmid pTNF1BR.
以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮＦ２Ｎ
（約３．ＩＫｂｌ））を、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドｐＴＮＦ３
（約２．４Ｋ ｌｏｇ）を、それぞれ作成した。第４図
及び第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３
の作成方法を、それぞれ示す。By the same method as above, synthetic oligonucleotide TN
Plasmid pTNF2N using F-8 to TNF-13
(approximately 3.IKbl)), the synthetic oligonucleotide TN
Plasmid pTNF3 using F-14 to TNF-17
(approximately 2.4K log) were created, respectively. Figures 4 and 5 show plasmids pTNF2N and pTNF3.
We will show how to create each.
こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含むプラス
ミドｐＴＮＦ１ＢＲ，ｐＲＮＦ２Ｎ及びｐＴ Ｎ Ｆ
３の、合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設
計通りであることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、
Ｍ、 Ｍａｘａｉ＋ら、 ＭｅｔｈＯｄＳＥｎｚｙｍｏ
ｌ、、６５． ４９９（１９８０） ］によって確認し
た。Plasmids pTNF1BR, pRNF2N and pTNF containing part of the human TNF gene thus obtained
3, the base sequence of the synthetic oligonucleotide used part was as designed, using the Maxam-Gilbert method [A,
M, Maxai+ et al., MethOdSEnzymo
l,,65. 499 (1980)].
実施例４（ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドの作成）
実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦＩＢＲ１０μ９
を、実施例３と同様にして制限酵素ＣｊａＩ及び５ａｌ
Ｉで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺
伝子の一部を含む約２２０ｂｌ）のＤＮＡ断片＜Ｃ１ａ
Ｉ”５ａｌＩ ）をポリアクＩＪ ルアミドゲルより
回収した。Example 4 (Creation of human TNF gene expression plasmid) Plasmid pTNFIBR10μ9 obtained in Example 3
was added to the restriction enzymes CjaI and 5al in the same manner as in Example 3.
After cutting with I and polyacrylamide gel electrophoresis (gel concentration 5%), a DNA fragment of about 220 bl containing part of the human TNF gene <C1a> was obtained according to the method of Example 2.
I''5alI) was recovered from polyacrylamide gel.
次に、実施例３で得られたプラスミドＥ）ＴＮＦ２ １
０ｕ９を１００μＮの１００１Ｍ Ｔ ｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ（ｆ）Ｈ７，５＞ 、 ６０ ｍＭ Ｎａ Ｃ１，
７ｇ＋ＭＭｇＣＩ２水溶液に溶解させ、４０ユニツトの
制限酵素ＰＶｕｌ（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間
切断反応を行なった。そして、実施例３の方法に準じて
制限酵素５ａｌＩによる切断、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に準じ
て、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１７０ｂｐのＤＮ
Ａ断片＜５ａｌＩ＋ＰｖｕＩＩ）をポリアクリルアミド
ゲルより回収した。Next, plasmid E) TNF2 1 obtained in Example 3
0u9 to 100μN of 1001M Tris-HC
I(f)H7,5>, 60 mM Na C1,
It was dissolved in 7g+MMgCI2 aqueous solution, 40 units of restriction enzyme PVul (Takara Shuzo) was added, and a cleavage reaction was carried out at 37°C for 1 hour. After digestion with the restriction enzyme 5alI and polyacrylamide gel electrophoresis (gel concentration 5%) according to the method of Example 3, about 170 bp containing part of the human TNF gene was extracted according to the method of Example 2. D.N.
The A fragment <5alI+PvuII) was recovered from the polyacrylamide gel.
また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３ １０
μ９も１００μｌの１０ ｉＭ Ｔ ｒｉｓ−Ｈ（Ｊ
（１）Ｈ７，５） 、 ６０１１１Ｍ Ｎａ （Ｊ、
７１ＭＭ１ｌｌＣｆ２水溶液に溶解させ、４０ユニツ
トの制限酵素ＰｖｕｌＩ及び４０ユニツトの制限酵素Ｈ
ｉｎｄＩ［［（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切断
反応を行なった。そして、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ゲル濃度５％）の侵、実施例２の方法に準じて、
ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断
片（ＰｖｕＩ［４−４８ｉｎｄ Ｔｌ＞ヲホ’）７’）
’））Ｌｔ７ミ’ｒ’ゲルより回収した。In addition, plasmid pTNF3 obtained in Example 3 10
μ9 also contained 100 μl of 10 iM Tris-H (J
(1)H7,5), 60111M Na (J,
Dissolve in 71MM1llCf2 aqueous solution and add 40 units of restriction enzyme PvulI and 40 units of restriction enzyme H.
indI[[(Takara Shuzo) was added, and the cleavage reaction was carried out at 37°C for 1 hour. Then, polyacrylamide gel electrophoresis (gel concentration 5%) was carried out according to the method of Example 2.
Approximately 110 bp DNA fragment containing part of the human TNF gene (PvuI[4-48ind Tl>woho')7')
')) Recovered from Lt7mi'r' gel.
一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐ
Ｙｓ３１Ｎ（約４．７Ｋｂｐ） ５μ９を、上記と同様
に制限酵素（ＪａＩ及びＨｉｎｄＩ［で切断し、アガロ
ースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）の後、実施例３
の方法に準じて、プラスミドＤＹＳ３１Ｎの大部分を含
む約４．７Ｋ ｂｐのＤＮＡ断片（（ＪａＩＨ）−１ｉ
ｎｄｌｌ［）をアガロースゲルより回収した。On the other hand, plasmid p with E. coli trp promoter
Ys31N (approximately 4.7 Kbp) 5μ9 was digested with restriction enzymes (JaI and HindI) in the same manner as above, and after agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.8%), Example 3
An approximately 4.7K bp DNA fragment ((JaIH)-1i
ndll[) was recovered from the agarose gel.
こうして得られた、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２
２０ｂｌ）、約１ｙｏｂｐ及び約１１０ｂｌ）の３つの
ＤＮＡ断片とプラスミドｐＹ８３１Ｎの大部分を含む約
４．７Ｋ ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノール沈
澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガー
ゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の
方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−＋ｅ−株
に導入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦ遺伝子
発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ（約５．２Ｋ ｂ
ｐ）を有するクローンを選択した。第６図に、そのプラ
スミドＤＴＮＦ４０１ＮＮの作成方法を示した。Approximately 2 cells containing part of the human TNF gene obtained in this way
20bl), about 1yobp and about 110bl) and a DNA fragment of about 4.7K bp containing most of plasmid pY831N, and after ethanol precipitation, T4 was prepared according to the method of Example 3. - A ligation reaction using DNA ligase was performed. After completion of the reaction, it was introduced into Escherichia coli C600r-+e- strain according to the method of Example 3, and the desired human TNF gene expression plasmid pTNF401NN (approximately 5.2K b
Clones with p) were selected. FIG. 6 shows the method for creating the plasmid DTNF401NN.
