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JPH032153A - アミノアセトフェノン誘導体及びそれを用いた酵素活性測定法 - Google Patents

アミノアセトフェノン誘導体及びそれを用いた酵素活性測定法

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JPH032153A
JPH032153A JP1137748A JP13774889A JPH032153A JP H032153 A JPH032153 A JP H032153A JP 1137748 A JP1137748 A JP 1137748A JP 13774889 A JP13774889 A JP 13774889A JP H032153 A JPH032153 A JP H032153A
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aminoacetophenone
acid
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黒岩　勝昌
Takeshi Nagasawa
長澤　健
Katsuhiro Katayama
勝博 片山
Shuichi Nakatsuyama
中津山　秀一
Hitoshi Matsuura
松浦　斎
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Nitto Boseki Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は、新規なアミノアセトフェノン誘導体、並びに
これを基質として用いる血清、血漿中の酵素活性測定法
に関する。
＋２１　　従来の技術 従来より、合成基質法によるプロテアーゼ活性やペプチ
ダーゼ活性を測定する場合、アミノ酸やペプチド誘導体
に発色基などが導入された合成基質が広く用いられてい
る。合成基質を用いた酵素活性測定法としては次の方法
がある。
■　ｐ−ニトロアニリン誘導体を用いる方法［ＫＩｌｎ
　Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ　、　４５．４７４．　　（１
９６７）　、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｉｎ、　Ａｃｔａ、　
、　７．７５５．　　（１９６２）、特開昭５２−３４
９４．特開昭５２−２４５９０］　　： ■　アニリン誘導体を用いる方法［特開昭５２−１４６
６９３．特開昭５２−５２６９１］　；■　ナフチルア
ミン誘導体を用いる方法［Ｃａｎｃｅｒ、　　１１　、
２８３．　　（１９５８）　、　Ｃｌ１ｎ。
Ｃｈｉｉ、Ａｃｔａ、　　　７，７５５．（１９６２）
］：■　クマリン誘導体を用いる方法［Ｊ、　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、。
８２．１４９５　（１９７７］。
これら合成基質を用いる測定法は酵素反応によりアミノ
酸やペプチド誘導体から遊離する発色基の吸光度や蛍光
強度を測定するか、もしくは、遊離した発色基を呈色反
応させ生じた色素の吸光度を測定する方法である。
（３）本発明が解決しようとする課題 ■　ｐ−ニトロアニリン誘導体を用いる方法は、酵素反
応により生成する発色の生成速度を直接測定する初速度
法での測定が出来、自動分析測定装置に簡単に適用する
事が可能で多数検体を処理出来るなど利点がある。しか
し使用されている測定波長が４００〜４１５Ｂである事
から血清、血漿成分、特にヘモグロビンやビリルビンの
影響を免れる事は出来ず、測定値に誤差を与える原因に
なっている。
■　アニリン誘導体を用いる方法は、酵素反応により生
成する発色基から化学反応や酵素を用いて色素を生成さ
せ、その吸光度を測定する方法である。この方法では血
清、血漿成分の影響を受は難い波長で測定する事が出来
る。しかし、操作が繁雑で初速度法での測定が困難で多