また、上記プラスミドｐＹｓ３１Ｎ５μ９を、上記の方
法に準じて制限酵素ｐｖｕ■で部分分解した後、さらに
制限酵素）（ｉｎｄｌｌで切断し、アガロースゲル電気
泳動（ゲル１度０．８％）の後、実施例３の方法に準じ
て、ｔｒｐプロモーターを含む約２．７Ｋ ｂｐのＤＮ
Ａ断片［ＰｖｕｌＩ（２１−Ｈｉｎｄ ｍ ］ ］１Ｆ
ｉ−アガロースゲより回収した。In addition, the above plasmid pYs31N5μ9 was partially digested with the restriction enzyme pvu■ according to the above method, further cut with the restriction enzyme (indll), and after agarose gel electrophoresis (gel 1 degree 0.8%), According to the method of Example 3, approximately 2.7K bp of DNA containing the trp promoter was prepared.
A fragment [PvulI(21-Hind m ]] 1F
It was recovered from i-agarose gel.
次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μ９に
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、先に得られた約２．７Ｋ ｂ
ｏのＤＮＡ断片［ｐｖｕＩ（２１４−Ｈｉｎｄ ｍ ］
トｍ合シ、Ｉ’５１／−ル沈１１（Ｆ）１１、実施例３
の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応
を行なった。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシ
ェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換
株の中より目的のプラスミドｐＡＡ４１（約２．７Ｋ
ｂｐ）を有するクローンを選択した。このようなプラス
ミドは、プラスミドＤＹ Ｓ ３１Ｎからコピー数制ａ
Ｓ域を除去し、ｔｒｐプロモーター下流に存在するクロ
ーニング・サイトの下流に大腸菌ｔｒｐ Ａターミネー
タ−を付与した形の、多コピー・高効率発現ベクターで
あり、第７図にその作成方法を示した。Next, an oligonucleotide having the base sequence shown in FIG. 7 was synthesized and purified according to the method of Example 2. The ends of each of the two synthetic oligonucleotides (0.5 μ9) obtained were phosphorylated according to the method of Example 3, and after annealing, the previously obtained approximately 2.7 K b
o DNA fragment [pvuI (214-Hind m ]
Tomaishi, I'51/-le Precipitation 11 (F) 11, Example 3
A ligation reaction using T4-DNA ligase was performed according to the method of . After the reaction was completed, it was introduced into Escherichia coli C600r-m- strain according to the method of Example 3, and the target plasmid pAA41 (approximately 2.7K
bp) was selected. Such plasmids can be obtained from plasmid DY S 31N by copy number control a
This is a multi-copy, high-efficiency expression vector in which the S region has been removed and the E. coli TRP A terminator has been added downstream of the cloning site located downstream of the trp promoter, and the method for its construction is shown in FIG.
このプラスミド１）ＡＡ４１ ２μ９を、上記と同様に
制限酵素ＣｊａＩ及びｌ−１ｉｎｄｌで切断し、アガロ
ースゲル電気法ＩＩＩ（ゲル濃＠ ０．８％）の後、実
施例３の方法に準じて、プラスミドＤＡ Ａ ４１の大
部分ヲ含ム約２，７Ｋ ｂｐのＤＮＡ断片（ＣｆａＩ−
Ｈｉｎｄｌｌ）を７ガロースゲルより回収した。This plasmid 1) AA41 2μ9 was cut with the restriction enzymes CjaI and l-1indl in the same manner as above, and after agarose gel electrolysis III (gel concentration @ 0.8%), the plasmid was extracted according to the method of Example 3. A DNA fragment of approximately 2.7 Kbp containing most of DA A41 (CfaI-
Hindll) was recovered from the 7 galose gel.
また、先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ｐＴＮＦ ４０１ＮＮ５μ９を、上記と同様に制限酵素
ＣｆａＩ及びｌ−１ｉｎｄｌｌ！で切断し、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動くゲル濃度５％）の後、実施例２
の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９ｏ
ＭのＤＮＡ断片（Ｃｆａ Ｉ←Ｈｉｎｄ ｍ ）をポリ
アクリルアミドゲルより回収した。Further, the previously obtained human TNF gene expression plasmid pTNF 401NN5μ9 was added to the restriction enzymes CfaI and l-1indll! in the same manner as above. Example 2
According to the method of
A DNA fragment of M (Cfa I←Hind m ) was recovered from the polyacrylamide gel.
こうして得られた、プラスミドＤＡ Ａ ４１の大部分
を含む約２．７Ｋ ｂｐのＤＮＡ断片とヒトＴＮＦ遺伝
子全域を含む約４９０ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エ
タノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−Ｄ
ＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。The approximately 2.7K bp DNA fragment containing most of the plasmid DA A 41 thus obtained and the approximately 490 bp DNA fragment containing the entire human TNF gene were mixed, and after ethanol precipitation, the method of Example 3 was performed. Accordingly, T4-D
A ligation reaction using NA ligase was performed.
反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドｐＴ Ｎ Ｆ ４０１Ａ （約３．２Ｋ
ｂｐ）を有するクローンを選択した。このプラスミドは
、ヒトＴＮＦ遺伝子をより効率良く発現させる能力を有
しており、第８図にその作成方法を示した。After completion of the reaction, according to the method of Example 3, Escherichia
The target plasmid pT NF 401A (approximately 3.2K
bp) was selected. This plasmid has the ability to express the human TNF gene more efficiently, and the method for its construction is shown in FIG.
実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成）
実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ｐＴＮＦ ４０１Ａ２０μ９を、実施例４の方法に準じ
て制限酵素ＣＩａＩ及びｌ−１ｉｎｄｌ［で切断し、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）及びア
ガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、それ
ぞれ実施例２及び３の方法に準じて、生成する２つのＤ
ＮＡ断片（約４９０ｂＤ及び約２．７Ｋ ｂｐ、両方共
Ｃｆａ Ｉ”Ｈｉｎｄ １１ ）をゲルより回収した。Example 5 (Creation of a novel antitumor active polypeptide gene expression plasmid) The human TNF gene expression plasmid pTNF 401A20μ9 obtained in Example 4 was treated with restriction enzymes CIaI and l-1indl according to the method of Example 4. After polyacrylamide gel electrophoresis (gel concentration 5%) and agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.8%), two D
The NA fragment (approximately 490 bD and approximately 2.7 K bp, both Cfa I''Hind 11 ) was recovered from the gel.
ここで得られたヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂ
ｐのＤＮＡ断片を５０μ磨の１０ ａＭ Ｔ ｒｉｓ
−）−１（Ｊ （１）Ｈ７，４） 。 １０ ｍ
Ｍ Ｍ ｇ ８０４ 、 １ −Ｍジチオ
スレイトール水溶液に溶解させ、１０ユニツトの制限酵
素ＨａｐＩ［（宝酒造）を添加して、３７℃で１時間切
断反応を行なった。反応終了後、ボリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、実施例２の方法
に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の大部分を含む約３９０ｂ
ｐのＤＮＡ断片（Ｈａｐ■←Ｈｉｎｄｌｌ［）をポリア
クリルアミドゲルより回収した。Approximately 490b including the entire human TNF gene obtained here
Polish the DNA fragment of p with 10 aM Tris
-)-1(J(1)H7,4). 10 m
M M g 804 was dissolved in a 1-M dithiothreitol aqueous solution, 10 units of the restriction enzyme HapI (Takara Shuzo Co., Ltd.) was added, and a cleavage reaction was carried out at 37°C for 1 hour. After completion of the reaction, polyacrylamide gel electrophoresis (gel concentration 5%) was performed according to the method of Example 2, and approximately 390 b
A DNA fragment of p (Hap■←Hindll[) was recovered from the polyacrylamide gel.
また、第９図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成。Furthermore, an oligonucleotide having the base sequence shown in FIG. 9 was synthesized according to the method of Example 2.
精製した。得られた４本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μ９について、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼによる連結反応を行なった。Purified. The terminals of 0.5μ9 of each of the four synthetic oligonucleotides obtained were phosphorylated according to the method of Example 3, and after annealing, T4-DN
A ligation reaction using A ligase was performed.
反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約２，７Ｋ ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃｊａ Ｉ
”Ｈｉｎｄ Ｉ［［）及びヒトＴＮＦ遺伝子の大部分ヲ
含ム約３９０ｂｐノＤＮＡ断片（ＨａｐＩ ＨＨｉｎｄ
ｎ［）と混合し、エタノール沈澱の優、実施例３の方法
に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行な
った。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒ
ア・コリＣ６００ｒ−ｉ−株に導入し、形質転換株の中
より目的のプラスミド１）ＴＮＦ４７１（約３．２Ｋｂ
＋））を有するクローンを選択した。このプラスミドは
、次のアミノ酸配列（８２Ｎ ） −Ａｒ（］ −Ｌｙ
ｓ−Ａｒ（１−Ｌｙｓ−Ｐ ｒｏ −Ｖ ａｌ−Ａ ｌ
ａ −Ｈｉｓ −Ｖ ａｔ −Ｖ ａｌ−Ａ １ａ−Ａ
ｓｎ −Ｐ ｒｏ −Ｇ Ｉｎ −Ａ ｌａ −Ｇ
Ｉｕ −Ｇ ｌｙ −Ｇ Ｉｎ −Ｌ ｅｕ−Ｇ ｌｎ
−Ｔ ｒｌｌ−Ｌ ｅｕ−Ａ Ｓｎ−Ａ ｒＯ−Ａ ｒ
ｌＪＡ Ｉａ −Ａ ｓｎ −Ａ Ｉａ −Ｌ ｅｕ
−Ｌ ｅｕ −Ａ ｌａ −Ａ ｓｎＧ ｌｙ−Ｖａｌ
−Ｇ ｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｏ−Ａｓｌ Ａｓｎ−Ｇｌｎ
−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｇｌｕ
−Ｇ ＩＶ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ −Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｔｙ
ｒ−Ｓｅｒ −Ｇ ｌｎ−Ｖ ａｌ−Ｌ ｅｕ−Ｐ ｈ
ｅ−Ｌ ｙｓ−Ｇ ｌｙ−Ｇ １ｎ−Ｇ ｌｙ −ＣＶ
ｓ −Ｐ ｒｏ −Ｓ ｅｒ −Ｔ ｈｒ −Ｈｉｓ
−Ｖ ａｔ −１ｅｕ −Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−）−１ｉｓ
−Ｔｈｒ−１１ｅ−８ｅｒＡｒａ−１１ｅ−Ａ Ｉａ−
Ｖａｌ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇ Ｉｎ −Ｔ ｈｒ −Ｌ
ｙｓ −Ｖ ａｔ −Ａ ｓｎ −Ｌ ｅｕ −Ｌ
ｅｕ −Ｓ ｅｒ −Ａ ｌａ −１１ｅ−Ｌｙｓ −
Ｓｅｒ −Ｐ ｒｏ −Ｃｙｓ −Ｇ Ｉｎ −Ａ ｒ
ａ −Ｇ ｌｕ −Ｔ ｈｒ−Ｐ ｒｏ−Ｇ Ｉｕ−Ｇ
ｌｙ −Ａ ｌａ −Ｇ ｌｕ −Ａ ｌａ−Ｌ ｙ
ｓ −Ｐ ｒｏ −Ｔ ｒｐ −Ｔ ｙｒ−Ｇ １ｕＰ
ｒｏ −１１ｅ −Ｔｙｒ −Ｌｅｕ −Ｇ ｌｙ −
Ｇ Ｉｙ −ＶａｔＰ ｈｅ −Ｇ ｌｎ−Ｌ ｅｕ
−Ｇ ｌｕ−Ｌ ｙＳ−Ｇ ｌｙ−Ａ Ｓｆｌ −Ａｒ
ｇ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉ １ｅ−Ａｓ
ｎＡ ｒＱ−Ｐ ｒＯ−Ａ ５ＥＩ−Ｔ Ｖｒ−Ｌ ｅ
ｕ−Ａ ５ｌ）−Ｐ ｈｅ−Ａ Ｉａ −Ｇ ｌｕ −
Ｓ ｅｒ −Ｇ ＩＩ／ −Ｇ Ｉｎ −Ｖ ａｌ −
Ｔ Ｖｒ −Ｐｈｅ−Ｇｌｙ −Ｉ Ｉｅ −１１ｅ−
Ａｌａ−Ｌｅｕ −（ＣＯＯＨ）
で表わされる抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミノ末
端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードする発
現型プラスミドであり、第９図にその作成方法を示した
。After the reaction was completed, the obtained double-stranded oligonucleotide was mixed with the approximately 2.7K bp DNA fragment (Cja I
"An approximately 390 bp DNA fragment containing Hind I[[) and most of the human TNF gene (HapI HHind
n[), followed by ethanol precipitation, and a ligation reaction using T4-DNA ligase was performed according to the method of Example 3. After the reaction was completed, it was introduced into Escherichia coli C600r-i strain according to the method of Example 3, and the target plasmid 1) TNF471 (approximately 3.2 Kb) was selected from the transformed strain.