数検体を処理出来る自動分析装置への適用が難しい。
また、酵素を用いて色素を生成させる方法では酵素試薬
が非常に高価で安定性に乏しい等の問題がある。
■　ナフチルアミン誘導体を用いる方法は、前述した■
と同様の問題を有しており、且つ、ナフチルアミン類の
発癌性が指摘されている等、実用性に欠けている。
■　クマリン誘導体を用いる方法は、酵素反応により生
成する蛍光物質を測定する方法である。
この方法は非常に感度良く測定出来る利点はあるが、測
定には蛍光光度計が必要であり、蛍光光度計は一般に高
価で自動分析装置に組込まれていない等、その適用が制
限されている。
したがって本発明の目的は、高感度で特異性が＾く、且
つ測定時に検体成分に影響されることなく自動分析装置
で初速度法による測定が可能な合成基質として有用であ
りまた合成基質の出発原料としても有用なアミノアセト
フェノン誘導体を提供することである。
本発明の他の目的は、上記アミノアセトフェノン誘導体
を合成基質として用いて酵素活性を測定する方法を提供
することである。
（４）課題を解決・するための手段 式々は従来法の欠点を解決すべく鋭意研究し本発明に到
達した。即ち、アミノアセトフェノン誘導体を合成し、
かかる化合物を基質として用いてＵ、Ｖ、法によるペプ
チダーゼ活性とプロテアーゼ活性測定法について検討し
た所、測定波長として約３３５〜約３５５　ｎｌの波長
を使用出来、極めて正確に再現性良（血清及び血漿中の
ペプチダーゼ活性やブＯテアーゼ活性を測定する事が可
能であり、種々の利点を有する事を知見し本発明に到達
した。
即ち、本発明は、一般式［Ｉ］ （式中、Ｒは水素、アルキル基、水酸基、またはアセト
キシ基を示し、Ｘは水素原子、末端アミン基を非可逆的
にマスクする基、またはペプチド化学において通常使用
されるアミノ基の保護基を示し、Ａはフェニルアラニン
、ロイシン、イソロイシン、グルタミン酸、ピログルタ
ミン酸、セリン、バリン、アルギニン、リジン、プロリ
ン、ピペコリン酸、アラニン及びフェニルアラニンから
なる群より選ばれる１体もしくは０体のアミノ酸残基も
しくはその同族体、またはこれらアミノ酸２個もしくは
３個からなるジもしくはトリペプチド残基もしくはその
同族体を示す。リジン残基のε−アミノ基は保護基によ
って保護されていても良く、保護されてなくても良い。
）で表わされるアミノアセトフェノン誘導体及びその酸
付加塩：及び、上記一般式［Ｉ］で示されるアミノアセ
トフェノン誘導体またはその酸付加塩を用いることを特
徴とするペプチダーゼ活性またはプロテアーゼ活性測定
法である。
上記式［Ｉ］におけるＲのアルキル基としては、メチル
、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルなどの炭素原子
数１〜５のアルキル基が挙げられる。
Ｘの末端アミノ基を非可逆的にマスクする基としては、
例えば、ベンゾイル基などが挙げられる。
ペプチド化学において通常使用されるアミン基の保護基
としては、例えばｔ−ブチルオキシカルボニル、ベンジ
ルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカル
ボニル ルオキシカルボニル ミノ酸残基の同族体としては、例えばグルタミン酸のγ
ーカルボキシル ロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどの炭素
原子数３〜６のシクロアルキル基が結合したグルタミン
酸誘導体残基；セリンのβ−水ＷＩＮにベンジル基が結
合したセリン誘導体残基などが挙げられる。ジもしくは
トリペプチド残基の同族体としては、これらアミノ酸誘
導体残基を含むジもしくはトリペプチド残基が挙げられ
る。リジン残基のε−アミノ基の保ｍｌとしてはベンジ
ルカルボニルまたは前記した保護基が同様に挙げられる
。
一般式［Ｉ］のアミノアセトフェノン誘導体は酸付加塩
でもよく、かかる酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭
化水素酸塩、硫１！２塩、リン酸塩などの無ｔｉ酸塩；
またはコハク酸塩、クエン酸塩、リンゴ１！２塩などの
有ｉ酸塩が挙げられる。
本発明による一般式［Ｉ］のアミノアセトフェノン誘導
体及びその酸付加塩は本来ペプチド化学において使用さ
れる通常の方法により合成される。
即ち、下記式［ＩＩ］ （Ｒは一般式［ＩＩ］の定義と同じ） で表わされる化合物と適当なアミノ酸、ジペプチドまた
はトリペプチドとを綜合反応することにより、あるいは
式［ｎｌの化合物にアミノ酸を段階的に縮合反応せしめ
ることによって合成することができる。これらの縮合反
応は、アミノ酸、ジペプチドまたはトリペプチドのアミ
ン基を前記した如き保［で保護しカルボキシル基を活性
化して通常行なわれる。カルボキシル基の活性化は例え
ばカルボジイミド法、アジド法、酸無水物法または活性
化エステル法にて行われ、綜合反応は、通常使用される
溶媒、例えばジメチルホルムアミド、ピリジン、クロロ
ホルム、塩化メチレン、酢酸エチル、テトラヒドロフラ
ン、ジオキサン等で行なわれる。
保１１の除去は合成の終点で好ましく除去される。保護
基は、塩１ｓ！２／酢酸、メタンスルホン酸／酢酸、２
５％臭化水素／酢酸、ギ酸、塩Ｍ／ギ酸、塩酸／ジオキ
サン、塩Ｍ／酢酸エチル、トリフルオロ酢酸等の酸分解
により通常除去される。
式［ＩＩ］においてＲが水酸基である４−アミノ−ω−
オキシ−アセトフェノン及びＲがアセトキシ基である４
−アミノ−ω−アセトキシ−アセトフェノンは公知の方
法によって製造できる（Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎ　ＸＩＶ．
　０．４９）　、　Ｒがアルキル基である化合物も通常
の方法によって製造できる。
次に、新規アミノアセトフェノン誘導体を用いる本発明
のペプチダーゼ活性またはプロテアーゼ活性の測定法に
ついて説明する。
ペプチダーゼ活性またはプロテアーゼ活性は、測定しよ
うとするペプチダーゼまたはプロテアーゼを含む検体と
一般式［Ｉ］のアミノアセトフェノン誘導体とを混合し
て酵素反応を行わせて式［ＩＩ］の化合物を遊離させ、
次いで吸光度を測定することにより遊離した式［ＩＩ］
の化合物を定量して測定することができる。
一般式［Ｉ］のアミノアセトフェノン誘導体として、例
えばロイシル−４−アセチルアニリドを用いた場合には
、ペプチダーゼまたはプロテアーゼを含む検体と混合し
て酵素反応を行わせることによりｐ−アミノアセトフェ
ノンが遊離する。第１図にｐ−アミノアセトフェノン（
ａ）とロイシル−４−アセチルアニリド（ｂ）のＵ．Ｖ
．スベクトルを示した。ｐ−アミノアセトフェノンは緩
衝液中で約３３５〜約３５５ｎｍに吸収を示すが、これ
とは対照的にペプチド結合せしめた合成基質であるロイ
シル−４−アセチルアニリドは約３３５ｎｍ以下の波長
に吸収を示す。従って、Ｕ、Ｖ。
法により測定波長３３５〜３５５　ｎ１ｌｌで反応を追
跡する事が出来る。この場合、この波長附近では他の血
清、血漿成分の干渉を受ける事が少ない。従って基質よ
り遊離するｐ−アミノアセトフェノンのＵ、Ｖ、吸収の
増加を正確に追跡することが出来、測定値に誤差を与え
る事が非常に少ない。
本発明の一般式［Ｉ］のアミノアセトフェノン誘導体を
用いることにより、例えばロイシンアミノペプチダーゼ
、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、プラスミノー
ゲン、アンチトロンビンなどのプロテアーゼまたはペプ
チダーゼを測定することができる。基質として好ましい
本発明のアミノアセトフェノン誘導体の例としては、実
施例１．２．３．４．６．８及び１４の基質並びに以下
のトリペプチド基質が挙げられる。
２８Ｃ１−１−（−Ｄ−８ｅｒ　（ＯＢｚｌ）−ＡＩａ
−Ａｒａ２ＨＣｊ！　・Ｈ−ｐＧ　ｌ　ｕ−△＋　ａ−
Ａｙｇ−Ｎ）−１−＠−ＣＯＣＨ３（５）発明の効果 本発明によればアミノアセトフェノン誘導体が提供され
、かかる化合物を酵素活性用の基質に用いる事により、
血清や血漿成分であるヘモグロビンやビリルビン等の影