+)) were selected. This plasmid has the following amino acid sequence (82N) -Ar(]-Ly
s-Ar(1-Lys-Pro-V al-A l
a -His -V at -V al-A 1a-A
sn -Pro -G In -A la -G
Iu −G ly −G In −L eu−G ln
-T rll-L eu-A Sn-A rO-A r
lJA Ia -A sn -A Ia -L eu
-L eu -A la -A snG ly-Val
-G lu-Leu-Aro-Asl Asn-Gln
-Leu-Val-Val-Pro-8er-Glu
-G IV-Leu-Tyr -Leu-11e-Ty
r-Ser -G ln-V al-L eu-P h
e-Lys-Gly-G 1n-Gly-CV
s -Pro -S er -T hr -His
-V at -1eu -Leu-Thr-)-1is
-Thr-11e-8erAra-11e-A Ia-
Val-5er-Tyr-G In-Thr-L
ys −V at −A sn −L eu −L
eu -S er -A la -11e-Lys -
Ser -Pro -Cys -G In -A r
a -G lu -T hr-Pro-G Iu-G
ly -A la -G lu -A la-L y
s -Pro -Trp -Tyr-G 1uP
ro -11e -Tyr -Leu -G ly -
G Iy -VatP he -G ln-L eu
-G lu-L yS-G ly-A Sfl -Ar
g-Leu-8er-Ala-Glu-I 1e-As
nA rQ-P rO-A 5EI-T Vr-L e
u-A 5l)-Phe-A Ia-Glu-
S er −G II/ −G In −V al −
T Vr -Phe-Gly -I Ie -11e-
This is an expression plasmid encoding an antitumor polypeptide represented by Ala-Leu-(COOH) or a polypeptide having Met bound to its amino terminus, and the method for its construction is shown in FIG.
一方、上記で得られた発現型プラスミドｐＴＮＦ ４７
１ ２０μ９を、実施例４の方法に準じて制限１１１Ｈ
ｉｎｄｌｌｒで切断した後、５０ ｓＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｊ （ｐＨ７，４） 、 １００ ｍＭ Ｎ
ａ Ｃ１，１０ｉＭＭ（ＩＩ ８０４水溶液中で制限酵
素ＮｃｏＩ（宝酒造）による切断反応を３７℃で１時間
行なう。反応終了後、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃
度０．７％）及びポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲ
ル濃度５％）を行ない、実施例２の方法に準じて、ヒト
ＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１４０ｂｌ）のＤＮＡ断片
（ＮｃｏＩ４−４１−１ｉ口ｄｌｌ［）をポリアクリル
アミドゲルより、そして実施例３の方法に準じて、ｐＴ
ＮＦ４７１の大部分を含む約３．０Ｋ ｂｐのＤＮＡ断
片（ＮｃｏＩ＋Ｈｉｎｄ ＩＩ［）をアガロースゲルよ
り、それぞれ回収した。On the other hand, the expression plasmid pTNF47 obtained above
1 20μ9 is limited to 111H according to the method of Example 4.
After cutting with indllr, 50 sM Tris
-HCj (pH 7,4), 100 mM N
a A cleavage reaction using the restriction enzyme NcoI (Takara Shuzo) in a C1,10iMM (II 804 aqueous solution) was performed at 37°C for 1 hour. After the reaction was completed, agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.7%) and polyacrylamide gel electrophoresis ( A DNA fragment of about 140 bl) containing a part of the human TNF gene (NcoI4-41-1i dll [)] was extracted from a polyacrylamide gel according to the method of Example 2. According to method 3, pT
A DNA fragment of approximately 3.0 Kbp (NcoI+Hind II [) containing most of NF471 was recovered from the agarose gel.
さらに、上で得られた約１４０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎｃ
ｏＩ＋Ｈｉｎｄ Ｉ［Ｉ）を５０μ交の１０＋Ｍ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩ （ｔｌＨ７，４） 、 １０ ａ＋Ｍ
ＭＱ ８０４ 、１１１Ｍジチオスレイトール水溶
液に溶解させ、１０ユニツトの制限酵素ＡＣＣ■（宝酒
造）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。Furthermore, the approximately 140 bp DNA fragment obtained above (Nc
oI+Hind I[I] 10+M T with 50μ intersection
ris-HCI (tlH7,4), 10a+M
MQ 804 was dissolved in a 111M dithiothreitol aqueous solution, 10 units of restriction enzyme ACC (Takara Shuzo) was added, and a cleavage reaction was carried out at 37°C for 1 hour.
反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度８％）を行ない、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮ
Ｆ遺伝子の一部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎ
ｃ。After the reaction, polyacrylamide gel electrophoresis (gel concentration 8%) was performed, and human TN was analyzed according to the method of Example 2.
Approximately 110 bp DNA fragment containing part of the F gene (N
c.
工←ＡＣＣＩ）をポリアクリルアミドゲルより回収した
。ACCI) was recovered from the polyacrylamide gel.
また、第１０図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドを、実施例２の方法に準じて、合成。Furthermore, an oligonucleotide having the base sequence shown in FIG. 10 was synthesized according to the method of Example 2.
精製した。得られた２本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μ９について、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングを行なった。Purified. 0.5 μ9 of each of the two synthetic oligonucleotides obtained were subjected to terminal phosphorylation and annealing according to the method of Example 3.
アニーリングの後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチド
を、先に得られた約３．ＯＫ ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎｃ
ｏＩ ＋Ｈｉｎｄ Ｉ［Ｉ ）及びヒトＴＮＦ遺伝子の
部含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ ＭＡＣＣ
Ｉ ）と混合し、エタノール沈殿の後、実施例３の方法
に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行な
った。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒ
ア・コリＣ６００ｒ−１１１−株に導入し、形質転換株
の中より目的のプラスミドｐＴＮＦ６１９（約３．２Ｋ
ｂｐ）を有するクローンを選択した。このプラスミド
は、次のアミノ酸配列
（Ｈ２Ｎ）−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ ＬｙＳ−Ｐ ｒ
ｏ −Ｖ ａｔ −Ａ ｌａ −Ｈｉｓ −Ｖ ａｌ
−Ｖ ａｌ −Ａ ｌａ −Ａ ｓｎ −Ｐ ｒｏ−Ｑ
ｌｎ−Ａ ｔａ −Ｑ ｌｕ −Ｇ ｌｙ −Ｑ Ｉ
ｎ −Ｌ ｅｕ −Ｇ ｌｎ−Ｔ ｒｏ−Ｌ ｅｕ −
Ａ Ｓｎ −Ａｒｇ −Ａ ｒｇ −Ａ ｌａ−Ａ ｓ
ｎ−Ａ ｌａ−１ｅｕ−Ｌ ｅｕ−Ａ ｌａ−Ａｓｎ
−Ｇ ｌｙ−Ｖ ａｌ−Ｇ Ｉｕ−Ｌ ｅＬｌ−Ａ ｒ
Ｑ−Ａ ５ｌ）−Ａ ５ｎ−Ｇ ｌｎ−Ｌ ｅｕ−Ｖ
ａｌ−Ｖ ａｌ−Ｐ ｒｏ −Ｓ ｅｒ−（３１ｕＧ＋
ｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｉ １ｅ−Ｔｙｒ−５ｅ
ｒ−Ｇ Ｉｎ−Ｖａｌ −Ｌｅｕ −Ｐｈｅ −Ｌ ｙ
ｓ −Ｇ ｌｙ −Ｇ Ｉｎ −Ｇ Ｉｙ −Ｃｙｓ−
Ｐ ｒｏ −Ｓ ｅｒ −Ｔ ｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖ ａｌ
−１ｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｉ Ｉ
ｅ−５ｅｒ−ＡｒＱ−１１ｅ＝ＡＩａ−Ｖａｌ−８ｅｒ
−Ｔｙｒ−ＧｌｎＴ ｈｒ−Ｌ ｙｓ−Ｖ ａｌ−Ａ
ｓｎ−Ｌ ｅｕ −Ｌ ｅｕ −Ｓ ｅｒ−Ａ ｌａ−
ｔ Ｉｅ−Ｌ”／Ｓ−５ｅｒ−Ｐ ｒＯ−ｃｙｓ−Ｇ
１ｎ−Ａ ｒｇ−Ｇ ｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐ ｒｏ−Ｇ ｌ
ｕ−Ｇ ｌｙ−Ａ Ｉａ−Ｑ ｌｌ−Ａ Ｉａ−ＬＶＳ
−Ｐ ｒＯ−Ｔ ｒｌ）−Ｔ’／ｒ−Ｇ １ｕ−Ｐ ｒ
ｏ−１１ｅ −Ｔｙｒ−Ｌｅｕ −Ｇ Ｉｙ −Ｇ ｌ
ｙ −Ｖａｌ −Ｐ ｈｅ−Ｇ ｌｎ−Ｌ ｅｕ−Ｇ
ｌｕ−Ｌ ｙｓ−Ｇ ｌｙ−Ａ ５ｐ−ＡｒＯ−Ｌｅｕ
−８ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ −１１ｅ−Ａｓｎ −Ａ
ｒｇ−Ｐ ｒｏ−Ａ ｓｐ −Ｔ ｙｒ −Ｌ ｅｕ
−Ａ ｓｐ−Ｐ ｈｅ −Ａ Ｉａ−Ｇ ｌｕ−５ｅｒ
−Ｇ ＩＶ−Ｇ Ｉｎ−Ｖ ａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇ
ｌｙ−Ｉ ｌｅ−Ｉ ｌｅ−Ｐｈｅ−ｌ ｅｕ−（Ｃ
ＯＯＨ）
で表わされる抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミノ末
端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードする抗
腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドであり、
第１０図にその作成方法を示した。After annealing, the resulting double-stranded oligonucleotide is combined with the previously obtained approximately 3. OK bp DNA fragment (Nc
oI + Hind I[I] and an approximately 110 bp DNA fragment containing a portion of the human TNF gene (NcoI MACC
I), and after ethanol precipitation, a ligation reaction using T4-DNA ligase was performed according to the method of Example 3. After the reaction was completed, it was introduced into Escherichia coli C600r-111- strain according to the method of Example 3, and the target plasmid pTNF619 (approximately 3.2K
bp) was selected. This plasmid has the following amino acid sequence (H2N)-Arg-Lys-ArgLyS-Pr
o -V at -A la -His -V al
-V al -A la -A sn -Pro-Q
ln-A ta -Q lu -G ly -Q I
n -L eu -G ln-T ro -L eu -
A Sn -Arg -A rg -A la-A s
n-A la-1eu-L eu-A la-Asn
-G ly-V al-G Iu-L eLl-A r
Q-A 5l)-A 5n-G ln-L eu-V
al-V al-Pro-Ser-(31uG+
y-Leu-Tyr-Leu-I 1e-Tyr-5e
r-G In-Val -Leu -Phe -L y
s -G ly -G In -G Iy -Cys-
Pro-Ser-Thr-His-Val
-1eu-Leu-Thr-His-Thr-I I
e-5er-ArQ-11e=AIa-Val-8er
-Tyr-GlnT hr-Lys-V al-A
sn-Leu-Leu-Ser-Ala-
t Ie-L”/S-5er-P rO-cys-G
1n-A rg-G lu-Thr-Pro-G l
u-G ly-A Ia-Q ll-A Ia-LVS
-P rO-T rl)-T'/r-G 1u-P r
o-11e -Tyr-Leu -G Iy -G l
y -Val -P he-G ln-L eu-G
lu-Lys-Gly-A 5p-ArO-Leu
-8er-Ala-Glu -11e-Asn -A
rg-Pro-Asp-Tyr-Leu
-A sp-P he -A Ia-G lu-5er
-G IV-G In-V al-Tyr-Phe-G
ly-I le-I le-Phe-le eu-(C
An antitumor active polypeptide gene expression plasmid encoding an antitumor polypeptide represented by OOH) or a polypeptide having Met bound to its amino terminus,
Fig. 10 shows the method for making it.
上記で得られた発現型プラスミドＩ）Ｔ Ｎ Ｆ ６１
９２０μ９を、実施例４の方法に準じて制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩ［Ｉで切断した後、５０ ｍＭ Ｔｒｙｓ −Ｈ
（Ｊ（ｐＨ７，４） 、 １００ ｍＭ
Ｎａ Ｃｊ、 １０ ｓＭ Ｍ ｇ８０４水
溶液中で制限酵素ＢｓｔＥＩＩ（東洋紡）による切断反
応を６０℃で１時間行なう。反応終了後、アガロースゲ
ル電気泳動くゲル濃度０．７％）を行ない、実施例３の
方法に準じて、ＤＴＮＦ６１９の大部分を含む約３．Ｏ
Ｋ ｂｌ）のＤＮＡ断片（ＢｓｔＥＩ［←ＨｉｎｄＩ［
［）をアガロースゲルより回収した。Expression type plasmid I) TN F 61 obtained above
920μ9 was treated with the restriction enzyme Hin according to the method of Example 4.