響を受は弁い３３５〜３５５ｒｖの波長でペプチダーゼ
またはプロテアーゼを測定出来、また初速変法による測
定が可能で検体毎の検体ブランクをたてる必要がなく迅
速に測定出来、多数の検体を処理出来る。また、病院等
施設に普及している自動分析装置に簡単に適用できる。
以上のごとく、本発明の新規アミノアセトフェノン誘導
体を用いるペプチダーゼ活性またはプロテアーゼ活性測
定は従来法の有する問題を解決し、多くの利点や特徴を
有し、日常の臨床検査に於けるペプチダーゼ活性または
プロテアーゼ活性を測定する方法として極めて有用であ
る。
（６）　　実施例 以下に実施例により、本発明をざらに詳細に説明するが
本発明はこれによって限定されるものではない。
実施例中に記載の略号は次の意味を有す。
ｓｏｃ　　　：ｔ−ブチルオキシカルボニルＺ　　　　
：ベンジルオキシカルボニルｔ　　。
□Ｂｕ　　　、ｔ−ブチルエステル ＡＣ　　　＝アセチル ＡｃＯＥｔ：酢酸エチル １−ｅｕ　　　：ロイシン Ｇｌｕ　　　：グルタミン酸 ＡｒＧ＋　　　ニアルギニン ｈｅ ｐｒ。
ｙＳ ｃＯＨ ｗｓｃ。
−ＨｅＸ ＳＯＨ ＯＰ ＯＢ　ｔ フェニルアラニン ブＯリン リジン 酢酸 水溶性カルボジイミド ｎ−ヘキサン ｐ−トルエンスルホン酸 ２−メルカプト−４．６−シメチ ルビリミジン ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾー ル 二Ｎ−エチルモルホリン メタノール 一Ｎーヒドロキシザクシンイミドエ ステル ：ｎ−ブタノール ＥＭ ＭｅＯＨ　　　： Ｓｕ −ＢｕＯＨ 実施例１ ＢＯＣ−Ｌｅｕ−ＯＨ　　８．１９及びｐ−７ミノアセ
トフエノン４．７ｇをピリジン７０ｄに溶解し０℃に冷
ｆＪ］′？ｊる。撹拌下、ＷＳＣＤ　　８．１７を加え
０℃で４時間、その後室温で一晩反応させる。反応終了
後、反応液にＡｃ０Ｅｔ　　３００ｄ加え、冷５％ＨＣ
Ｉ、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和食塩水で洗浄し有機
相を無水硫酸マグネシウムで乾燥する。溶媒を減圧留去
し粗生成物を得た。
これをシリカゲルりロマトグラフイー（メルりＡｒｔ７
７３４゜ Ａｃ０Ｅｔ：ｎ−Ｈｅｘ　　１：４）に付し目的のフラ
クションを集め、濃縮し１１．４９ので得た。これに防
湿下、２Ｎ−ＨＣｌ　／Ａｃ０Ｈ７７ｄを加え５〜１０
℃で１時間反応し保１基を脱離した。反応後、無水エー
テルに沈殿させ目的物　７．９ｇを得た。（収率８９％
） 融点　１２８℃（分解） 元素分析　Ｃ１４Ｈ２１Ｎ２０２Ｃ１２１５Ｈ２０Ｃ（
％）　　　Ｈ（％）　　　Ｎ（％）理論値　５７．５９
　　７．５２　　９．５９実測値　５７．４４　　７，
６０　　９．４４実施例２ ＢＯＣ−Ｇｌｕ−ＯＢｕｔｌ、２ｇ、ｐ−アミノアセト
フェノン０．５ｇ、ＷＳＣＤ　　０．８ｇとピリジン１
０ｍを使用し実施例１と同様の操作により反応、後処理
を行なった後、 ２Ｎ−ＨＣ１／ＡｃＯＨで保護基を脱離してトヨパール
ＨＷ４０Ｆ　（３０％Ａｃ０Ｈ）によるゲルろ過を行な
い目的物のフラクションを集め凍結乾燥し目的物を０．
６ｇ得た。
（収率７１％） 元素分析　　Ｃ１３Ｈ１□Ｎ２０４ＣＩＣ（％）　　　
Ｈ（％）　　　Ｎ（％）理論値　５１．９２　　５．７
０　　９．３１実測値　５２．２２　　５．８７　　９
．４７実施例３ Ｈｃ　＋　−Ｈ−７−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｎｌ−＋ｃ）−ｃｏ
ｃ＋−＋２０ＣＯＣＨ３ＢＯＧ−ＧＩｕ＝ＯＢｕｔ１．
３６ｇ、　ｐ−アミノ−ω−オキシ−アセトフェノン０
．８６１ＨＯＢｔ　　Ｏ，５（１，ＷＳＣＤ　　０．９
ｇとＤＭＦ　　２０ｍを使用し、実施例１と同様に操作
し反応、後処理を行なって得た粗生成物を△ｃＯＥ　ｔ
／ｎ−Ｈｅｘにて再結晶してＢＯＣ７Ｇｌｕ−ＮＨ−Ｃ
＞ＣＯＣＨ２０ＡＣを１．６１９得た（収率７５％）。
このうち０．６７に防湿下 ２Ｎ−ＨＣＩ／ＡｃＯＨ６，２〆加え、室温で１時間反