After cutting with dI[I, 50 mM Trys-H
(J(pH7,4), 100mM
A cleavage reaction using the restriction enzyme BstEII (Toyobo) is carried out at 60° C. for 1 hour in an aqueous solution of Na Cj, 10 sM M g804. After completion of the reaction, agarose gel electrophoresis (gel concentration: 0.7%) was performed according to the method of Example 3, and approximately 3.0% of DTNF619 containing the majority of DTNF619 was analyzed. O
Kbl) DNA fragment (BstEI[←HindI[
[) was recovered from the agarose gel.
また、第１１図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドを、実施例２の方法に準じて、合成。Furthermore, an oligonucleotide having the base sequence shown in FIG. 11 was synthesized according to the method of Example 2.
精製した。得られた２本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μ９について、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングを行なった。Purified. 0.5 μ9 of each of the two synthetic oligonucleotides obtained were subjected to terminal phosphorylation and annealing according to the method of Example 3.
アニーリングの後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチド
を、先に得られた約３．０Ｋ ｂｐのＤＮＡ断片（Ｂｓ
ｔＥ Ｉｆ ＨＨｉｎｄ Ｉ［［） ト共に１り／−４
沈殿した後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリ
ガーゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例
３の方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｉ−
株に導入し、形質転換株の中より目的のプラスミドＩ）
ＴＮＦ６６Ｂ（約３．２Ｋｂｐ）を有するクローンを選
択した。このプラスミドは、次のアミノ酸配列
（８２Ｎ ） Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇｉｙｓ−Ｐ
ｒｏ −Ｖａｔ −Ａ ！ａ−ｌ−１ｉＳ−Ｖａｌ−Ｖ
ａｌ−Ａ ｌａＡ ｓｎ −Ｐ ｒｏ −Ｇ Ｉｎ −
Ａ Ｉａ −Ｇ ｔｕ −Ｇ Ｉｙ −Ｇ Ｉｎ −Ｌ
ｅｔｌ−Ｇｌｎ−ＴｒＣｌ−ＬｅｌＪ−ＡＳｎ−Ａ、ｒ
（Ｊ−ＡｒＵ−Ａ ｌａ −Ａ ｓｎ −Ａ ｌａ −
１ｅｕ −Ｌ ｅｕ −Ａ ｌａ −Ａ ｓｎ −Ｇｌ
ｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−１，、−ｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−
Ａｓｎ −Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−
８ｅｒ−Ｇｌｕ −Ｇ Ｉｙ −Ｌｅｕ−Ｔｙｒ −Ｌ
ｅｕ −１１ｅ −Ｔｙｒ −Ｓｅｒ −Ｇ Ｉｎ −
Ｖ ａｌ−Ｌ ｅｕ −Ｐ ｈｅ−Ｌ ｖｓ−Ｇ ｌｖ
−Ｇ ＩｎＧ ＩＶ −ＣｙＳ−Ｐ ｒｏ −Ｓ ｅｒ
−Ｔ ｈｒ −Ｈｉｓ−Ｖ ａｔ −Ｌｅｕ −Ｌｅ
ｕ −Ｔｈｒ −Ｈｉｓ −Ｔｈｒ −１１ｅ−８ｅｒ
−Ａｒ（１−［１ｅ−Ａｌａ−ｖａｔ−８ｅｒ−ＴＶ
ｒ−Ｇｌｎ −Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ −Ｌ
ｅｕ −ｌ ｅｕ−８ｅｒ −Ａ ｌａ −［ｌｅ −
Ｌｙｓ −Ｓｅｒ −Ｐｒｏ −Ｃｙｓ−Ｇ Ｉｎ −
Ａ ｒｇ−Ｇ ｌｕ−Ｔ ｈｒ−Ｐ ｒｏ−Ｇ ｌｕ−
Ｇ ｌｙ−Ａ Ｉａ−Ｇ ｌｕ−Ａ ｌａ−Ｌ ｙｓ−
Ｐ ｒｏ−Ｔ ｒｐ−Ｔ ｙｒ−Ｇ Ｉｕ −Ｐ ｒｏ
−１ｌｅ −ＴＶｒ −Ｌｅｕ −Ｇ ｌｙ−Ｇ ｌ
ｙ−Ｖａｌ −Ｐ ｈｅ−Ｇ Ｉｎ−Ｌ ｅｕ−Ｇ Ｉ
ｕ−Ｌ ｙｓ−Ｇ ｌｙ −Ａ Ｓｐ −Ａｒｇ −Ｌ
ｅｕ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｓｎ −Ａ
ｒＱ−Ｐ ｒＯ−Ａ ５ｌ）−Ｔ Ｖｒ−Ｌ ｅｕ−
Ａ ５ｌ）−Ｐ ｈｅ−Ａ ｌａ −Ｇ Ｉｕ −Ｓ
ｅｒ −Ｇ ｌｙ −Ｇ Ｉｎ −Ｖ ａｔ −Ｔ ｙ
ｒ −Ｐｈｅ−Ｇｌｙ −１ｌｅ −１１ｇ−Ｐｈｅ−
１ｅｕ−（ＣＯＯＨ”）
で表わされる抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミノ末
端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードする抗
腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドであり、
第１１図にその作成方法を示した。After annealing, the obtained double-stranded oligonucleotide was combined with the previously obtained approximately 3.0K bp DNA fragment (Bs
tE If HHind I[[] Both are 1/-4
After precipitation, a ligation reaction using T4-DNA ligase was performed according to the method of Example 3. After the reaction, Escherichia coli C600r-i-
The desired plasmid I) is introduced into the strain and selected from among the transformed strains.
A clone with TNF66B (approximately 3.2 Kbp) was selected. This plasmid has the following amino acid sequence (82N) Arg-Lys-Argiys-P
ro-Vat-A! a-l-1iS-Val-V
al-A laA sn -Pro -G In -
A Ia -G tu -G Iy -G In -L
etl-Gln-TrCl-LelJ-ASn-A, r
(J-ArU-A la -A sn -A la -
1eu -L eu -A la -A sn -Gl
y-Val-Glu-1, -eu-Arg-Asp-
Asn -Gln-Leu-Val-Val-Pro-
8er-Glu-G Iy-Leu-Tyr-L
eu -11e -Tyr -Ser -G In -
V al-L eu -P he-L vs-G lv
-G InG IV -CyS-Pro -Ser
-T hr -His-V at -Leu -Le
u -Thr -His -Thr -11e-8er
-Ar(1-[1e-Ala-vat-8er-TV
r-Gln-Thr-Lys-Val-Asn-L
eu -l eu-8er -A la -[le -
Lys-Ser-Pro-Cys-G In-
A rg-G lu-T hr-Pro-G lu-
G ly-A Ia-G lu-A la-L ys-
Pro-Trp-Tyr-G Iu-Pro
-1le -TVr -Leu -G ly-G l
y-Val -P he-G In-L eu-G I
u-L ys-G ly -A Sp -Arg -L
eu-3er-Thr-Glu-11e-Asn-A
rQ-P rO-A 5l)-T Vr-L eu-
A5l)-Phe-Ala-GIu-S
er −G ly −G In −V at −T y
r -Phe-Gly -1le -11g-Phe-
An antitumor active polypeptide gene expression plasmid encoding an antitumor polypeptide represented by 1eu-(COOH") or a polypeptide having Met bound to its amino terminus,
FIG. 11 shows the method for making it.
実施例６（発現の確認）
前記実施例５で得られた新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺
伝子発現型プラスミドＥＩＴＮＦ６６８を有するエシェ
リヒアφコリＣ６００ｒ−ｍ−株を、３０μ９／Ｉ１１
のアンピシリン、０．２％のグルコース及び４Ｊｌ／ａ
ｌｔのカザミノ酸を含むＭ９培地［０，６％Ｎ８ ２
８ＰＯ４−０，３％に２ ＨＰＯ４−０，０５％Ｎａ
ｃｆ−０，１％ＮＨ＊Ｃｊ水溶液（１）８７．４）をオ
ートクレーブ滅菌した後に、別途にオートクレーブ滅菌
したＭｇ５ｏｎ水溶液及びＣａＣｌ２水溶液をそれぞれ
最終濃度２１１Ｍ及び０．１ ｉＭになるように加える
。］ ２００ｄに接種し、ＯＤｏρが０．１に達する
まで、３７℃で振どう培養を行なった。次いで、最終濃
度５０μ９／ｄの３−β−インドールアクリル酸を培養
液中に添加し、さらに３７℃で１２時間振どう培養を続
けた。Example 6 (Confirmation of expression) Escherichia φ coli C600r-m- strain having the novel anti-tumor active polypeptide gene expression plasmid EITNF668 obtained in Example 5 was incubated at 30μ9/I11.
of ampicillin, 0.2% glucose and 4 Jl/a
M9 medium containing lt of casamino acids [0,6% N8 2
8PO4-0,3% to 2HPO4-0,05%Na
After sterilizing the cf-0, 1% NH*Cj aqueous solution (1) 87.4) in an autoclave, separately sterilized Mg5on aqueous solution and CaCl2 aqueous solution are added to final concentrations of 211 M and 0.1 iM, respectively. ] The cells were inoculated at 200 d, and cultured with shaking at 37° C. until ODoρ reached 0.1. Next, 3-β-indoleacrylic acid at a final concentration of 50 μ9/d was added to the culture solution, and the culture was further continued with shaking at 37° C. for 12 hours.
遠心分離により大腸菌国体を集めた後、ＰＢＳバッフ？
−（１５０ｇ＋Ｍ Ｎａ Ｃ１を含む２０ ｓＭリ
ン酸バッファー、 ＥＩＨ７，４＞を用いて菌体の洗
浄を行なった。洗浄後の菌体を１０Ｉ１１のＰＢＳバッ
ファーに懸濁させ、超音波発生装置（久保田、 ２０
０Ｍ型）を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌
体残漬の除去を行なった。After collecting Escherichia coli by centrifugation, PBS buffer?
- (20 sM phosphate buffer containing 150 g+M NaCl, EIH7,4>) was used to wash the bacterial cells.The washed bacterial cells were suspended in 10I11 PBS buffer and placed in an ultrasonic generator (Kubota, 20
After the bacterial cells were disrupted using 0M type), residual bacterial cells were removed by centrifugation.
得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉｓ−
ＨＣｆバッファー （ｐＨ６，８＞ 、 ＳＤＳ、 ２
−メルカプトエタノール、グリセロールを、それぞれ最
終部１！１６０ｅＭ、２％、 ４％、 １０％Ｇｉ：ナ
ルヨうに加え、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動［鈴木、遺伝、 ３１．４３ （１９７７） ］を行
なった。A portion of the obtained E. coli lysate was treated with Tris-
HCf buffer (pH 6,8>, SDS, 2
- Mercaptoethanol and glycerol were added to the final portions of 1!160 eM, 2%, 4%, and 10% Gi:Naruyo, respectively, and 5DS-polyacrylamide gel electrophoresis [Suzuki, Genetics, 31.43 (1977)] was performed. .
分離用ゲルは１５％とし、泳動バッファーはＳＯＳ。The separation gel was 15%, and the running buffer was SOS.
Ｔ ｒｉｓ−グリシン系［Ｕ、 Ｋ、 Ｌａｅ＋ｕ＋ｌ
ｉ。Tris-glycine system [U, K, Lae+u+l
i.
Ｎａｔｕｒｅ 、 ２２７． ６８０（１９７０）
］を用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマ
シープルーＲ−２５０（バイオ・ランド）で染色し、新
規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現の確認を行なっ
た。Nature, 227. 680 (1970)
] was used. After the electrophoresis was completed, the proteins in the gel were stained with Coomassie Blue R-250 (Bio-Rand) to confirm the expression of the novel antitumor active polypeptide gene.
実施例７（活性の評価）
新規抗腫瘍活性ポリペプチドのｉｎ ＶｉｔｒＯ抗癌活
性測定は、前記Ｒｕｆｆの方法に準じて行なった。Example 7 (Evaluation of Activity) The in VitrO anticancer activity of the novel antitumor active polypeptide was measured according to the method of Ruff.
すなわち、実施例６で得られた新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドを含む大腸菌ライゼートを順次培地で希釈した試料
１００μ文と、４ Ｘ １０５個／ｄの濃度のマウスＬ
−９２９１維芽細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ９２９）懸濁液１
００μρを、９６穴の組織培養用マイクロプレート（コ
ースタ−）内で混合した。なおこの際に、最終濃度１μ
ｇ／ｌｄのアクチノマイシンＤ（コスメゲン、萬有製薬
）を添加しておく。That is, 100μ of the E. coli lysate containing the novel antitumor active polypeptide obtained in Example 6 was diluted in a medium, and mouse L at a concentration of 4 x 105 cells/d.
-9291 fibroblast (ATCCCCCL929) suspension 1
00 μρ was mixed in a 96-well tissue culture microplate (Coaster). At this time, the final concentration is 1μ
g/ld of actinomycin D (Cosmegen, Banyu Pharmaceutical) is added.