応を行ない無水エーテルを加え沈殿させ、ろ集し減圧乾
燥を行ない、目的物を０．４１ｇ得た。
融点　１７９−１８４℃ 元素分析　Ｃ１５Ｈ１９Ｎ２０５Ｃ１１／２Ｈ２０Ｃ（
％）　　Ｈ（％）　　　Ｎ（％） 理論ｌｉｔ’！　　４８．９９　　５．７６　　７．６
２実測値　４８，９０　　５．４１　　７．４１実施例
４ ＨＣＩ　・Ｈ７Ｃ１ｕ　ＮＨ−Ｑ−ＣＯＣＨ２０Ｈ実施
例３で得た ＢＯＣ−７−ＧＩｕ−ＮＨ＋ＣＯＣＨ２０Ａｃ０．９６
ｇを無水メタノール１０Ｉｌ！ｉ！に溶解し、２８％Ｃ
Ｈ３０Ｎ　ａ　　Ｍ　ｅ　ＯＨ０、１ｄ加え、５℃で撹
拌下−晩反応を行ない、反応終了後Ａｃ０Ｅｔ　　１０
０ｍを加え、飽和ＮａＣ１，冷５％ＨＣＩ、飽和Ｎ　ａ
　ＨＣＯ３水溶液、飽和食塩水で洗浄し、有機相を無水
硫酸マグネシウムで乾燥する。溶媒を減圧留去し粗生成
物を得た。これをＡｃ０Ｅｔ／ｎ−Ｈｅｘで再結晶し、
を０．５６９得た（収率６４％）。融点１２９−１３６
℃　　防湿下、２Ｎ−ＨＣｌ／Ａｃ０Ｈ５ｄ加え、室温
で１時間反応後、無水エーテルを加え沈殿させ、ろ果し
、減圧乾燥を行ない目的物を０．２ｇ得た（収率５０％
）。
融点　８４−８７℃ 元素分析　Ｃ１３Ｈ１□Ｎ２０５　Ｃｌ　　　２１５　
Ｈ２０Ｃ（％）　　　Ｈ（％）　　　Ｎ（％）理論値　
４８．２０　　５．５４　　８．６５実測値　４８．３
４　　５．５８　　８．３３実施例５ ＢＯＣ−Ａｒｏ−ＯＨ−ＨＣ１−Ｈ２Ｏ２，２ｇ、　ｐ
−アミノアセトフェノン３．８９゜ＷＳＣＤ　　９．６
９とピリジン７０Ｉｄを用いて、実施例１と同様に操作
し反応を行ない、Ａｃ０Ｅｔ／ｎ−ＢｕＯＨ（７５ｄ：
４０ａｅ）で抽出し、飽和食塩水、冷５％ＨＣＩ、飽和
ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和食塩水で洗浄し、有機相を無
水硫酸マグネシウムで乾燥する。溶媒を減圧留去し目的
物をフオーム状で８．８９得た（収率７９％）。
元素分析　Ｃ１９Ｈ３ｏＮ５０Ｃ１１１５Ｈ２０Ｃ（％
）　　　１−１（％）　　　Ｎ（％）理論値　５２．８
８　　７．１０　　１６．２３実測値　５２．８７　　
７．３２　　１５．９０実施例６ 実施例５で得た ｙに２Ｎ−１−ＩＣＩ／ＡｃＯＨ４７，５ｄを加ｔ５℃
で２時間反応を行ない、無水エーテルに加え沈殿させ目
的物をアモルファス状で６．９！Ｊ得た。
（収率１００％） 元素分析Ｃ１４８２３Ｎ５０□ＣＩ　　　　１／１０Ｈ
２０Ｃ（％）　　　Ｈ（％）　　　Ｎ（％）理論値　４
６．１６　　６．３６　　１９．２３実測値　４５．９
３　　６．３８　　１９．１３実施例７ ＢＯＣ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒａ−ＮＨ（ΣＣＯＣ
ｌ−１３実施例６で得た ６、７４ｇ、ＢＯＣ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ＯＨ６，７
０１ＨＯＢｔ　　２．８３グをＤＭＦ１５５−に溶解後
、５℃に冷却し、ＮＥＭ１８．５ｄを加え、ＷＳＣＤ　
　３．８９ＳＪを加え、５℃で４時間反応後、室温で一
晩反応を行なう。
反応後、ＤＭＦを減圧留去し、ＭｅＯＨ／Ａｃ０Ｅｔ　
（２２ｄ１９０ｍ）に溶解し、飽和食塩水、冷５％ＨＣ
Ｉ、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和食塩水で洗浄し、有
機相を無水５Ａ酸マグネシウムで乾燥する。溶媒を減圧
留去し油状物を得たこれをセファデックス　ＬＨ−２０
（ＭｅＯＨ）に付し、ゲルろ過を行ない目的物のフラク
ションを集め濃縮し、Ａｃ０Ｅｔ／ｎ−Ｈｅｘｔ’再結
晶し目的物を９．４ｇ得た（収率５９％）。
融点　　９７−１１６℃ 元素分析Ｃ３３Ｈ４６Ｎ　７０６　ＣＩ　・１／２　Ｍ
　ｅ　ＯＨＣ（％）　　　Ｈ（％）　　　Ｎ（％〉理論
値　５８．４６　　７．０３　　１４．２５実測値　５
８．５２　　７．１９　　１３．９６実施例８ ２ＨＣＩ　−Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ＡｒＱ−ＮＨ−
Ｑ−ＣＯＣＨ３実施例７で得た保護トリペプチド７．０
６ｇに２Ｎ−ＨＣＩ／ＡｃＯＨ２６，３ｄ加え、防湿上
室温で１時間反応を行なう。反応後、無水エーテルに加
え析出した沈殿物をろ果し、トヨバールＨＷ４０Ｆ（３
０％Ａｃ０Ｈ）によるゲルろ過を行ない目的物のフラク
ションを集め凍結乾燥し目的物を５．２６ｇ得た。（収
率８２％）元素分析　ＣＨＮ　ＯＣＩ　・２Ｈ２゜Ｃ（
％）　　Ｈ（％）　　　Ｎ（％） 理論値　５２．１７　　６．７２　　１５．２１実測値
　５２．２４　　６．’５２　　１５．０７実施例９ ＢＯＣ−Ｌｙｓ（Ｚ）−０Ｈ３８，Ｏｇ。
ｐ−アミノアセトフェノン１３．５ｇ、ＷＳＣＤ２１．
０ｇとピリジン２００−を使用し実施例１と同様に反応
、後処理を行ない Ａｃ０Ｅ　ｔ／ｎ−Ｈｅｘで再結晶し目的物を４３．８
９を得た（収率８８％）。
融点　　１１０−１１９℃ 元素分析　Ｃ２７Ｈ３５Ｎ３０６ Ｃ（％）　　　Ｈ（％）　　　Ｎ（％）理論値　６５，
１７　　７．０９　　８．４５実測値　６５，１２　　
７．２２　　８．４５実施例１０ ＴＳＯＨ−Ｈ−ＬＶＳ　（Ｚ）　−ＮＨ−Ｑ−ＣＯＣＨ
３実施例９で得た ２５ｇをＡｃ０Ｅｔ　　１４０−に溶解、３０℃に加温
しＡＣＯＥｔ　　９０ｄにＴＯ８ＯＨ３５ＳＦを溶解し
た物を加え、３時間撹拌下反応を行なう。
反応後析出した結晶をろ果して減圧乾燥し、目的物を２
０．１！Ｊ得た（収率７１％）。
融点　　１７４−１８３℃ 元素分析　Ｃ２９Ｈ３６Ｎ３０７Ｓ・　１／２Ｈ２０Ｃ
（％）　　　Ｈ（％）　　　Ｎ（％）理論値　６０，０
９　　６．４０　　７．２５実測値　６０．１７　　６
，２０　　６．９９実施例１１ ｓｏｃ−ｐｈｅ−ｃｙｓ　（Ｚ）　−Ｎ＋＋ｃ、ｏｃ＋
３実施例１０で得た ＴｓＯＨ−Ｈ−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＮＨ−Ｑ−ＣＯＣＨ３７
，４１ｐをＤＭＦ　　２６ｄに溶解し、５℃に冷１］後
、ＮＥＭ　　１．６９ｍを加え、次いでＢＯＣ−Ｐｈｅ
−８ＤＰ　　５．０４ｇを粉末で加え、５℃で４時間、
室温で一晩反応する。反応後、ＤＭＦを減圧留去し、Ａ
ｃ０Ｅｔ　　１９０＋ｅに溶解し、飽和食塩水、冷５％
ＨＣＩ、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和食塩水で洗浄し
、有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥する。溶媒を減
圧留去し７．４８ｇを結晶で得た（収率９０％）。
融点　　１６７−１７２℃ 元素分析　Ｃ３６Ｈ４４Ｎ４０□ Ｃ（％）　　　Ｈ（％）　　　Ｎ（％）理論値　６６．
９６　　７．０２　　８．６７実測値　６６．８１　　
７．１３　　８．５９実施例１２ ＴＳＯＨ−Ｈ−Ｐｈｅ−ＬＶＳ　（Ｚ）　−ＮＨ＋ＣＯ
ＣＨ３実施例１１で得た ＢＯＣ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ　（Ｚ）　−Ｎ）−１−ｃ／−
ｃＯＣＨ３７，４１ｇをＡｃ０Ｅｔ　　３４ｄ！、：Ｗ
ＪＷＩした後、その溶液にＡＣＯＥｔ　　２３ｄに溶解
したＴＳＯＨ８，７５９を加え、３０℃で３時間反応後
、エーテル６０ｄ加え結晶を析出させる。この結晶をろ
集し、減圧乾燥し目的物を７．４８９得た（収集９０％
）。
融点　　１８９−１９３℃ 元素分析　Ｃ３８Ｈ４４Ｎ４０８Ｓ Ｃ（％）　　　Ｈ（％）　　　Ｎ（％）理論値　６３．
６７　　６．１９　　７．８２実測値　６３．６４　　
６．３７　　７．６２実施例１３ ｓｏｃ−ｏ−Ｌｙｓ　（Ｑ−ＣＨ２Ｃｏ）−Ｐｈｅ−Ｌ
ｙｓ（Ｚ）−ＮＨＱＣＯＣ）（３実施例１２で得た ＴｓＯＨ−Ｈ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ　（Ｚ）　−ＮＨ−Ｑ−
ＣＯＣＨ３３，５８ｇをＤＭＦ４０ｍに溶解し、５℃に
冷却後、ＮＥＭ　　０．６５ｄを加え、次いでＢＯＣ−
Ｄ−Ｌｙｓ　（ｃ＞Ｃ）−１２Ｇｏ）　−０８ｕ２．３
１ｇを粉末で加え、５℃で４時間、室温で一晩反応する