培地としては、５％（ｖｏｌ ／ｖｏｌ ）のウシ胎児
血清を含むイーグルのミニマム・エッセンシャル培地（
日永製薬）を用いた。上記マイクロプレートを、５％炭
酸ガスを含む空気中、３７℃で１８〜２０時間培養した
後、クリスタル・バイオレット溶液［５％（ｖｏｌ／ｖ
ａｔ ）メタノール水溶液に、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ
）のクリスタル・バイオレットを溶解させたもの］を
用いて生細胞を染色した。余分なりリスタル・バイオレ
ットを洗い流し乾燥した後、残ったクリスタル・バイオ
レットを１００μ文の０．５％ＳＤＳ水溶液で抽出し、
その５９５ｎｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡアナライザ
ー（東洋側器。The medium used was Eagle's Minimum Essential Medium containing 5% (vol/vol) fetal bovine serum.
Hinaga Pharmaceutical) was used. After culturing the above microplate at 37°C for 18 to 20 hours in air containing 5% carbon dioxide, a crystal violet solution [5% (vol/v
at) 0.5% (wt/vol) in methanol aqueous solution
) was used to stain living cells. After washing away the excess crystal violet and drying it, the remaining crystal violet was extracted with 100μ of 0.5% SDS aqueous solution.
The absorbance at 595 nm was measured using an ELISA analyzer (Toyo sideki).
ＥＴＹ−９６型）で測定する。この吸光度は、生き残っ
た細胞数に比例する。そこで、抗腫瘍活性ポリペプチド
等を含む大腸菌ライゼートの希釈溶液を加えない対照の
吸光度の５０％の値に相当する大腸菌ライゼートの希釈
倍率をグラフ（たとえば第１２図）によって求め、その
希釈倍率をユニットと定義する。第１２図より、発現型
プラスミドｐＴＮＦ６６８にコードされる新規抗腫瘍活
性ポリペプチドを含む大鵬菌ライゼート１００μ隻は３
．５Ｘ １０５ユニツトの活性を有していることが用ら
かになった。ETY-96 model). This absorbance is proportional to the number of surviving cells. Therefore, the dilution factor of E. coli lysate containing antitumor active polypeptide, etc., which corresponds to 50% of the absorbance of the control to which no diluted solution is added, is calculated using a graph (for example, Fig. 12), and the dilution factor is calculated by unit. It is defined as From Figure 12, 100μ of the Taiho bacterium lysate containing the novel antitumor active polypeptide encoded by the expression plasmid pTNF668 is 3
．． It was found that the compound had an activity of 5×105 units.
第１図は設計したヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５
図は、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を有するプラスミドｐＴ
ＮＦＩＢＲ，ｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成方法を
、それぞれ示したものである。第６図はヒトＴＮＦ遺伝
子発現型プラスミドｐＴＮＦ ４０１ＮＮの作成方法を
、第７図は発現ベクターｐＡ Ａ ４１の作成方法を、
そして第８図はヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド１）
ＴＮＦ４０１Ａの作成方法を、それぞれ示したものであ
る。第９図は抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラ
スミド１）ＴＮＦ４７１の作成方法を示したものである
。第１０図は抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラ
スミド１ｌＴＮＦ６１９の作成方法を示したものである
。第１１図は新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドｐＴＮＦ６６８の作成方法を示したものであ
る。第１２図は新規抗腫瘍活性ポリペプチドのｉｎ Ｖ
ｉｔｒＯ抗癌活性測定結果を示したものである。Figure 1 shows the nucleotide sequence of the designed human TNF gene, and
The figures show the base sequences of chemically synthesized synthetic oligonucleotides. Figures 3, 4 and 5
The figure shows plasmid pT containing part of the human TNF gene.
The methods for producing NFIBR, pTNF2N, and pTNF3 are shown. Figure 6 shows the method for creating the human TNF gene expression plasmid pTNF401NN, and Figure 7 shows the method for creating the expression vector pA A41.
Figure 8 shows human TNF gene expression plasmid 1)
Each method for creating TNF401A is shown. FIG. 9 shows the method for producing the antitumor active polypeptide gene expression plasmid 1) TNF471. FIG. 10 shows the method for constructing the antitumor active polypeptide gene expression plasmid 11TNF619. FIG. 11 shows the method for constructing the novel antitumor active polypeptide gene expression plasmid pTNF668. Figure 12 shows the in V
This figure shows the results of itrO anticancer activity measurement.
Claims (10)
する請求項１記載のポリペプチド。(2) The polypeptide according to claim 1, characterized in that Met is bound to the amino terminus.
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。(3) A recombinant plasmid containing a DNA region encoding a novel physiologically active polypeptide represented by the following amino acid sequence (gene sequence available) or a polypeptide with Met bound to its amino terminus.
Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする請求
項３記載のプラスミド。(4) Single-stranded DNA whose DNA region is represented by the following base sequence [there is a gene sequence] and its complementary single-stranded DNA
The plasmid according to claim 3, characterized in that it contains a double-stranded DNA consisting of A.
Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする請求
項３記載のプラスミド。(5) Single-stranded DNA whose DNA region is represented by the following base sequence [there is a gene sequence] and its complementary single-stranded DNA
The plasmid according to claim 3, characterized in that it contains a double-stranded DNA consisting of A.
請求項３記載のプラスミド。(6) The plasmid according to claim 3, wherein the plasmid is plasmid pTNF668.
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
れた組換え微生物細胞。(7) A recombinant transformed with a recombinant plasmid containing a DNA region encoding a novel physiologically active polypeptide represented by the following amino acid sequence [gene sequence is available] or a polypeptide with Met bound to its amino terminus. modified microbial cells.
とする請求項７記載の微生物細胞。(8) The microbial cell according to claim 7, wherein the microbial cell is Escherichia coli.
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプトチドをコード
するＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換
された組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理
活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物か
ら新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とす
る、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。(9) Recombinant transformation with a recombinant plasmid containing a DNA region encoding a novel physiologically active polypeptide represented by the following amino acid sequence [gene sequence is available] or a polypeptide with Met attached to its amino terminus. 1. A method for producing a novel bioactive polypeptide, which comprises culturing microbial cells, producing and accumulating a novel bioactive polypeptide in the culture, and isolating the novel bioactive polypeptide from the resulting culture.
配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する
医薬組成物。(10) A pharmaceutical composition containing an antitumor-effective amount of a novel physiologically active polypeptide represented by the following amino acid sequence (gene sequence is available) or a polypeptide having Met bound to its amino terminus.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2019074A JPH03224479A (en) | 1990-01-31 | 1990-01-31 | Novel bioactive polypeptide |
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-
1990
- 1990-01-31 JP JP2019074A patent/JPH03224479A/en active Pending
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