。反応後、ＤＭＦを減圧留去し、Ａｃ０Ｅｔ　　２００
ｍｋ：溶解し、飽和食塩水、冷５％ＨＣ１、飽和ＮａＨ
ＣＯ３水溶液、飽和食塩水で洗浄し、有機相を無水！ｉ
ｉ！Ｉ！マグネシウムで乾燥する。溶媒を減圧留去し、
３．８３９を結晶で得たく収率８５％）。
融点　　１４５−１４７℃ 元素分析　Ｃ３ｏＨ６２Ｎ６０ｇ　・３１５　Ｈ２０Ｃ
（％）　　Ｈ（％）　　　Ｎ（％） 理論値　６６．５９　　７．０６　　９．３２実測値　
６６．５１　　７．０６　　９．５４実施例１４ ２ＨＢｒ−Ｈ−Ｄ−Ｌｙｓ　（Ｑ−ＣＨ２Ｃｏ）　−Ｐ
ｈｅ−ＬＶＳ−Ｎ）−ＩＱ−ＣＯＣＨ３実施例１３で得
た保護トリペプチド３．２４ｇに防湿下、２５％Ｈｅｒ
／ＡｃＯ８２７，２ｉ加え撹拌下、空温で１時間反応後
、無水エーテル５００−に加え析出した沈殿物をろ集し
、トヨパールＨＷ４０Ｆ　（３０％Ａｃ０Ｈ）によるゲ
ルろ過を行ない目的物のフラクションを集め凍結乾燥し
　　検体はヒト血清を使用した。ロイシンアミノベブ目
的物を１．９４ｇまた。（収率６４％）　　　　　　チ
ダーゼ活性値は下記の式により計算される。
元素分析　Ｃ３７Ｈ５ｏＮ６０５Ｂｒ２・３／２Ｈ２０
Ｃ（％）　　　　Ｈ（％）　　　Ｎ　（％）ｌａｌｍ　
　５２．５５　　６，３２　　９．９４実ＩＩ　　５２
．５３　　６．１７　　９．８４実施例１５　血清中ロ
イシンアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性測定法 ■　１２５ＩＩＨトリス緩衝液　ｐＨ７，８（２５℃） ■　検体 ■　２０．４ｍＨＩ質（実施例１）液 ■の緩衝液２．ＯＩｄに検体０．０５−を加え２〜１０
分間程分間子℃で予加温し、それに■の基質液０．５＋
＋ｄ！加え、同時にストップウォッチをスタートさせ正
確に３０秒、９０秒の３４０ｍｍにおける吸光度を測定
し１分間当りの吸光度変化を求める。第２図に反応タイ
ムコースを示した。
１）　八〇、　Ｄ／ｎ＋ｉｎは測定波長３４０ｎｍにお
ける１分間当りの吸光度変化。
２）波長３４０　ｎｍにおける分子吸光係数は、６２８
４である。
上式より使用した血清は１３５（ＩＵ＃り単位であった
。
第２図に示したごとく、１０分間、経時的にタイムラグ
のない直線を示した。これは自動分析装置に使用可能な
事を示している。
実施例１６　血清中γ−グルタミルトランスペプチダー
ゼ（γ−ＧＴＰ）活性測定法 ０２００ｍＨｔ−リス、１００ｍ）Ｉグリシルグリシン
緩衝液　ｐＨ１８，３＜２５℃） ■　検体 ■　５０■Ｈ基質（実施例２）液 ■の緩衝液４．０ｔｄに検体０．２−を加え２〜１０分
間程分間子℃で予加温し、それに■の基質液０．４ａｊ
加え、同時にストップウォッチをスタートさせ正確に３
０秒、９０秒の３４０ｎｌｌｌにおける吸光度を測定し
１分間当りの吸光度変化を求める。第３図に反応タイム
コースを示した。
検体はヒト血清を使用した。血清中γ−グルタミルトラ
ンスペプチダーゼ活性値は実施例１３と同様の計算式に
より計算される。
また、実施例３．４で得た化合物を基質とした測定法も
、上記の試薬を用いて同様の操作方法で測定する。第４
図、第５図にそれぞれの反応タイムコースを示した。
実施例１７　　ｐ−アミノアセトフェノンの標準曲線 ■　実施例１５の緩衝液 ■　ｐ−アミノアセトフェノン０．１ｇＭ〜０．５１８
（最終濃度２０μＨ〜 １００μＨ） 各濃度の■の水溶液を正確に５−を２０−のメスフラス
コに取り、■の緩衝液でメスアップし、それぞれの溶液
を２〜１０分間程度予加温して３４Ｑｎｍに於ける各濃
度の吸光度を測定した。第６図は標準曲線を示す。
第６図に示したごとく、１００μＨｉ１５度まで原点を
通る直線を示した。この事は十分、定伍性がある事を示
している。
実施例１８　アンチトロンビン−Ｉ［［（ＡＴ−ＩＩＩ
）の測定 ■　トロンビン（ＴＨ）０．５Ｎ　ＩＨ／Ｉｄとヘパリ
ン０．５ＬＩ／−を含む７５ｍＨトリス緩衝液　ｐＨ８
，６（２５℃） ■　１Ｑ＋ａＨ基質（実施例８）水溶液■　ヒト血漿（
生理食塩水で５倍希釈したもの） ■の緩衝液２．０ａｉ！に■の検体０．０２５ｄを加え
２〜１０分間程分間子℃で予加温し、それに■の基質液
０．５１ｄ加え、同時にストップウォッチをスタートさ
せ正確に３０秒、９０秒の３４０ｎｎ＋における吸光度
を測定し１分間当りの吸光度変化を求める。検体の希釈
倍数に対して１分当りの吸光度変化をプロットし、検量
線を作成した。その結果を第７図に示す。
この結果、本発明の新規基質を用いる事によってＡＴ−
１［［が高感度、且つ定量性良く測定できることがわか
る。
実施例１９　プラスミノーゲン（Ｐ　Ｌ　Ｇ　）の測定
■　ストレプトキナーゼ（ＳＫ）０．２７Ｕ／〆を含む
　１５０ｍ）ｌ　　トリス−マレイン酸緩衝液　ｐｌ＋
６．８（２５℃）■　１０１８　　基質（実施例１４）
水溶液■　ヒト血漿（生理食塩水で５倍希釈したもの） ■の緩衝液３．Ｏａｅに■の検体０．２１ｄを加え２〜
１０分間程度３７℃で予加温し、それに■のＭ質液０３
５Ｉｄ加え、同時にストップウォッチをスタートさせ正
確に３０秒、９０秒の３４０ｍｍにおける吸光度を測定
し１分間当りの吸光度変化を求める。検体の希釈倍数に
対して１分当りの吸光度変化をプロットし、検量線を作
成した。その結果を第８図に示す。
この結果、本発明の新規基質を用いる事によっでＰＬＧ
が高感度、且つ定量性良く測定できることがわかる。
【図面の簡単な説明】
第１図はに）ｐ−アミノアセトフェノン（濃度５０μＨ
）及び、（ハ）ロイシル−４−アセチルアニリド（ｌ！
１度５０μＭ）の１２５ｍＭ）−リス緩衝液ｐｌ＋７．
８　（２５℃）中のＵ、Ｖ、スペクトルを示す。 第２図はロイシル−４−アセチルアニリドを基質とした
場合の血清中のＬＡＰ活性による（２）反応タイムコー
スと（ハ）試薬ブランクを示す。 第３図はγ−グルタミルー４−アセチルアニリドを基質
とした場合の血清中γ−ＧＴＰ活性による（２）反応タ
イムコースと（ハ）試薬ブランクを示す。 第４図はγ−グルタミルー４−（ω−アセトキシアセチ
ル）アニリドを基質とした場合の血清中のγ−ＧＴＰ活
性による（２）反応タイムコースと（へ）試薬ブランク
を示す。 第５図はγ−グルタミルー４−（ω−オキシアセチル）
アニリドを基質とした場合の血清中のγ−ＧＴＰ活性に
よる■反応タイムコースと（ハ）試薬ブランクを示す。 第６図はｐ−アミノアセトフェノンの標準曲線を示す。 第７図は実施例８の化合物を基質として使用し、ＡＴ−
Ｉ［［を測定した場合の検量線であり、縦軸は測定波長
３４０ｒｖにおける１分間当りの吸光度変化、横軸はＡ
Ｔ−ＩＩＩ活性を示す。 第８図は実施例１４の化合物を基質として使用し、ＰＬ
Ｏを測定した場合の検量線であり、Ｉｔ１＠は測定波長
３４０ｎ−における１分間当りの吸光度変化、横軸はＰ
ＬＯ活性を示す。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）一般式［ I ］ ▲数式、化学式、表等があります▼［ I ］ （式中、Ｒは水素、アルキル基、水酸基、またはアセト
    キシ基を示し、Ｘは水素原子、末端アミノ基を非可逆的
    にマスクする基、またはペプチド化学において通常使用
    されるアミノ基の保護基を示し、Ａはフェニルアラニン
    、ロイシン、イソロイシン、グルタミン酸、ピログルタ
    ミン酸、セリン、バリン、アルギニン、リジン、プロリ
    ン、ピペコリン酸、アラニン及びフェニルアラニンから
    なる群より選ばれるＬ体もしくはＤ体のアミノ酸残基も
    しくはその同族体、またはこれらアミノ酸２個もしくは
    ３個からなるジもしくはトリペプチド残基もしくはその
    同族体を示す。リジン残基のε−アミノ基は保護基によ
    つて保護されていても良く、保護されてなくても良い。 ）で表わされるアミノアセトフェノン誘導体及びその酸
    付加塩。
  2. （２）上記一般式［ I ］で示されるアミノアセトフェ
    ノン誘導体またはその酸付加塩を用いることを特徴とす
    るペプチダーゼ活性またはプロテアーゼ活性測定法。
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